Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantifiering av järntransport över musmoderkakan in vivo med hjälp av icke-radioaktiva järnisotoper

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Denna artikel visar hur man förbereder och administrerar transferrinbundet icke-radioaktivt isotopjärn för studier av järntransport vid musgraviditet. Tillvägagångssättet för kvantifiering av isotopjärn i fetoplacentala fack beskrivs också.

Abstract

Järn är viktigt för moderns och fostrets hälsa under graviditeten, med cirka 1 g järn som behövs hos människor för att upprätthålla en hälsosam graviditet. Fetal järnbegåvning är helt beroende av järnöverföring över moderkakan, och störningar av denna överföring kan leda till negativa graviditetsresultat. Hos möss förlitade sig mätning av järnflöden över moderkakan traditionellt på radioaktiva järnisotoper, ett mycket känsligt men betungande tillvägagångssätt. Stabila järnisotoper (57Fe och 58Fe) erbjuder ett icke-radioaktivt alternativ för användning i graviditetsstudier på människa.

Under fysiologiska förhållanden är transferrinbundet järn den dominerande formen av järn som tas upp av moderkakan. Således framställdes och injicerades 58Fe-transferrin intravenöst i gravida dammar för att direkt bedöma placentajärntransport och kringgå moderns tarmjärnabsorption som en förvirrande variabel. Isotopiskt järn kvantifierades i moderkakans och musens embryonala vävnader genom induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS). Dessa metoder kan också användas i andra djurmodellsystem för fysiologi eller sjukdom för att kvantifiera in vivo järndynamik.

Introduction

Järn är avgörande för olika metaboliska processer, inklusive tillväxt och utveckling, energiproduktion och syretransport1. Underhåll av järnhomeostas är en dynamisk, samordnad process. Järn absorberas från mat i tolvfingertarmen och transporteras runt kroppen i cirkulationen bunden till järntransportproteintransferrinet (Tf). Det används av varje cell för enzymatiska processer, införlivas i hemoglobin i begynnande erytrocyter och återvinns från åldrade erytrocyter av makrofager. Järn lagras i levern när det är överflödigt och förloras från kroppen genom blödning eller cellsloughing. Mängden järn i omlopp är resultatet av balansen mellan konsumtionen och tillförseln av järn, den senare regleras tätt av leverhormonet hepcidin (HAMP), den centrala regulatorn för järnhomeostas1. Hepcidin fungerar för att begränsa järnbiotillgängligheten i blod genom att täppa till eller inducera ubiquitination och bryta ned järnexportören ferroportin (FPN)2. Minskning av funktionellt FPN leder till minskad järnabsorption i kosten, järnbindning i levern och minskad järnåtervinning från makrofager1.

Hepcidin regleras av järnstatus, inflammation, erytropoietisk enhet och graviditet (granskas i 3). Med tanke på att järnhomeostas är mycket dynamisk är det viktigt att förstå och mäta den totala järnpoolen och järnfördelningen och omsättningen. Djurstudier förlitade sig traditionellt på radioaktiva järnisotoper, ett mycket känsligt men betungande tillvägagångssätt för att mäta järndynamik. Men i nyare studier, inklusive studien som presenteras här4, används icke-radioaktiva, stabila järnisotoper (58Fe) för att mäta järntransport under graviditeten 5,6,7,8,9. Stabila isotoper är värdefulla verktyg för att studera näringsämnesmetabolism (granskad i 10). Användningen av stabila järnisotoper i mänskliga studier visade att i) järnabsorptionen ökar mot slutet av dräktigheten5,6, ii) överföring av dietjärn till fostret är beroende av moderns järnstatus7, iii) moderligt intaget hemjärn införlivas lättare av fostret än nonheme järn 8, och iv) järnöverföring till fostret är negativt korrelerat med moderns hepcidinnivåer 8, 9. Dessa experiment mätte järnisotoper i serum eller deras införlivande i RBC; mätning av järn som ingår i enbart RBC kan dock underskatta sann järnabsorption9. I den aktuella studien mäts både heme och nonheme järn i vävnader.

Under graviditeten krävs järn för att stödja expansionen av moderns röda blodkroppar och för överföring över moderkakan för att stödja fostrets tillväxt och utveckling11. Fostrets järnbegåvning är helt beroende av järntransport över moderkakan. Under graviditethos människa 12 och gnagare 4,13 minskar hepcidinnivåerna dramatiskt, vilket ökar plasmajärntillgängligheten för överföring till fostret.

Grunderna för placenta järntransport karakteriserades ursprungligen på 1950-70-talet med hjälp av radioaktiva spårämnen (59Fe och 55Fe). Dessa studier fastställde att järntransport över moderkakan ärenkelriktad 14,15 och att diferrisk transferrin är en viktig källa till järn för moderkakan och fostret16,17. Den nuvarande förståelsen av placentajärntransport är mer fullständig, även om vissa viktiga järntransportörer och regleringsmekanismer fortfarande är okända. Musmodeller har varit viktiga för att förstå järnreglering och transport18 eftersom de viktigaste transportörerna och mekanismerna är anmärkningsvärt lika. Både mänskliga och muspotter är hemokoriabla, det vill säga moderns blod är i direkt kontakt med fostrets korion19. Det finns dock några anmärkningsvärda strukturella skillnader.

Synkytiotrophoblasten är placentacellskiktet som separerar moderns och fostrets cirkulation och aktivt transporterar järn och andra näringsämnen20. Hos människor är syncytiotrophoblasten ett enda lager av smälta celler. Däremot består musmoderkakan av två syncytiotrophoblastlager 21, Syn-I och Syn-II. Gapkorsningar vid gränssnittet mellan Syn-I och Syn-II möjliggör emellertid diffusion av näringsämnen mellan skikten22,23. Således fungerar dessa lager som ett enda syncytialskikt som liknar den mänskliga syncytiotrophoblasten. Ytterligare likheter och skillnader mellan mänskliga och musmoderkakor granskas av Rossant och Cross21. Placental järntransport utlöses av bindningen av järn-Tf från moderns blod till transferrinreceptorn (TfR1) lokaliserad på den apikala sidan av syncytiotrophoblast24. Denna interaktion inducerar järn-Tf / TfR1-internalisering via clathrinmedierad endocytos25. Järn frigörs sedan från Tf i den sura endosomen26, reduceras till järn med ett obestämt ferrireduktas och exporteras från endosomen till cytoplasman av en ännu inte bestämd transportör. Hur järn kaperoneras inom syncytiotrophoblasten återstår också att beskriva. Järn transporteras så småningom till fostrets sida av järnexportören, FPN, lokaliserat på den basala eller fostervända ytan av syncytiotrophoblasten (granskad i27).

För att förstå hur fysiologisk och patologisk reglering av TfR1, FPN och hepcidin påverkar placentajärntransport användes stabila järnisotoper för att kvantifiera järntransport från moderns cirkulation till moderkakan och embryot in vivo4. Detta dokument presenterar metoderna för beredning och administrering av isotopiskt järntransferrin till dräktiga möss, bearbetning av vävnader för ICP-MS och beräkning av järnkoncentrationer i vävnader. Användningen av stabila järnisotoper in vivo kan anpassas för att undersöka järnreglering och fördelning i olika djurmodeller för att undersöka fysiologisk och patologisk järnreglering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprotokoll och experimentella förfaranden godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of California Los Angeles.

1. Förberedelse av 58Fe-Tf

OBS: Protokollet använder 58Fe; ett identiskt protokoll kan dock användas för 57Fe. Endera isotopen kan användas och kasseras som en vanlig järnkemikalie utan ytterligare försiktighetsåtgärder.

  1. Lös upp 58 Fe i 12 N HCl vid 50μL HCl/mg 58Fe.
    1. Tillsätt HCl till metallen i injektionsflaskan med glas som levereras av säljaren och sätt tillbaka locket löst. För att lösa upp järnet, värm 58Fe/HCl-lösningen till 60 °C i 1 timme. Om den fortfarande inte är upplöst, lämna lösningen över natten vid rumstemperatur i rökhuven för att lösa upp.
      OBS: Upplöst 58Fe / HCl-lösning är gulaktig-orange i färgen.
      Fe3O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) +4H 2 O
  2. Oxidera eventuell återstående Fe(II)Cl2för att generera Fe(III)Cl3-lösningen.
    1. Värm upp 58Fe/HCl-lösningen till 60 °C med locket av för att underlätta oxidation.
    2. Tillsätt 1 μl 35%H2O2per 50 μl 58Fe/HCl lösning för att ytterligare underlätta oxidation.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) +2H2O
  3. Bered järnkloridlösningen (58Fe(III)Cl3).
    1. Låt järnkloridlösningen stå i huven vid 60 °C med locket avstängt för att avdunsta provet.
      OBS: Avdunstning kan ta mellan en och flera dagar.
    2. Rekonstituera 58 Fe(III)Cl3 till 100 mM med ultrarentH2O, och beräkna mängden ultrarent H2O som krävs baserat på den initiala metallvikten som används i steg 1.1 (molekylvikt på 58 Fe(III)Cl3är 162.2).
  4. Bered 58 Fe(III)-nitrilotriacetat (NTA) genom att inkubera 58Fe(III)Cl3med NTA i ett molförhållande på 1:5 i närvaro av 20 mM NaHCO3.
    1. Förbered 500 mM NTA i 1 N NaOH.
    2. Förbered 5x transferrinbelastningsbuffert (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Förbered 1 M NaHCO3 i ultrarenH2O.
    4. Tillsätt 150 μl 100 mM 58 Fe(III)Cl3-lösning (från steg 1.3.2) till ett 15 ml koniskt rör, 150 μl 500 mM NTA framställt i 1 N NaOH, 480 μL ultrarentH2O, 200 μL 5xtransferrinbelastningsbuffert och 20 μL 1 M NaHCO3-lösning.
    5. Inkubera blandningen i 5 minuter vid rumstemperatur.
  5. Ladda apo-Tf med 58 Fe (III) -NTA för att bilda 58Fe-Tf.
    OBS: Detta protokoll anpassades från McCarthy och Kosman28.
    1. Lös upp 500 mg apo-Tf i 4 ml 1x Tf-laddningsbuffert.
    2. Tillsätt 4 ml apo-Tf-lösning till det koniska röret på 15 ml i steg 1.4.4 som innehåller 1 ml 58Fe(III)-NTA-lösningen.
      OBS: Detta är ett 3: 1 molförhållande på 58Fe-NTA med apo-Tf. Varje Tf innehåller 2 Fe-bindningsställen; överskott 58Fe-NTA lades till för att säkerställa att Tf var fulladdad.
    3. För att tillåta maximal belastning av 58Fe-NTA på apo-Tf, kontrollera att lösningen är vid pH 7,5 och justera pH, om nödvändigt, med NaHCO3 eller HCl.
    4. Inkubera i 2,5 h vid rumstemperatur.
  6. Ta bort överflödigt obundet 58Fe(III)-NTA och släppt NTA.
    1. Överför 58Fe-Tf-lösningen till en brytkolonn med molekylvikt (30 kDa cutoff) och centrifugera vid 2 500 × g i 15 minuter vid rumstemperatur.
    2. Tvätta kolonnen med 10 ml 1x transferrinbelastningsbuffert och centrifugera vid 2 500 × g i 15 min vid rumstemperatur. Upprepa tvätten och centrifugeringen, utför en saltlösningstvätt med 10 ml saltlösning och centrifugera vid 2 500 × g i 15 min vid rumstemperatur.
  7. Beräkna koncentrationen av 58Fe-Tf.
    OBS: På grund av tillsatsen av överskott 58Fe i steg 1.5.2, anta att allt transferrin är diferriskt. Som 500 mg apo-Tf användes, ~ 500 mg 58Fe-Tf producerades i steg 1.5.4.
    1. Mät volymen som återvinns från centrifugeringen efter saltlösningstvätten i steg 1.6.2.
    2. Dela 500 mg med den återvunna volymen för att bestämma koncentrationen (i mg/ml) av 58Fe-Tf-lösningen.
  8. Sterilisera 58Fe-Tf-lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter; Förvara vid 4 °C tills den är klar att användas.
    OBS: 58Fe-Tf-lösning användes mellan 1 och 4 veckor efter beredning.

2. Ställ in tidsinställda musgraviditeter

  1. Använd 6- till 8-veckors gamla kvinnliga möss. Placera djur på en lågjärndiet (4 ppm järn) eller standard chow (185 ppm järn) i 2 veckor före parning och behåll djur på respektive diet under hela graviditeten.
  2. Alternativ 01: Bekräfta graviditeten genom viktökning vid E7.5.
    1. Sätt upp flera avelsburar. För varje bur, kombinera 2 honor med 1 man över natten; Följande dag när djuren separeras betraktas som embryonal dag (E)0,5. Väg honor vid E7.5 för att avgöra om de är gravida. Mate män igen med kvinnor som inte gick upp i vikt.
      OBS: I WT C57BL / 6 är en viktökning på 1 g vid E7.5 en bra indikator på graviditet. Denna metod säkerställer att implantation inträffade inom en specifik tidsram på 16 timmar, vilket möjliggör synkron behandling av alla djur som blev dräktiga under samma parningsperiod.
  3. Alternativ 02: Bekräfta graviditeten genom stickprov.
    1. Kombinera 2 honor med 1 hane och utför dagliga stickprovskontroller för att avgöra om kopulation har inträffat.
      OBS: Denna metod kan resultera i förskjutna graviditeter, och närvaron av en plugg garanterar inte graviditet.

3. Administrera 58Fe-Tf intravenöst till E17.5 gravida möss

  1. Förbered 58Fe-Tf från steg 1.8 för injektion.
    1. Bered 58Fe-Tf lösning vid 35 mg / ml i saltlösning; injicera 100 μL per mus.
    2. Fyll en insulinspruta med 100 μl av 58Fe-Tf-lösningen.
      OBS: Varje dos innehåller 3,5 mg human 58Fe-Tf (5 μg 58Fe).
  2. Bedöva en gravid mus med isofluran.
    1. Använd en isofluranregulator med en kammare.
    2. Använd följande inställningar: 5% isofluran, 2 L/ml O 2,2 min.
    3. Bekräfta att musen är bedövad genom att leta efter brist på svar på en tåklämma.
    4. Applicera ögonsmörjmedel på ögats yta och placera musen på en värmedyna.
  3. Injicera långsamt och försiktigt 58Fe-Tf-lösningen i retro-orbital sinus.
  4. Låt musen återhämta sig från anestesi; Lämna inte djuret utan uppsikt förrän det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
  5. Sex timmar efter injektion, avliva E17.5 gravida kvinnor genom överdosering av isofluran.
    1. Utför en hjärtpunktion för att exsanguinera musen som en form av sekundär eutanasi.
    2. Fäst fötterna med nålar för stabilisering.
  6. Samla placentan och embryolever.
    1. Använd sterila pincett och dissektionssax, ta försiktigt bort livmodern från den gravida musen. Skär av en placenta foster-placentaenhet, som består av ett enda foster och moderkaka i fostersäcken omgiven av en del av livmodern.
    2. Skär försiktigt genom livmodern och fostersäcken utan att störa fostret och moderkakan.
    3. Skala tillbaka fostersäcken och ta bort fostret och moderkakan.
    4. Klipp navelsträngen.
    5. Torka fostret och moderkakan på en ren uppgift torka för att ta bort överflödigt fostervatten.
    6. Registrera vikterna på hela moderkakan.
    7. Skär varje moderkaka i hälften med ett rakblad, placera varje hälft i ett 2,0 ml rör och snäppfrys i flytande kväve.
      OBS: Eftersom 58 Fe inte kräver särskilda hanteringsåtgärder och bortskaffande, kan hälften av moderkakan användas för 58Fe-mätning och den andra hälften för alla andra analyser, inklusive kvantifiering av transferrinreceptor (TFR1) och ferroportin (FPN) -uttryck genom western blotting och qPCR.
    8. För att samla embryolever, offra embryot: använd ett rakblad för att snabbt halshugga embryot.
      OBS: Vid E17.5 måste alla embryon i livmodern avlivas individuellt, även om de inte används i studien.
    9. Fäst ner embryot för stabilisering och lämna buken exponerad.
    10. Använd dissektionssax, gör ett litet snitt där navelsträngen fästes, sätt in ena änden av dissektionssaxen i snittet och utför ett medianplan som skärs mot koronalplanet cirka 1/4 tum. Utför sedan tvärgående planskärningar för att exponera fostrets lever.
    11. Använd pincett för att ta bort fostrets lever.
    12. Registrera vikterna för hela embryoleveren.
    13. Placera hela embryoleveren i 2 ml rör och snäppfrys dem i flytande kväve.
      OBS: Alternativt kan endast en del av embryolevern användas för 58Fe-mätning om ytterligare analyser önskas. Användning av 2,0 ml rör möjliggör bättre vävnadshomogenisering än 1,5 ml rör.
  7. Förvara vävnaderna på obestämd tid vid -80 °C.

4. Processvävnader för kvantitativ järnanalys av ICP-MS

  1. Bearbeta moderkakan och fosterlever för kvantifiering av nonheme-järn.
    1. Tina moderkakshalvor och hela fosterlever och väg placentahalvorna (se steg 3.6.12 för registrering av fostrets levervikter).
    2. Tillsätt 400 μl proteinutfällningslösning (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Homogenisera vävnaden med hjälp av en elektrisk homogenisator.
    4. Inkubera proverna vid 100 °C i 1 timme.
    5. Kyl proverna i rumstempererat vatten i 2 minuter.
    6. Öppna locken för att släppa trycket och stäng sedan rören igen.
    7. Centrifugera vid 17 000 × g i 10 minuter vid rumstemperatur till pelletvävnadsskräp.
    8. Överför försiktigt supernatanten till ett nytt märkt rör.
    9. Skicka iväg prover för ICP-MS-analys.
  2. Bearbeta placentan och fosterleveren för kvantifiering av hemjärn.
    OBS: Efter extraktion av nonhemjärn i steg 1 är järnet som finns kvar i pelleten övervägande heme.
    1. Registrera vikten på varje pellet från steg 4.1.7.
    2. Röta pelletsen i 10 ml koncentrerad 70%HNO3 kompletterad med 1 ml 30%H2O2
      OBS: Rådgör med ICP-MS-kärnan eller centret för att optimera volymen av HNO3 för specifika studier; Volymen kommer delvis att vara beroende av provets vikt.
    3. Värm proverna till 200 °C i 15 minuter.
    4. Skicka iväg proverna för ICP-MS-analys.
      OBS: Om det inte är nödvändigt att skilja mellan hemjärn och icke-hemjärnkällor och endast totalt järn mäts, kan hela vävnaden smälta i HNO3 som det första steget.

5. Analys av data

Anm.: Data från ICP-MS har lämnats som 56Fe- och 58Fe-koncentrationer i ng/ml eller mg, ppb (tabell 1). 56 Fe är den vanligaste järnisotopen i naturen, och dess mätning återspeglar järnansamling i moderkakan / embryot under hela graviditeten, medan 58Fe-mätning återspeglar järn som överfördes under 6 timmar efter injektion.

  1. Subtrahera det naturliga överflödet av 58 Fe (0,28% av det totala Fe) från de uppmätta 58Fe-värdena.
  2. Beräkna totalt nonheme 58Fe.
    1. Beräkna embryoleverns totala nonheme-järn (ng) genom att först multiplicera järnkoncentrationen (ng/ml) beräknad i steg 5.1 med volymen (ml) under den inledande bearbetningen i steg 4.1.2 för att uppskatta totalt 58Fe.
    2. Beräkna mängden järn i hela moderkakan genom att ta moderkakans totala vikt mätt i steg 3.6.6 och dividera den med vikten på den moderkaka som bearbetats i steg 4.1.1. Multiplicera detta värde med det totala nonheme-järnet (ng) beräknat i steg 5.2.1 för att få fram den totala nonheme-halten på 58Fe i moderkakan.
  3. Beräkna totalt heme 58Fe.
    1. Beräkna den totala hemhalten 58Fe genom att först multiplicera järnkoncentrationen (ng/mg) beräknad i steg 5.1 med pelletens vikt (i mg) mätt i steg 4.2.1.
    2. Dividera sedan moderkakans totala vikt mätt i steg 3.5.1 med placentapelletlets vikt mätt i steg 4.2.1. Multiplicera detta värde med det totala hemjärnet (ng) beräknat i steg 5.3.1 för att få den totala hemhalten på 58Fe i moderkakan.
  4. Summera de beräknade nonheme- och hemvärdena 58Fe för att bestämma det totala järninnehållet för varje vävnad.

Figure 1
Figur 1: Visuell sammanfattning av stegen i protokollet . (A) Beredning av 58Fe-transferrin. B) Administrering in vivo av 58Fe-transferrin. C) Uppsamling och förvaring av vävnader. D) Bearbetning av moderkakan och embryolever för kvantifiering av metallarter med ICP-MS. Förkortningar: Fe = järn; NTA = nitrilotriättiksyra; Tf = transferrin; PPS = proteinutfällningslösning; Sup = supernatant; TCA = triklorättiksyra; ICP-MS = induktivt kopplad plasmamasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tidigare studie med stabila järnisotoper för att mäta järntransport visade att moderns järnbrist resulterade i nedreglering av moderkakans järnexportör, FPN4. FPN är den enda kända järnexportören hos däggdjur, och frånvaron av FPN under utveckling resulterar i embryonal död före E9.529. För att avgöra om den observerade minskningen av FPN-uttryck översattes funktionellt till minskad järntransport i placenta, injicerades 58Fe-Tf intravenöst i dräktiga moderdjur, och järn i moderkakan och embryot kvantifierades i närvaro av moderns järnbrist.

För att förstå hur placentajärntransport påverkas av moderns järnstatus modellerades järnbrist hos möss4. Kvinnliga C57BL/6-möss placerades på en lågjärndiet (4 ppm järn) eller standard chow (185 ppm järn) i 2 veckor före och under hela graviditeten. Denna kostregim resulterar i lägre moderns lever nonheme järn och serumjärn och hemoglobin vid E12.5, E15.5 och E18.5 jämfört med djur på en standarddiet4. Vid E18.5 hade embryon från järnfattiga mödrar lägre leverjärn och var hypoferremiska och anemiska än embryon från järnfyllda mödrar. Tre dräktiga möss användes i var och en av de järnfyllda och järnbristgrupperna, och 2-3 moderkakor användes från varje gravid mus för analys.

För att kvantifiera järntransport av placenta bereddes ochinjicerades 58 Fe-transferrin intravenöst i dräktiga moderdjur och 58Fe mätt i moderkakan och fosterlever med ICP-MS, enligt beskrivningen i protokollet och illustreras i figur 1. Innan icke-hemjärnprover skickades ut för ICP-MS-analys kvantifierades de totala icke-hemiska järnnivåerna oberoende via en ferene-metod som beskrivits tidigare30. Icke-hemiska järnkoncentrationer uppmätta med feren- kontra ICP-MS-metoderna var mycket signifikant korrelerade i alla uppmätta vävnader (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Representativa resultat från ICP-MS-kvantifiering av järnisotoper presenteras i tabell 1. Totalt beräknades 58Fe enligt beskrivningen i steg 5 i protokollet. Data presenteras som totalt snarare än hemjärn eller icke-hemjärn (figur 2A-D) eftersom målet var att kvantifiera totalt järn som överfördes till moderkakan och totalt järn som överfördes till embryot från moderkakan.

I genomsnitt återfanns 21% av den administrerade dosen 58Fe i moderkakan, embryolevern och embryoserumet tillsammans. 56Fe-mätningen ger insikt i den långsiktiga järnöverföringen i moderkakan och embryolevern under hela graviditeten. Den totala placentagruppen 56Fe var liknande i grupperna med järnbrist och -fylld (figur 2A), medan det totala embryoleverjärnet minskade i gruppen med järnbrist (figur 2B). Detta förväntades baserat på den observerade minskningen av placenta FPN i den järnbristiga gruppen4, vilket skulle resultera i järnretention i moderkakan på bekostnad av embryot. Totalt 58Fe ger en ögonblicksbild av kortvariga järntransporter. I denna studie, liknande 56Fe, var placenta 58 Fe liknande i både järnbrist- och -fyllnadsgrupperna (figur 2C), och embryolever 58Fe minskade i gruppen med järnbrist (figur 2D). Dessa data indikerar att under järnbristgraviditet resulterar nedregleringen av placenta FPN i minskad järntransport till embryot, vilket leder till kumulativa skillnader i järninnehåll i moderkakan och embryot.

Det är viktigt att överväga den dos av järn som administreras eftersom det kan leda till oavsiktliga förändringar i hepcidinkoncentrationen eller järntransportöruttrycket31. Det visades att moderns järnbrist orsakade en minskning av placental FPN4. För att avgöra om Fe-Tf-injektion påverkade denna reglering mättes placenta FPN 6 timmar efter injektion med western blot. Järndosen på 5 μg var otillräcklig för att ändra placenta FPN-reglering genom moderns järnbrist (figur 3).

Sammanfattningsvis användes denna metod för att visa att fysiologisk reglering av placenta FPN under moderns järnbrist resulterar i minskad järntransport över moderkakan in vivo. Stabila järnisotoper utgör ett känsligt och kvantifierbart alternativ till radioaktivitet för mätning av transport och distribution av järn, vilket möjliggör samtidig användning av vävnader för ytterligare analyser.

Figure 2
Figur 2: 56Fe och 58Fe transport över moderkakan vid järnbrist eller järnfyllda graviditeter. Totalt 56Fe i moderkakan (A) och embryolever (B). Totalt 58Fe i moderkakan (C) och fosterlever (D). Statistisk analys utfördes med hjälp av ett 2-tailed Students t-test för normalt fördelade värden och i övrigt av Mann-Whitney U rank-sum test (betecknat med en asterisk efter P-värdet). Antalet djur anges i boxens x-axlar och whisker-tomter. Den övre delen av rutdiagrammet anger den 75:e percentilen och den nedre anger den 25:e percentilen. morrhår ovanför rutan anger den 90:e percentilen, och de under rutan anger den 10:e percentilen. Den heldragna linjen i rutan anger medianen och den streckade linjen medelvärdet. Statistisk analys utfördes med hjälp av vetenskaplig grafering och dataanalysprogramvara. Denna siffra har modifierats från4. Förkortning: Fe = järn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Placenta TFR1- och FPN-nivåer. (A) TFR1- och FPN-uttryck bedömdes med western blot i järnbrist och -fylld moderkaka 6 h efter behandling av mödrar med 58Fe-Tf. (B) Proteinuttrycket kvantifierades och presenterades som proteinuttryck i förhållande till β-aktin. Statistisk analys utfördes med hjälp av ett 2-tailed Students t-test för normalt fördelade värden. Antalet djur anges i boxens x-axlar och whisker-tomter. Den övre delen av rutdiagrammet anger den 75:e percentilen och den nedre anger den 25:e percentilen. morrhår ovanför rutan anger den 90:e percentilen, och de under rutan anger den 10:e percentilen. Den heldragna linjen i rutan anger medianen och den streckade linjen medelvärdet. Statistisk analys utfördes med hjälp av vetenskaplig grafering och dataanalysprogramvara. Denna siffra har modifierats från4. Förkortningar: TFR1 = transferrinreceptor; FPN = ferroportin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prov 56 Fe 58 Fe Totalt Fe
Koncentration [ng/ml eller mg, ppb] Koncentration [ng/ml eller mg, ppb] Summan av isotoper [ng/ml eller mg]
Genomsnitt* Stdev Genomsnitt* Stdev
Nonheme järn Moderkaka järnbrist 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
järnfylld 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Hej Moderkaka järnbrist 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
järnfylld 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Nonheme järn Embryo lever järnbrist 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
järnfylld 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Hej Embryo lever järnbrist 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
järnfylld 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tabell 1: Representativa resultat från ICP-MS-kvantifiering av 56 Fe och 58Fe i moderkakor och embryolever. Förkortningar: ppb = delar per miljard; stdev = standardavvikelse; ICP-MS = induktivt kopplad plasmamasspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Järn är viktigt för många biologiska processer, och dess rörelse och fördelning i kroppen är mycket dynamiska och reglerade. Stabila järnisotoper ger ett konsekvent och bekvämt alternativ till radioaktiva isotoper för bedömning av dynamiken hos järnhomeostas. Ett kritiskt steg i protokollet är att hålla reda på alla vävnadsvikter och volymer. Järn är ett grundämne och kan därför inte syntetiseras eller brytas ner. Således, om alla vikter och volymer loggas noggrant, kan allt järn i systemet redovisas genom beräkning. Som beskrivits kan denna metod användas för att skilja mellan heme och nonheme järnkällor. Om denna åtskillnad mellan järnformer inte är nödvändig och endast totalt järn mäts, kan protokollet förenklas genom att vävnad endast behandlas med koncentreradHNO3 enligt beskrivningen i protokollsteg 4.2. Det är viktigt att notera att om vävnader inte perfuseras före analys, särskilt mycket vaskulära vävnader som placentan, kan närvaron av blod resultera i överskattning av vävnadshemjärnhalten.

Transferrinbundet järn valdes ut för studien eftersom det är den viktigaste källan till järn som tas upp av moderkakan16,17. Global knockdown av TFR1 hos möss resulterade i embryonal dödlighet före E12.5, vilket tyder på att transferrinbundet järn är avgörande för utveckling. Det är möjligt att andra järnarter, såsom ferritin och nontransferrinbundet järn (NTBI), också bidrar till fostrets järnbegåvning i mindre utsträckning. Bidraget från dessa alternativa järnarter bedömdes dock inte. I framtiden kan stabila isotoper användas för att bestämma olika järnkällors bidrag till utveckling och embryojärn.

Syftet med studien var att bestämma effekterna av förändringar i moderns järnstatus på placenta järntransport. Minskad hepcidin under järnbrist resulterar dock i förhöjda enterocyt-FPN-nivåer och förbättrad järntransport i cirkulationen1. Således, i järnbristdammar, skulle järnabsorptionen från kosten i sig ha ökat och förvirrat tolkningen av resultaten om 58Fe administrerades oralt. Således valdes intravenös administrering av 58Fe-Tf eftersom den kringgår järnreglering vid nivån av intestinal absorption. En dos på 5 μg 58Fe/mus valdes baserat på serumjärnkoncentrationer av järnfyllda E18,5 dräktiga dammar. I dräktiga dammar av vildtyp C57BL/6 E18.5 varierar serumjärnkoncentrationerna från 10 till 50 μM4. En gravid E18.5-mus förväntas ha cirka 2 ml total blodvolym32. Således varierar den totala mängden järn i cirkulationen av järnfyllda gravida dammar från 1,1 till 5,6 μg. Således motsvarar 5 μg 58Fe/mus fysiologiska koncentrationer som observerats hos järnfyllda djur.

En begränsning av ICP-MS-detektion på 58 Fe är den isobariska störningen från 58Ni. Endogena Ni-koncentrationer i moderkakan hos mus är 0,04 ± 0,02 μg/g våtvikt33. En genomsnittlig E18.5 mus placenta väger 0.080 g; därför är den totala mängden Ni cirka 3,2 ng. Det naturliga överflödet av 58 Ni är 68%; således är mängden 58 Ni i musmoderkakan ~ 2,2 ng, vilket är ungefär 10 gånger lägre än de detekterade 58Fe-nivåerna. I embryot är Ni-koncentrationerna ännu lägre vid 0,01 ± 0,01 μg/g våtvikt33. Det genomsnittliga E18.5-musembryot väger 1 g; således är den totala mängden Ni i ett normalt musembryo cirka 10 ng. Förutsatt att allt embryo Ni finns i embryolevern är dessa nivåer fortfarande 10 gånger lägre än de 58Fe-koncentrationerna och nästan 1 000 gånger lägre än det totala järninnehållet i embryolever. Med tanke på det lägre överflödet av Ni i dessa musvävnader beaktades inte 58Ni-interferens i denna studie.

Ett ytterligare övervägande är analysens detektionsgräns. Detektionsgränsen i denna studie var 250 pg/ml 58Fe. Detta gränsvärde kan dock ändras för att detektera ännu lägre koncentrationer på 58Fe om utspädningen av vävnader minskas vid vävnadsbehandlingssteget (protokollsteg 4.1.2 och figur 1D) eller genom modifieringar vid ICP-MS-kärnanläggningen. När 58 Fe mättes i hela embryot upptäcktes inte dess nivåer eftersom koncentrationen på 58Fe låg under detektionsgränsen. 58 Fe upptäcktes dock i embryolevern, som är det primära järnlagringsorganet. Det är möjligt att administrering av en större dos på 58 Fe skulle ha möjliggjort detektion av 58Fe även i hela embryot. En relativt liten mängd 58Fe användes dock för att undvika järnbelastning av moderkakan, vilket kan utlösa återkopplingsmekanismer och förändra uttrycket av järntransportörer. I denna modell, som använde vildtyp C57BL/6-möss, mättes embryoleverjärn som en återspegling av total placentajärntransport, eftersom embryoleverjärnkoncentrationen är proportionell mot hela embryojärnkoncentrationen4. Men i musmodeller där järnfördelningen förändras34 kan det hända att enbart embryoleverjärn inte exakt representerar den totala järntransporten i placentan. I sådana fall kan det vara nödvändigt att mäta järn som ingår i hela embryot eller erytrocytfacket. Dessutom kommer variationer i experimentella tidpunkter också att kräva ytterligare optimering och mätning av järn i olika fosterfack. Denna stabila isotopspårningsmetod användes för att kvantifiera järntransport under musgraviditet. Metodiken är lätt att anpassa för att studera järntransport hos icke-gravida möss och andra djurmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN är en vetenskaplig medgrundare av Intrinsic LifeSciences och Silarus Pharma och konsult för Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics och Disc Medicine. VS förklarar inga konflikter.

Acknowledgments

Författarna erkänner användningen av ICP-MS-anläggningen inom UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology i CNSI vid UCLA för deras hjälp med att optimera protokollet för 58Fe-mätningar. Studien stöddes av NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, till VS) och NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, till EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

Biologi utgåva 183
Kvantifiering av järntransport över musmoderkakan <em>in vivo</em> med hjälp av icke-radioaktiva järnisotoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter