Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد كمية نقل الحديد عبر مشيمة الفأر في الجسم الحي باستخدام نظائر الحديد غير المشعة

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

توضح هذه المقالة كيفية تحضير وإدارة الحديد النظيري غير المشع المرتبط بالترانسفيرين لدراسات نقل الحديد في حمل الفئران. كما تم وصف نهج قياس الحديد النظيري في مقصورات الجنين.

Abstract

الحديد ضروري لصحة الأم والجنين أثناء الحمل ، مع ما يقرب من 1 غرام من الحديد اللازم في البشر للحفاظ على حمل صحي. يعتمد وقف الحديد الجنيني كليا على نقل الحديد عبر المشيمة ، ويمكن أن تؤدي اضطرابات هذا النقل إلى نتائج سلبية للحمل. في الفئران ، اعتمد قياس تدفقات الحديد عبر المشيمة تقليديا على نظائر الحديد المشعة ، وهو نهج حساس للغاية ولكنه مرهق. توفر نظائر الحديد المستقرة (57Fe و 58Fe) بديلا غير مشع للاستخدام في دراسات الحمل البشري.

في ظل الظروف الفسيولوجية، يكون الحديد المرتبط بالترانسفيرين هو الشكل السائد من الحديد الذي تمتصه المشيمة. وهكذا ، تم تحضير 58Fe-transferrin وحقنه عن طريق الوريد في السدود الحوامل لتقييم نقل الحديد المشيمي مباشرة وتجاوز امتصاص الحديد المعوي للأم كمتغير مربك. تم قياس كمية الحديد النظيري في الأنسجة الجنينية للمشيمة والفأر بواسطة قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-MS). يمكن أيضا استخدام هذه الطرق في أنظمة النماذج الحيوانية الأخرى لعلم وظائف الأعضاء أو المرض لتحديد ديناميكيات الحديد في الجسم الحي .

Introduction

الحديد أمر بالغ الأهمية لعمليات التمثيل الغذائي المختلفة ، بما في ذلك النمو والتنمية ، وإنتاج الطاقة ، ونقل الأكسجين1. الحفاظ على توازن الحديد هو عملية ديناميكية ومنسقة. يتم امتصاص الحديد من الطعام في الاثني عشر ونقله في جميع أنحاء الجسم في الدورة الدموية المرتبطة ببروتين نقل الحديد ترانسفيرين (Tf). يتم استخدامه من قبل كل خلية للعمليات الأنزيمية ، ودمجها في الهيموغلوبين في كريات الدم الحمراء الوليدة ، وإعادة تدويرها من كريات الدم الحمراء القديمة بواسطة البلاعم. يتم تخزين الحديد في الكبد عندما يكون زائدا ويفقد من الجسم من خلال النزيف أو تقشير الخلايا. كمية الحديد المتداولة هي نتيجة التوازن بين استهلاك وتوريد الحديد ، ويتم تنظيم هذا الأخير بإحكام بواسطة هرمون الكبد hepcidin (HAMP) ، المنظم المركزي لتوازن الحديد1. يعمل الهيبسيدين على الحد من التوافر البيولوجي للحديد في الدم عن طريق سد أو إحداث الوجود في كل مكان وتدهور فيروبورتين المصدر للحديد (FPN)2. يؤدي انخفاض FPN الوظيفي إلى انخفاض امتصاص الحديد الغذائي ، وعزل الحديد في الكبد ، وانخفاض إعادة تدوير الحديد من الضامة1.

يتم تنظيم Hepcidin من خلال حالة الحديد ، والالتهاب ، ومحرك الكريات الحمر ، والحمل (تمت مراجعته في 3). بالنظر إلى أن توازن الحديد ديناميكي للغاية ، فمن المهم فهم وقياس إجمالي تجمع الحديد وتوزيع الحديد ودورانه. اعتمدت الدراسات على الحيوانات تقليديا على نظائر الحديد المشعة ، وهو نهج حساس للغاية ولكنه مرهق لقياس ديناميكيات الحديد. ومع ذلك ، في الدراسات الحديثة ، بما في ذلك الدراسة المقدمة هنا4 ، يتم استخدام نظائر الحديد غير المشعة والمستقرة (58Fe) لقياس نقل الحديد أثناء الحمل5،6،7،8،9. النظائر المستقرة هي أدوات قيمة لدراسة استقلاب المغذيات (تمت مراجعتها في 10). أظهر استخدام نظائر الحديد المستقرة في الدراسات البشرية أن أ) زيادة امتصاص الحديد في نهاية الحمل5،6 ، ب) نقل الحديد الغذائي إلى الجنين يعتمد على حالة الحديد الأم7 ، ج) يتم دمج حديد الهيم المبتلع من قبل الأم بسهولة أكبر من قبل الجنين من الحديد غير الهيم 8 ، و د) يرتبط نقل الحديد إلى الجنين سلبا بمستويات هيبسيدين الأم8 ، 9. قامت هذه التجارب بقياس نظائر الحديد في الأمصال أو دمجها في كرات الدم الحمراء. ومع ذلك ، فإن قياس الحديد المدمج في كرات الدم الحمراء وحده قد يقلل من امتصاص الحديد الحقيقي9. في الدراسة الحالية ، يتم قياس كل من حديد الهيم وغير الهيم في الأنسجة.

أثناء الحمل ، الحديد مطلوب لدعم توسيع حجم خلايا الدم الحمراء للأم ونقلها عبر المشيمة لدعم نمو الجنينوتطوره 11. يعتمد الوقف الحديدي الجنيني كليا على نقل الحديد عبر المشيمة. خلال الحمل البشري12 والقورضا 4,13 ، تنخفض مستويات الهيبسيدين بشكل كبير ، مما يزيد من توافر الحديد في البلازما لنقله إلى الجنين.

تم وصف أساسيات نقل الحديد المشيمي في البداية في 1950s-70s باستخدام المتتبعات المشعة (59Fe و 55Fe). حددت هذه الدراسات أن نقل الحديد عبر المشيمة أحادي الاتجاه 14,15 وأن الترانسفيرين ثنائي الهديريك هو مصدر رئيسي للحديد للمشيمة والجنين 16,17. الفهم الحالي لنقل الحديد المشيمي أكثر اكتمالا ، على الرغم من أن بعض ناقلات الحديد الرئيسية والآليات التنظيمية لا تزال غير معروفة. كانت نماذج الماوس ضرورية لفهم تنظيم الحديد ونقله18 لأن الناقلات والآليات الرئيسية متشابهة بشكل ملحوظ. كل من المشيمة البشرية والفأر هي hemochorial ، أي أن دم الأم على اتصال مباشر مع مشيمية الجنين19. ومع ذلك ، هناك بعض الاختلافات الهيكلية الملحوظة.

الأرومة الغاذية المخلوية هي طبقة الخلايا المشيمة التي تفصل بين الدورة الدموية للأم والجنين وتنقل بنشاط الحديد والمواد المغذية الأخرى20. في البشر ، الأرومة المخلوية هي طبقة واحدة من الخلايا المنصهرة. في المقابل ، تتكون مشيمة الفأر من طبقتين من الأرومة الغاذية المخلوية21 ، Syn-I و Syn-II. ومع ذلك ، تسمح تقاطعات الفجوة في واجهة Syn-I و Syn-II بنشر العناصر الغذائية بين الطبقات22,23. وبالتالي ، تعمل هذه الطبقات كطبقة مخلوية واحدة مماثلة للأبلاست المخلوي الخلوي. تمت مراجعة أوجه التشابه والاختلاف الإضافية بين المشيمة البشرية والفأرية بواسطة Rossant و Cross21. يتم تشغيل نقل الحديد المشيمي عن طريق ربط الحديد-Tf من دم الأم إلى مستقبل الترانسفيرين (TfR1) الموضعي على الجانب القمي من الأرومة الغاذية المخلوية24. يؤدي هذا التفاعل إلى استيعاب الحديد-Tf / TfR1 عبر الالتداخل الخلوي بوساطة الكلثرين25. ثم يتم إطلاق الحديد من Tf في الإندوسومالحمضي 26 ، ويتم اختزاله إلى حديد حديدي بواسطة فيريراختزال غير محدد ، ويتم تصديره من الإندوسوم إلى السيتوبلازم بواسطة ناقل لم يتم تحديده بعد. كيف يتم مرافقة الحديد داخل الأرومة الغاذية المخلوية لا يزال يتعين وصفها. يتم نقل الحديد في نهاية المطاف إلى جانب الجنين بواسطة مصدر الحديد ، FPN ، الموضعي على السطح القاعدي أو المواجه للجنين من الأرومة المخلوية (تمت مراجعته في27).

لفهم كيفية تأثير التنظيم الفسيولوجي والمرضي ل TfR1 و FPN والهيبسيدين على نقل الحديد المشيمي ، تم استخدام نظائر الحديد المستقرة لتحديد كمية نقل الحديد من الدورة الدموية للأم إلى المشيمة والجنين في الجسم الحي4. تقدم هذه الورقة طرق تحضير وإعطاء ترانسفيرين الحديد النظيري للفئران الحوامل، ومعالجة الأنسجة من أجل ICP-MS، وحساب تركيزات الحديد في الأنسجة. يمكن تكييف استخدام نظائر الحديد المستقرة في الجسم الحي للتحقيق في تنظيم الحديد وتوزيعه في نماذج حيوانية مختلفة للتحقيق في تنظيم الحديد الفسيولوجي والمرضي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية والإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس.

1. إعداد 58Fe-TF

ملاحظة: يستخدم البروتوكول 58Fe; ومع ذلك ، يمكن استخدام بروتوكول مماثل ل 57Fe. يمكن استخدام أي من النظيرين والتخلص منهما كمادة كيميائية قياسية للحديد دون احتياطات إضافية.

  1. قم بإذابة 58 Fe في 12 N HCl عند 50 ميكرولتر من HCl / mg من 58Fe.
    1. أضف حمض الهيدروكلوريك إلى المعدن الموجود في القارورة الزجاجية التي يوفرها البائع ، واستبدل الغطاء بشكل غير محكم. لإذابة المكواة ، قم بتسخين محلول 58Fe / HCl إلى 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إذا لم يذوب بعد ، اترك المحلول طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان ليذوب.
      ملاحظة: محلول 58Fe / HCl المذاب لونه برتقالي مصفر.
      Fe3O4 (s) + 8HCl (aq) → Fe (II) Cl 2 (aq) + 2Fe (III) Cl 3 (aq) + 4H2 O
  2. أكسدة أي Fe(II)Cl2 متبق لتوليد محلول Fe(III)Cl3 .
    1. قم بتسخين محلول 58Fe / HCl إلى 60 درجة مئوية مع إزالة الغطاء لتسهيل الأكسدة.
    2. أضف 1 ميكرولتر من 35٪ H 2 O2لكل 50 ميكرولتر من محلول 58Fe / HCl لتسهيل الأكسدة بشكل أكبر.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. تحضير محلول كلوريد الحديديك (58Fe(III)Cl3).
    1. اترك محلول كلوريد الحديديك في الغطاء عند 60 درجة مئوية مع إزالة الغطاء لتبخير العينة.
      ملاحظة: قد يستغرق التبخر ما بين يوم وعدة أيام.
    2. أعد تكوين 58Fe(III)Cl 3 إلى 100 mM باستخدام H 2 O فائق النقاء، واحسب كمية H 2 O فائقة النقاء المطلوبة بناء على وزن المعدن الأولي المستخدم في الخطوة 1.1 (الوزن الجزيئي 58Fe(III)Cl3 هو 162.2).
  4. تحضير 58 Fe(III)-nitrilotriacetate (NTA) عن طريق احتضان 58Fe(III)Cl 3 مع NTA بنسبة مولار 1:5 في وجود 20 mM NaHCO3.
    1. تحضير 500 mM NTA في 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
    2. قم بإعداد 5x محلول تحميل ترانسفيرين (0.5 م HEPES ، درجة حموضة 7.5 ؛ 0.75 م كلوريد الصوديوم).
    3. تحضير 1 M NaHCO3 في H2O.
    4. إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، أضف 150 ميكرولتر من محلول 100 mM 58 Fe (III) Cl 3 (من الخطوة 1.3.2) ، و 150 ميكرولتر من 500 mM NTA المحضر في 1 N NaOH ، و 480 ميكرولتر من H2O عالي النقاء ، و 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الترانسفيرين 5x، و 20 ميكرولتر من محلول 1 M NaHCO3.
    5. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتحميل apo-Tf مع 58 Fe (III) -NTA لتشكيل 58Fe-Tf.
    ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من مكارثي وكوزمان28.
    1. قم بإذابة 500 مجم من apo-Tf في 4 مل من المخزن المؤقت لتحميل 1x Tf.
    2. إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل في الخطوة 1.4.4 الذي يحتوي على 1 مل من محلول 58Fe(III)-NTA، أضف 4 مل من محلول apo-Tf.
      ملاحظة: هذه نسبة مولار 3: 1 تبلغ 58Fe-NTA مع apo-Tf. كل Tf يحتوي على 2 مواقع ربط Fe ؛ تمت إضافة 58Fe-NTA الزائدة لضمان تحميل Tf بالكامل.
    3. للسماح بالتحميل الأقصى ل 58Fe-NTA على apo-Tf ، تحقق من أن المحلول عند الرقم الهيدروجيني 7.5 ، واضبط الرقم الهيدروجيني ، إذا لزم الأمر ، باستخدام NaHCO3 أو HCl.
    4. احتضان لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإزالة 58Fe (III) -NTA الزائدة غير المنضمة و NTA التي تم إصدارها.
    1. انقل محلول 58Fe-Tf إلى عمود قطع الوزن الجزيئي (قطع 30 كيلو دالتون) وأجهزة الطرد المركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل العمود ب 10 مل من 1x مخزن مؤقت وجهاز طرد مركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسيل والطرد المركزي ، وقم بإجراء غسل ملحي مع 10 مل من المحلول الملحي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2500 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. احسب تركيز 58Fe-Tf.
    ملاحظة: نظرا لإضافة 58Fe الزائدة في الخطوة 1.5.2 ، افترض أن كل الترانسفيرين ثنائي التوجيه. كما تم استخدام 500 ملغ من apo-Tf ، ~ 500 ملغ 58Fe-Tf تم إنتاجه في الخطوة 1.5.4.
    1. قم بقياس الحجم المستعاد من الطرد المركزي بعد غسل المحلول الملحي في الخطوة 1.6.2.
    2. قسم 500 مجم على الحجم المسترد لتحديد تركيز (ملغم / مل) من محلول 58Fe-Tf.
  8. تعقيم محلول 58Fe-Tf باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر ؛ يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
    ملاحظة: تم استخدام محلول 58Fe-Tf بين 1 إلى 4 أسابيع بعد التحضير.

2. إعداد حمل الفأر الموقوت

  1. استخدم إناث الفئران التي يبلغ عمرها من 6 إلى 8 أسابيع. ضع الحيوانات على نظام غذائي منخفض الحديد (4 جزء في المليون من الحديد) أو تشاو القياسي (185 جزء في المليون من الحديد) لمدة 2 أسابيع قبل التزاوج والحفاظ على الحيوانات على الوجبات الغذائية المعنية طوال فترة الحمل.
  2. الخيار 01: تأكيد الحمل عن طريق زيادة الوزن في E7.5.
    1. إنشاء أقفاص تربية متعددة. لكل قفص ، والجمع بين 2 الإناث مع 1 الذكور بين عشية وضحاها. يعتبر اليوم التالي عندما يتم فصل الحيوانات اليوم الجنيني (E) 0.5. وزن الإناث في E7.5 لتحديد ما إذا كنت حاملا. تزاوج الذكور مرة أخرى مع الإناث التي لم تكتسب وزنا.
      ملاحظة: في WT C57BL / 6 ، تعد زيادة الوزن بمقدار 1 جم عند E7.5 مؤشرا جيدا على الحمل. تضمن هذه الطريقة حدوث الزرع في إطار زمني محدد مدته 16 ساعة ، مما يسمح بالعلاج المتزامن لجميع الحيوانات التي أصبحت حاملا خلال نفس فترة التزاوج.
  3. الخيار 02: تأكيد الحمل عن طريق فحص المكونات.
    1. الجمع بين 2 الإناث مع 1 ذكر وإجراء فحوصات المكونات اليومية لتحديد ما إذا كان الجماع قد حدث.
      ملاحظة: قد تؤدي هذه الطريقة إلى حالات حمل متداخلة ، ولا يضمن وجود سدادة الحمل.

3. إدارة 58Fe-Tf عن طريق الوريد إلى الفئران الحوامل E17.5

  1. تحضير 58Fe-Tf من الخطوة 1.8 للحقن.
    1. تحضير محلول 58Fe-Tf عند 35 ملغم / مل في محلول ملحي ؛ حقن 100 ميكرولتر لكل ماوس.
    2. املأ حقنة الأنسولين ب 100 ميكرولتر من محلول 58Fe-Tf.
      ملاحظة: كل جرعة تحتوي على 3.5 ملغ من الإنسان58 Fe-Tf (5 ميكروغرام من 58Fe).
  2. تخدير الفأر الحامل باستخدام إيزوفلوران.
    1. استخدم منظم إيزوفلوران مع غرفة.
    2. استخدم الإعدادات التالية: 5٪ إيزوفلوران ، 2 لتر / مل من O 2 ،2 دقيقة.
    3. تأكد من تخدير الفأر من خلال البحث عن عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
    4. ضع مادة تشحيم العين على سطح العين وضع الماوس على وسادة التدفئة.
  3. حقن ببطء وبعناية محلول 58Fe-Tf في الجيب المداري الرجعي.
  4. السماح للفأر بالتعافي من التخدير ؛ لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على راقد القص.
  5. ست ساعات بعد الحقن ، القتل الرحيم E17.5 الإناث الحوامل عن طريق جرعة زائدة من إيزوفلوران.
    1. إجراء ثقب في القلب لexsanguinate الفأر كشكل من أشكال القتل الرحيم الثانوي.
    2. دبوس القدمين لأسفل مع الإبر لتحقيق الاستقرار.
  6. جمع المشيمة وكبد الجنين.
    1. باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح ، قم بإزالة الرحم بعناية من الفأر الحامل. قطع وحدة المشيمة الجنينية المشيمة ، والتي تتكون من جنين واحد ومشيمة في الكيس الأمنيوسي محاط بجزء من الرحم.
    2. قطع بعناية من خلال الرحم والكيس الأمنيوسي دون إزعاج الجنين والمشيمة.
    3. قشر الكيس الأمنيوسي وإزالة الجنين والمشيمة.
    4. قطع الحبل السري.
    5. امسح الجنين والمشيمة بمهمة نظيفة لإزالة السائل الأمنيوسي الزائد.
    6. سجل أوزان المشيمة بأكملها.
    7. اقطعي كل مشيمة إلى نصفين بشفرة حلاقة ، ضعي كل نصف في أنبوب سعة 2.0 مل ، وجمديها في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: نظرا لأن 58 Fe لا يتطلب احتياطات مناولة خاصة والتخلص ، يمكن استخدام نصف المشيمة لقياس 58Fe والنصف الآخر لأي تحليلات أخرى ، بما في ذلك القياس الكمي لمستقبلات الترانسفيرين (TFR1) وتعبير الفيروبورتين (FPN) عن طريق النشاف الغربي و qPCR.
    8. لجمع كبد الجنين ، ضحي بالجنين: استخدم شفرة حلاقة لقطع رأس الجنين بسرعة.
      ملاحظة: في E17.5 ، يجب القتل الرحيم لجميع الأجنة في الرحم بشكل فردي ، حتى لو لم يتم استخدامها في الدراسة.
    9. ثبت الجنين لتحقيق الاستقرار ، وترك البطن مكشوفا.
    10. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل شق صغير حيث تم توصيل الحبل السري ، وأدخل أحد طرفي مقص التشريح في الشق ، وقم بإجراء قطع مستوى متوسط باتجاه المستوى الإكليلي حوالي 1/4 بوصة. بعد ذلك ، قم بإجراء جروح مستعرضة لفضح كبد الجنين.
    11. استخدم ملقط لإزالة كبد الجنين.
    12. سجل أوزان كبد الجنين كله.
    13. ضع كبد الجنين بالكامل في أنابيب سعة 2 مل وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام جزء فقط من كبد الجنين لقياس 58Fe إذا كانت هناك حاجة إلى تحليلات إضافية. يسمح استخدام أنابيب سعة 2.0 مل بتجانس الأنسجة بشكل أفضل من الأنابيب سعة 1.5 مل.
  7. قم بتخزين المناديل إلى أجل غير مسمى عند -80 درجة مئوية.

4. معالجة الأنسجة لتحليل الحديد الكمي بواسطة ICP-MS

  1. معالجة المشيمة وكبد الجنين لتحديد كمية الحديد غير الهيم.
    1. إذابة نصفي المشيمة وكبد الجنين الكامل ، ووزن نصفي المشيمة (انظر الخطوة 3.6.12 لتسجيل أوزان كبد الجنين).
    2. أضف 400 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين (0.53 N HCl ، 5.3٪ TCA).
    3. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الكهربائي.
    4. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    5. تبريد العينات في الماء درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    6. افتح الأغطية لتحرير الضغط ، ثم أغلق الأنابيب مرة أخرى.
    7. جهاز طرد مركزي بسرعة 17000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحطام أنسجة الحبيبات.
    8. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد مسمى.
    9. إرسال عينات لتحليل ICP-MS.
  2. معالجة المشيمة وكبد الجنين لتحديد كمية حديد الهيم.
    ملاحظة: بعد استخراج الحديد غير الهيم في الخطوة 1 ، يكون الحديد المتبقي في الحبيبات هو في الغالب الهيم.
    1. سجل وزن كل حبيبة من الخطوة 4.1.7.
    2. هضم الكريات في 10 مل من 70٪ HNO3 المركزة مع 1 مل من 30٪ H 2 O2
      ملاحظة: التشاور مع مركز أو مركز ICP-MS لتحسين حجم HNO3 لدراسات محددة ؛ سيعتمد الحجم جزئيا على وزن العينة.
    3. سخني العينات إلى 200 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. أرسل العينات لتحليل ICP-MS.
      ملاحظة: إذا لم يكن التمييز بين مصادر الحديد الهيم وغير الهيم مطلوبا وتم قياس الحديد الكلي فقط ، فيمكن هضم الأنسجة الكاملة في HNO3 كخطوة أولى.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: قدمت البيانات المستمدة من برنامج المقارنات الدولية MS على شكل تركيزات 56Fe و 58Fe في نانوغرام / مل أو ملغم ، جزء في البليون (الجدول 1). 56 الحديد هو نظير الحديد الأكثر وفرة في الطبيعة ، ويعكس قياسه تراكم الحديد في المشيمة / الجنين طوال فترة الحمل ، بينما يعكس قياس 58Fe الحديد الذي تم نقله خلال 6 ساعات بعد الحقن.

  1. اطرح الوفرة الطبيعية ل 58 Fe (0.28٪ من إجمالي Fe) من قيم 58Fe المقاسة.
  2. احسب إجمالي nonheme 58Fe.
    1. احسب إجمالي الحديد غير الهيم للكبد الجنيني (ng) بضرب تركيز الحديد (ng / mL) المحسوب في الخطوة 5.1 بالحجم (mL) أثناء المعالجة الأولية في الخطوة 4.1.2 لتقدير إجمالي 58Fe.
    2. احسب كمية الحديد في المشيمة بأكملها بأخذ الوزن الكلي للمشيمة المقاسة في الخطوة 3.6.6 وقسمتها على وزن المشيمة المعالجة في الخطوة 4.1.1. اضرب هذه القيمة في إجمالي الحديد غير الهيم (ng) المحسوب في الخطوة 5.2.1 للحصول على إجمالي محتوى nonheme 58Fe للمشيمة.
  3. حساب مجموع الهيم 58الحديد.
    1. احسب إجمالي الهيم 58Fe بضرب تركيز الحديد (ng / mg) المحسوب في الخطوة 5.1 بوزن الحبيبات (بالملغم) المقاس في الخطوة 4.2.1.
    2. بعد ذلك, قسم الوزن الإجمالي للمشيمة المقاسة في الخطوة 3.5.1 على وزن حبيبات المشيمة المقاسة في الخطوة 4.2.1. اضرب هذه القيمة في إجمالي حديد الهيم (ng) المحسوب في الخطوة 5.3.1 للحصول على إجمالي محتوى الهيم 58Fe للمشيمة.
  4. اجمع قيم nonheme و heme 58Fe المحسوبة لتحديد إجمالي محتوى الحديد لكل نسيج.

Figure 1
الشكل 1: ملخص مرئي للخطوات في البروتوكول. (أ) تحضير 58مادة Fe-transferrin. (ب) إعطاء 58Fe-transferrin. ج: جمع الأنسجة وتخزينها. (د) معالجة المشيمة وكبد الجنين لتحديد كمية الأنواع المعدنية بواسطة ICP-MS. الاختصارات: Fe = حديد. NTA = حمض النيتريلوتريسيتيك. Tf = ترانسفيرين ؛ PPS = محلول ترسيب البروتين ؛ سوب = طاف ؛ TCA = حمض ثلاثي كلورو الخليك ؛ ICP-MS = مطياف كتلة البلازما المقترن بالحث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أظهرت دراسة سابقة باستخدام نظائر الحديد المستقرة لقياس انتقال الحديد أن نقص الحديد الأمومي أدى إلى انخفاض تنظيم مصدر الحديد المشيمة ، FPN4. FPN هو المصدر الوحيد المعروف للحديد في الثدييات ، ويؤدي غياب FPN أثناء التطور إلى موت الجنين قبل E9.529. لتحديد ما إذا كان الانخفاض الملحوظ في تعبير FPN يترجم وظيفيا إلى انخفاض نقل الحديد المشيمي ، تم حقن 58Fe-Tf عن طريق الوريد في السدود الحوامل ، وتم تحديد الحديد في المشيمة والجنين في وجود نقص الحديد الأمومي.

لفهم كيفية تأثر نقل الحديد المشيمي بحالة الحديد الأمومية ، تم نمذجة نقص الحديد في الفئران4. تم وضع إناث الفئران C57BL / 6 على نظام غذائي منخفض الحديد (4 جزء في المليون من الحديد) أو تشاو القياسي (185 جزء في المليون من الحديد) لمدة 2 أسابيع قبل وطوال فترة الحمل. ينتج عن هذا النظام الغذائي انخفاض الحديد غير الهيم في كبد الأم وحديد المصل والهيموجلوبين عند E12.5 و E15.5 و E18.5 مقارنة بالحيوانات التي تتبع نظاما غذائيا قياسيا4. في E18.5 ، كان لدى الأجنة من الأمهات اللواتي يعانين من نقص الحديد انخفاض في حديد الكبد وكانت ناقصة الحديد وفقر الدم من أجنة الأمهات المليئة بالحديد. تم استخدام ثلاثة فئران حامل في كل من المجموعات المليئة بالحديد ونقص الحديد ، وتم استخدام 2-3 مشيمة من كل فأر حامل للتحليل.

لتحديد كمية نقل الحديد المشيمي ، تم تحضير 58Fe-transferrin وحقنه عن طريق الوريد في السدود الحوامل و 58Fe تم قياسه في المشيمة وكبد الجنين بواسطة ICP-MS ، كما هو موضح في البروتوكول والموضح في الشكل 1. قبل إرسال عينات الحديد غير الهيم لتحليل ICP-MS ، تم تحديد إجمالي مستويات الحديد غير الهيم بشكل مستقل عبر طريقة فيرين الموصوفة سابقا30. كانت تركيزات الحديد غير الهيم المقاسة بواسطة طرق الفرين مقابل ICP-MS مرتبطة بشكل كبير في جميع الأنسجة المقاسة (R2 = 0.94 ، P < 0.0001 ، n = 36). وترد في الجدول 1 النتائج التمثيلية للقياس الكمي لنظائر الحديد في برنامج المقارنات الدولية. تم حساب إجمالي 58Fe كما هو موضح في الخطوة 5 من البروتوكول. يتم تقديم البيانات على أنها حديد كلي بدلا من حديد الهيم أو الحديد غير الهيم (الشكل 2A-D) لأن الهدف كان تحديد إجمالي الحديد المنقول إلى المشيمة والحديد الكلي المنقول إلى الجنين من المشيمة.

في المتوسط ، تم استرداد 21٪ من جرعة 58Fe المعطاة في المشيمة وكبد الجنين ومصل الأجنة مجتمعة. يوفر قياس 56Fe نظرة ثاقبة على نقل الحديد على المدى الطويل في المشيمة وكبد الجنين طوال فترة الحمل. كان إجمالي المشيمة 56Fe مشابها في المجموعات التي تعاني من نقص الحديد والمليء (الشكل 2 أ) ، في حين انخفض إجمالي حديد كبد الجنين في المجموعة التي تعاني من نقص الحديد (الشكل 2 ب). كان هذا متوقعا بناء على الانخفاض الملحوظ في FPN المشيمي في المجموعة4 التي تعاني من نقص الحديد ، مما قد يؤدي إلى احتباس الحديد في المشيمة على حساب الجنين. يوفر Total 58Fe لقطة لنقل الحديد على المدى القصير. في هذه الدراسة ، على غرار 56Fe ، كانت المشيمة 58 Fe متشابهة في كل من المجموعات التي تعاني من نقص الحديد والمليئة (الشكل 2C) ، وتم تقليل كبد الجنين 58Fe في المجموعة التي تعاني من نقص الحديد (الشكل 2D). تشير هذه البيانات إلى أنه أثناء الحمل الذي يعاني من نقص الحديد ، يؤدي انخفاض تنظيم FPN المشيمي إلى انخفاض نقل الحديد إلى الجنين ، مما يؤدي إلى اختلافات تراكمية في محتوى الحديد في المشيمة والجنين.

من المهم النظر في جرعة الحديد التي يتم إعطاؤها لأنها قد تؤدي إلى تغييرات غير مقصودة في تركيز الهيبسيدين أو تعبير ناقل الحديد31. وقد ثبت أن نقص الحديد الأمهات تسبب في انخفاض في المشيمة FPN4. لتحديد ما إذا كان حقن Fe-Tf قد أثر على هذه اللائحة ، تم قياس المشيمة FPN بعد 6 ساعات من الحقن بواسطة اللطخة الغربية. كانت جرعة الحديد البالغة 5 ميكروغرام غير كافية لتغيير تنظيم FPN المشيمي بسبب نقص الحديد الأمومي (الشكل 3).

باختصار ، تم استخدام هذه الطريقة لإثبات أن التنظيم الفسيولوجي ل FPN المشيمي أثناء نقص الحديد لدى الأمهات يؤدي إلى انخفاض نقل الحديد عبر المشيمة في الجسم الحي. توفر نظائر الحديد المستقرة بديلا حساسا وقابلا للقياس الكمي للنشاط الإشعاعي لقياس نقل الحديد وتوزيعه ، مما يسمح بالاستخدام المتزامن للأنسجة لإجراء تحليلات إضافية.

Figure 2
الشكل 2: ينتقل 56Fe و 58Fe عبر المشيمة في حالات الحمل التي تعاني من نقص الحديد أو الحديد المليء بالحديد. إجمالي 56حديد في المشيمة (أ) وكبد الجنين (ب). إجمالي 58Fe في المشيمة (C) وكبد الجنين (D). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب 2-tailed للقيم الموزعة بشكل طبيعي وبخلاف ذلك عن طريق اختبار مجموع رتبة Mann-Whitney U (يشار إليه بعلامة النجمة بعد قيمة P). يشار إلى عدد الحيوانات في المحاور السينية للمربع ومؤامرات شارب. يشير الجزء العلوي من مخطط الصندوق إلى النسبة المئوية 75 ، ويشير الجزء السفليإلى النسبة المئوية 25 ؛ تشير الشعيرات الموجودة أعلى المربع إلى النسبة المئوية 90 ، وتشير تلك الموجودة أسفل المربعإلى النسبة المئوية 10. يشير الخط المتصل داخل المربع إلى الوسيط والخط المتقطع إلى المتوسط. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الرسوم البيانية العلمية وبرامج تحليل البيانات. تم تعديل هذا الرقم من4. اختصار: Fe = الحديد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: مستويات المشيمة TFR1 و FPN. (أ) تم تقييم تعبير TFR1 و FPN بواسطة اللطخة الغربية في المشيمة التي تعاني من نقص الحديد والمليئة بعد 6 ساعات من العلاج للأمهات المصابات ب 58Fe-Tf. (ب) تم تحديد تعبير البروتين كميا وتقديمه كتعبير بروتيني بالنسبة إلى β-actin. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب 2-tailed للقيم الموزعة بشكل طبيعي. يشار إلى عدد الحيوانات في المحاور السينية للمربع ومؤامرات شارب. يشير الجزء العلوي من مخطط الصندوق إلى النسبة المئوية 75 ، ويشير الجزء السفليإلى النسبة المئوية 25 ؛ تشير الشعيرات الموجودة أعلى المربع إلى النسبة المئوية 90 ، وتشير تلك الموجودة أسفل المربعإلى النسبة المئوية 10. يشير الخط المتصل داخل المربع إلى الوسيط والخط المتقطع إلى المتوسط. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام الرسوم البيانية العلمية وبرامج تحليل البيانات. تم تعديل هذا الرقم من4. الاختصارات: TFR1 = مستقبلات الترانسفيرين ؛ FPN = فيروبورتين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عينة 56 ف 58 ف توتال في
التركيز [نانوغرام / مل أو ملغ ، جزء في البليون] التركيز [نانوغرام / مل أو ملغ ، جزء في البليون] مجموع النظائر [نانوغرام / مل أو ملغ]
متوسط* ستيف متوسط* ستيف
الحديد غير الهيم مشيمة نقص الحديد 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
الحديد المليء 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
الهيم مشيمة نقص الحديد 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
الحديد المليء 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
الحديد غير الهيم كبد الجنين نقص الحديد 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
الحديد المليء 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
الهيم كبد الجنين نقص الحديد 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
الحديد المليء 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

الجدول 1: النتائج التمثيلية من تحديد كمية ICP-MS ل 56 Fe و 58Fe في المشيمة وكبد الجنين. الاختصارات: جزء في البليون = أجزاء في المليار ؛ stdev = الانحراف المعياري ؛ ICP-MS = مطياف كتلة البلازما المقترن بالحث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحديد مهم للعديد من العمليات البيولوجية ، وحركته وتوزيعه داخل الجسم ديناميكي للغاية ومنظم. توفر نظائر الحديد المستقرة بديلا ثابتا ومناسبا للنظائر المشعة لتقييم ديناميات توازن الحديد. الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي تتبع جميع أوزان الأنسجة وأحجامها. الحديد عنصر وبالتالي لا يمكن تصنيعه أو تكسيره. وبالتالي ، إذا تم تسجيل جميع الأوزان والأحجام بعناية ، فيمكن حساب كل الحديد داخل النظام عن طريق الحساب. كما هو موضح ، يمكن استخدام هذه الطريقة للتمييز بين مصادر الحديد الهيم وغير الهيم. ومع ذلك ، إذا لم يكن هذا التمييز بين أشكال الحديد ضروريا وتم قياس الحديد الكلي فقط ، فيمكن تبسيط البروتوكول عن طريق معالجة الأنسجة فقط باستخدام HNO3 المركز كما هو موضح في بروتوكول الخطوة 4.2. من المهم ملاحظة أنه إذا لم يتم تخلل الأنسجة قبل التحليل ، وخاصة الأنسجة الوعائية للغاية مثل المشيمة ، فقد يؤدي وجود الدم إلى المبالغة في تقدير محتوى الحديد في الهيم في الأنسجة.

تم اختيار الحديد المرتبط بالترانسفيرين للدراسة لأنه المصدر الرئيسي للحديد الذي تمتصه المشيمة16,17. أدت الضربة القاضية العالمية ل TFR1 في الفئران إلى فتك الجنين قبل E12.5 ، مما يشير إلى أن الحديد المرتبط بالترانسفيرين أمر بالغ الأهمية للتنمية. من الممكن أن تساهم أنواع الحديد الأخرى ، مثل الحديد المرتبط بالفيريتين والحديد غير المرتبط بالترانسفيرين (NTBI) ، في هبة الحديد الجنيني بدرجة أقل. ومع ذلك ، لم يتم تقييم مساهمة هذه الأنواع البديلة من الحديد. في المستقبل ، يمكن استخدام النظائر المستقرة لتحديد مساهمة مصادر الحديد المختلفة في التنمية وهبة الحديد الجنينية.

كان الهدف من الدراسة هو تحديد آثار التغيرات في حالة الحديد الأمومية على نقل الحديد المشيمي. ومع ذلك ، فإن انخفاض الهيبسيدين أثناء نقص الحديد يؤدي إلى ارتفاع مستويات FPN المعوية وتعزيز نقل الحديد إلى الدورة الدموية1. وهكذا ، في السدود التي تعاني من نقص الحديد ، كان من الممكن زيادة امتصاص الحديد من النظام الغذائي بطبيعته وتفسير مربك للنتائج إذا تم إعطاء 58Fe عن طريق الفم. وهكذا ، تم اختيار الحقن الوريدي ل 58Fe-Tf لأنه يتجاوز تنظيم الحديد على مستوى امتصاص الأمعاء. تم اختيار جرعة 5 ميكروغرام من 58Fe / فأر بناء على تركيزات الحديد في المصل من السدود الحوامل E18.5 المليئة بالحديد. في السدود الحامل C57BL / 6 E18.5 من النوع البري ، تتراوح تركيزات الحديد في الدم من 10 إلى 50 ميكرومتر4. من المتوقع أن يكون لدى الفأر الحامل E18.5 ما يقرب من 2 مل من إجمالي حجم الدم32. وبالتالي ، فإن إجمالي كمية الحديد في تداول السدود الحامل المليئة بالحديد يتراوح من 1.1 إلى 5.6 ميكروغرام. وبالتالي ، فإن 5 ميكروغرام من 58Fe / فأر تعادل التركيزات الفسيولوجية التي لوحظت في الحيوانات المليئة بالحديد.

أحد قيود اكتشاف ICP-MS ل 58 Fe هو التداخل متساوي الضغط من 58Ni. تركيزات النيكل الداخلية في مشيمة الفأر هي 0.04 ± 0.02 ميكروغرام / غرام من الوزن الرطب33. يبلغ متوسط وزن مشيمة الفأر E18.5 0.080 جم ؛ لذلك ، فإن إجمالي كمية Ni هو حوالي 3.2 نانوغرام. الوفرة الطبيعية ل 58 Ni هي 68٪ ؛ وبالتالي ، فإن مقدار 58 Ni في مشيمة الماوس هو ~ 2.2 نانوغرام ، وهو أقل بحوالي 10 أضعاف من مستويات 58Fe المكتشفة. في الجنين ، تكون تركيزات النيكل أقل عند 0.01 ± 0.01 ميكروغرام / غرام من الوزن الرطب33. يزن جنين الفأر E18.5 المتوسط 1 جم ؛ وبالتالي ، فإن إجمالي كمية النيكل في جنين الفأر الطبيعي هو حوالي 10 نانوغرام. بافتراض وجود كل الجنين Ni في كبد الجنين ، فإن هذه المستويات لا تزال أقل بمقدار 10 أضعاف من تركيزات الحديد البالغ عددها 58وأقل بنحو 1000 ضعف من إجمالي محتوى الحديد في كبد الجنين. بالنظر إلى انخفاض وفرة النيكل في أنسجة الفئران هذه ، لم يتم أخذ تدخل 58Ni في الاعتبار في هذه الدراسة.

هناك اعتبار إضافي هو حد اكتشاف الفحص. كان حد الكشف في هذه الدراسة 250 بيكوغرام / مل 58Fe. ومع ذلك ، يمكن تغيير هذا الحد للكشف عن تركيزات أقل من 58Fe إذا تم تقليل تخفيف الأنسجة في خطوة معالجة الأنسجة (خطوة البروتوكول 4.1.2 والشكل 1D) أو عن طريق التعديلات في المرفق الأساسي لبرنامج المقارنات الدولية-MS. عندما تم قياس 58Fe في الجنين بأكمله ، لم يتم اكتشاف مستوياته لأن تركيز 58Fe كان أقل من حد الكشف. ومع ذلك ، تم الكشف عن 58Fe في كبد الجنين ، وهو جهاز تخزين الحديد الأساسي. من الممكن أن يكون إعطاء جرعة أكبر من 58 Fe قد سمح باكتشاف 58Fe حتى في الجنين بأكمله. ومع ذلك ، تم استخدام كمية صغيرة نسبيا من 58Fe لتجنب تحميل الحديد للمشيمة ، مما قد يؤدي إلى آليات التغذية المرتدة وتغيير تعبير ناقلات الحديد. في هذا النموذج ، الذي استخدم الفئران البرية C57BL / 6 ، تم قياس حديد كبد الجنين كانعكاس لنقل الحديد المشيمي الكلي ، حيث يتناسب تركيز الحديد في كبد الجنين مع تركيز الحديد في الجنين بالكامل4. ومع ذلك ، في نماذج الفئران حيث يتم تغيير توزيع الحديد34 ، قد لا يمثل حديد كبد الجنين وحده بدقة إجمالي نقل الحديد المشيمي. في مثل هذه الحالات ، قد يكون من الضروري قياس الحديد المدمج في الجنين بأكمله أو مقصورة كرات الدم الحمراء. بالإضافة إلى ذلك ، ستتطلب الاختلافات في النقاط الزمنية التجريبية أيضا مزيدا من التحسين والقياس للحديد في مقصورات الجنين المختلفة. تم استخدام نهج تتبع النظائر المستقرة هذا لتحديد كمية نقل الحديد أثناء حمل الفئران. المنهجية قابلة للتكيف بسهولة لدراسة نقل الحديد في الفئران غير الحوامل والنماذج الحيوانية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN هو مؤسس علمي مشارك ل Intrinsic LifeSciences و Silarus Pharma ومستشار ل Protagonist و Vifor و RallyBio و Ionis و Shield Therapeutics و Disc Medicine. VS تعلن عدم وجود تعارضات.

Acknowledgments

يقر المؤلفون باستخدام مرفق ICP-MS داخل مركز UC للآثار البيئية لتكنولوجيا النانو في CNSI في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس لمساعدتهم في تحسين البروتوكول لقياسات 58Fe. تم دعم الدراسة من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) (K01DK127004 ، إلى VS) والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) (R01HD096863 ، إلى EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

علم الأحياء، العدد 183،
تحديد كمية نقل الحديد عبر مشيمة الفأر <em>في الجسم الحي</em> باستخدام نظائر الحديد غير المشعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter