Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

מאמר זה מדגים כיצד להכין ולנהל ברזל איזוטופי לא-רדיואקטיבי הקשור לטרנספרין למחקרים על הובלת ברזל בהריון עכבר. כמו כן מתוארת הגישה לכימות ברזל איזוטופי בתאי fetoplacental.

Abstract

ברזל חיוני לבריאות האם והעובר במהלך ההריון, כאשר כ-1 גרם ברזל דרושים בבני אדם כדי לקיים הריון בריא. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהעברת ברזל על פני השליה, והפרעות בהעברה זו עלולות להוביל לתוצאות הריון שליליות. בעכברים, מדידת שטפי הברזל על פני השליה הסתמכה באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה. איזוטופים יציבים מברזל (57 Fe ו-58Fe) מציעים חלופה לא-רדיואקטיבית לשימוש במחקרי הריון אנושי.

בתנאים פיזיולוגיים, ברזל הקשור לטרנספרין הוא הצורה השלטת של ברזל שנלקחה על ידי השליה. לפיכך, 58Fe-transferrin הוכן והוזרק לווריד בסכרים בהריון כדי להעריך ישירות את הובלת ברזל השליה ולעקוף את ספיגת הברזל במעיים האימהיים כמשתנה מבלבל. ברזל איזוטופי היה כמותי ברקמות עובריות של השליה והעכברים על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). ניתן להשתמש בשיטות אלה גם במערכות אחרות של מודלים של בעלי חיים של פיזיולוגיה או מחלות כדי לכמת את דינמיקת הברזל in vivo .

Introduction

ברזל חיוני לתהליכים מטבוליים שונים, כולל גדילה והתפתחות, ייצור אנרגיה והובלת חמצן1. תחזוקה של הומאוסטזיס ברזל הוא תהליך דינמי ומתואם. ברזל נספג מהמזון בתריסריון ומועבר ברחבי הגוף במחזור הדם הקשור להעברת חלבון הובלת הברזל (Tf). הוא מנוצל על ידי כל תא לתהליכים אנזימטיים, משולב בהמוגלובין באריתרוציטים מתהווים, וממוחזר מאריתרוציטים מיושנים על ידי מקרופאגים. ברזל מאוחסן בכבד כאשר עודף ואבד מהגוף באמצעות דימום או sloughing התא. כמות הברזל במחזור היא תוצאה של האיזון בין הצריכה לבין אספקת הברזל, האחרון להיות מוסדר היטב על ידי הורמון הכבד hepcidin (HAMP), הרגולטור המרכזי של ברזל הומאוסטזיס1. הפצידין מתפקד כדי להגביל את הזמינות הביולוגית של ברזל בדם על ידי חסימה או גרימת יוביקוויטין והשפלת יצואנית הברזל פרופורטין (FPN)2. הפחתה ב-FPN התפקודי מובילה לירידה בספיגת ברזל בתזונה, לפירוק ברזל בכבד ולירידה במיחזור ברזל ממקרופאגים1.

הפצידין מווסת על ידי מצב ברזל, דלקת, דחף אריתרופויטי והריון (נבדק ב -3). בהתחשב בכך שהומאוסטזיס ברזל הוא דינמי מאוד, חשוב להבין ולמדוד את סך מאגר הברזל ואת התפלגות הברזל ותחלופתו. מחקרים בבעלי חיים הסתמכו באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה למדידת הדינמיקה של ברזל. עם זאת, במחקרים עדכניים יותר, כולל המחקר המוצג כאן4, איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי ויציב (58Fe) משמשים למדידת הובלת ברזל במהלך ההריון 5,6,7,8,9. איזוטופים יציבים הם כלים חשובים לחקר חילוף החומרים של חומרים מזינים (נבדקו ב-10). השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל במחקרים בבני אדם הראה כי 1) ספיגת הברזל עולה לקראת סוף ההיריון5,6, ii) העברת ברזל תזונתי לעובר תלויה במצב הברזל האימהי7, 3) ברזל heme שנבלע אימהי משולב בקלות רבה יותר על ידי העובר מאשר ברזל nonheme 8, ו- 4) העברת ברזל לעובר מתואמת שלילית עם רמות hepcidin אימהי 8, 9. ניסויים אלה מדדו איזוטופים של ברזל בסרה או שילובם ב-RBCs; עם זאת, מדידה של ברזל המשולב ב-RBCs בלבד עלולה לזלזל בספיגת ברזלאמיתית 9. במחקר הנוכחי, הן heme והן ברזל nonheme נמדדים ברקמות.

במהלך ההריון, ברזל נדרש כדי לתמוך בהרחבת נפח תאי הדם האדומים האימהיים ולהעברה על פני השליה כדי לתמוך בגדילה ובהתפתחות של העובר11. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהובלת ברזל על פני השליה. במהלך הריון12 אנושי ומכרסם 4,13, רמות ההפצידין יורדות באופן דרמטי, מה שמגדיל את זמינות ברזל הפלזמה להעברה לעובר.

היסודות של הובלת ברזל שליה אופיינו בתחילה בשנות החמישים וה -70 באמצעות עקבות רדיואקטיביים (59Fe ו 55Fe). מחקרים אלה קבעו כי שינוע הברזל על פני השליה הואחד-כיווני 14,15 וכי טרנספרין דיפרי הוא מקור עיקרי לברזל עבור השליה והעובר16,17. ההבנה הנוכחית של הובלת ברזל שליה שלמה יותר, אם כי כמה מובילי ברזל מרכזיים ומנגנוני ויסות עדיין לא ידועים. מודלים של עכברים היו חיוניים להבנת ויסות ברזל ותעבורה18 מכיוון שהמובילים והמנגנונים המרכזיים דומים להפליא. הן השליה האנושית והן השליה העכברית הן המוכוריאליות, כלומר, הדם האימהי נמצא במגע ישיר עם כוריון העובר19. עם זאת, ישנם כמה הבדלים מבניים בולטים.

ה- syncytiotrophoblast היא שכבת תאי השליה המפרידה בין מחזור הדם האימהי והעוברי ומעבירה באופן פעיל ברזל וחומרים מזינים אחרים20. בבני אדם, הסינקטיוטרופובלסט הוא שכבה אחת של תאים מתמזגים. לעומת זאת, שליית העכבר מורכבת משתי שכבות סינכטיוטרופובלסט21, Syn-I ו- Syn-II. עם זאת, צמתי מרווחים בממשק של Syn-I ו- Syn-II מאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים בין שכבות22,23. לפיכך, שכבות אלה מתפקדות כשכבה סינסיטיאלית אחת הדומה לסינכטיוטרופובלסט האנושי. קווי דמיון והבדלים נוספים בין שליה אנושית לעכבר נבדקים על ידי Rossant ו- Cross21. הובלת ברזל שליה מופעלת על ידי קשירת ברזל-Tf מדם אימהי לקולטן טרנספרין (TfR1) הממוקם בצד האפיקלי של הסינכטיוטרופובלסט24. אינטראקציה זו גורמת להפנמה של ברזל-Tf/TfR1 באמצעות אנדוציטוזה בתיווך קלתרין25. לאחר מכן הברזל משתחרר מ-Tf באנדוזום26 החומצי, מצטמצם לברזל ברזלי על ידי פרירדוקטאז שלא נקבע, ומיוצא מהאנדוזום לציטופלסמה על ידי טרנספורטר שטרם נקבע. כיצד ברזל מלווה בתוך syncytiotrophoblast גם נשאר לתאר. ברזל מועבר בסופו של דבר לצד העוברי על ידי יצואן הברזל, FPN, הממוקם על פני השטח הבסיסיים או העובריים של הסינסיטיוטרופובלסט (נבדק ב-27).

כדי להבין כיצד ויסות פיזיולוגי ופתולוגי של TfR1, FPN והפצידין משפיע על הובלת ברזל שליה, נעשה שימוש באיזוטופים של ברזל יציב כדי לבצע הובלת ברזל כמותית ממחזור הדם האימהי אל השליה והעובר in vivo4. מאמר זה מציג את השיטות להכנה ולמתן איזוטופי של ברזל-טרנספרין לעכברות הרות, עיבוד רקמות עבור ICP-MS וחישוב ריכוזי הברזל ברקמות. ניתן להתאים את השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל in vivo כדי לחקור ויסות ופיזור ברזל במודלים שונים של בעלי חיים כדי לחקור ויסות ברזל פיזיולוגי ופתולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים והנהלים הניסיוניים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.

1. הכנת 58Fe-Tf

הערה: הפרוטוקול משתמש ב- 58Fe; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זהה עבור 57Fe. ניתן להשתמש בכל אחד מהאיזוטופים ולהשליך אותם ככימיקל ברזל סטנדרטי ללא אמצעי זהירות נוספים.

  1. יש להמיס 58 Fe ב-12 N HCl ב-50 μL של HCl/מ"ג של 58Fe.
    1. הוסיפו HCl למתכת בבקבוקון הזכוכית שסופק על ידי הספק, והחליפו את המכסה באופן רופף. כדי להמיס את הברזל, יש לחמם את תמיסת 58Fe/HCl ל-60°C למשך שעה אחת. אם עדיין לא מומס, השאירו את התמיסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר במכסה האדים כדי להתמוסס.
      הערה: תמיסת 58Fe/HCl מומסת בצבע כתום-צהבהב.
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2 O
  2. חמצנו את כל Fe(II)Cl2 הנותר כדי ליצור את תמיסת Fe(III)Cl3 .
    1. חממו את תמיסת 58Fe/HCl ל-60°C כשהמכסה כבוי כדי להקל על החמצון.
    2. יש להוסיף 1 μL של 35% H2 O2 לכל 50 μL של תמיסת 58Fe/HCl כדי להקל עוד יותר על החמצון.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. הכן את תמיסת ברזל כלוריד (58Fe(III)Cl3).
    1. השאירו את תמיסת הברזל כלוריד במכסה המנוע בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס כשהמכסה כבוי כדי לאדות את הדגימה.
      הערה: האידוי עשוי להימשך בין יום אחד למספר ימים.
    2. צור מחדש 58 Fe(III)Cl 3 עד 100 mM עם Ultrapure H 2 O, וחשב את כמות האולטרה-טהור H 2 O הנדרשת בהתבסס על משקל המתכת הראשוני המשמש בשלב 1.1 (משקל מולקולרי של 58 Fe(III)Cl3 הוא 162.2).
  4. הכן 58 Fe(III)-nitrilotriacetate (NTA) על ידי דגירה 58Fe(III)Cl 3 עם NTA ביחס טוחן 1:5 בנוכחות 20 mM NaHCO3.
    1. הכן 500 mM NTA ב 1 N NaOH.
    2. הכן 5x מאגר טעינה טרנספרין (0.5 M HEPES, pH 7.5; 0.75 M NaCl).
    3. הכן 1 M NaHCO3 ב-H2O אולטרה-טהור.
    4. לצינור חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 150 μLשל 100 mM 58 Fe(III)Cl 3 פתרון (משלב 1.3.2), 150 μL של 500 mM NTA מוכן ב 1 N NaOH, 480 μL של ultrapure H2O, 200 μL של 5xמאגר טעינה טרנספרין, ו 20 μLשל 1 M NaHCO 3 פתרון.
    5. דוגרים את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. טען apo-Tf עם 58 Fe(III)-NTA כדי ליצור 58Fe-Tf.
    הערה: פרוטוקול זה הותאם ממקארתי וקוסמן28.
    1. יש להמיס 500 מ"ג של apo-Tf ב-4 מ"ל של מאגר טעינת Tf אחד.
    2. לצינור החרוטי של 15 מ"ל בשלב 1.4.4 המכיל 1 מ"ל מתמיסת 58Fe(III)-NTA, הוסף 4 מ"ל של תמיסת apo-Tf.
      הערה: זהו יחס טוחן 3:1 של 58Fe-NTA עם apo-Tf. כל Tf מכיל 2 אתרי קשירה Fe; עודף 58Fe-NTA נוסף כדי להבטיח כי Tf היה טעון במלואו.
    3. כדי לאפשר טעינה מקסימלית של 58Fe-NTA על apo-Tf, בדוק שהפתרון נמצא ב- pH 7.5, והתאם את ה- pH, במידת הצורך, עם NaHCO3 או HCl.
    4. דגירה במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר.
  6. הסר עודפים לא מאוגדים 58Fe(III)-NTA ושחרר את NTA.
    1. מעבירים את תמיסת 58 Fe-Tf לעמוד חיתוך במשקל מולקולרי (חיתוך של 30 kDa) וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שטפו את העמוד ב-10 מ"ל של חיץ העמסת טרנספרין 1x וצנטריפוגה ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הכביסה והצנטריפוגה, בצע שטיפה מלוחה עם 10 מ"ל של מלח, וצנטריפוגה ב 2,500 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. חישוב הריכוז של 58Fe-Tf.
    הערה: בשל תוספת של עודף 58Fe בשלב 1.5.2, נניח שכל הטרנספרין הוא דיפרי. כמו 500 מ"ג של apo-Tf שימש, ~ 500 מ"ג 58Fe-Tf הופק בשלב 1.5.4.
    1. מדוד את הנפח שהתאושש מהצנטריפוגה לאחר שטיפת המלח בשלב 1.6.2.
    2. חלקו 500 מ"ג בנפח שהתאושש כדי לקבוע את הריכוז (במ"ג/מ"ל) של תמיסת Fe-Tf 58.
  8. לעקר את תמיסת Fe-Tf 58באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
    הערה: 58תמיסת Fe-Tf שימשה בין שבוע לארבעה שבועות לאחר ההכנה.

2. הגדרת הריונות עכבר מתוזמנים

  1. יש להשתמש בעכברים בני 6 עד 8 שבועות. יש להניח את בעלי החיים על תזונה דלת ברזל (ברזל 4 ppm) או צ'או סטנדרטי (ברזל 185 ppm) במשך שבועיים לפני ההזדווגות ולשמור על בעלי חיים בתזונה המתאימה לאורך כל ההריון.
  2. אפשרות 01: אשר הריון לפי עלייה במשקל ב- E7.5.
    1. להקים כלובי רבייה מרובים. עבור כל כלוב, לשלב 2 נקבות עם זכר אחד לילה; היום שלמחרת שבו בעלי חיים מופרדים נחשב יום עוברי (E)0.5. שקלו את הנקבות ב-E7.5 כדי לקבוע אם בהריון. להזדווג שוב עם נקבות שלא עלו במשקל.
      הערה: ב- WT C57BL/6, עלייה במשקל של 1 גרם ב- E7.5 היא אינדיקטור טוב להריון. שיטה זו מבטיחה כי ההשתלה התרחשה במסגרת זמן מסוימת של 16 שעות, ומאפשרת טיפול סינכרוני בכל בעלי החיים שנכנסו להריון באותה תקופת הזדווגות.
  3. אפשרות 02: לאשר הריון על ידי בדיקות תקע.
    1. שלבו 2 נקבות עם זכר אחד ובצעו בדיקות תקע יומיות כדי לקבוע אם התרחשה התלקחות.
      הערה: שיטה זו עלולה לגרום להריונות מדשדשים, ונוכחות של תקע אינה מבטיחה הריון.

3. מתן 58Fe-Tf לווריד לעכברות הרות E17.5

  1. הכן 58Fe-Tf משלב 1.8 להזרקה.
    1. הכן 58תמיסת Fe-Tf ב 35 מ"ג / מ"ל במלח; להזריק 100 μL לכל עכבר.
    2. מלאו מזרק אינסולין ב-100 מיקרון מתוך תמיסת Fe-Tf 58.
      הערה: כל מנה מכילה 3.5 מ"ג של Fe-Tf אנושי 58Fe-Tf (5 מיקרוגרם מתוך 58Fe).
  2. הרדמת עכבר בהריון באמצעות איזופלורן.
    1. השתמש בווסת איזופלורן עם תא.
    2. השתמש בהגדרות הבאות: 5% איזופלורן, 2 ליטר למ"ל של O 2,2 דקות.
    3. ודא שהעכבר מורדם על ידי חיפוש חוסר תגובה לצביטת בוהן.
    4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על פני השטח של העין ולהניח את העכבר על כרית חימום.
  3. לאט ובזהירות להזריק את תמיסת 58Fe-Tf לתוך הסינוס הרטרו-מסלולי.
  4. אפשר לעכבר להתאושש מהרדמה; אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משענת החזה.
  5. שש שעות לאחר ההזרקה, להרדים נקבות הרות E17.5 על ידי מנת יתר איזופלורן.
    1. בצע ניקור לב כדי exsanguinate העכבר כצורה של המתת חסד משנית.
    2. הצמידו את כפות הרגליים למטה עם מחטים לייצוב.
  6. לאסוף את השליה ואת כבדי העובר.
    1. באמצעות מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר בזהירות את הרחם מן העכבר ההרה. חתכו יחידת שליה עוברית שליה, הכוללת עובר יחיד ושליה בשק מי השפיר המוקף בחלק מהרחם.
    2. בזהירות לחתוך דרך הרחם ואת שק מי השפיר מבלי להפריע לעובר ואת השליה.
    3. מקלפים בחזרה את שק מי השפיר ומסירים את העובר והשליה.
    4. חותכים את חבל הטבור.
    5. כתם את העובר ואת השליה על ניגוב משימה נקייה כדי להסיר את עודף מי השפיר.
    6. רשום את המשקולות של השליה כולה.
    7. חותכים כל שליה לשניים בעזרת סכין גילוח, מניחים כל חצי בצינור של 2.0 מ"ל, ומקפיאים בחנקן נוזלי.
      הערה: מכיוון ש-58Fe אינו דורש אמצעי זהירות מיוחדים לטיפול וסילוק, ניתן להשתמש במחצית אחת של השליה למדידת 58Fe ובמחצית השנייה לכל ניתוח אחר, כולל כמות של קולטן טרנספרין (TFR1) וביטוי פרופורטין (FPN) על ידי כתם מערבי ו- qPCR.
    8. כדי לאסוף כבדי עובר, הקריבו את העובר: השתמשו בסכין גילוח כדי לערוף את העובר במהירות.
      הערה: ב- E17.5, יש להרדים את כל העוברים ברחם בנפרד, גם אם הם אינם משמשים במחקר.
    9. הצמידו את העובר לייצוב, והותירו את הבטן חשופה.
    10. באמצעות מספריים לנתיחה, מבצעים חתך קטן במקום בו מחובר חבל הטבור, מכניסים קצה אחד של מספריים הדיסקציה לתוך החתך, ומבצעים חתך מישורי חציוני לכיוון מישור הקורונה כ-1/4 אינץ'. לאחר מכן, בצע חיתוכי מישור רוחביים כדי לחשוף את הכבד העוברי.
    11. השתמש מלקחיים כדי להסיר את הכבד העוברי.
    12. רשום את המשקלים של כל כבדי העובר.
    13. מניחים את כל כבדי העובר בצינורות של 2 מ"ל ומקפיאים אותם בחנקן נוזלי.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש רק בחלק מכבד העובר למדידת 58Fe אם יש צורך בניתוחים נוספים. שימוש בצינורות 2.0 מ"ל מאפשר הומוגניזציה טובה יותר של רקמות מאשר צינורות 1.5 מ"ל.
  7. לאחסן את הרקמות ללא הגבלת זמן ב -80 מעלות צלזיוס.

4. רקמות תהליך לניתוח ברזל כמותי על ידי ICP-MS

  1. מעבדים את השליה ואת כבדי העובר לכמות של ברזל nonheme.
    1. הפשרת חצאי שליה וכבד עוברי שלם, ושקילת חצאי שליה (ראה שלב 3.6.12 לרישום משקל כבד עוברי).
    2. הוסף 400 μL של תמיסת משקעי חלבון (0.53 N HCl, 5.3% TCA).
    3. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגנייזר חשמלי.
    4. דגירה של הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
    5. מצננים את הדגימות במים בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    6. פתח את הכובעים כדי לשחרר לחץ, ולאחר מכן סגור שוב את הצינורות.
    7. צנטריפוגה ב-17,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפסולת רקמות.
    8. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש המסומן.
    9. שלח דוגמאות לניתוח ICP-MS.
  2. מעבדים את השליה ואת כבדי העובר לכמות של ברזל הם.
    הערה: לאחר מיצוי של ברזל nonheme בשלב 1, הברזל שנותר בגלולה הוא בעיקר heme.
    1. רשום את המשקל של כל כדור משלב 4.1.7.
    2. לעכל את הכדורים ב-10 מ"ל של 70% HNO3 מרוכזים בתוספת 1 מ"ל של 30% H 2 O2
      הערה: התייעץ עם הליבה או המרכז של ICP-MS כדי למטב את עוצמת הקול של HNO3 עבור מחקרים ספציפיים; הנפח יהיה תלוי בחלקו במשקל המדגם.
    3. מחממים את הדגימות ל-200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    4. שלח את הדגימות לניתוח ICP-MS.
      הערה: אם אין צורך בהבחנה בין מקורות ברזל heme ו- nonheme ונמדד רק ברזל כולל, ניתן לעכל רקמה שלמה ב- HNO3 כצעד ראשון.

5. ניתוח נתונים

הערה: הנתונים מ-ICP-MS סופקו כריכוזים של 56 Fe ו-58Fe ב-ng/mL או mg, ppb (טבלה 1). 56 Fe הוא איזוטופ הברזל הנפוץ ביותר בטבע, ומדידתו משקפת הצטברות ברזל בשליה/עובר לאורך כל ההריון, בעוד שמדידת 58Fe משקפת ברזל שהועבר במהלך 6 שעות לאחר ההזרקה.

  1. הפחת את השפע הטבעי של 58 Fe (0.28% מסך Fe) מהערכים הנמדדים של 58Fe.
  2. חישוב סה"כ nonheme 58Fe.
    1. חשב את סך כל הברזל הלא-המי בכבד העובר (ng) על-ידי הכפלת ריכוז הברזל (ng/mL) המחושב בשלב 5.1 בנפח (mL) במהלך העיבוד הראשוני בשלב 4.1.2 כדי להעריך את סך הכל 58Fe.
    2. חשב את כמות הברזל בכל השליה על ידי לקיחת המשקל הכולל של השליה הנמדדת בשלב 3.6.6 וחלוקתה במשקל השליה המעובדת בשלב 4.1.1. הכפל ערך זה בסך כל הברזל nonheme (ng) המחושב בשלב 5.2.1 כדי לקבל את התוכן הכולל nonheme 58Fe של השליה.
  3. חישוב סה"כ heme 58Fe.
    1. יש לחשב את סך ה-heme 58Fe על ידי הכפלת ריכוז הברזל (ng/mg) המחושב בשלב 5.1 במשקל הכדור (במ"ג) הנמדד בשלב 4.2.1.
    2. לאחר מכן, חלקו את המשקל הכולל של השליה שנמדד בשלב 3.5.1 במשקל כדור השליה שנמדד בשלב 4.2.1. הכפל ערך זה בסך כל ברזל heme (ng) המחושב בשלב 5.3.1 כדי לקבל תוכן heme 58Fe הכולל של השליה.
  4. סכמו את הערכים המחושבים nonheme ו- heme 58Fe כדי לקבוע את תכולת הברזל הכוללת עבור כל רקמה.

Figure 1
איור 1: סיכום חזותי של שלבים בפרוטוקול . (A) הכנת 58Fe-transferrin. (ב) ניהול In vivo של 58Fe-transferrin. (ג) איסוף ואחסון רקמות. (D) עיבוד השליה וכבד העובר לכמות של מיני מתכות על ידי ICP-MS. קיצורים: Fe = ברזל; NTA = חומצה ניטרילוטריאצטית; Tf = טרנספרין; PPS = תמיסת משקעי חלבון; Sup = סופרנטנט; TCA = חומצה טריכלורואצטית; ICP-MS = ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר מוקדם יותר שהשתמש באיזוטופים יציבים של ברזל למדידת הובלת ברזל הראה כי מחסור אימהי בברזל הביא לירידה בוויסות של יצואנית ברזל השליה, FPN4. FPN היא יצואנית הברזל היחידה הידועה ליונקים, והיעדר FPN במהלך הפיתוח גורם למוות עוברי לפני E9.529. כדי לקבוע אם הירידה שנצפתה בביטוי FPN תורגמה פונקציונלית לירידה בהובלת ברזל השליה, 58Fe-Tf הוזרק תוך ורידי לסכרים בהריון, וברזל בשליה ובעובר כומת בנוכחות מחסור בברזל אימהי.

כדי להבין כיצד הובלת ברזל שליה מושפעת ממצב הברזל האימהי של השליה, נוצר מודל של מחסור בברזל בעכברים4. נקבות C57BL/6 עכברות הוכנסו לדיאטה דלת ברזל (ברזל 4 ppm) או צ'או סטנדרטי (ברזל 185 ppm) במשך שבועיים לפני ההריון ולכל אורכו. משטר תזונה זה גורם לרמות נמוכות יותר של ברזל בכבד האימהי וברזל והמוגלובין בסרום ברמות E12.5, E15.5 ו-E18.5 בהשוואה לבעלי חיים בתזונה סטנדרטית4. ב-E18.5, עוברים מאמהות עם מחסור בברזל היו בעלי רמת ברזל נמוכה יותר בכבד, והם היו היפופרמיים ואנמיים מאשר עוברים מאמהות גדושות ברזל. שלוש עכברות הרות שימשו בכל אחת מהקבוצות הגדושות בברזל ובמחסור בברזל, ו-2-3 שליה שימשו מכל עכברה הרה לניתוח.

כדי לבצע הובלה כמותית של ברזל שליה, 58 Fe-transferrin הוכנו והוזרקו לווריד בסכרים בהריון ו-58Fe נמדדו בשליה ובכבד העוברי על ידי ICP-MS, כפי שמתואר בפרוטוקול ומודגם באיור 1. לפני שליחת דגימות ברזל nonheme לניתוח ICP-MS, סך רמות הברזל nonheme כומתו באופן עצמאי באמצעות שיטת פרן שתוארה קודםלכן 30. ריכוזי הברזל הלא-היים שנמדדו בשיטות פרן לעומת ICP-MS היו בקורלציה משמעותית ביותר בכל הרקמות שנמדדו (R2 = 0.94, P < 0.0001, n = 36). תוצאות מייצגות מכמות ICP-MS של איזוטופים מברזל מוצגות בטבלה 1. סה"כ 58Fe חושב כמתואר בשלב 5 של הפרוטוקול. הנתונים מוצגים כסך הכל ולא כ-heme או nonheme iron (איור 2A-D) מכיוון שהמטרה הייתה לכמת את סך הברזל שהועבר לתוך השליה ואת סך הברזל שהועבר לעובר מהשליה.

בממוצע, 21% ממנת 58Fe שניתנה נמצאה בשליה, בכבד העובר ובסרום העובר גם יחד. מדידת 56Fe מספקת תובנה לגבי העברת הברזל ארוכת הטווח בכבד השליה והעובר במהלך ההריון. סך כל השליה 56Fe היה דומה בקבוצות חסר הברזל והגדושות (איור 2A), בעוד שסך כל הברזל בכבד העובר ירד בקבוצה עם מחסור בברזל (איור 2B). זה היה צפוי בהתבסס על הירידה הנצפית ב- FPN השליה בקבוצה חסרת הברזל4, מה שיגרום לשימור ברזל בשליה על חשבון העובר. סה"כ 58Fe מספק תמונת מצב של הובלת ברזל לטווח קצר. במחקר הזה, בדומה ל-56 Fe, השליה 58 Fe הייתה דומה גם בקבוצה של מחסור בברזל וגם בקבוצה של מחסור בברזל (איור 2C), וכבד עובר 58Fe ירד בקבוצה של מחסור בברזל (איור 2D). נתונים אלה מצביעים על כך שבמהלך הריון עם מחסור בברזל, הירידה בוויסות ה-FPN של השליה גורמת לירידה בהובלת הברזל לעובר, מה שמוביל להבדלים מצטברים בתכולת הברזל בשליה ובעובר.

חשוב לשקול את מינון הברזל הניתן מכיוון שהוא עלול להוביל לשינויים לא מכוונים בריכוז הפסידין או בביטוי טרנספורטר ברזל31. הוכח כי מחסור אימהי בברזל גרם לירידה ב- FPN4 שליה. כדי לקבוע אם הזרקת Fe-Tf השפיעה על תקנה זו, FPN השליה נמדדה 6 שעות לאחר ההזרקה על ידי כתם מערבי. מינון הברזל של 5 מיקרוגרם לא היה מספיק כדי לשנות את ויסות ה-FPN של השליה על-ידי מחסור אימהי בברזל (איור 3).

לסיכום, שיטה זו שימשה כדי להדגים כי ויסות פיזיולוגי של FPN שליה במהלך מחסור אימהי בברזל גורם לירידה בהובלת הברזל על פני השליה in vivo. איזוטופים יציבים מברזל מספקים חלופה רגישה וניתנת לכימות לרדיואקטיביות למדידת ההובלה וההפצה של הברזל, ומאפשרים שימוש בו-זמני ברקמות לניתוחים נוספים.

Figure 2
איור 2: 56Fe ו-58Fe מועברים על פני השליה בהריונות עם מחסור בברזל או גדופי ברזל. סה"כ 56Fe בשליה (A) ובכבד העובר (B). סה"כ 58Fe בשליה (C) ובכבד העוברי (D). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי עבור ערכים המתפלגים בדרך כלל ובאופן אחר על ידי מבחן סכום הדירוג של Mann-Whitney U (מסומן בכוכבית לאחר ערך P). מספר בעלי החיים מצוין בצירי ה- x של חלקות הקופסה והשפם. החלק העליון של עלילת התיבה מציין את האחוזון ה-75, והתחתון מציין את האחוזוןה-25; שפמים מעל התיבה מציינים את האחוזון ה-90, ואלה שמתחת לתיבה מציינים את האחוזוןה-10. הקו המוצק בתוך התיבה מציין את החציון ואת הקו המקווקו את הממוצע. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה לגרפים מדעיים וניתוח נתונים. נתון זה שונהמ-4. קיצור: Fe = ברזל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: רמות TFR1 ו-FPN של שליה. (A) ביטוי TFR1 ו-FPN הוערך על ידי כתם מערבי בשליה חסרת ברזל וגדושה 6 שעות לאחר הטיפול באמהות עם 58Fe-Tf. (B) ביטוי החלבון היה כמותי והוצג כביטוי חלבון ביחס ל-β-אקטין. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי עבור ערכים המתפלגים באופן נורמלי. מספר בעלי החיים מצוין בצירי ה- x של חלקות הקופסה והשפם. החלק העליון של עלילת התיבה מציין את האחוזון ה-75, והתחתון מציין את האחוזוןה-25; שפמים מעל התיבה מציינים את האחוזון ה-90, ואלה שמתחת לתיבה מציינים את האחוזוןה-10. הקו המוצק בתוך התיבה מציין את החציון ואת הקו המקווקו את הממוצע. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנה לגרפים מדעיים וניתוח נתונים. נתון זה שונהמ-4. קיצורים: TFR1 = קולטן טרנספרין; FPN = פרופורטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לדוגמה 56 פה 58 פה סה"כ Fe
ריכוז [ng/mL או mg, ppb] ריכוז [ng/mL או mg, ppb] סכום האיזוטופים [ng/mL או mg]
ממוצע* סטדב ממוצע* סטדב
ברזל נונהם שליה מחסור בברזל 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
גדוש בברזל 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
הם שליה מחסור בברזל 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
גדוש בברזל 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
ברזל נונהם כבד עובר מחסור בברזל 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
גדוש בברזל 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
הם כבד עובר מחסור בברזל 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
גדוש בברזל 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

טבלה 1: תוצאות מייצגות מכמות ICP-MS של 56 Fe ו-58Fe בכבד השליה והעובר. קיצורים: ppb = חלקים למיליארד; stdev = סטיית תקן; ICP-MS = ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ברזל חשוב לתהליכים ביולוגיים רבים, ותנועתו והפצתו בגוף הן דינמיות ומווסתות מאוד. איזוטופים יציבים מברזל מספקים חלופה עקבית ונוחה לאיזוטופים רדיואקטיביים להערכת הדינמיקה של הומאוסטזיס ברזל. שלב קריטי בפרוטוקול הוא מעקב אחר כל המשקלים והנפחים של הרקמות. ברזל הוא יסוד ולכן לא ניתן לסנתז אותו או לפרק אותו. לכן, אם כל המשקולות והנפחים נרשמים בקפידה, ניתן להסביר את כל הברזל בתוך המערכת על ידי חישוב. כפי שתואר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להבחין בין מקורות ברזל heme ו nonheme. עם זאת, אם הבחנה זו בין צורות ברזל אינה הכרחית ורק סך הברזל נמדד, ניתן לפשט את הפרוטוקול על ידי טיפול ברקמה רק עם HNO3 מרוכז כמתואר בשלב 4.2 של הפרוטוקול. חשוב לציין כי אם רקמות אינן perfused לפני ניתוח, במיוחד רקמות כלי דם מאוד כגון השליה, נוכחות של דם עלול לגרום overestimation של רקמת heme תוכן ברזל.

ברזל הקשור לטרנספרין נבחר למחקר מכיוון שהוא המקור העיקרי לברזל שנלקח על ידיהשליה 16,17. ההפלה הגלובלית של TFR1 בעכברים גרמה לקטלניות עוברית לפני E12.5, מה שמרמז על כך שברזל הקשור לטרנספרין הוא קריטי להתפתחות. ייתכן שמיני ברזל אחרים, כגון פריטין וברזל שאינו קשור לטרנספרין (NTBI), תורמים גם הם להקדשת ברזל עוברי במידה פחותה. עם זאת, תרומתם של מיני ברזל חלופיים אלה לא הוערכה. בעתיד ניתן יהיה להשתמש באיזוטופים יציבים כדי לקבוע את תרומתם של מקורות ברזל שונים להתפתחות ולהקדשת ברזל בעוברים.

מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של שינויים במצב הברזל האימהי על הובלת ברזל שליה. עם זאת, ירידה בהפצידין במהלך מחסור בברזל גורמת לרמות גבוהות של FPN אנטרוציטים ולהובלת ברזל משופרת למחזור הדם1. לכן, בסכרים עם מחסור בברזל, ספיגת הברזל מהתזונה הייתה מוגברת מטבעה ופרשנות מבלבלת של התוצאות אם 58Fe היה ניתן דרך הפה. לפיכך, מתן תוך ורידי של 58Fe-Tf נבחר כפי שהוא עוקף את ויסות הברזל ברמה של ספיגת מעיים. מנה של 5 מיקרוגרם של 58Fe/mouse נבחרה על סמך ריכוזי ברזל בסרום של סכרי הריון E18.5 גדולי ברזל. בסכרים בהריון מסוג C57BL/6 E18.5, ריכוזי הברזל בסרום נעים בין 10 ל-50 מיקרומטר4. עכבר E18.5 בהריון צפוי להיות כ 2 מ"ל של נפח הדם הכולל32. לפיכך, הסכום הכולל של ברזל במחזור של סכרים בהריון גדוש ברזל נע בין 1.1 ל 5.6 מיקרוגרם. לפיכך, 5 מיקרוגרם של 58Fe/mouse שווה ערך לריכוזים פיזיולוגיים שנצפו בבעלי חיים גדושים בברזל.

מגבלה של זיהוי ICP-MS של 58 Fe היא ההפרעה האיזוברית מ- 58Ni. ריכוזי Ni אנדוגניים בשליית העכבר הם 0.04 ± 0.02 מיקרוגרם/גרם משקל רטוב33. שליה ממוצעת של עכבר E18.5 שוקלת 0.080 גרם; לכן, הסכום הכולל של Ni הוא כ 3.2 ng. השפע הטבעי של 58 Ni הוא 68%; לפיכך, כמות של 58Ni בשליה העכבר הוא ~ 2.2 ng, שהוא בערך פי 10 נמוך יותר מאשר רמות 58Fe שזוהו. בעובר, ריכוזי Ni נמוכים עוד יותר ב 0.01 ± 0.01 מיקרוגרם / גרם משקל רטוב33. עובר העכבר הממוצע E18.5 שוקל 1 גרם; לפיכך, הסכום הכולל של Ni בעובר עכבר רגיל הוא כ 10 ng. בהנחה שכל העובר Ni נמצא בכבד העובר, רמות אלה עדיין נמוכות פי 10 מריכוזי 58Fe ונמוכות כמעט פי 1,000 מתכולת הברזל הכוללת בכבד העובר. בהתחשב בשפע הנמוך יותר של Ni ברקמות עכברים אלה, הפרעה של 58Ni לא נלקחה בחשבון במחקר זה.

שיקול נוסף הוא מגבלת הגילוי של הבדיקה. גבול הזיהוי במחקר זה היה 250 pg/mL 58Fe. עם זאת, ניתן לשנות מגבלה זו כדי לזהות ריכוזים נמוכים עוד יותר של 58Fe אם דילול הרקמות מופחת בשלב עיבוד הרקמות (שלב פרוטוקול 4.1.2 ואיור 1D) או באמצעות שינויים במתקן הליבה של ICP-MS. כאשר נמדד58 Fe בעובר כולו, רמותיו לא זוהו מכיוון שריכוז 58Fe היה מתחת לגבול הגילוי. עם זאת, 58Fe זוהה בכבד העובר, שהוא איבר אחסון הברזל העיקרי. ייתכן כי מתן מנה גדולה יותר של 58 Fe היה מאפשר זיהוי של 58Fe אפילו בעובר כולו. עם זאת, כמות קטנה יחסית של 58Fe שימשה כדי למנוע העמסת ברזל של השליה, אשר יכול להפעיל מנגנוני משוב ולשנות את הביטוי של מובילי ברזל. במודל זה, שהשתמש בעכברים מסוג C57BL/6, נמדד ברזל כבד עובר כהשתקפות של הובלת ברזל שליה כוללת, שכן ריכוז הברזל בכבד העובר פרופורציונלי לכל ריכוז הברזל בעובר4. עם זאת, במודלים של עכברים שבהם התפלגות הברזל משתנה34, ברזל כבד עובר לבדו עשוי שלא לייצג במדויק את הובלת הברזל השלייתית הכוללת. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך למדוד ברזל המשולב בעובר כולו או בתא כדורית הדם. בנוסף, שינויים בנקודות הזמן של הניסוי ידרשו גם אופטימיזציה ומדידה נוספת של ברזל בתאי העובר השונים. גישה זו למעקב אחר איזוטופים יציבים שימשה לכימות הובלת ברזל במהלך הריון עכבר. המתודולוגיה ניתנת להתאמה בקלות כדי לחקור הובלת ברזל בעכברים שאינם בהריון ובמודלים אחרים של בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN היא מייסדת-שותפה מדעית של Intrinsic LifeSciences ו-Silarus Pharma ויועצת ל-Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics ו-Disc Medicine. VS מצהיר שאין התנגשויות.

Acknowledgments

המחברים מודים על השימוש במתקן ICP-MS במרכז UC להשלכות סביבתיות של ננוטכנולוגיה ב-CNSI באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס על עזרתם באופטימיזציה של הפרוטוקול למדידות 58Fe. המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של NIH (NIDDK) (K01DK127004, to VS) והמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) (R01HD096863, ל-EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

ביולוגיה גיליון 183
הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר <em>In Vivo</em> באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter