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Biology

नॉनरेडियोएक्टिव आयरन आइसोटोप का उपयोग करके विवो में माउस प्लेसेंटा के पार आयरन ट्रांसपोर्ट की मात्रा निर्धारित करना

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

यह लेख दर्शाता है कि माउस गर्भावस्था में लोहे के परिवहन के अध्ययन के लिए ट्रांसफरिन-बाध्य गैर-रेडियोधर्मी आइसोटोपिक लोहे को कैसे तैयार और प्रशासित किया जाए। फेटोप्लासेंटल डिब्बों में आइसोटोपिक लोहे की मात्रा निर्धारित करने के दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है।

Abstract

गर्भावस्था के दौरान मातृ और भ्रूण के स्वास्थ्य के लिए आयरन आवश्यक है, स्वस्थ गर्भावस्था को बनाए रखने के लिए मनुष्यों में लगभग 1 ग्राम लोहे की आवश्यकता होती है। भ्रूण आयरन एंडोमेंट पूरी तरह से प्लेसेंटा में लोहे के हस्तांतरण पर निर्भर है, और इस हस्तांतरण के गड़बड़ी से प्रतिकूल गर्भावस्था के परिणाम हो सकते हैं। चूहों में, प्लेसेंटा में लोहे के प्रवाह का माप पारंपरिक रूप से रेडियोधर्मी लोहे के आइसोटोप पर निर्भर था, जो एक अत्यधिक संवेदनशील लेकिन बोझिल दृष्टिकोण था। स्थिर लोहे के आइसोटोप (57Fe और 58Fe) मानव गर्भावस्था अध्ययन में उपयोग के लिए एक गैर-रेडियोधर्मी विकल्प प्रदान करते हैं।

शारीरिक परिस्थितियों में, ट्रांसफरिन-बाउंड आयरन प्लेसेंटा द्वारा लिए गए लोहे का प्रमुख रूप है। इस प्रकार, 58फे-ट्रांसफरिन तैयार किया गया था और गर्भवती बांधों में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया था ताकि सीधे प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट का आकलन किया जा सके और मातृ आंतों के लोहे के अवशोषण को एक भ्रमित चर के रूप में बाईपास किया जा सके। आइसोटोपिक आयरन को अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) द्वारा प्लेसेंटा और माउस भ्रूण के ऊतकों में मात्रा निर्धारित की गई थी। विवो आयरन डायनेमिक्स में मात्रा निर्धारित करने के लिए इन विधियों को शरीर विज्ञान या बीमारी के अन्य पशु मॉडल प्रणालियों में भी नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

लोहा विभिन्न चयापचय प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें विकास और विकास, ऊर्जा उत्पादन और ऑक्सीजन परिवहनशामिल हैं। लोहे के होमियोस्टैसिस का रखरखाव एक गतिशील, समन्वित प्रक्रिया है। लोहे को ग्रहणी में भोजन से अवशोषित किया जाता है और लोहे के परिवहन प्रोटीन ट्रांसफरिन (टीएफ) से बंधे परिसंचरण में शरीर के चारों ओर ले जाया जाता है। इसका उपयोग हर कोशिका द्वारा एंजाइमेटिक प्रक्रियाओं के लिए किया जाता है, नवजात एरिथ्रोसाइट्स में हीमोग्लोबिन में शामिल किया जाता है, और मैक्रोफेज द्वारा वृद्ध एरिथ्रोसाइट्स से पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। आयरन यकृत में जमा होता है जब अधिक मात्रा में होता है और रक्तस्राव या सेल स्लॉइंग के माध्यम से शरीर से खो जाता है। परिसंचरण में लोहे की मात्रा लोहे की खपत और आपूर्ति के बीच संतुलन का परिणाम है, बाद में हेपेटिक हार्मोन हेक्सिडिन (एचएएमपी) द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है, जो लोहे के होमियोस्टेसिस1 का केंद्रीय नियामक है। हेपसीडिन लोहे के निर्यातक फेरोपोर्टिन (एफपीएन) 2 को अवरुद्ध या प्रेरित करके रक्त में लोहे की जैव उपलब्धता को सीमित करने का कार्य करता है। कार्यात्मक एफपीएन में कमी से आहार लौह अवशोषण में कमी आती है, यकृत में लोहे का पृथक्करण होता है, और मैक्रोफेज1 से लोहे के पुनर्चक्रण में कमी आती है।

हेपसीडिन को लोहे की स्थिति, सूजन, एरिथ्रोपोइटिक ड्राइव और गर्भावस्था (3 में समीक्षा) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। यह देखते हुए कि लौह होमियोस्टैसिस अत्यधिक गतिशील है, कुल लोहे के पूल और लोहे के वितरण और कारोबार को समझना और मापना महत्वपूर्ण है। पशु अध्ययन पारंपरिक रूप से रेडियोधर्मी लोहे के आइसोटोप पर निर्भर थे, लोहे की गतिशीलता को मापने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील लेकिन बोझिल दृष्टिकोण। हालांकि, हाल के अध्ययनों में, यहां प्रस्तुत अध्ययन सहित4, गैर-रेडियोधर्मी, स्थिर लौह आइसोटोप (58 एफई) का उपयोग गर्भावस्था 5,6,7,8,9 के दौरान लोहे के परिवहन को मापने के लिए किया जाता है। स्थिर आइसोटोप पोषक तत्व चयापचय का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं (10 में समीक्षा की गई)। मानव अध्ययनों में स्थिर लोहे के आइसोटोप के उपयोग से पता चला है कि i) गर्भधारण के अंत में लोहे का अवशोषण बढ़जाता है 5,6, ii) भ्रूण को आहार लोहे का हस्तांतरण मातृ लोहे की स्थिति पर निर्भर है7, iii) मातृ रूप से निगला हुआ हीम आयरन नॉनहेम आयरन की तुलना में भ्रूण द्वारा अधिक आसानी से शामिल होता है8, और iv) भ्रूण में लोहे का हस्तांतरण मातृ हेपसीडिन स्तर8 के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध होता है। 9. इन प्रयोगों ने सेरा में लोहे के आइसोटोप या आरबीसी में उनके समावेश को मापा; हालांकि, अकेले आरबीसी में शामिल लोहे का माप वास्तविक लोहे के अवशोषण को कम कर सकताहै। वर्तमान अध्ययन में, हीम और नॉनहेम आयरन दोनों को ऊतकों में मापा जाता है।

गर्भावस्था के दौरान, मातृ लाल रक्त कोशिका की मात्रा के विस्तार का समर्थन करने और भ्रूण के विकास और विकास का समर्थन करने के लिए प्लेसेंटा में स्थानांतरण के लिए लोहे की आवश्यकता होतीहै। भ्रूण लौह बंदोबस्ती पूरी तरह से प्लेसेंटा में लोहे के परिवहन पर निर्भर है। मानव12 और कृंतक 4,13 गर्भावस्था के दौरान, हेक्सिडिन का स्तर नाटकीय रूप से कम हो जाता है, जिससे भ्रूण में स्थानांतरण के लिए प्लाज्मा आयरन की उपलब्धता बढ़ जाती है।

प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट के मूल सिद्धांतों को शुरू में 1950-70 के दशक में रेडियोधर्मी ट्रेसर (59एफई और 55एफई) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इन अध्ययनों ने निर्धारित किया कि प्लेसेंटा में लोहे का परिवहन यूनिडायरेक्शनल14,15 है और डिफेरिक ट्रांसफरिन प्लेसेंटा और भ्रूण16,17 के लिए लोहे का एक प्रमुख स्रोत है। प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट की वर्तमान समझ अधिक पूर्ण है, हालांकि कुछ प्रमुख लौह ट्रांसपोर्टर और नियामक तंत्र अज्ञात हैं। माउस मॉडल लोहे के विनियमन और परिवहन18 को समझने के लिए आवश्यक हैं क्योंकि प्रमुख ट्रांसपोर्टर और तंत्र उल्लेखनीय रूप से समान हैं। मानव और माउस प्लेसेंटा दोनों हेमोकोरियल हैं, अर्थात, मातृ रक्त भ्रूण कोरियन19 के सीधे संपर्क में है। हालांकि, कुछ उल्लेखनीय संरचनात्मक अंतर हैं।

सिंसाइटियोट्रोफोब्लास्ट प्लेसेंटल सेल परत है जो मातृ और भ्रूण परिसंचरण को अलग करती है और सक्रिय रूप से लोहे और अन्य पोषक तत्वोंका परिवहन करती है। मनुष्यों में, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट फ्यूज्ड कोशिकाओं की एक एकल परत है। इसके विपरीत, माउस प्लेसेंटा में दो सिंसाइटियोट्रोफोब्लास्ट परतें21, सिन-1 और सिन-II होती हैं। हालांकि, Syn-I और Syn-II के इंटरफ़ेस पर गैप जंक्शनपरतों 22,23 के बीच पोषक तत्वों के प्रसार की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, ये परतें मानव सिंसाइटियोट्रोफोब्लास्ट के समान एकल सिंसाइटियल परत के रूप में कार्य करती हैं। रोसेंट और क्रॉस21 द्वारा मानव और माउस प्लेसेंटा के बीच अतिरिक्त समानता और अंतर की समीक्षा की जाती है। प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट मातृ रक्त से ट्रांसफरिन रिसेप्टर (टीएफआर 1) में लोहे-टीएफ के बंधन से शुरू होता है, जो सिंसाइटियोट्रोफोब्लास्ट24 के एपिकल साइड पर स्थानीयकृत होता है। यह इंटरैक्शन क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस25 के माध्यम से आयरन-टीएफ / टीएफआर 1 आंतरिककरण को प्रेरित करता है। लोहे को तब अम्लीय एंडोसोम26 में टीएफ से जारी किया जाता है, एक अनिर्धारित फेरिरिडक्टेस द्वारा लौह लोहे में कम किया जाता है, और अभी तक निर्धारित ट्रांसपोर्टर द्वारा एंडोसोम से साइटोप्लाज्म में निर्यात किया जाता है। सिंसाइटियोट्रोफोब्लास्ट के भीतर लोहे को कैसे रखा जाता है, इसका भी वर्णन किया जाना बाकी है। लोहे को अंततः लोहे के निर्यातक, एफपीएन द्वारा भ्रूण की तरफ ले जाया जाता है, जो सिंसाइटियोट्रोफोब्लास्ट (27 में समीक्षा) की बेसल या भ्रूण-चेहरे वाली सतह पर स्थानीयकृत होता है।

यह समझने के लिए कि टीएफआर 1, एफपीएन और हेक्सिडिन का शारीरिक और पैथोलॉजिकल विनियमन प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट को कैसे प्रभावित करता है, स्थिर लोहे के आइसोटोप का उपयोग विवो4 में मातृ परिसंचरण से प्लेसेंटा और भ्रूण तक लोहे के परिवहन की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। यह पेपर गर्भवती चूहों को आइसोटोपिक आयरन-ट्रांसफरिन तैयार करने और प्रशासित करने, आईसीपी-एमएस के लिए ऊतकों के प्रसंस्करण और ऊतकों में लोहे की सांद्रता की गणना करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है। विवो में स्थिर लोहे के आइसोटोप का उपयोग फिजियोलॉजिकल और पैथोलॉजिकल आयरन विनियमन की जांच के लिए विभिन्न पशु मॉडल में लोहे के विनियमन और वितरण की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय लॉस एंजिल्स के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. 58Fe-Tf की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल 58Fe का उपयोग करता है; हालाँकि, 57Fe के लिए एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है। या तो आइसोटोप का उपयोग किया जा सकता है और अतिरिक्त सावधानी के बिना एक मानक लोहे के रसायन के रूप में निपटाया जा सकता है।

  1. 58 Fe के 50μL HCl/mg पर 12 N HCl में 58Fe को घोलें।
    1. विक्रेता द्वारा आपूर्ति की गई कांच की शीशी में धातु में एचसीएल जोड़ें, और टोपी को ढीले तरीके से बदलें। लोहे को भंग करने के लिए, 58Fe / HCl घोल को 1 घंटे के लिए 60 ° C तक गर्म करें। यदि अभी भी भंग नहीं हुआ है, तो घोल को घुलने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ दें।
      नोट: घुलित 58Fe / HCl समाधान पीले-नारंगी रंग का होता है।
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O
  2. Fe(III)Cl3 समाधान उत्पन्न करने के लिए किसी भी शेष Fe(II)Cl2 को ऑक्सीकरण करें।
    1. ऑक्सीकरण की सुविधा के लिए कैप ऑफ के साथ 58Fe / HCl समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. ऑक्सीकरण को और सुविधाजनक बनाने के लिए 58 Fe/HCl घोल के 35% H2O2 प्रति 50μL का 1 μL जोड़ें।
      Fe(II) Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III) Cl3(aq) + 2H2O
  3. फेरिक क्लोराइड (58Fe(III)Cl3) समाधान तैयार करें।
    1. नमूने को वाष्पित करने के लिए कैप ऑफ के साथ हुड में फेरिक क्लोराइड घोल को 60 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
      नोट: वाष्पीकरण में एक से कई दिन लग सकते हैं।
    2. अल्ट्राप्योर एच2ओ के साथ 58Fe (III) Cl3 से 100 mM का पुनर्गठन करें, और चरण 1.1 में उपयोग किए गए प्रारंभिक धातु वजन के आधार पर आवश्यक अल्ट्राप्योर H2O की मात्रा की गणना करें (58Fe (III) Cl3 का आणविक भार 162.2 है)।
  4. 20 mM NaHCO 3 की उपस्थिति में 1: 5 मोलर अनुपात पर NTA के साथ 58Fe (III) -नाइट्रिलोट्रिएसेटेट (NTA) तैयार करें।
    1. 1 NNAOH में 500 mM NTA तैयार करें।
    2. 5x transferrin-लोडिंग बफर (0.5 M HEPES, pH 7.5; 0.75 M NaCl) तैयार करें।
    3. अल्ट्राप्योर एच2ओ में 1 एम एनएएचसीओ3 तैयार करें।
    4. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में, 100 mM 58Fe (III) Cl3 समाधान (चरण 1.3.2 से) का 150 μL, 1 N NaOH में तैयार 500 mM NTA का 150 μL, अल्ट्राप्योर H2O का 480 μL, 5x ट्रांसफरिन लोडिंग बफर का 200 μL, और 1 M NaHCO3 समाधान का 20 μL जोड़ें।
    5. मिश्रण को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 58Fe(III)-NTA के साथ Apo-Tf लोड करें ताकि 58Fe-Tf बनाया जा सके।
    नोट: यह प्रोटोकॉल मैकार्थी और कोसमैन28 से अनुकूलित किया गया था।
    1. 1x Tf-लोडिंग बफर के 4 एमएल में 500 मिलीग्राम एपीओ-टीएफ को भंग करें।
    2. चरण 1.4.4 में 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 58Fe(III)-NTA समाधान का 1 mL है, 4 mL apo-Tf समाधान जोड़ें।
      नोट: यह एपीओ-टीएफ के साथ 58Fe-NTA का 3: 1 मोलर अनुपात है। प्रत्येक टीएफ में 2 एफई बाइंडिंग साइटें होती हैं; यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त 58Fe-NTA जोड़ा गया था कि Tf पूरी तरह से लोड किया गया था।
    3. एपीओ-टीएफ पर 58Fe-NTA की अधिकतम लोडिंग की अनुमति देने के लिए, जांचें कि समाधान pH 7.5 पर है, और यदि आवश्यक हो, तो NAHCO3 या HCl के साथ pH समायोजित करें।
    4. कमरे के तापमान पर 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. अतिरिक्त अनबाउंड 58Fe (III)-NTA को हटा दें और NTA जारी करें।
    1. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 58Fe-Tf समाधान को आणविक भार कटऑफ कॉलम (30 kDA कटऑफ) और सेंट्रीफ्यूज को 2,500 × ग्राम पर स्थानांतरित करें।
    2. कॉलम को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10 एमएल 1x ट्रांसफरिन-लोडिंग बफर और सेंट्रीफ्यूज को 2,500 × ग्राम पर धोएं। धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10 एमएल खारा के साथ एक खारा धोना करें, और सेंट्रीफ्यूज 2,500 × ग्राम पर करें।
  7. 58Fe-Tf की सांद्रता की गणना करें।
    नोट: चरण 1.5.2 में अतिरिक्त 58Fe के अतिरिक्त के कारण, मान लें कि सभी ट्रांसफरिन डाइफेरिक हैं। जैसा कि 500 मिलीग्राम एपीओ-टीएफ का उपयोग किया गया था, ~ 500 मिलीग्राम 58एफई-टीएफ चरण 1.5.4 में उत्पादित किया गया था।
    1. चरण 1.6.2 में खारा धोने के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन से पुनर्प्राप्त मात्रा को मापें।
    2. 58 Fe-Tf समाधान की एकाग्रता (mg/mL में) निर्धारित करने के लिए पुनर्प्राप्त मात्रा से 500mg को विभाजित करें।
  8. 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके 58Fe-Tf समाधान को निष्फल करें; उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 58Fe-Tf समाधान का उपयोग तैयारी के बाद 1 से 4 सप्ताह के बीच किया गया था।

2. समयबद्ध माउस गर्भधारण सेट करें

  1. 6- से 8 सप्ताह की मादा चूहों का उपयोग करें। संभोग से पहले 2 सप्ताह के लिए जानवरों को कम लोहे के आहार (4 पीपीएम लोहा) या मानक चाउ (185 पीपीएम लोहा) पर रखें और गर्भावस्था के दौरान संबंधित आहार पर जानवरों को बनाए रखें।
  2. विकल्प 01: E7.5 पर वजन बढ़ने से गर्भावस्था की पुष्टि करें।
    1. कई प्रजनन पिंजरों को स्थापित करें। प्रत्येक पिंजरे के लिए, रात भर 1 नर के साथ 2 मादाओं को मिलाएं; अगले दिन जब जानवरों को अलग किया जाता है तो भ्रूण दिवस (ई) 0.5 माना जाता है। गर्भवती होने का निर्धारण करने के लिए E7.5 पर महिलाओं का वजन करें। पुरुषों को फिर से उन महिलाओं के साथ संभोग करें जिनका वजन नहीं बढ़ा था।
      नोट: WT C57BL/6 में, E7.5 पर 1 ग्राम का वजन बढ़ना गर्भावस्था का एक अच्छा संकेतक है। यह विधि सुनिश्चित करती है कि आरोपण एक विशिष्ट 16 घंटे की समय सीमा के भीतर हुआ, जिससे सभी जानवरों के तुल्यकालिक उपचार की अनुमति मिलती है जो एक ही संभोग अवधि के दौरान गर्भवती हो गए थे।
  3. विकल्प 02: प्लग चेक द्वारा गर्भावस्था की पुष्टि करें।
    1. 2 महिलाओं को 1 पुरुष के साथ मिलाएं और यह निर्धारित करने के लिए दैनिक प्लग जांच करें कि क्या सहवास हुआ है।
      नोट: इस विधि के परिणामस्वरूप क्रमबद्ध गर्भधारण हो सकता है, और प्लग की उपस्थिति गर्भावस्था की गारंटी नहीं देती है।

3. ई 17.5 गर्भवती चूहों को अंतःशिरा रूप से 58Fe-Tf प्रशासित करें

  1. इंजेक्शन के लिए चरण 1.8 से 58Fe-Tf तैयार करें।
    1. खारा में 35मिलीग्राम / एमएल पर 58 Fe-Tf समाधान तैयार करें; प्रति माउस 100 μL इंजेक्ट करें।
    2. 58Fe-Tf समाधान के 100 μL के साथ एक इंसुलिन सिरिंज भरें।
      नोट: प्रत्येक खुराक में 3.5 मिलीग्राम मानव 58Fe-Tf ( 58Fe का 5 μg) होता है।
  2. आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके एक गर्भवती माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    1. एक कक्ष के साथ एक आइसोफ्लुरेन नियामक का उपयोग करें।
    2. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 5% आइसोफ्लुरेन, ओ 2 का2 एल / एमएल, 2 मिनट।
    3. पुष्टि करें कि पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी की तलाश करके माउस को एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
    4. आंख की सतह पर आंख स्नेहक लागू करें और माउस को हीटिंग पैड पर रखें।
  3. धीरे-धीरे और सावधानीपूर्वक रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस में 58Fe-Tf समाधान इंजेक्ट करें।
  4. माउस को संज्ञाहरण से ठीक होने दें; जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
  5. इंजेक्शन के छह घंटे बाद, आइसोफ्लुरेन ओवरडोज द्वारा ई 17.5 गर्भवती महिलाओं को इच्छामृत्यु दी जाती है।
    1. द्वितीयक इच्छामृत्यु के रूप में माउस को बाहर निकालने के लिए कार्डियक पंचर करें।
    2. स्थिरीकरण के लिए सुइयों के साथ पैरों को नीचे पिन करें।
  6. प्लेसेंटा और भ्रूण यकृत एकत्र करें।
    1. बाँझ बल और विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, गर्भवती माउस से गर्भाशय को सावधानीपूर्वक हटा दें। एक प्लेसेंटल भ्रूण-प्लेसेंटल यूनिट को काट दें, जिसमें गर्भाशय के एक हिस्से से घिरे एमनियोटिक थैली में एक एकल भ्रूण और प्लेसेंटा शामिल है।
    2. भ्रूण और प्लेसेंटा को परेशान किए बिना गर्भाशय और एमनियोटिक थैली के माध्यम से सावधानीपूर्वक काट लें।
    3. एमनियोटिक थैली को वापस छीलें और भ्रूण और प्लेसेंटा को हटा दें।
    4. गर्भनाल को काट लें।
    5. अतिरिक्त एमनियोटिक द्रव को हटाने के लिए एक साफ टास्क वाइप पर भ्रूण और प्लेसेंटा को ब्लोट करें।
    6. पूरे प्लेसेंटा के वजन को रिकॉर्ड करें।
    7. प्रत्येक प्लेसेंटा को रेजर ब्लेड के साथ आधे में काटें, प्रत्येक आधे को 2.0 एमएल ट्यूब में रखें, और तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें।
      नोट: क्योंकि 58Fe को विशेष हैंडलिंग सावधानियों और निपटान की आवश्यकता नहीं होती है, प्लेसेंटा के आधे हिस्से का उपयोग 58Fe माप के लिए और दूसरे आधे हिस्से का उपयोग किसी भी अन्य विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिसमें वेस्टर्न ब्लोटिंग और QPCR द्वारा ट्रांसफरिन रिसेप्टर (TFR1) और फेरोपोर्टिन (FPN) अभिव्यक्ति की मात्रा शामिल है।
    8. भ्रूण के यकृत को इकट्ठा करने के लिए, भ्रूण का त्याग करें: भ्रूण को तेजी से विघटित करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
      नोट: E17.5 पर, गर्भाशय में सभी भ्रूणों को व्यक्तिगत रूप से इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए, भले ही उनका उपयोग अध्ययन में नहीं किया गया हो।
    9. स्थिरीकरण के लिए भ्रूण को पिन करें, पेट को उजागर छोड़ दें।
    10. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, एक छोटा सा चीरा लगाएं जहां गर्भनाल जुड़ी हुई थी, विच्छेदन कैंची के एक छोर को चीरा में डालें, और कोरोनल विमान की ओर लगभग 1/4 इंच की औसत विमान कटौती करें। फिर, भ्रूण के जिगर को उजागर करने के लिए अनुप्रस्थ विमान कटौती करें।
    11. भ्रूण के जिगर को हटाने के लिए बल का उपयोग करें।
    12. पूरे भ्रूण यकृत के वजन को रिकॉर्ड करें।
    13. पूरे भ्रूण के यकृत को 2 एमएल ट्यूबों में रखें और उन्हें तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, भ्रूण यकृत के केवल एक हिस्से का उपयोग 58Fe माप के लिए किया जा सकता है यदि अतिरिक्त विश्लेषण वांछित हैं। 2.0 एमएल ट्यूबों का उपयोग 1.5 एमएल ट्यूबों की तुलना में बेहतर ऊतक समरूपीकरण की अनुमति देता है।
  7. ऊतकों को -80 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल तक स्टोर करें।

4. आईसीपी-एमएस द्वारा मात्रात्मक लोहे के विश्लेषण के लिए ऊतकों की प्रक्रिया

  1. नॉनहेम आयरन की मात्रा के लिए प्लेसेंटा और भ्रूण के यकृत को संसाधित करें।
    1. प्लेसेंटल हाफ और पूरे भ्रूण के यकृत को पिघलाएं, और प्लेसेंटल हाफ का वजन करें (भ्रूण के यकृत वजन को रिकॉर्ड करने के लिए चरण 3.6.12 देखें)।
    2. प्रोटीन वर्षा समाधान के 400 μL जोड़ें (0.53 N HCl, 5.3% TCA)।
    3. एक इलेक्ट्रिक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके ऊतक को समरूप करें।
    4. नमूनों को 1 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. नमूने को कमरे के तापमान के पानी में 2 मिनट के लिए ठंडा करें।
    6. दबाव छोड़ने के लिए कैप खोलें, फिर ट्यूबों को फिर से बंद करें।
    7. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 17,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पेलेट ऊतक मलबे के लिए।
    8. सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एक नए लेबल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    9. आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए नमूने भेजें।
  2. हीम-आयरन की मात्रा के लिए प्लेसेंटा और भ्रूण के यकृत को संसाधित करें।
    नोट: चरण 1 में नॉनहेम आयरन के निष्कर्षण के बाद, गोली में शेष लोहा मुख्य रूप से हीम है।
    1. चरण 4.1.7 से प्रत्येक गोली का वजन रिकॉर्ड करें।
    2. छर्रों को 10 एमएल में 70% HNO 3 में पचाएं, जिसे 30 % H2 O 2के 1 mL के साथ पूरक किया जाताहै
      नोट: विशिष्ट अध्ययनों के लिए एचएनओ3 की मात्रा को अनुकूलित करने के लिए आईसीपी-एमएस कोर या केंद्र से परामर्श करें; मात्रा आंशिक रूप से नमूना वजन पर निर्भर होगी।
    3. नमूने को 15 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    4. आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए नमूने भेजें।
      नोट: यदि हीम और नॉनहेम आयरन स्रोतों के बीच अंतर करने की आवश्यकता नहीं है और केवल कुल लोहे को मापा जाता है, तो पूरे ऊतक को पहले चरण के रूप में एचएनओ3 में पचाया जा सकता है।

5. डेटा विश्लेषण

नोट: आईसीपी-एमएस से डेटा एनजी / एमएल या मिलीग्राम, पीपीबी (तालिका 1) में 56एफई और 58एफई सांद्रता के रूप में प्रदान किया गया है। 56 फे प्रकृति में सबसे प्रचुर मात्रा में लौह आइसोटोप है, और इसका माप पूरी गर्भावस्था में प्लेसेंटा / भ्रूण में लोहे के संचय को दर्शाता है, जबकि 58एफई माप लोहे को दर्शाता है जो इंजेक्शन के बाद 6 घंटे के दौरान स्थानांतरित किया गया था।

  1. मापा गया58 Fe मानों से 58Fe (कुल Fe का 0.28%) की प्राकृतिक प्रचुरता घटाएं।
  2. कुल नॉनहेम 58एफई की गणना करें।
    1. भ्रूण यकृत कुल नॉनहेम आयरन (एनजी) की गणना पहले चरण 4.1.2 में प्रारंभिक प्रसंस्करण के दौरान मात्रा (एमएल) से चरण 5.1 में गणना की गई लोहे की एकाग्रता (एनजी / एमएल) को गुणा करके कुल 58एफई का अनुमान लगाने के लिए की जाती है।
    2. चरण 3.6.6 में मापा गया प्लेसेंटा के कुल वजन को लेकर और इसे चरण 4.1.1 में संसाधित प्लेसेंटा के वजन से विभाजित करके पूरे प्लेसेंटा में लोहे की मात्रा की गणना करें। प्लेसेंटा की कुल नॉनहेम 58एफई सामग्री प्राप्त करने के लिए चरण 5.2.1 में गणना की गई कुल नॉनहेम आयरन (एनजी) से इस मान को गुणा करें।
  3. कुल हेम 58Fe की गणना करें।
    1. चरण 5.1 में गणना की गई लोहे की सांद्रता (एनजी/मिलीग्राम) को चरण 4.2.1 में मापे गए पेलेट (मिलीग्राम में) के वजन से गुणा करके कुल हीम 58Fe की गणना करें।
    2. फिर, चरण 3.5.1 में मापा गया प्लेसेंटा के कुल वजन को चरण 4.2.1 में मापा गया प्लेसेंटा गोली के वजन से विभाजित करें। प्लेसेंटा की कुल हीम 58एफई सामग्री प्राप्त करने के लिए चरण 5.3.1 में गणना की गई कुल हीम आयरन (एनजी) से इस मान को गुणा करें।
  4. प्रत्येक ऊतक के लिए कुल लोहे की सामग्री निर्धारित करने के लिए गणना किए गए नॉनहेम और हीम 58एफई मानों को सारांशित करें।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल में चरणों का दृश्य सारांश। (A) 58Fe-transferrin की तैयारी। (बी) 58फे-ट्रांसफरिन के विवो प्रशासन में। (सी) ऊतक संग्रह और भंडारण। (घ) आईसीपी-एमएस द्वारा धातु प्रजातियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्लेसेंटा और भ्रूण यकृत का प्रसंस्करण। संक्षेप: Fe = लोहा; एनटीए = नाइट्रिलोट्रिएसिटिक एसिड; टीएफ = ट्रांसफरिन; पीपीएस = प्रोटीन वर्षा समाधान; सूप = सतह पर तैरनेवाला; टीसीए = ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड; आईसीपी-एमएस = अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

लोहे के परिवहन को मापने के लिए स्थिर लोहे के आइसोटोप का उपयोग करने वाले एक पहले के अध्ययन से पता चला है कि मातृ लोहे की कमी के परिणामस्वरूप प्लेसेंटा आयरन निर्यातक, एफपीएन4 का डाउनरेग्यूलेशन हुआ। एफपीएन एकमात्र ज्ञात स्तनधारी लोहा निर्यातक है, और विकास के दौरान एफपीएन की अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप ई 9.5 29 से पहले भ्रूण की मृत्यु होजाती है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एफपीएन अभिव्यक्ति में देखी गई कमी कार्यात्मक रूप से प्लेसेंटल आयरन परिवहन में कमी के लिए अनुवादित है, 58एफई-टीएफ को गर्भवती बांधों में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया था, और प्लेसेंटा और भ्रूण में लोहे को मातृ लोहे की कमी की उपस्थिति में परिमाणित किया गया था।

यह समझने के लिए कि मातृ लोहे की स्थिति से प्लेसेंटल आयरन परिवहन कैसे प्रभावित होता है, चूहों में लोहे की कमी का मॉडल तैयार किया गया था। मादा सी 57बीएल /6 चूहों को गर्भावस्था से पहले और पूरे 2 सप्ताह के लिए कम लोहे के आहार (4 पीपीएम लोहा) या मानक चाउ (185 पीपीएम लोहा) पर रखा गया था। इस आहार आहार के परिणामस्वरूप मानक आहार 4 पर जानवरों की तुलना में ई 12.5, ई 15.5 और ई 18.5 पर कम मातृ यकृत नॉनहेम आयरन और सीरम आयरन और हीमोग्लोबिन होताहै। ई 18.5 पर, लोहे की कमी वाली माताओं के भ्रूण में कम यकृत लोहा था और लोहे से परिपूर्ण माताओं के भ्रूण की तुलना में हाइपोफेरेमिक और एनीमिक थे। लोहे से परिपूर्ण और लौह की कमी वाले समूहों में से प्रत्येक में तीन गर्भवती चूहों का उपयोग किया गया था, और विश्लेषण के लिए प्रत्येक गर्भवती माउस से 2-3 प्लेसेंटा का उपयोग किया गया था।

प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 58फे-ट्रांसफरिन तैयार किए गए और गर्भवती बांधों में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किए गए और आईसीपी-एमएस द्वारा प्लेसेंटा और भ्रूण के यकृत में 58एफई मापा गया, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है और चित्रा 1 में चित्रित किया गया है। आईसीपी-एमएस विश्लेषण के लिए नॉनहेम आयरन के नमूने भेजने से पहले, कुल नॉनहेम आयरन के स्तर को स्वतंत्र रूप से30 से वर्णित एक फेरेन विधि के माध्यम से निर्धारित किया गया था। फेरेन बनाम आईसीपी-एमएस विधियों द्वारा मापा गया नॉनहेम आयरन सांद्रता मापा गया सभी ऊतकों में अत्यधिक महत्वपूर्ण रूप से सहसंबद्ध था (आर2 = 0.94, पी < 0.0001, एन = 36)। लोहे के आइसोटोप के आईसीपी-एमएस मात्रा के प्रतिनिधि परिणाम तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। प्रोटोकॉल के चरण 5 में वर्णित के रूप में कुल 58एफई की गणना की गई थी। डेटा को हीम या नॉनहेम आयरन (चित्रा 2 ए-डी) के बजाय कुल के रूप में प्रस्तुत किया जाता है क्योंकि इसका उद्देश्य प्लेसेंटा में स्थानांतरित कुल लोहे और प्लेसेंटा से भ्रूण में स्थानांतरित कुल लोहे की मात्रा निर्धारित करना था।

औसतन, प्रशासित 58एफई खुराक का 21% प्लेसेंटा, भ्रूण यकृत और भ्रूण सीरम में संयुक्त रूप से बरामद किया गया था। 56एफई माप गर्भावस्था के दौरान प्लेसेंटा और भ्रूण यकृत में दीर्घकालिक लौह हस्तांतरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। कुल प्लेसेंटल 56एफई लोहे की कमी वाले और -परिपूर्ण समूहों (चित्रा 2 ए) में समान था, जबकि लोहे की कमी वाले समूह (चित्रा 2 बी) में कुल भ्रूण यकृत लोहा कम हो गया था। यह लोहे की कमी वाले समूह4 में प्लेसेंटल एफपीएन में देखी गई कमी के आधार पर अपेक्षित था, जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण की कीमत पर प्लेसेंटा में लौह प्रतिधारण होगा। कुल 58एफई अल्पकालिक लौह परिवहन का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। इस अध्ययन में, 56Fe के समान, प्लेसेंटल 58Fe लोहे की कमी और -परिपूर्ण समूहों (चित्रा 2 सी) दोनों में समान था, और भ्रूण यकृत 58एफई लोहे की कमी वाले समूह (चित्रा 2 डी) में कम हो गया था। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि लोहे की कमी वाली गर्भावस्था के दौरान, प्लेसेंटल एफपीएन के डाउनरेग्यूलेशन के परिणामस्वरूप भ्रूण में लोहे के परिवहन में कमी आती है, जिससे प्लेसेंटा और भ्रूण में लोहे की सामग्री में संचयी अंतर होता है।

प्रशासित लोहे की खुराक पर विचार करना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे हेक्सिडिन एकाग्रता या लौह ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति31 में अनपेक्षित परिवर्तन हो सकते हैं। यह प्रदर्शित किया गया था कि मातृ लोहे की कमी से प्लेसेंटल एफपीएन4 में कमी आई। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या Fe-Tf इंजेक्शन ने इस विनियमन को प्रभावित किया है, प्लेसेंटा FPN को पश्चिमी धब्बा द्वारा इंजेक्शन के 6 घंटे बाद मापा गया था। मातृ लोहे की कमी से प्लेसेंटल एफपीएन विनियमन को बदलने के लिए 5 μg की लोहे की खुराक अपर्याप्त थी (चित्रा 3)।

सारांश में, इस विधि का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि मातृ लोहे की कमी के दौरान प्लेसेंटल एफपीएन के शारीरिक विनियमन के परिणामस्वरूप विवो में प्लेसेंटा में लोहे के परिवहन में कमी आई है। स्थिर लोहे के आइसोटोप लोहे के परिवहन और वितरण के माप के लिए रेडियोधर्मिता का एक संवेदनशील और मात्रात्मक विकल्प प्रदान करते हैं, जिससे अतिरिक्त विश्लेषण के लिए ऊतकों के एक साथ उपयोग की अनुमति मिलती है।

Figure 2
चित्र 2: आयरन की कमी या लोहे से परिपूर्ण गर्भधारण में प्लेसेंटा के पार 56एफई और 58एफई परिवहन। प्लेसेंटा (ए) और भ्रूण यकृत (बी) में कुल 56एफई। प्लेसेंटा (सी) और भ्रूण यकृत (डी) में कुल 58एफई। सांख्यिकीय विश्लेषण सामान्य रूप से वितरित मूल्यों के लिए 2-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था और अन्यथा मैन-व्हिटनी यू रैंक-सम टेस्ट (पी-वैल्यू के बाद तारांकन द्वारा चिह्नित) द्वारा किया गया था। जानवरों की संख्या बॉक्स और मूंछ भूखंडों के एक्स-अक्षों में इंगित की गई है। बॉक्स प्लॉट का ऊपरी हिस्सा 75वें प्रतिशत को इंगित करता है, और निचला 25वें प्रतिशत को इंगित करता है; बॉक्स के ऊपर मूंछें 90वें प्रतिशत को इंगित करती हैं, और बॉक्स के नीचे के लोग 10वें प्रतिशत को इंगित करते हैं। बॉक्स के भीतर ठोस रेखा माध्य को इंगित करती है और धराशायी रेखा माध्य को इंगित करती है। सांख्यिकीय विश्लेषण वैज्ञानिक ग्राफिंग और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। इस आंकड़े को4 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त नाम: Fe = लोहा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए) टीएफआर 1 और एफपीएन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पश्चिमी धब्बा द्वारा लोहे की कमी और -परिपूर्ण प्लेसेंटा में 58एफई-टीएफ के साथ माताओं के उपचार के 6 घंटे बाद किया गया था। (बी) प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की गई थी और β-एक्टिन के सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति के रूप में प्रस्तुत किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण सामान्य रूप से वितरित मूल्यों के लिए 2-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। जानवरों की संख्या बॉक्स और मूंछ भूखंडों के एक्स-अक्षों में इंगित की गई है। बॉक्स प्लॉट का ऊपरी हिस्सा 75वें प्रतिशत को इंगित करता है, और निचला 25वें प्रतिशत को इंगित करता है; बॉक्स के ऊपर मूंछें 90वें प्रतिशत को इंगित करती हैं, और बॉक्स के नीचे के लोग 10वें प्रतिशत को इंगित करते हैं। बॉक्स के भीतर ठोस रेखा माध्य को इंगित करती है और धराशायी रेखा माध्य को इंगित करती है। सांख्यिकीय विश्लेषण वैज्ञानिक ग्राफिंग और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। इस आंकड़े को4 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: टीएफआर 1 = ट्रांसफरिन रिसेप्टर; एफपीएन = फेरोपोर्टिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना 56 Fe 58 Fe Total Fe
एकाग्रता [एनजी / एमएल या मिलीग्राम, पीपीबी] एकाग्रता [एनजी / एमएल या मिलीग्राम, पीपीबी] आइसोटोप का योग [एनजी / एमएल या मिलीग्राम]
औसत* stdev औसत* stdev
नॉनहेम आयरन गर्भनाल आयरन की कमी 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
लोहे से परिपूर्ण 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
हीम गर्भनाल आयरन की कमी 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
लोहे से परिपूर्ण 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
नॉनहेम आयरन भ्रूण यकृत आयरन की कमी 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
लोहे से परिपूर्ण 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
हीम भ्रूण यकृत आयरन की कमी 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
लोहे से परिपूर्ण 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

तालिका 1: प्लेसेंटा और भ्रूण यकृत में 56एफई और 58 एफई की आईसीपी-एमएस मात्रा के प्रतिनिधि परिणाम। संक्षेप: पीपीबी = भाग प्रति बिलियन; stdev = मानक विचलन; आईसीपी-एमएस = अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री।

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Discussion

लोहा कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है, और शरीर के भीतर इसकी गति और वितरण अत्यधिक गतिशील और विनियमित हैं। स्थिर लौह आइसोटोप लोहे के होमियोस्टैसिस की गतिशीलता के आकलन के लिए रेडियोधर्मी आइसोटोप के लिए एक सुसंगत और सुविधाजनक विकल्प प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम सभी ऊतक भार और मात्रा का ट्रैक रखना है। लोहा एक तत्व है और इसलिए इसे संश्लेषित नहीं किया जा सकता है और न ही तोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, यदि सभी वजन और वॉल्यूम सावधानीपूर्वक लॉग किए जाते हैं, तो सिस्टम के भीतर सभी लोहे को गणना द्वारा हिसाब दिया जा सकता है। जैसा कि वर्णित है, इस विधि का उपयोग हीम और नॉनहेम लौह स्रोतों के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यदि लोहे के रूपों के बीच यह अंतर आवश्यक नहीं है और केवल कुल लोहे को मापा जाता है, तो प्रोटोकॉल चरण 4.2 में वर्णित केवल केंद्रित एचएनओ3 के साथ ऊतक का इलाज करके प्रोटोकॉल को सरल बनाया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यदि विश्लेषण से पहले ऊतकों को संक्रमित नहीं किया जाता है, विशेष रूप से प्लेसेंटा जैसे अत्यधिक संवहनी ऊतक, तो रक्त की उपस्थिति के परिणामस्वरूप ऊतक हीम आयरन सामग्री की अतिवृद्धि हो सकती है।

अध्ययन के लिए ट्रांसफरिन-बाउंड आयरन का चयन किया गया था क्योंकि यह प्लेसेंटा16,17 द्वारा लिए गए लोहे का प्रमुख स्रोत है। चूहों में टीएफआर 1 के वैश्विक वध के परिणामस्वरूप ई 12.5 से पहले भ्रूण की घातकता हुई, यह सुझाव देते हुए कि विकास के लिए ट्रांसफरिन-बाध्य लोहा महत्वपूर्ण है। यह संभव है कि अन्य लौह प्रजातियां, जैसे फेरिटिन और नॉनट्रांसफेरिन बाउंड आयरन (एनटीबीआई), कुछ हद तक भ्रूण के लोहे के बंदोबस्त में भी योगदान करती हैं। हालांकि, इन वैकल्पिक लौह प्रजातियों के योगदान का आकलन नहीं किया गया था। भविष्य में, स्थिर आइसोटोप का उपयोग विकास और भ्रूण लौह बंदोबस्ती के लिए विभिन्न लौह स्रोतों के योगदान को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

अध्ययन का उद्देश्य प्लेसेंटल आयरन ट्रांसपोर्ट पर मातृ लोहे की स्थिति में परिवर्तन के प्रभावों को निर्धारित करना था। हालांकि, लोहे की कमी के दौरान हेक्सिडिन में कमी के परिणामस्वरूप एंटरोसाइट एफपीएन का स्तर बढ़ जाता है और परिसंचरण में लोहे का परिवहन बढ़जाता है। इस प्रकार, लोहे की कमी वाले बांधों में, आहार से लोहे का अवशोषण स्वाभाविक रूप से बढ़ गया होगा और परिणामों की अस्पष्ट व्याख्या होगी यदि 58एफई को मौखिक रूप से प्रशासित किया गया था। इस प्रकार, 58Fe-Tf के अंतःशिरा प्रशासन का चयन किया गया था क्योंकि यह आंतों के अवशोषण के स्तर पर लोहे के विनियमन को बायपास करता है। 58 Fe/mouse की 5μg की खुराक का चयन लोहे से परिपूर्ण E18.5 गर्भवती बांधों के सीरम आयरन सांद्रता के आधार पर किया गया था। जंगली प्रकार के C57BL/6 E18.5 गर्भवती बांधों में, सीरम आयरन सांद्रता 10 से 50 μM4 तक होती है। एक गर्भवती E18.5 माउस में कुल रक्त की मात्रा32 का लगभग 2 एमएल होने की उम्मीद है। इस प्रकार, लोहे से परिपूर्ण गर्भवती बांधों के संचलन में लोहे की कुल मात्रा 1.1 से 5.6 μg तक होती है। इस प्रकार, 58Fe / माउस का 5 μg लोहे से परिपूर्ण जानवरों में देखी गई शारीरिक सांद्रता के बराबर है।

58Fe के ICP-MS का पता लगाने की एक सीमा 58Ni से आइसोबेरिक हस्तक्षेप है। माउस प्लेसेंटा में अंतर्जात नी सांद्रता 0.04 ± 0.02 μg / g गीला वजन33 है। एक औसत ई 18.5 माउस प्लेसेंटा का वजन 0.080 ग्राम है; इसलिए, Ni की कुल मात्रा लगभग 3.2 ng है। 58नी की प्राकृतिक प्रचुरता 68% है; इस प्रकार, माउस प्लेसेंटा में 58नी की मात्रा ~ 2.2 एनजी है, जो पता लगाए गए 58एफई स्तरों की तुलना में लगभग 10 गुना कम है। भ्रूण में, नी सांद्रता 0.01 ± 0.01 μg / g गीले वजन33 पर भी कम होती है। औसत ई 18.5 माउस भ्रूण का वजन 1 ग्राम है; इस प्रकार, एक सामान्य माउस भ्रूण में नी की कुल मात्रा लगभग 10 एनजी है। यह मानते हुए कि सभी भ्रूण नी भ्रूण यकृत में पाए जाते हैं, ये स्तर अभी भी 58एफई सांद्रता की तुलना में 10 गुना कम हैं और कुल भ्रूण यकृत लौह सामग्री की तुलना में लगभग 1,000 गुना कम हैं। इन माउस ऊतकों में नी की कम प्रचुरता को देखते हुए, इस अध्ययन में 58नी हस्तक्षेप को शामिल नहीं किया गया था।

एक अतिरिक्त विचार परख की पहचान की सीमा है। इस अध्ययन में पता लगाने की सीमा 250 pg / mL 58Fe थी। हालांकि, इस सीमा को 58Fe की कम सांद्रता का पता लगाने के लिए बदला जा सकता है यदि ऊतक प्रसंस्करण चरण (प्रोटोकॉल चरण 4.1.2 और चित्रा 1 डी) पर या आईसीपी-एमएस कोर सुविधा में संशोधनों के माध्यम से ऊतकों का कमजोर पड़ना कम हो जाता है। जब पूरे भ्रूण में 58Fe मापा गया, तो इसके स्तर का पता नहीं चला क्योंकि 58Fe एकाग्रता पहचान की सीमा से नीचे थी। हालांकि, भ्रूण के यकृत में 58एफई का पता चला था, जो प्राथमिक लौह भंडारण अंग है। यह संभव है कि 58Fe की बड़ी खुराक के प्रशासन ने पूरे भ्रूण में भी 58Fe का पता लगाने की अनुमति दी होगी। हालांकि, प्लेसेंटा के लौह-लोडिंग से बचने के लिए 58एफई की अपेक्षाकृत कम मात्रा का उपयोग किया गया था, जो प्रतिक्रिया तंत्र को ट्रिगर कर सकता है और लोहे के ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को बदल सकता है। इस मॉडल में, जिसमें जंगली प्रकार के सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग किया गया था, भ्रूण यकृत लोहे को कुल प्लेसेंटल आयरन परिवहन के प्रतिबिंब के रूप में मापा गया था, क्योंकि भ्रूण यकृत लौह एकाग्रता पूरे भ्रूण लोहे की एकाग्रताके आनुपातिक है। हालांकि, माउस मॉडल में जहां लोहे के वितरण को बदल दियाजाता है, भ्रूण यकृत लोहा अकेले कुल प्लेसेंटल आयरन परिवहन का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। ऐसे मामलों में, पूरे भ्रूण या एरिथ्रोसाइट डिब्बे में शामिल लोहे को मापना आवश्यक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक समय बिंदुओं में भिन्नता के लिए विभिन्न भ्रूण डिब्बों में लोहे के आगे अनुकूलन और माप की भी आवश्यकता होगी। माउस गर्भावस्था के दौरान लोहे के परिवहन को मापने के लिए इस स्थिर आइसोटोप ट्रेसिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। कार्यप्रणाली आसानी से गैर-गर्भवती चूहों और अन्य पशु मॉडल में लोहे के परिवहन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है।

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Disclosures

ईएन आंतरिक जीवन विज्ञान और सिलारस फार्मा के वैज्ञानिक सह-संस्थापक हैं और नायक, विफोर, रैलीबायो, आयोनिस, शील्ड थेरेप्यूटिक्स और डिस्क मेडिसिन के लिए एक सलाहकार हैं। वीएस कोई संघर्ष घोषित नहीं करता है।

Acknowledgments

लेखक यूसीएलए में सीएनएसआई में नैनो टेक्नोलॉजी के पर्यावरणीय निहितार्थ के लिए यूसी सेंटर के भीतर आईसीपी-एमएस सुविधा के उपयोग को स्वीकार करते हैं ताकि 58एफई माप के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में उनकी सहायता हो सके। अध्ययन एनआईएच नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) (के01डीके127004, टू वीएस) और एनआईएच नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट (एनआईसीएचडी) (आर01एचडी096863, ईएन) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

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References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
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जीव विज्ञान अंक 183
नॉनरेडियोएक्टिव आयरन आइसोटोप का उपयोग करके <em>विवो में</em> माउस प्लेसेंटा के पार आयरन ट्रांसपोर्ट की मात्रा निर्धारित करना
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Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

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