Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantificering af jerntransport over musemoderkagen In Vivo ved hjælp af ikke-radioaktive jernisotoper

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Denne artikel demonstrerer, hvordan man forbereder og administrerer transferrinbundet ikke-radioaktivt isotopisk jern til undersøgelser af jerntransport i musegraviditet. Fremgangsmåden til kvantificering af isotopisk jern i fetoplacentale rum er også beskrevet.

Abstract

Jern er afgørende for moderens og fostrets sundhed under graviditeten, med ca. 1 g jern, der er nødvendigt hos mennesker for at opretholde en sund graviditet. Føtal jernbegavelse er helt afhængig af jernoverførsel over moderkagen, og forstyrrelser af denne overførsel kan føre til negative graviditetsresultater. Hos mus var måling af jernstrømme over moderkagen traditionelt afhængig af radioaktive jernisotoper, en meget følsom, men byrdefuld tilgang. Stabile jernisotoper (57Fe og 58Fe) er et ikke-radioaktivt alternativ til brug i graviditetsundersøgelser på mennesker.

Under fysiologiske forhold er transferrinbundet jern den dominerende form for jern, der optages af moderkagen. Således blev 58Fe-transferrin fremstillet og injiceret intravenøst i gravide dæmninger for direkte at vurdere placenta jerntransport og omgå maternel intestinal jernabsorption som en forvirrende variabel. Isotopisk jern blev kvantificeret i moderkagen og musens embryonale væv ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS). Disse metoder kan også anvendes i andre dyremodelsystemer af fysiologi eller sygdom for at kvantificere in vivo jerndynamik.

Introduction

Jern er afgørende for forskellige metaboliske processer, herunder vækst og udvikling, energiproduktion og ilttransport1. Vedligeholdelse af jernhomeostase er en dynamisk, koordineret proces. Jern absorberes fra mad i tolvfingertarmen og transporteres rundt i kroppen i cirkulationen bundet til jerntransportproteintransferrinet (Tf). Det bruges af hver celle til enzymatiske processer, inkorporeret i hæmoglobin i spirende erythrocytter og genbrugt fra alderen erythrocytter af makrofager. Jern opbevares i leveren, når det er overskydende og tabt fra kroppen gennem blødning eller cellesloughing. Mængden af jern i omløb er resultatet af balancen mellem forbruget og forsyningen af jern, hvor sidstnævnte er tæt reguleret af leverhormonet hepcidin (HAMP), den centrale regulator for jernhomeostase1. Hepcidin har til formål at begrænse jernbiotilgængeligheden i blodet ved at okkludere eller fremkalde ubiquitination og nedbryde jerneksportøren ferroportin (FPN)2. Reduktion i funktionel FPN fører til nedsat jernabsorption i kosten, jernbinding i leveren og nedsat jerngenanvendelse fra makrofager1.

Hepcidin reguleres af jernstatus, betændelse, erythropoietisk drev og graviditet (gennemgået i 3). I betragtning af at jernhomeostase er meget dynamisk, er det vigtigt at forstå og måle den samlede jernpulje og jernfordeling og omsætning. Dyreforsøg var traditionelt afhængige af radioaktive jernisotoper, en meget følsom, men byrdefuld tilgang til måling af jerndynamik. I nyere undersøgelser, herunder den her præsenteredeundersøgelse 4, anvendes imidlertid ikke-radioaktive, stabile jernisotoper (58Fe) til at måle jerntransport under graviditet 5,6,7,8,9. Stabile isotoper er værdifulde værktøjer til at studere næringsstofmetabolisme (gennemgået i 10). Anvendelsen af stabile jernisotoper i humane undersøgelser viste, at i) jernabsorptionen øges mod slutningen af drægtigheden5,6, ii) overførsel af jern i kosten til fosteret er afhængig af moderens jernstatus7, iii) maternelt indtaget hæmjern inkorporeres lettere af fosteret end nonheme jern 8, og iv) jernoverførsel til fosteret er negativt korreleret med moderens hepcidinniveauer 8, 9. Disse eksperimenter målte jernisotoper i sera eller deres inkorporering i RBC'er; måling af jern, der er inkorporeret i RBC'er alene, kan dog undervurdere ægte jernabsorption9. I den aktuelle undersøgelse måles både hæm og nonheme jern i væv.

Under graviditeten kræves jern for at understøtte udvidelsen af moderens røde blodlegemevolumen og til overførsel over moderkagen for at understøtte fostrets vækst og udvikling11. Føtal jernbegavelse er helt afhængig af jerntransport over moderkagen. Under human12 og gnaver 4,13 graviditet, hepcidin niveauer dramatisk falde, øge plasma jern tilgængelighed til overførsel til fosteret.

Grundlaget for placenta jerntransport blev oprindeligt karakteriseret i 1950'erne-70'erne ved hjælp af radioaktive sporstoffer (59Fe og 55Fe). Disse undersøgelser fastslog, at jerntransport over moderkagen er ensrettet 14,15, og at diferrisk transferrin er en vigtig kilde til jern til moderkagen og fosteret 16,17. Den nuværende forståelse af placentajerntransport er mere fuldstændig, selv om nogle vigtige jerntransportører og reguleringsmekanismer stadig er ukendte. Musemodeller har været afgørende for at forstå jernregulering og transport18, fordi de vigtigste transportører og mekanismer er bemærkelsesværdigt ens. Både menneskelige og mus placenta er hæmochorial, det vil sige moderens blod er i direkte kontakt med fosterkorionen19. Der er dog nogle bemærkelsesværdige strukturelle forskelle.

Syncytiotrophoblast er placentacellelaget, der adskiller moderens og fostrets cirkulation og aktivt transporterer jern og andre næringsstoffer20. Hos mennesker er syncytiotrophoblast et enkelt lag af smeltede celler. I modsætning hertil består musens moderkage af to syncytiotrophoblast lag21, Syn-I og Syn-II. Imidlertid tillader mellemrumskryds ved grænsefladen mellem Syn-I og Syn-II diffusion af næringsstoffer mellem lag22,23. Således fungerer disse lag som et enkelt synkront lag svarende til den menneskelige syncytiotrophoblast. Yderligere ligheder og forskelle mellem moderkage til mennesker og mus gennemgås af Rossant og Cross21. Placental jerntransport udløses ved binding af jern-Tf fra moderblod til transferrinreceptoren (TfR1) lokaliseret på den apikale side af syncytiotrophoblast24. Denne interaktion inducerer jern-Tf / TfR1 internalisering via clathrin-medieret endocytose25. Jern frigives derefter fra Tf i det sure endosom26, reduceres til jernholdigt jern ved en ubestemt ferrireduktase og eksporteres fra endosomet til cytoplasmaet af en endnu ikke bestemt transportør. Hvordan jern chaperoned inden for syncytiotrophoblast er også stadig at beskrive. Jern transporteres til sidst til fostersiden af jerneksportøren, FPN, lokaliseret på den basale eller fostervendte overflade af syncytiotrophoblast (gennemgået i27).

For at forstå, hvordan fysiologisk og patologisk regulering af TfR1, FPN og hepcidin påvirker placenta jerntransport, blev stabile jernisotoper brugt til at kvantificere jerntransport fra moderens cirkulation til moderkagen og embryoet in vivo4. Dette papir præsenterer metoderne til fremstilling og administration af isotopisk jernoverføringsmiddel til gravide mus, behandling af væv til ICP-MS og beregning af jernkoncentrationer i væv. Brugen af stabile jernisotoper in vivo kan tilpasses til at undersøge jernregulering og fordeling i forskellige dyremodeller for at undersøge fysiologisk og patologisk jernregulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller og eksperimentelle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California Los Angeles.

1. Forberedelse af 58Fe-Tf

BEMÆRK: Protokollen bruger 58Fe; en identisk protokol kan dog bruges til 57Fe. Begge isotoper kan anvendes og bortskaffes som et standard jernkemikalie uden yderligere forholdsregler.

  1. 58 Fe opløses i 12 N HCl ved 50 μL HCI/mg på 58Fe.
    1. Tilsæt HCI til metallet i glashætteglasset, der leveres af sælgeren, og sæt hætten løst på igen. For at opløse strygejernet opvarmes 58Fe/HCl-opløsningen til 60 °C i 1 time. Hvis den stadig ikke er opløst, skal du lade opløsningen stå natten over ved stuetemperatur i røghætten for at opløses.
      BEMÆRK: Opløst 58Fe/HCI-opløsning er gullig-orange i farven.
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl 3(aq) + 4H 2 O
  2. Oxider eventuelle resterende Fe (II) Cl2 for at generere Fe (III) Cl 3-opløsningen.
    1. 58 Fe/HCI-opløsningen opvarmes til 60 °C med hætten af for at lette oxidationen.
    2. Der tilsættes 1 μL 35 % H2O2 pr. 50 μL 58Fe/HCI-opløsning for yderligere at lette oxidationen.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. Præparatet af jernchloridopløsningen (58Fe(III)Cl3).
    1. Jernchloridopløsningen efterlades i emhætten ved 60 °C med hætten af for at fordampe prøven.
      BEMÆRK: Fordampning kan tage mellem en og flere dage.
    2. Rekonstituere 58 Fe(III)Cl3 til 100 mM med ultraren H2O, og beregne mængden af ultrarenH2O, der kræves,baseret på den oprindelige metalvægt, der blev anvendt i trin 1.1 (molekylvægt på 58Fe(III)Cl3 er 162.2).
  4. Der fremstilles 58 Fe(III)-nitrilotriacetat (NTA) ved at inkubere 58 Fe(III)Cl3 med NTA ved et molforhold på 1:5 under tilstedeværelse af 20 mM NaHCO 3.
    1. Forbered 500 mM NTA i 1 N NaOH.
    2. Der forberedes 5x transferrinbelastningsbuffer (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Forbered 1 M NaHCO3 i ultraren H2O.
    4. Til et konisk 15 ml konisk rør tilsættes 150 μL 100 mM 58 Fe(III)Cl 3-opløsning (fra trin 1.3.2), 150 μL 500 mM NTA fremstillet i 1 N NaOH, 480 μL ultraren H 2O, 200 μL 5xtransferrinbelastningsbuffer og20μL 1 M NaHCO3-opløsning.
    5. Inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Indlæs apo-Tf med 58 Fe (III) -NTA for at danne 58Fe-Tf.
    BEMÆRK: Denne protokol blev tilpasset fra McCarthy og Kosman28.
    1. Opløs 500 mg apo-Tf i 4 ml 1x Tf-belastningsbuffer.
    2. Til det koniske 15 ml rør i trin 1.4.4, der indeholder 1 ml af 58Fe(III)-NTA-opløsningen, tilsættes 4 ml apo-Tf-opløsning.
      BEMÆRK: Dette er et 3: 1 molært forhold på 58Fe-NTA med apo-Tf. Hver Tf indeholder 2 Fe bindingssteder; overskydende 58Fe-NTA blev tilføjet for at sikre, at Tf var fuldt lastet.
    3. For at tillade maksimal belastning af 58Fe-NTA på apo-Tf skal du kontrollere, at opløsningen er ved pH 7,5, og justere pH om nødvendigt med NaHCO3 eller HCI.
    4. Inkuberes i 2,5 timer ved stuetemperatur.
  6. Fjern overskydende ubundet 58Fe (III) -NTA og frigivet NTA.
    1. 58Fe-Tf-opløsningen overføres til en molekylvægtsafskæringskolonne (30 kDa cutoff) og centrifugeres ved 2.500 × g i 15 minutter ved stuetemperatur.
    2. Søjlen vaskes med 10 ml 1x transferrinbelastningsbuffer og centrifuge ved 2.500 × g i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag vask og centrifugering, udfør en saltvandsvask med 10 ml saltvand og centrifuge ved 2.500 × g i 15 minutter ved stuetemperatur.
  7. Beregn koncentrationen på 58Fe-Tf.
    BEMÆRK: På grund af tilføjelsen af overskydende 58Fe i trin 1.5.2, antag, at al transferrin er diferrisk. Da 500 mg apo-Tf blev brugt, ~ 500 mg 58Fe-Tf blev produceret i trin 1.5.4.
    1. Det volumen, der genvindes fra centrifugering efter saltvandsvasken, måles i trin 1.6.2.
    2. 500 mg divideres med det genvundne volumen for at bestemme koncentrationen (i mg/ml) af 58Fe-Tf-opløsningen.
  8. Steriliser 58Fe-Tf-opløsningen ved hjælp af et sprøjtefilter på 0,22 μm; opbevares ved 4 °C, indtil det er klar til brug.
    BEMÆRK: 58Fe-Tf opløsning blev brugt mellem 1 og 4 uger efter tilberedning.

2. Opsæt tidsbestemte musegraviditeter

  1. Brug 6 til 8 uger gamle hunmus. Placer dyr på en diæt med lavt jernindhold (4 ppm jern) eller standard chow (185 ppm jern) i 2 uger før parring og hold dyr på de respektive kostvaner under hele graviditeten.
  2. Mulighed 01: Bekræft graviditet ved vægtøgning ved E7.5.
    1. Opret flere avlsbure. For hvert bur kombineres 2 hunner med 1 mand natten over; den følgende dag, hvor dyrene adskilles, betragtes som fosterdag (E)0.5. Vej hunnerne ved E7.5 for at afgøre, om de er gravide. Mate mænd igen med kvinder, der ikke tog på i vægt.
      BEMÆRK: I WT C57BL/6 er en vægtøgning på 1 g ved E7.5 en god indikator for graviditet. Denne metode sikrer, at implantation fandt sted inden for en bestemt tidsramme på 16 timer, hvilket giver mulighed for synkron behandling af alle dyr, der blev gravide i samme parringsperiode.
  3. Mulighed 02: Bekræft graviditet ved stikkontrol.
    1. Kombiner 2 hunner med 1 mand og udfør daglige stikkontroller for at afgøre, om kopulation har fundet sted.
      BEMÆRK: Denne metode kan resultere i forskudte graviditeter, og tilstedeværelsen af et stik garanterer ikke graviditet.

3. Administrer 58Fe-Tf intravenøst til E17.5 gravide mus

  1. Forbered 58Fe-Tf fra trin 1.8 til injektion.
    1. Der fremstilles 58Fe-Tf opløsning ved 35 mg/ml i saltvand; injicer 100 μL pr. mus.
    2. Fyld en insulinsprøjte med 100 μL af 58Fe-Tf-opløsningen.
      BEMÆRK: Hver dosis indeholder 3,5 mg human 58 Fe-Tf (5 μg af 58Fe).
  2. Anæstetiser en gravid mus ved hjælp af isofluran.
    1. Brug en isofluranregulator med et kammer.
    2. Brug følgende indstillinger: 5% isofluran, 2 L/ml O 2,2 min.
    3. Bekræft, at musen er bedøvet ved at lede efter manglende reaktion på en tåspids.
    4. Påfør øjensmøremiddel på overfladen af øjet og læg musen på en varmepude.
  3. Injicer langsomt og forsigtigt 58Fe-Tf-opløsningen i retro-orbital sinus.
  4. Lad musen komme sig efter anæstesi; Efterlad ikke dyret uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
  5. Seks timer efter injektion skal du aflive E17.5 gravide kvinder ved isofluranoverdosis.
    1. Udfør en hjertepunktur for at ekssanguinere musen som en form for sekundær eutanasi.
    2. Fastgør fødderne med nåle til stabilisering.
  6. Saml placenta og embryolever.
    1. Brug sterile tang og dissektion saks, fjern forsigtigt livmoderen fra den gravide mus. Afskær en placenta-føtal placenta enhed, som omfatter et enkelt foster og placenta i fostervandet omgivet af en del af livmoderen.
    2. Skær forsigtigt gennem livmoderen og fostervandet uden at forstyrre fosteret og moderkagen.
    3. Skræl fostervandet tilbage og fjern fosteret og moderkagen.
    4. Klip navlestrengen.
    5. Blot fosteret og moderkagen på en ren opgavetørring for at fjerne overskydende fostervand.
    6. Registrer vægten af hele moderkagen.
    7. Skær hver moderkage i halve med et barberblad, læg hver halvdel i et 2,0 ml rør, og snap-frys i flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Da 58 Fe ikke kræver særlige håndteringsforholdsregler og bortskaffelse, kan halvdelen af moderkagen anvendes til 58Fe-måling og den anden halvdel til andre analyser, herunder kvantificering af transferrinreceptor (TFR1) og ferroportin (FPN) ekspression ved western blotting og qPCR.
    8. For at indsamle embryolever skal du ofre embryoet: Brug et barberblad til hurtigt at halshugge embryoet.
      BEMÆRK: Ved E17.5 skal alle embryoner i livmoderen aflives individuelt, selvom de ikke bruges i undersøgelsen.
    9. Fastgør embryoet til stabilisering, hvilket efterlader maven udsat.
    10. Brug dissektionssaks til at lave et lille snit, hvor navlestrengen var fastgjort, indsætte den ene ende af dissektionssaksen i snittet og udføre et medianplan skåret mod koronalplanet ca. 1/4 tommer. Udfør derefter tværgående planskæringer for at udsætte fosterleveren.
    11. Brug tang til at fjerne fosterleveren.
    12. Optag vægten af hele embryoleveren.
    13. Placer hele embryoleveren i 2 ml rør og snap-frys dem i flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Alternativt kan kun en del af embryoleveren bruges til 58Fe-måling, hvis der ønskes yderligere analyser. Brug af 2,0 ml rør giver mulighed for bedre vævshomogenisering end 1,5 ml rør.
  7. Vævene opbevares på ubestemt tid ved -80 °C.

4. Procesvæv til kvantitativ jernanalyse af ICP-MS

  1. Behandle placenta og fosterlever til kvantificering af nonheme jern.
    1. Optø placentahalvdele og hele fosterlever, og vej placentahalvdele (se trin 3.6.12 for registrering af føtal levervægt).
    2. Der tilsættes 400 μL proteinudfældningsopløsning (0,53 N HCI, 5,3 % TCA).
    3. Homogeniser vævet ved hjælp af en elektrisk homogenisator.
    4. Prøverne inkuberes ved 100 °C i 1 time.
    5. Prøverne afkøles i vand ved stuetemperatur i 2 min.
    6. Åbn hætterne for at frigøre tryk, og luk derefter rørene igen.
    7. Centrifuge ved 17.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur til pelletsvævsrester.
    8. Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt mærket rør.
    9. Send prøver afsted til ICP-MS analyse.
  2. Behandle placenta og fosterlever til kvantificering af hæmjern.
    BEMÆRK: Efter ekstraktion af nonhemejern i trin 1 er det jern, der er tilbage i pelleten, overvejende hæm.
    1. Vægten af hver pellet registreres fra trin 4.1.7.
    2. Fordøje pellets i 10 ml koncentreret 70% HNO3 suppleret med 1 ml 30% H 2 O2
      BEMÆRK: Rådfør dig med ICP-MS-kernen eller -centret for at optimere mængden af HNO3 til specifikke undersøgelser; Volumenet vil delvis afhænge af prøvevægten.
    3. Prøverne opvarmes til 200 °C i 15 min.
    4. Send prøverne til ICP-MS-analyse.
      BEMÆRK: Hvis det ikke er nødvendigt at skelne mellem hæm og nonheme jernkilder, og kun total jern måles, kan hele væv fordøjes i HNO3 som det første trin.

5. Dataanalyse

BEMÆRK: Data fra ICP-MS er angivet som 56Fe og 58Fe koncentrationer i ng/ml eller mg, ppb (tabel 1). 56 Fe er den mest udbredte jernisotop i naturen, og dens måling afspejler jernophobning i moderkagen/embryoet over hele graviditeten, mens 58Fe-måling afspejler jern, der blev overført i løbet af 6 timer efter injektion.

  1. Træk den naturlige forekomst på 58 Fe (0,28% af den samlede Fe) fra de målte 58Fe-værdier.
  2. Beregn total nonheme 58Fe.
    1. Embryoleverens samlede nonhemejern (ng) beregnes ved først at gange jernkoncentrationen (ng/ml) beregnet i trin 5.1 med volumenet (ml) under den indledende behandling i trin 4.1.2 for at estimere total 58Fe.
    2. Mængden af jern i hele moderkagen beregnes ved at tage moderkagens samlede vægt målt i trin 3.6.6 og dividere den med vægten af moderkagen, der er behandlet i trin 4.1.1. Denne værdi multipliceres med det samlede nonhemejern (ng) beregnet i trin 5.2.1 for at opnå moderkagens samlede nonheme 58Fe-indhold.
  3. Beregn total heme 58Fe.
    1. Det samlede hæm 58Fe beregnes ved først at gange jernkoncentrationen (ng/mg) beregnet i trin 5.1 med pelletens vægt (i mg) målt i trin 4.2.1.
    2. Derefter divideres moderkagens samlede vægt målt i trin 3.5.1 med vægten af moderkagepelleten målt i trin 4.2.1. Denne værdi multipliceres med det samlede hæmjern (ng) beregnet i trin 5.3.1 for at opnå et samlet hæmindhold på 58Fe i moderkagen.
  4. Sum de beregnede nonheme og heme 58Fe værdier for at bestemme det samlede jernindhold for hvert væv.

Figure 1
Figur 1: Visuel oversigt over trin i protokollen . (A) Fremstilling af 58Fe-transferrin. (B) In vivo administration af 58Fe-transferrin. C) Indsamling og opbevaring af væv. D) ICP-MS' forarbejdning af moderkagen og embryoleveren til kvantificering af metalarter. Forkortelser: Fe = jern; NTA = nitrilotrieddikesyre; Tf = transferrin; PPS = opløsning af proteinudfældning; Sup = supernatant; TCA = trichloreddikesyre; ICP-MS = induktivt koblet plasmamassespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tidligere undersøgelse ved hjælp af stabile jernisotoper til måling af jerntransport viste, at moderens jernmangel resulterede i nedregulering af moderkagejerneksportøren, FPN4. FPN er den eneste kendte eksportør af pattedyrjern, og fraværet af FPN under udviklingen resulterer i embryonal død før E9.529. For at afgøre, om det observerede fald i FPN-ekspression oversættes funktionelt til nedsat placentajerntransport, blev 58Fe-Tf injiceret intravenøst i gravide moderdyr, og jern i moderkagen og embryoet blev kvantificeret i nærvær af moderens jernmangel.

For at forstå, hvordan placenta jerntransport påvirkes af moderens jernstatus, blev jernmangel modelleret i mus4. Hunmus med C57BL/6 blev placeret på en diæt med lavt jernindhold (4 ppm jern) eller standard chow (185 ppm jern) i 2 uger før og under hele graviditeten. Dette diætregime resulterer i lavere moderlever nonheme jern og serumjern og hæmoglobin ved E12.5, E15.5 og E18.5 sammenlignet med dyr på en standard diæt4. Ved E18.5 havde embryoner fra jernfattige mødre lavere leverjern og var hypoferkæmiske og anæmiske end embryoner fra jernfyldte mødre. Tre drægtige mus blev brugt i hver af de jernfyldte og jernmangelgrupper, og 2-3 moderkager blev brugt fra hver gravid mus til analyse.

For at kvantificere placentajerntransport blev 58 Fe-transferrin fremstillet og injiceret intravenøst i gravide moderdyr og 58Fe målt i moderkagen og fosterleveren ved ICP-MS, som beskrevet i protokollen og illustreret i figur 1. Før nonheme jernprøver blev sendt ud til ICP-MS-analyse, blev de samlede nonheme jernniveauer uafhængigt kvantificeret via en ferenmetode beskrevet tidligere30. Nonheme jernkoncentrationer målt ved feren versus ICP-MS metoder var meget signifikant korreleret i alle målte væv (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Repræsentative resultater fra ICP-MS-kvantificering af jernisotoper fremgår af tabel 1. I alt 58Fe blev beregnet som beskrevet i trin 5 i protokollen. Data præsenteres som total snarere end hæm eller nonheme jern (figur 2A-D), fordi målet var at kvantificere total jern overført til moderkagen og total jern overført til embryoet fra moderkagen.

I gennemsnit blev 21% af den administrerede 58Fe dosis genvundet i moderkagen, embryoleveren og embryoserum kombineret. 56Fe-målingen giver indsigt i den langsigtede jernoverførsel i moderkagen og embryoleveren gennem hele graviditeten. Den samlede placenta 56Fe var ens i de jernfattige og -fyldte grupper (figur 2A), mens det samlede embryoleverjern blev nedsat i gruppen med jernmangel (figur 2B). Dette forventedes baseret på det observerede fald i placenta FPN i den jernmangelgruppe4, hvilket ville resultere i jernretention i moderkagen på bekostning af embryoet. I alt 58Fe giver et øjebliksbillede af kortvarig jerntransport. I denne undersøgelse, svarende til 56Fe, var placenta 58 Fe ens i både jernmangel- og -fyldte grupper (figur 2C), og embryolever 58Fe blev nedsat i den jernmangelgruppe (figur 2D). Disse data indikerer, at under jernmangel graviditet resulterer nedreguleringen af placenta FPN i nedsat jerntransport til embryoet, hvilket fører til kumulative forskelle i jernindhold i moderkagen og embryoet.

Det er vigtigt at overveje den administrerede dosis jern, da det kan føre til utilsigtede ændringer i hepcidinkoncentrationen eller jerntransportørekspression31. Det blev påvist, at moderens jernmangel forårsagede et fald i placenta FPN4. For at afgøre, om Fe-Tf-injektion påvirkede denne regulering, blev placenta FPN målt 6 timer efter injektion ved western blot. Jerndosis på 5 μg var utilstrækkelig til at ændre placenta FPN-regulering ved moderens jernmangel (figur 3).

Sammenfattende blev denne metode brugt til at demonstrere, at fysiologisk regulering af placenta FPN under moderens jernmangel resulterer i nedsat jerntransport over moderkagen in vivo. Stabile jernisotoper udgør et følsomt og kvantificerbart alternativ til radioaktivitet til måling af jerntransport og -fordeling, hvilket muliggør samtidig anvendelse af væv til yderligere analyser.

Figure 2
Figur 2: 56Fe og 58Fe transport over moderkagen i jernmangel eller jernfyldte graviditeter. I alt 56Fe i moderkagen (A) og embryoleveren (B). I alt 58Fe i moderkagen (C) og fosterleveren (D). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en 2-halet Student's t-test for normalt fordelte værdier og ellers ved Mann-Whitney U rank-sum test (betegnet med en stjerne efter P-værdien). Antallet af dyr er angivet i x-akserne i kassen og whisker plots. Den øverste del af boksplottet angiver 75-percentilen, og bunden angiver den 25. percentil; whiskers over boksen angiver den 90. percentil, og dem under boksen angiver den 10. percentil. Den faste linje i boksen angiver medianen og den stiplede linje middelværdien. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af videnskabelig graf- og dataanalysesoftware. Dette tal er ændret fra4. Forkortelse: Fe = jern. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Placenta TFR1- og FPN-niveauer. (A) TFR1- og FPN-ekspression blev vurderet ved western blot i jernmangel og -fyldt placenta 6 timer efter behandling af mødre med 58Fe-Tf. (B) Proteinekspression blev kvantificeret og præsenteret som proteinekspression i forhold til β-actin. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en 2-halet Student's t-test for normalt fordelte værdier. Antallet af dyr er angivet i x-akserne i kassen og whisker plots. Den øverste del af boksplottet angiver 75-percentilen, og bunden angiver den 25. percentil; whiskers over boksen angiver den 90. percentil, og dem under boksen angiver den 10. percentil. Den faste linje i boksen angiver medianen og den stiplede linje middelværdien. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af videnskabelig graf- og dataanalysesoftware. Dette tal er ændret fra4. Forkortelser: TFR1 = transferrinreceptor; FPN = ferroportin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøve 56 Fe 58 Fe Fe i alt
Koncentration [ng/ml eller mg, ppb] Koncentration [ng/ml eller mg, ppb] Summen af isotoper [ng/ml eller mg]
Gennemsnitlig* Stdev Gennemsnitlig* Stdev
Nonheme jern Moderkage jernmangel 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
jernfyldt 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Heme Moderkage jernmangel 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
jernfyldt 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Nonheme jern Embryo lever jernmangel 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
jernfyldt 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Heme Embryo lever jernmangel 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
jernfyldt 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tabel 1: Repræsentative resultater fra ICP-MS-kvantificering på 56 Fe og 58Fe i moderkage og embryolever. Forkortelser: ppb = dele pr. milliard; stdev = standardafvigelse; ICP-MS = induktivt koblet plasmamassespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jern er vigtigt for mange biologiske processer, og dets bevægelse og fordeling i kroppen er meget dynamisk og reguleret. Stabile jernisotoper giver et konsekvent og bekvemt alternativ til radioaktive isotoper til vurdering af dynamikken i jernhomeostase. Et kritisk skridt i protokollen er at holde styr på alle vævsvægte og volumener. Jern er et element og kan derfor ikke syntetiseres eller nedbrydes. Således, hvis alle vægte og volumener er omhyggeligt logget, kan alt jern i systemet redegøres for ved beregning. Som beskrevet kan denne metode bruges til at skelne mellem hæm og nonheme jernkilder. Men hvis denne skelnen mellem jernformer ikke er nødvendig, og kun total jern måles, kan protokollen forenkles ved kun at behandle væv med koncentreret HNO3 som beskrevet i protokoltrin 4.2. Det er vigtigt at bemærke, at hvis væv ikke perfunderes før analyse, især meget vaskulære væv som moderkagen, kan tilstedeværelsen af blod resultere i overvurdering af vævets hæmjernindhold.

Transferrinbundet jern blev valgt til undersøgelsen, da det er den største kilde til jern, der optages af moderkagen16,17. Global knockdown af TFR1 hos mus resulterede i embryonal dødelighed før E12.5, hvilket tyder på, at transferrinbundet jern er kritisk for udvikling. Det er muligt, at andre jernarter, såsom ferritin og nontransferrin bundet jern (NTBI), også bidrager til føtal jernbegavelse i mindre grad. Bidraget fra disse alternative jernarter blev imidlertid ikke vurderet. I fremtiden kan stabile isotoper bruges til at bestemme forskellige jernkilders bidrag til udvikling og embryojernbegavelse.

Formålet med undersøgelsen var at bestemme virkningerne af ændringer i moderens jernstatus på placenta jerntransport. Imidlertid resulterer nedsat hepcidin under jernmangel i forhøjede enterocyt FPN-niveauer og forbedret jerntransport ind i cirkulationen1. I jernmangeldæmninger ville jernabsorptionen fra kosten således i sagens natur have været øget og forvirret fortolkning af resultaterne, hvis 58Fe blev administreret oralt. Således blev intravenøs administration af 58Fe-Tf valgt, da den omgår jernregulering på niveauet for tarmabsorption. En dosis på 5 μg af 58Fe/mus blev valgt baseret på serumjernkoncentrationer af jernfyldte E18.5 drægtige moderdyr. I vildtype C57BL/6 E18.5 gravide dæmninger varierer serumjernkoncentrationer fra 10 til 50 μM4. En gravid E18.5 mus forventes at have ca. 2 ml total blodvolumen32. Således varierer den samlede mængde jern i cirkulationen af jernfyldte gravide dæmninger fra 1,1 til 5,6 μg. 5 μg 58Fe/mus svarer således til fysiologiske koncentrationer observeret hos jernfyldte dyr.

En begrænsning af ICP-MS-detektion på 58 Fe er den isobariske interferens fra 58Ni. Endogene Ni-koncentrationer i musens moderkage er 0,04 ± 0,02 μg/g vådvægt33. En gennemsnitlig E18.5 mus placenta vejer 0,080 g; derfor er den samlede mængde Ni ca. 3, 2 ng. Den naturlige overflod på 58 Ni er 68%; således er mængden af 58 Ni i musens moderkage ~ 2,2 ng, hvilket er ca. 10 gange lavere end de detekterede 58Fe-niveauer. I embryoet er Ni-koncentrationerne endnu lavere ved 0,01 ± 0,01 μg/g vådvægt33. Det gennemsnitlige E18.5 museembryo vejer 1 g; således er den samlede mængde Ni i et normalt museembryo ca. 10 ng. Hvis vi antager, at alt embryoet Ni findes i embryoleveren, er disse niveauer stadig 10 gange lavere end 58Fe-koncentrationerne og næsten 1.000 gange lavere end det samlede embryoleverjernindhold. I betragtning af den lavere overflod af Ni i disse musevæv blev 58Ni-interferens ikke indregnet i denne undersøgelse.

En yderligere overvejelse er analysens detektionsgrænse. Detektionsgrænsen i denne undersøgelse var 250 pg/ml 58Fe. Denne grænse kan dog ændres for at detektere endnu lavere koncentrationer på 58Fe, hvis fortyndingen af væv reduceres på vævsbehandlingstrinnet (protokoltrin 4.1.2 og figur 1D) eller via ændringer på ICP-MS-kernefaciliteten. Da 58Fe blev målt i hele embryoet, blev dets niveauer ikke opdaget, da 58Fe-koncentrationen var under detektionsgrænsen. Imidlertid blev 58Fe påvist i embryoleveren, som er det primære jernopbevaringsorgan. Det er muligt, at administrationen af en større dosis på 58 Fe ville have tilladt påvisning af 58Fe selv i hele embryoet. Imidlertid blev en relativt lille mængde på 58Fe brugt til at undgå jernbelastning af moderkagen, hvilket kunne udløse feedbackmekanismer og ændre udtrykket af jerntransportører. I denne model, der anvendte vildtype C57BL/6 mus, blev embryoleverjern målt som en afspejling af total placenta jerntransport, da embryoleverens jernkoncentration er proportional med hele embryojernkoncentrationen4. I musemodeller, hvor jernfordelingen ændres34, repræsenterer embryoleverjern alene muligvis ikke nøjagtigt den samlede placentale jerntransport. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at måle jern, der er inkorporeret i hele embryoet eller erytrocytrummet. Derudover vil variationer i eksperimentelle tidspunkter også kræve yderligere optimering og måling af jern i forskellige fosterrum. Denne stabile isotopsporingsmetode blev brugt til at kvantificere jerntransport under musegraviditet. Metoden kan let tilpasses til at studere jerntransport i ikke-gravide mus og andre dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN er en videnskabelig medstifter af Intrinsic LifeSciences og Silarus Pharma og konsulent for Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics og Disc Medicine. VS erklærer ingen konflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender brugen af ICP-MS-anlægget inden for UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology i CNSI på UCLA for deres hjælp med at optimere protokollen til 58Fe-målinger. Undersøgelsen blev støttet af NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, til VS) og NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, til EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

Biologi udgave 183
Kvantificering af jerntransport over musemoderkagen <em>In Vivo</em> ved hjælp af ikke-radioaktive jernisotoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter