Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Количественная оценка транспорта железа через плаценту мыши In Vivo с использованием нерадиоактивных изотопов железа

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

В данной статье показано, как получать и вводить трансферрин-связанное нерадиоактивное изотопное железо для исследований транспорта железа при беременности мышей. Описан также подход к количественной оценке изотопного железа в фетоплацентарных компартментах.

Abstract

Железо необходимо для здоровья матери и плода во время беременности, причем примерно 1 г железа необходим людям для поддержания здоровой беременности. Обогащение железа плодом полностью зависит от переноса железа через плаценту, и возмущения этого переноса могут привести к неблагоприятным исходам беременности. У мышей измерение потоков железа через плаценту традиционно основывалось на радиоактивных изотопах железа, что является очень чувствительным, но обременительным подходом. Стабильные изотопы железа (57Fe и 58Fe) предлагают нерадиоактивную альтернативу для использования в исследованиях беременности человека.

В физиологических условиях железо, связанное с трансферрином, является преобладающей формой железа, поглощаемой плацентой. Таким образом, 58Fe-трансферрин был приготовлен и введен внутривенно беременным дамам для непосредственной оценки плацентарного транспорта железа и обхода материнской кишечной абсорбции железа в качестве смешивающей переменной. Изотопное железо количественно оценивали в эмбриональных тканях плаценты и мыши с помощью масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы (ICP-MS). Эти методы также могут быть использованы в других модельных системах физиологии или заболевания животных для количественной оценки динамики железа in vivo .

Introduction

Железо имеет решающее значение для различных метаболических процессов, включая рост и развитие, производство энергии и транспорт кислорода1. Поддержание гомеостаза железа является динамичным, скоординированным процессом. Железо всасывается из пищи в двенадцатиперстной кишке и транспортируется по всему телу в циркуляции, связанной с транспортным белком железа трансферрином (Tf). Он используется каждой клеткой для ферментативных процессов, включается в гемоглобин в зарождающихся эритроцитах и рециркулируется из стареющих эритроцитов макрофагами. Железо хранится в печени при избытке и теряется из организма в результате кровоизлияния или шелушения клеток. Количество железа в обращении является результатом баланса между потреблением и поступлением железа, причем последнее жестко регулируется печеночным гормоном гепцидином (HAMP), центральным регулятором гомеостаза железа1. Гепцидин функционирует для ограничения биодоступности железа в крови путем закупорки или индуцирования убиквитинирования и деградации ферропортина экспортера железа (FPN)2. Снижение функционального FPN приводит к снижению всасывания железа с пищей, секвестрации железа в печени и снижению рециркуляции железа из макрофагов1.

Гепцидин регулируется статусом железа, воспалением, эритропоэтическим драйвом и беременностью (рассмотрено в 3). Учитывая, что гомеостаз железа очень динамичен, важно понимать и измерять общий пул железа, а также распределение и оборот железа. Исследования на животных традиционно опирались на радиоактивные изотопы железа, очень чувствительный, но обременительный подход к измерению динамики железа. Однако в более поздних исследованиях, включая представленное здесьисследование 4, нерадиоактивные, стабильные изотопы железа (58Fe) используются для измерения транспорта железа во время беременности 5,6,7,8,9. Стабильные изотопы являются ценными инструментами для изучения метаболизма питательных веществ (рассмотрено в 10). Использование стабильных изотопов железа в исследованиях на людях показало, что i) абсорбция железа увеличивается к концу беременности 5,6, ii) перенос пищевого железа плоду зависит от материнского статуса железа7, iii) гемовое железо, принимаемое матерью, легче включается плодом, чем негемовое железо8, и iv) перенос железа плоду отрицательно коррелирует с материнскими уровнями гепцидина8, См. 9. В ходе этих экспериментов измеряли изотопы железа в сыворотках или их включение в эритроциты; однако измерение железа, включенного только в эритроциты, может недооценивать истинное поглощение железа9. В текущем исследовании в тканях измеряется как гемовое, так и негемовое железо.

Во время беременности железо требуется для поддержки расширения объема материнских эритроцитов и для передачи через плаценту для поддержки роста и развития плода11. Содержание железа у плода полностью зависит от транспорта железа через плаценту. Во время12-летней беременности человека игрызуна 4,13 уровень гепцидина резко снижается, повышая доступность железа в плазме для передачи плоду.

Основы переноса плацентарного железа были первоначально охарактеризованы в 1950-70-х годах с использованием радиоактивных индикаторов (59Fe и 55Fe). Эти исследования определили, что транспорт железа через плаценту однонаправленный14,15 и что диферрический трансферрин является основным источником железа для плаценты и плода16,17. Нынешнее понимание переноса плацентарного железа является более полным, хотя некоторые ключевые транспортеры железа и регулирующие механизмы остаются неизвестными. Мышиные модели были важны для понимания регулирования и транспортировки железа18, потому что ключевые транспортеры и механизмы удивительно похожи. И человеческие, и мышиные плаценты гемохориальные, то есть материнская кровь находится в непосредственном контакте с хорионом плода19. Тем не менее, есть некоторые заметные структурные различия.

Синцитиотрофобласт представляет собой слой плацентарных клеток, который разделяет материнский и фетальный кровоток и активно транспортирует железо и другие питательные вещества20. У человека синцитиотрофобласт представляет собой один слой сросшихся клеток. Напротив, плацента мыши состоит из двух синцитиотрофобластных слоев21, Syn-I и Syn-II. Однако щелевые соединения на границе раздела Syn-I и Syn-II позволяют диффузию питательных веществ между слоями 22,23. Таким образом, эти слои функционируют как единый синцитиальный слой, похожий на синцитиотрофобласт человека. Дополнительные сходства и различия между плацентами человека и мыши рассматриваются Rossant и Cross21. Плацентарный транспорт железа запускается связыванием железа-Tf из материнской крови с рецептором трансферрина (TfR1), локализованным на апикальной стороне синцитиотрофобласта24. Это взаимодействие индуцирует интернализацию железа-Tf/TfR1 через клатрин-опосредованный эндоцитоз25. Затем железо высвобождается из Tf в кислой эндосоме26, восстанавливается до двухвалентного железа неопределенной ферриредуктазой и экспортируется из эндосомы в цитоплазму еще не определенным транспортером. Как железо сопровождается синцитиотрофобластом, также еще предстоит описать. Железо в конечном итоге транспортируется на сторону плода экспортером железа, FPN, локализованным на базальной или обращенной к плоду поверхности синцитиотрофобласта (рассмотрено в27).

Чтобы понять, как физиологическая и патологическая регуляция TfR1, FPN и гепцидина влияет на плацентарный транспорт железа, были использованы стабильные изотопы железа для количественного определения транспорта железа из материнского кровообращения в плаценту и эмбрион in vivo4. В данной работе представлены методы получения и введения изотопного железа-трансферрина беременным мышам, обработки тканей для ICP-MS и расчета концентраций железа в тканях. Использование стабильных изотопов железа in vivo может быть адаптировано для исследования регуляции и распределения железа на различных животных моделях для изучения физиологической и патологической регуляции железа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы и экспериментальные процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.

1. Подготовка 58Fe-Tf

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол использует 58Fe; однако идентичный протокол может быть использован для 57Fe. Любой изотоп может быть использован и утилизирован в качестве стандартного химического вещества железа без дополнительных мер предосторожности.

  1. Растворить 58Fe в 12 N HCl при 50 мкл HCl/мг 58Fe.
    1. Добавьте HCl к металлу в стеклянном флаконе, поставляемом продавцом, и замените колпачок свободно. Для растворения железа нагревают раствор 58Fe/HCl до 60 °C в течение 1 ч. Если раствор еще не растворен, оставьте раствор на ночь при комнатной температуре в вытяжке для растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворенный раствор 58Fe/HCl желтовато-оранжевого цвета.
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O
  2. Окисляют любые оставшиеся Fe(II)Cl2 для получения раствора Fe(III)Cl3.
    1. Разогрейте раствор 58Fe/HCl до 60 °C с выключенным колпачком для облегчения окисления.
    2. Добавьте 1 мкл 35% H2O2 на 50 мкл раствора 58Fe/HCl для дальнейшего облегчения окисления.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2O
  3. Готовят раствор хлорида железа (58Fe(III)Cl3).
    1. Оставьте раствор хлорида железа в вытяжке при температуре 60 °C, сняв крышку, чтобы испарить образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Испарение может занять от одного до нескольких дней.
    2. Восстановите 58Fe(III)Cl3 до 100 мМ со сверхчистымH2O и рассчитайте необходимое количество сверхчистогоH2O на основе исходной массы металла, используемой на этапе 1.1 (молекулярная масса 58Fe(III)Cl3 составляет 162,2).
  4. Получают 58Fe(III)-нитрилотриацетат (NTA) путем инкубации 58Fe(III)Cl3 с NTA при молярном соотношении 1:5 в присутствии 20 мМ NaHCO3.
    1. Приготовьте 500 мМ NTA в 1 N NaOH.
    2. Подготовьте 5-кратный буфер трансферрин-нагрузки (0,5 М HEPES, рН 7,5; 0,75 М NaCl).
    3. Готовят 1 М NaHCO3 в сверхчистомH2O.
    4. К конической трубке объемом 15 мл добавляют 150 мкл 100 мМ 58Fe(III)Cl3 раствора (со стадии 1,3.2), 150 мкл 500 мМ НТА, приготовленного в 1 Н NaOH, 480 мкл сверхчистогоH2O, 200 мкл 5x трансферринового нагрузочного буфера и 20 мкл 1 М Раствор NaHCO3 .
    5. Инкубировать смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Загрузите апо-Tf с 58Fe(III)-NTA с образованием 58Fe-Tf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был адаптирован из McCarthy and Kosman28.
    1. Растворить 500 мг апо-Tf в 4 мл 1x Tf-нагрузочного буфера.
    2. К конической трубке объемом 15 мл на стадии 1.4.4, содержащей 1 мл раствора 58Fe(III)-NTA, добавляют 4 мл раствора апо-Tf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это молярное соотношение 3:1 58Fe-NTA с апо-Tf. Каждый Tf содержит 2 сайта связывания Fe; избыток 58Fe-NTA был добавлен для обеспечения полной загрузки Tf.
    3. Чтобы обеспечить максимальную нагрузку 58Fe-NTA на apo-Tf, проверьте, что раствор находится при pH 7,5, и при необходимости отрегулируйте pH с помощью NaHCO3 или HCl.
    4. Инкубировать в течение 2,5 ч при комнатной температуре.
  6. Удалите избыток несвязанного 58Fe(III)-NTA и освободите NTA.
    1. Перенесите раствор 58Fe-Tf в отсечную колонну с молекулярной массой (отсечка 30 кДа) и центрифугу при 2 500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    2. Промывайте колонну 10 мл 1x трансферрин-нагрузочного буфера и центрифуги при 2 500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторите промывку и центрифугирование, выполните солевой промывкой с 10 мл физиологического раствора и центрифугируйте при 2 500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре.
  7. Рассчитывают концентрацию 58Fe-Tf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с добавлением превышения 58Fe на этапе 1.5.2 предположим, что весь трансферрин является диферерным. Поскольку использовалось 500 мг апо-Tf, на стадии 1.5.4 было получено ~ 500 мг 58Fe-Tf.
    1. Измерьте объем, полученный в результате центрифугирования после солевой промывки на этапе 1.6.2.
    2. Разделите 500 мг на восстановленный объем, чтобы определить концентрацию (в мг/мл) раствора 58Fe-Tf.
  8. Стерилизовать раствор 58Fe-Tf с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм; хранить при температуре 4 °C до готовности к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 58растворОв Fe-Tf использовали через 1-4 недели после подготовки.

2. Настройка приуроченной мышиной беременности

  1. Используйте 6-8-недельных самок мышей. Поместите животных на диету с низким содержанием железа (4 ppm железа) или стандартный чау (185 ppm железа) в течение 2 недель до спаривания и поддерживайте животных на соответствующих диетах на протяжении всей беременности.
  2. Вариант 01: Подтвердить беременность по увеличению веса при Е7,5.
    1. Установите несколько гнездовых клеток. Для каждой клетки объедините 2 самки с 1 самцом на ночь; следующий день, когда животные разделены, считается эмбриональным днем (E)0,5. Взвешивайте самок на E7.5, чтобы определить, беременна ли она. Спаривайте самцов снова с самками, которые не набрали вес.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При WT C57BL/6 увеличение веса на 1 г при E7.5 является хорошим показателем беременности. Этот метод гарантирует, что имплантация произошла в течение определенного 16-часового периода времени, что позволяет синхронно лечить всех животных, которые забеременели в течение одного и того же периода спаривания.
  3. Вариант 02: Подтвердите беременность с помощью проверок штепсельной вилки.
    1. Объедините 2 самки с 1 самцом и выполняйте ежедневные проверки пробок, чтобы определить, произошло ли совокупление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод может привести к ступенчатой беременности, а наличие пробки не гарантирует беременность.

3. Вводите 58Fe-Tf внутривенно беременным мышам E17.5

  1. Подготовьте 58Fe-Tf из шага 1.8 для инъекций.
    1. Приготовить 58fe-Tf раствора по 35 мг/мл в физиологическом растворе; ввести 100 мкл на мышь.
    2. Заполните инсулиновый шприц 100 мкл раствора 58Fe-Tf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая доза содержит 3,5 мг человеческого 58Fe-Tf (5 мкг 58Fe).
  2. Обезболить беременную мышь с помощью изофлурана.
    1. Используйте изофлурановый регулятор с камерой.
    2. Используйте следующие настройки: 5% изофлурана, 2 л/мл O2, 2 мин.
    3. Убедитесь, что мышь обезболена, выполнив поиск отсутствия реакции на защемление пальца ноги.
    4. Нанесите глазную смазку на поверхность глаза и поместите мышь на грелку.
  3. Медленно и осторожно вводят раствор 58Fe-Tf в ретроорбитальный синус.
  4. Дайте мыши восстановиться после анестезии; не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
  5. Через шесть часов после инъекции усыпляют беременных женщин Е17,5 путем передозировки изофлурана.
    1. Выполните пункцию сердца, чтобы обесценить мышь как форму вторичной эвтаназии.
    2. Прижмите стопы вниз иглами для стабилизации.
  6. Соберите плаценту и эмбрион печени.
    1. Используя стерильные щипцы и рассеченные ножницы, осторожно удалите матку у беременной мыши. Отрежьте плацентарную фетально-плацентарную единицу, которая состоит из одного плода и плаценты в амниотическом мешке, окруженном частью матки.
    2. Тщательно прорежьте матку и околоплодный мешок, не нарушая плод и плаценту.
    3. Очистите околоплодный мешок и удалите плод и плаценту.
    4. Перережьте пуповину.
    5. Промокните плод и плаценту на чистой салфетке, чтобы удалить лишнюю амниотическую жидкость.
    6. Запишите веса всей плаценты.
    7. Разрежьте каждую плаценту пополам лезвием бритвы, поместите каждую половинку в пробирку объемом 2,0 мл и заморозьте в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку 58Fe не требует особых мер предосторожности при обращении и утилизации, половина плаценты может быть использована для измерения 58Fe, а другая половина для любых других анализов, включая количественное определение экспрессии рецептора трансферрина (TFR1) и ферропортина (FPN) путем вестерн-блоттинга и qPCR.
    8. Чтобы собрать печень эмбриона, принесите эмбрион в жертву: используйте лезвие бритвы, чтобы быстро обезглавить эмбрион.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При E17.5 все эмбрионы в матке должны быть усыплены индивидуально, даже если они не используются в исследовании.
    9. Зафиксируйте эмбрион для стабилизации, оставив брюшную полость открытой.
    10. Используя ножницы для рассечения, сделайте небольшой разрез, где была прикреплена пуповина, вставьте один конец ножниц для рассечения в разрез и выполните средний разрез плоскости к корональной плоскости примерно на 1/4 дюйма. Затем выполните поперечные плоские разрезы, чтобы обнажить печень плода.
    11. Используйте щипцы для удаления печени плода.
    12. Запишите вес всей печени эмбриона.
    13. Поместите всю печень эмбриона в пробирки по 2 мл и заморозьте их в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, только часть печени эмбриона может быть использована для измерения 58Fe, если требуется дополнительный анализ. Использование пробирок объемом 2,0 мл позволяет лучше гомогенизировать ткани, чем пробирки объемом 1,5 мл.
  7. Хранить ткани неограниченное время при -80 °C.

4. Технологические ткани для количественного анализа железа методом ICP-MS

  1. Обработайте плаценты и печень плода для количественного определения негемового железа.
    1. Разморозьте плацентарные половинки и целую печень плода, а также взвесьте половинки плаценты (см. шаг 3.6.12 для регистрации веса печени плода).
    2. Добавьте 400 мкл раствора осаждения белка (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Гомогенизировать ткань с помощью электрического гомогенизатора.
    4. Инкубируйте образцы при температуре 100 °C в течение 1 ч.
    5. Охладите образцы в воде комнатной температуры в течение 2 мин.
    6. Откройте колпачки, чтобы снять давление, затем снова закройте трубки.
    7. Центрифуга на 17 000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре до гранулированного тканевого мусора.
    8. Осторожно перенесите супернатант на новую маркированную трубку.
    9. Отправляйте образцы на анализ ICP-MS.
  2. Обработайте плаценты и печень плода для количественного определения гем-железа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После экстракции негемового железа на стадии 1 железо, оставшееся в окатыше, представляет собой преимущественно гем.
    1. Запишите вес каждой гранулы с этапа 4.1.7.
    2. Переварить гранулы в 10 мл концентрированного 70% HNO3 с добавлением 1 мл 30% H2O2
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проконсультируйтесь с ядром или центром МСП-МС для оптимизации объема HNO3 для конкретных исследований; объем будет частично зависеть от веса образца.
    3. Нагревайте образцы до 200 °C в течение 15 мин.
    4. Отправьте образцы на анализ ICP-MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если различие между гемовыми и негемовыми источниками железа не требуется и измеряется только общее количество железа, вся ткань может быть переварена в HNO3 в качестве первого шага.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные МСП-МС были представлены в виде концентраций 56Fe и 58Fe в нг/мл или мг, ppb (таблица 1). 56 См. Fe является наиболее распространенным изотопом железа в природе, и его измерение отражает накопление железа в плаценте / эмбрионе в течение всей беременности, тогда как измерение 58Fe отражает железо, которое было перенесено в течение 6 ч после инъекции.

  1. Вычтите естественное содержание 58Fe (0,28% от общего Fe) из измеренных 58значений Fe.
  2. Вычислить общее число негемов 58Fe.
    1. Рассчитайте общее количество негемового железа в печени эмбриона (нг) путем предварительного умножения концентрации железа (нг/мл), рассчитанной на стадии 5.1, на объем (мл) во время первоначальной обработки на стадии 4.1.2 для оценки общего числа 58Fe.
    2. Рассчитайте количество железа во всей плаценте, взяв общую массу плаценты, измеренную на этапе 3.6.6, и разделив ее на вес плаценты, обработанной на этапе 4.1.1. Умножьте это значение на общее содержание негемового железа (нг), рассчитанное на этапе 5.2.1, чтобы получить общее содержание негемы 58Fe в плаценте.
  3. Рассчитайте общий гем 58Fe.
    1. Рассчитать общий гем 58Fe путем предварительного умножения концентрации железа (нг/мг), рассчитанной на стадии 5.1, на массу окатыша (в мг), измеренную на стадии 4.2.1.
    2. Затем разделите общую массу плаценты, измеренную на этапе 3.5.1, на массу гранул плаценты, измеренную на стадии 4.2.1. Умножьте это значение на общее содержание гемового железа (нг), рассчитанное на этапе 5.3.1, чтобы получить общее содержание гема 58Fe в плаценте.
  4. Суммируйте рассчитанные значения nonheme и heme 58Fe, чтобы определить общее содержание железа для каждой ткани.

Figure 1
Рисунок 1: Визуальное резюме шагов в протоколе. (A) Подготовка 58Fe-трансферрина. (B) In vivo введение 58Fe-трансферрина. (C) Сбор и хранение тканей. D) обработка печени плаценты и эмбриона для количественного определения видов металлов с помощью МСП-МС. Сокращения: Fe = железо; NTA = нитрилотриацетовая кислота; Tf = трансферрин; PPS = раствор осаждения белка; Sup = супернатант; TCA = трихлоруксусная кислота; ICP-MS = масс-спектрометрия плазменной с индуктивной связью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Более раннее исследование с использованием стабильных изотопов железа для измерения переноса железа показало, что дефицит железа у матери приводит к снижению регуляции экспортера плацентного железа, FPN4. FPN является единственным известным экспортером железа млекопитающих, и отсутствие FPN во время развития приводит к эмбриональной смерти до E9.529. Чтобы определить, трансформировалось ли наблюдаемое снижение экспрессии FPN функционально в снижение плацентарного транспорта железа, 58Fe-Tf вводили внутривенно беременным дамам, а железо в плаценте и эмбрионе количественно оценивали при наличии материнского дефицита железа.

Чтобы понять, как плацентарный транспорт железа влияет на материнский статус железа, дефицит железа был смоделирован у мышей4. Самок мышей C57BL/6 помещали на диету с низким содержанием железа (4 ppm железа) или стандартный чау (185 ppm железа) в течение 2 недель до и на протяжении всей беременности. Этот режим питания приводит к снижению материнского железа в печени и сывороточного железа и гемоглобина при E12.5, E15.5 и E18.5 по сравнению с животными на стандартной диете4. При E18.5 эмбрионы матерей с дефицитом железа имели более низкое железо в печени и были гипоферремными и анемичными, чем эмбрионы матерей, полных железа. Три беременные мыши были использованы в каждой из групп с дефицитом железа и железа, и 2-3 плаценты были использованы от каждой беременной мыши для анализа.

Для количественной оценки переноса плацентарного железа 58Fe-трансферринов готовили и вводили внутривенно беременным дамам и 58Fe, измеренных в плаценте и печени плода С помощью ВЧП-МС, как описано в протоколе и проиллюстрировано на рисунке 1. Перед отправкой образцов негемового железа для анализа ICP-MS общие уровни негемового железа были независимо количественно определены с помощью метода ферена, описанного ранее30. Концентрации негемового железа, измеренные методами ферена по сравнению с методами ICP-MS, были в значительной степени коррелированы во всех измеренных тканях (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Репрезентативные результаты количественного определения изотопов железа в МСП-МС представлены в таблице 1. Всего было рассчитано 58Fe, как описано в шаге 5 протокола. Данные представлены как общее, а не гемовое или негемовое железо (рисунок 2A-D), потому что цель состояла в том, чтобы количественно оценить общее железо, перенесенное в плаценту, и общее железо, перенесенное эмбриону из плаценты.

В среднем, 21% введенной дозы 58Fe был восстановлен в плаценте, печени эмбриона и эмбриональной сыворотке вместе взятых. Измерение 56Fe дает представление о долгосрочном переносе железа в печени плаценты и эмбриона на протяжении всей беременности. Общий плацентарный 56Fe был аналогичен в группах с дефицитом железа и полных железа (рисунок 2A), тогда как общее количество железа в печени эмбриона было снижено в группе с дефицитом железа (рисунок 2B). Это было ожидаемо на основе наблюдаемого снижения плацентарной FPN в группе с дефицитом железа4, что привело бы к задержке железа в плаценте за счет эмбриона. Total 58Fe дает представление о кратковременном переносе железа. В этом исследовании, аналогичном 56Fe, плацентарный 58Fe был аналогичен как в группе с дефицитом железа, так и в группе с дефицитом железа (рисунок 2C), а печень эмбриона 58Fe была уменьшена в группе с дефицитом железа (рисунок 2D). Эти данные указывают на то, что во время беременности с дефицитом железа снижение регуляции плацентарного FPN приводит к снижению транспорта железа к эмбриону, что приводит к кумулятивным различиям в содержании железа в плаценте и эмбрионе.

Важно учитывать дозу введенного железа, поскольку это может привести к непреднамеренным изменениям концентрации гепцидина или экспрессии переносчика железа31. Было продемонстрировано, что материнский дефицит железа вызывал снижение плацентарного FPN4. Чтобы определить, повлияла ли инъекция Fe-Tf на эту норму, плацента FPN измеряли через 6 ч после инъекции с помощью вестерн-блоттинга. Доза железа 5 мкг была недостаточной для изменения плацентарной регуляции FPN при дефиците железа у матери (рисунок 3).

Таким образом, этот метод был использован для демонстрации того, что физиологическая регуляция плацентарного FPN во время материнского дефицита железа приводит к снижению транспорта железа через плаценту in vivo. Стабильные изотопы железа обеспечивают чувствительную и поддающуюся количественной оценке альтернативу радиоактивности для измерения переноса и распределения железа, позволяя одновременно использовать ткани для дополнительных анализов.

Figure 2
Рисунок 2: 56Fe и 58Fe транспортируют через плаценту при железодефицитной или железонасыщенной беременности. Всего 56Fe в плаценте (А) и печени эмбриона (В). Всего 58Fe в плаценте (С) и печени плода (D). Статистический анализ проводили с использованием 2-хвостового t-теста Стьюдента для нормально распределенных значений и в противном случае с помощью теста ранговой суммы Манн-Уитни U (обозначаемого звездочкой после P-значения). Количество животных указывается на участках x-осей коробки и усов. Верхняя часть прямоугольного графика указывает на75-й процентиль, а нижняя — на25-й процентиль; усы над коробкой указывают на90-й процентиль, а те, что ниже коробки, указывают на10-й процентиль. Сплошная линия внутри поля обозначает медиану, а пунктирная линия — среднее. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для научного построения графиков и анализа данных. Эта цифра была изменена с4. Аббревиатура: Fe = железо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Плацентарные уровни TFR1 и FPN. (A) Экспрессия TFR1 и FPN оценивалась по вестерн-блоттингу в железодефицитных и -полных плацентах через 6 ч после лечения матерей с 58Fe-Tf. (B) Экспрессия белка была количественно оценена и представлена как экспрессия белка относительно β-актина. Статистический анализ проводился с использованием 2-хвостового t-теста Студента для нормально распределенных значений. Количество животных указывается на участках x-осей коробки и усов. Верхняя часть прямоугольного графика указывает на75-й процентиль, а нижняя — на25-й процентиль; усы над коробкой указывают на90-й процентиль, а те, что ниже коробки, указывают на10-й процентиль. Сплошная линия внутри поля обозначает медиану, а пунктирная линия — среднее. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для научного построения графиков и анализа данных. Эта цифра была изменена с4. Сокращения: TFR1 = рецептор трансферрина; FPN = ферропортин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Образец 56 См. Фе 58 См. Фе Всего Fe
Концентрация [нг/мл или мг, ppb] Концентрация [нг/мл или мг, ppb] Сумма изотопов [нг/мл или мг]
Средний* стдев Средний* стдев
Негемовое железо Плацента дефицит железа 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
железо-полный 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Гем Плацента дефицит железа 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
железо-полный 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Негемовое железо Печень эмбриона дефицит железа 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
железо-полный 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Гем Печень эмбриона дефицит железа 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
железо-полный 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Таблица 1: Репрезентативные результаты количественного определения ICP-MS 56Fe и 58Fe в печени плацент и эмбрионов. Сокращения: ppb = части на миллиард; stdev = стандартное отклонение; ICP-MS = масс-спектрометрия плазменной с индуктивной связью.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Железо важно для многих биологических процессов, а его движение и распределение в организме очень динамичны и регулируются. Стабильные изотопы железа обеспечивают последовательную и удобную альтернативу радиоактивным изотопам для оценки динамики гомеостаза железа. Критическим шагом в протоколе является отслеживание всех весов и объемов тканей. Железо является элементом и поэтому не может быть синтезировано или расщеплено. Таким образом, если все веса и объемы тщательно регистрироваться, все железо внутри системы может быть учтено путем расчета. Как описано, этот метод может быть использован для различения источников гемового и негемового железа. Однако, если это различие между формами железа не является необходимым и измеряется только общее количество железа, протокол может быть упрощен путем обработки ткани только концентрированным HNO3 , как описано в стадии протокола 4.2. Важно отметить, что если ткани не перфузируются перед анализом, особенно высоко сосудистые ткани, такие как плацента, наличие крови может привести к завышению содержания железа в тканях.

Для исследования было выбрано железо, связанное с трансферрином, поскольку оно является основным источником железа, поглощаемого плацентой16,17. Глобальный нокдаун TFR1 у мышей привел к эмбриональной летальности до E12.5, предполагая, что железо, связанное с трансферрином, имеет решающее значение для развития. Возможно, что другие виды железа, такие как ферритин и нетрансферриновое связанное железо (NTBI), также в меньшей степени способствуют усвоению железа плодом. Однако вклад этих альтернативных видов железа не оценивался. В будущем стабильные изотопы могут быть использованы для определения вклада различных источников железа в развитие и обогащение эмбрионального железа.

Целью исследования было определение влияния изменений материнского статуса железа на плацентарный транспорт железа. Однако снижение гепцидина во время дефицита железа приводит к повышению уровня FPN энтероцитов и усилению транспорта железа в циркуляцию1. Таким образом, в плотинах с дефицитом железа поглощение железа из рациона было бы по своей природе увеличено и путало бы интерпретацию результатов, если бы 58Fe вводили перорально. Таким образом, было выбрано внутривенное введение 58Fe-Tf, так как оно обходит регуляцию железа на уровне кишечной абсорбции. Доза 5 мкг 58Fe/мышь была выбрана на основе концентраций железа в сыворотке крови в наполненных железом беременных плотинах E18.5. В беременных плотинах дикого типа C57BL/6 E18.5 концентрации сывороточного железа колеблются от 10 до 50 мкМ4. Ожидается, что беременная мышь E18.5 будет иметь примерно 2 мл общего объема крови32. Таким образом, общее количество железа в циркуляции наполненных железом беременных плотин колеблется от 1,1 до 5,6 мкг. Таким образом, 5 мкг 58Fe/мышь эквивалентны физиологическим концентрациям, наблюдаемым у животных, полных железа.

Ограничением обнаружения ICP-MS 58Fe является изобарическая интерференция от 58Ni. Эндогенные концентрации Ni в плаценте мыши составляют 0,04 ± 0,02 мкг/г влажного веса33. Средняя плацента мыши E18.5 весит 0,080 г; таким образом, общее количество Ni составляет приблизительно 3,2 нг. Естественное содержание 58Ni составляет 68%; таким образом, количество 58Ni в плаценте мыши составляет ~2,2 нг, что примерно в 10 раз ниже обнаруженных 58уровней Fe. В эмбрионе концентрации Ni еще ниже при 0,01 ± 0,01 мкг/г влажного веса33. Средний эмбрион мыши E18.5 весит 1 г; таким образом, общее количество Ni в нормальном эмбрионе мыши составляет примерно 10 нг. Предполагая, что весь эмбрион Ni обнаружен в печени эмбриона, эти уровни все еще в 10 раз ниже, чем концентрации 58Fe и почти в 1000 раз ниже, чем общее содержание железа в печени эмбриона. Учитывая более низкое содержание Ni в этих тканях мышей, 58Ni интерференция не была учтена в этом исследовании.

Дополнительным соображением является предел обнаружения анализа. Предел обнаружения в этом исследовании составил 250 пг/мл 58Fe. Однако этот предел может быть изменен для обнаружения еще более низких концентраций 58Fe, если разбавление тканей уменьшается на стадии обработки тканей (этап протокола 4.1.2 и рисунок 1D) или путем модификаций в ядре ICP-MS. Когда 58Fe измеряли во всем эмбрионе, его уровни не были обнаружены, поскольку концентрация 58Fe была ниже предела обнаружения. Тем не менее, 58Fe было обнаружено в печени эмбриона, которая является основным органом хранения железа. Возможно, что введение большей дозы 58Fe позволило бы обнаружить 58Fe даже во всем эмбрионе. Тем не менее, относительно небольшое количество 58Fe использовалось, чтобы избежать железной нагрузки плаценты, которая могла бы запустить механизмы обратной связи и изменить экспрессию транспортеров железа. В этой модели, в которой использовались мыши дикого типа C57BL/6, железо печени эмбриона измеряли как отражение общего переноса плацентарного железа, поскольку концентрация железа в печени эмбриона пропорциональна концентрации железа всего эмбриона4. Однако в мышиных моделях, где распределение железа изменено34, железо печени эмбриона может не точно представлять общий перенос плацентарного железа. В таких случаях может потребоваться измерение железа, включенного во весь эмбрион или эритроцитарный компартмент. Кроме того, изменения в экспериментальных временных точках также потребуют дальнейшей оптимизации и измерения железа в различных фетальных компартментах. Этот подход к отслеживанию стабильных изотопов был использован для количественной оценки транспорта железа во время беременности мышей. Методология легко адаптируется для изучения транспорта железа у небеременных мышей и других животных моделей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN является научным соучредителем Intrinsic LifeSciences и Silarus Pharma и консультантом Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics и Disc Medicine. VS объявляет об отсутствии конфликтов.

Acknowledgments

Авторы признают использование объекта ICP-MS в Центре экологических последствий нанотехнологий Калифорнийского университета в CNSI в UCLA для их помощи в оптимизации протокола для измерений 58Fe. Исследование было поддержано Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек NIH (NIDDK) (K01DK127004, для VS) и Nih National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, to EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

Биология выпуск 183
Количественная оценка транспорта железа через плаценту мыши <em>In Vivo</em> с использованием нерадиоактивных изотопов железа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter