Summary
يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. يمكن تحليل القرنيات المجددة أو المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.
Abstract
تظهر جروح القرنية الجنينية في الفرخ قدرة ملحوظة على التجدد الكامل والسريع ، في حين تعاني القرنيات المصابة البالغة من فقدان الشفافية بسبب الندوب الليفية. يتم استعادة سلامة أنسجة القرنيات الجنينية المصابة بشكل جوهري مع عدم وجود ندبة يمكن اكتشافها. نظرا لسهولة الوصول إليه وسهولة التلاعب به ، يعد جنين الفرخ نموذجا مثاليا لدراسة إصلاح جرح القرنية بدون ندبة. يوضح هذا البروتوكول الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها جرح قرنية الفرخ الجنيني في البيض. أولا ، يتم وضع البيض في العصور الجنينية المبكرة للوصول إلى العين. ثانيا ، يتم إجراء سلسلة من التلاعب الفيزيائي في البويضة للأغشية خارج الجنين لضمان الحفاظ على الوصول إلى العين خلال مراحل لاحقة من التطور ، تتوافق مع وقت تشكيل الطبقات الخلوية الثلاث للقرنية. ثالثا ، يتم إجراء جروح القرنية الخطية التي تخترق الطبقة الظهارية الخارجية والسدى الأمامي باستخدام سكين جراحي مجهري. يمكن تحليل عملية التجديد أو القرنيات المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح. وقد كشفت الدراسات التي أجريت حتى الآن باستخدام هذا النموذج أن القرنيات الجنينية المصابة تظهر تنشيط تمايز الخلايا القرنية، وتخضع لإعادة تشكيل منسقة لبروتينات ECM إلى بنيتها الكلية ثلاثية الأبعاد الأصلية، وتصبح معصبة بشكل كاف بواسطة الأعصاب الحسية القرنية. في المستقبل ، يمكن تحليل التأثير المحتمل للعوامل الداخلية أو الخارجية على عملية التجدد في القرنيات الشافية باستخدام تقنيات البيولوجيا التنموية ، مثل تطعيم الأنسجة ، أو الكهربية ، أو العدوى الفيروسية الرجعية ، أو زرع الخرز. تحدد الاستراتيجية الحالية الفرخ الجنيني كنموذج تجريبي حاسم لتوضيح العوامل الجزيئية والخلوية التي تنسق التئام جروح القرنية بدون ندوب.
Introduction
القرنية هي النسيج الشفاف والخارجي للعين الذي ينقل وينكسر الضوء الذي يؤدي إلى حدة البصر. في القرنية البالغة ، يؤدي تلف أو عدوى سدى القرنية إلى استجابة سريعة وقوية لالتئام الجروح تتميز بانتشار الخلايا القرنية ، والتليف ، وزيادة الالتهاب الذي يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيتوكين ، وتوليد الخلايا الليفية العضلية الإصلاحية ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) بشكل عام 1,2 . بعد الإصابة ، يؤدي إصلاح أنسجة القرنية هذا إلى أنسجة ندبية غير شفافة تقلل من شفافية القرنية وتمنع مرور الضوء ، وبالتالي تشوه الرؤية ، وفي الحالات الشديدة ، تؤدي إلى عمى القرنية3. وبالتالي ، هناك حاجة واضحة لتطوير نماذج حيوانية موثوقة لمعالجة تعقيدات التئام الجروح وتحديد العوامل الخلوية والجزيئية المسؤولة عن إغلاق الجروح وتجديد الأنسجة.
حتى الآن ، استخدمت معظم الدراسات التي تدرس التئام جروح القرنية نماذج حيوانية بعد الولادة4 أو البالغين1،2،5،6،7. في حين أن هذه الدراسات قد أدت إلى تقدم كبير في فهم استجابة التئام جروح القرنية والآليات الكامنة وراء تكوين الندبات ، فإن أنسجة القرنية التالفة في نماذج الشفاء هذه تفشل في التجدد الكامل ، مما يحد من فائدتها لتحديد العوامل الجزيئية والآليات الخلوية المسؤولة عن تلخيص كامل لمورفولوجيا القرنية وهيكلها بعد الإصابة. على النقيض من ذلك ، فإن جروح الجنين الناتجة بسكين في قرنية الفرخ الجنينية تمتلك قدرة جوهرية على الشفاء التام بطريقة خالية من الندوب8. على وجه التحديد ، تظهر قرنية الفرخ الجنينية تجديدا غير ليفي مع التلخيص الكامل لبنية المصفوفة خارج الخلية وأنماط التعصيب 8,9.
يصف هذا البروتوكول سلسلة من الخطوات التي ينطوي عليها جرح قرنية كتكوت جنيني في البيض. أولا ، يتم وضع البيض في الأعمار الجنينية المبكرة لتسهيل الوصول إلى الجنين. ثانيا ، يتم إجراء سلسلة من التلاعب الفيزيائي في البويضة للأغشية خارج الجنين لضمان الحفاظ على الوصول إلى العين خلال مراحل لاحقة من التطور ، تتوافق مع وقت تشكل الطبقات الخلوية الثلاث للقرنية ويكون الجرح مطلوبا. ثالثا ، يتم إجراء شقوق القرنية المركزية الخطية التي تخترق ظهارة القرنية وفي السدى الأمامي باستخدام سكين جراحي مجهري. يمكن تحليل عملية التجديد أو القرنيات المستعادة بالكامل بحثا عن إمكانات التجدد باستخدام تقنيات خلوية وجزيئية مختلفة بعد إجراء الجرح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت سلالة البيض المستخدمة في هذا البروتوكول هي White Leghorn ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة إلينوي ويسليان.
1. حضانة بيض الفرخ
- حافظ على البيض عند ~ 10 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد وضعها لوقف التطور. عندما تكون مستعدا لبدء نمو جنين الفرخ ، امسح قشر البيض بالكامل بمناديل خالية من الوبر (انظر جدول المواد) مشبعة بالماء في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأوساخ والحطام.
- تأكد من تعقيم قشر البيض. امسح سطح البيض بالكامل باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. امسح الإيثانول بسرعة لتجفيف البويضة وتجنب امتصاص الإيثانول من خلال قشر البيض إلى الجنين.
- رتب البيض أفقيا على صينية. ضع علامة على الجزء العلوي من البويضة للإشارة إلى الموضع المتوقع للجنين. احتضن البيض أفقيا ، مع تنشيط وظيفة الهزاز ، في حاضنة رطبة 38 درجة مئوية.
2. نافذة البيض للتحضير لتشريح الغشاء
- إزالة البيض من الحاضنة في اليوم الثالث من التطور الجنيني (E3). قم بتعقيم الجزء العلوي من البيض باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. تجفيف الإيثانول من أسطح قشر البيض.
ملاحظة: لضمان عدم تأخير التطور أثناء إجراء النوافذ ، تمت إزالة 6-12 بيضة ، وتم تنفيذ الإجراء بسرعة على هذه البويضات بينما تركت البويضات المتبقية في الحاضنة. - ضع البيضة أفقيا في حامل بيض آمن (انظر جدول المواد). باستخدام النهاية الحادة لمقص التشريح ، قم بإنشاء ثقب صغير في الجزء العلوي من قشر البيض بالقرب من النهاية المدببة للبيضة.
ملاحظة: سيسهل هذا الثقب إزالة الزلال ، وهو أمر ضروري لإسقاط صفار البيض والجنين بعيدا عن سطح قشر البيض الداخلي. بالنسبة لحاملي البيض ، تم استخدام شقق حشو البيض من لب الورق ، والتي يتم شحن البيض داخلها. - من خلال الثقب (الخطوة 2.2) ، أدخل إبرة تحت الجلد مشطوفة 18 G. مع دفع الإبرة إلى السطح الداخلي السفلي للبويضة والجانب المائل من الإبرة الذي يواجه الطرف المدبب للبويضة (على سبيل المثال ، بعيدا عن الموقع المتوقع لصفار البيض والجنين بالقرب من منتصف البيضة) ، قم بإزالة 2-3 مل من الزلال من بيضة الدجاج وتخلص منها.
ملاحظة: إذا كانت إبرة الشخص تصطدم بالجنين أو الأوعية الدموية المرتبطة به خلال هذه الخطوة، فسيؤدي ذلك إلى شفط الدم مع الزلال. هذا سيؤدي إلى وفاة الجنين. علاوة على ذلك ، إذا تم شفط صفار البيض عن غير قصد مع الزلال خلال هذه الخطوة ، فلن يكون الجنين قابلا للحياة. في كلتا الحالتين ، يجب التخلص من البويضة إذا لم يكن من الممكن استخدام الجنين على الفور لأغراض أخرى. - نظف سطح قشر البيض المحيط بالثقب باستخدام مناديل خالية من الوبر مبللة قليلا بالإيثانول بنسبة 70٪ وامسحها جافة. ختم الثقب المصنوع لإزالة الزلال بشريط شفاف.
- مع النهاية الحادة لمقص التشريح ، قم بعمل ثقب "نافذة" ثان في الجزء العلوي من قشر البيض في موقع وضع العلامات (الخطوة 1.3). تأكد من أن المقص لا يمتد بعيدا جدا في قشر البيض لتجنب ملامسة الجنين أو الأوعية الدموية الجنينية وإتلافها ، والتي غالبا ما يتم وضعها داخل البويضة أسفل موقع الثقب الثاني مباشرة.
- باستخدام ملقط القزحية المنحني ، قم بتوسيع ثقب "النافذة" ليمتد قطره ~ 2-3 سم ويكون بمثابة "نافذة" للجنين النامي أسفل القشرة.
- أدخل أحد طرفي الملقط في الحفرة ، مع إبقائه موازيا لقشر البيض ومتجاورا بشكل وثيق. مع وضع نهاية الملقط الأخرى خارج قشر البيض ، قم بقرصة نهايتين الملقطتين بعناية معا ، مما يسمح لهما بكسر وإزالة قطع صغيرة من قشر البيض. استمر في كسر وإزالة شظايا قشر البيض حتى تبقى نافذة 2-3 سم تتراكب مباشرة على الجنين.
ملاحظة: البيض الذي لا توضع فيه الأجنة مباشرة تحت الثقب المصنوع في الخطوة 2.6. يجب ألا تستخدم لأن تشريح الغشاء القادم سيكون من الصعب إكماله. حتى مع هز البيض أفقيا ، فإن حوالي 10٪ من البيض غير صالح للاستخدام بسبب سوء وضع الجنين. يمكن استخدام هذه الأجنة لأغراض أخرى.
- أدخل أحد طرفي الملقط في الحفرة ، مع إبقائه موازيا لقشر البيض ومتجاورا بشكل وثيق. مع وضع نهاية الملقط الأخرى خارج قشر البيض ، قم بقرصة نهايتين الملقطتين بعناية معا ، مما يسمح لهما بكسر وإزالة قطع صغيرة من قشر البيض. استمر في كسر وإزالة شظايا قشر البيض حتى تبقى نافذة 2-3 سم تتراكب مباشرة على الجنين.
- للحد من التلوث البكتيري ، أضف من خلال ثقب النافذة (على سبيل المثال ، في البيضة) ~ 100-200 ميكرولتر من محلول رينجر (8 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.37 غرام من KCl ، و 0.23 غرام من CaCl 2.2H 2 0 لكل لتر من H2المقطر 0) يحتوي على المضادات الحيوية البنسلين/ الستربتومايسين (50 U / مل من البنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، انظر جدول المواد).
- قم بإغلاق فتحة النافذة باستخدام شريط لاصق شفاف. قم بإجراء ختم البيض عن طريق محاذاة زاوية من الشريط على المحور الطويل للثقب والضغط على الشريط إلى القشرة على بعد 1-2 سم تقريبا من حافة الحفرة.
- استمر في الختم حول الفتحة حتى يتم ترك رفرف معلق من الشريط على جانب واحد. اضغط على قطعتي الشريط معا ، مما يخلق شكلا مقببا فوق الثقب ، واضغط على رفرف الشريط المتدلي على القشرة لإنهاء ختم البيضة.
ملاحظة: يجب وضع البيض في نافذة إما E2 أو E3. وفقا للتجربة، يؤدي النوافذ قبل E2 إلى انخفاض صلاحية الجنين. علاوة على ذلك ، بواسطة E4 ، يصبح الجنين والأغشية خارج الجنين ملتصقة بقشر البيض10 ، وغالبا ما تؤدي أي محاولات للنافذة في E4 أو في وقت لاحق إلى تلف الجنين أو تمزق الأوعية الدموية خارج الجنين ، مع أي من الحدثين يؤدي إلى نتيجة موت الجنين.
- استمر في الختم حول الفتحة حتى يتم ترك رفرف معلق من الشريط على جانب واحد. اضغط على قطعتي الشريط معا ، مما يخلق شكلا مقببا فوق الثقب ، واضغط على رفرف الشريط المتدلي على القشرة لإنهاء ختم البيضة.
- أعد البيض "النافذة" إلى الحاضنة لمزيد من التطوير. تأكد من إبقاء البيض أفقيا وإيقاف تشغيل وظيفة هزاز الحاضنة.
- كرر الخطوات 2.2.-2.9. لكل بيضة.
3. التشريح المجهري للأغشية خارج الجنين
- قم بإزالة بيضة E5.5 ذات النوافذ من الحاضنة. كشف الجنين عن طريق قطع الشريط بعيدا عن النافذة باستخدام مقص تشريح معقم.
- استخدم مجهرا تشريحيا لمراقبة الجنين وأغشيته خارج الجنين من خلال النافذة. إذا لزم الأمر ، استخدم المقص أو ملقط القزحية المنحني لتوسيع النافذة بحيث يكون الجنين في وضع جيد أسفل النافذة ، مع الحرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية الجنينية.
- أضف قطرتين من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- استخدم مجهر تشريح للتأكد من أن الجنين في مرحلة النمو المناسبة (هامبورغر هاملتون المرحلة 27 ، ~ E5.5)11,12 وتحديد مواقع الغشاء السلوي (ACM) والغشاء المشيمي (CAM).
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون الجنين محاطا ب ACM ، والذي يتكون من الغشاء الأمنيوسي والغشاء المشيمي العلوي المنصهر والمغطى جزئيا بواسطة allantois عالي الأوعية الدموية ، والذي يمتد من منطقة الأمعاء الجنين ويندمج مع المشيمية المتراكبة لتشكيل CAM11,12. لا يتم إجراء ACM بشكل كبير في الأوعية الدموية ، مما يمكن المرء من تشريح هذه الأغشية لفضح الجنين دون إتلاف الأوعية الدموية وإلحاق الضرر بالجنين. - إجراء تشريح الغشاء خارج الجنين في هذه المرحلة (E5.5).
ملاحظة: E5.5 هو الوقت المثالي لإجراء تشريح الغشاء خارج الجنين. تشريح الأغشية في وقت مبكر (على سبيل المثال ، في E4) قبل تشكيل CAM يقلل من إمكانية الوصول إلى الجنين في المراحل اللاحقة11. علاوة على ذلك ، في E5.5 ، يتم تغطية الجنين جزئيا فقط بواسطة CAM عالي الأوعية الدموية ، ولكن على مدار الأيام 1-2 التالية ، يغلف CAM بسرعة ويمنع المزيد من الوصول إلى الجنين11,12. لهذا السبب ، فإن تشريح الغشاء في E6 أو في وقت لاحق يمثل تحديا مع زيادة خطر تمزق الأوعية الدموية.- استخدم زوجا من الملقط الناعم المعقم للإمساك بلطف ACM وسحبه بعيدا عن الجنين. ثم استخدم مقص تشريح دقيق معقم لقطع ثقب في ACM مباشرة فوق الطرف الأمامي الذي يمتد من الغشاء الذي يغطي الطرف الأمامي إلى الغشاء الذي يغطي الرأس.
ملاحظة: تعمل هذه الخطوة على استرخاء أغشية المشيمة والسلى، مما يسهل الإمساك بها وتشريحها باستخدام الملقط في الخطوات التالية. انظر الشكل 1 للحصول على مخطط مفيد لكيفية تشريح الأغشية من خلال نافذة قشر البيض.
- استخدم زوجا من الملقط الناعم المعقم للإمساك بلطف ACM وسحبه بعيدا عن الجنين. ثم استخدم مقص تشريح دقيق معقم لقطع ثقب في ACM مباشرة فوق الطرف الأمامي الذي يمتد من الغشاء الذي يغطي الطرف الأمامي إلى الغشاء الذي يغطي الرأس.
- استخدم زوجين من الملقط الناعم والمعقم للقبض بلطف على السلى في وضعين متجاورين بين ACM و CAM (على سبيل المثال ، منطقة بين القطع المصنوع فوق الطرف الأمامي وأقرب حافة من CAM).
- حرك بعناية كل زوج من الملقط ، وكلاهما يمسك الغشاء الأمنيوسي بقوة ، بعيدا عن بعضهما البعض ، مع تحرك زوج واحد ظهريا إلى الجنين والآخر بطنيا.
ملاحظة: تعمل هذه الحركة على تمزيق السلى بشكل أكبر مع فصل ACM (الذي يتم سحبه في الاتجاه الظهري فيما يتعلق بالجنين بواسطة زوج واحد من الملقط) و CAM (الذي يتم سحبه في الاتجاه البطني فيما يتعلق بالجنين بواسطة الزوج الآخر من الملقط). - تأكد من فصل الأغشية عندما لا يغطي الطب التكميلي والبديل الجنين والشريان والوريد الألانتويك ، الذي ينبعث من الأمعاء الجنينية إلى CAM ، واضح بسهولة.
- حرك بعناية كل زوج من الملقط ، وكلاهما يمسك الغشاء الأمنيوسي بقوة ، بعيدا عن بعضهما البعض ، مع تحرك زوج واحد ظهريا إلى الجنين والآخر بطنيا.
- استخدم ملقط ناعم معقم لتشريح وإزالة أي غشاء أمنيون متبق يغطي الجنين. ويلاحظ بشكل شائع أن السلى المتبقي سيغطي جزئيا النصف الذيلي من الجنين.
- باستخدام ملقط معقم ، أمسك السلى بالقرب من منطقة منتصف الجمجمة من الجنين واسحب السلى بعناية في اتجاه ذيلي فيما يتعلق بالجنين نحو CAM النازح السابق. سيتم الآن كشف الجنين بالكامل ، وسيحدث المزيد من نمو CAM بشكل رئيسي بعيدا عن الجنين النامي.
ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على مخطط مفيد حول كيفية ظهور الجنين المكشوف بعد تشريح الغشاء. راجع أيضا التقرير11 المنشور مسبقا للحصول على مخططات تخطيطية مفيدة للخطوات من 3.3.-3.6.
- باستخدام ملقط معقم ، أمسك السلى بالقرب من منطقة منتصف الجمجمة من الجنين واسحب السلى بعناية في اتجاه ذيلي فيما يتعلق بالجنين نحو CAM النازح السابق. سيتم الآن كشف الجنين بالكامل ، وسيحدث المزيد من نمو CAM بشكل رئيسي بعيدا عن الجنين النامي.
- أضف بضع قطرات من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- أعد إغلاق فتحة النافذة باستخدام شريط شفاف، كما هو موضح في الخطوة 2.8. أعد البيضة إلى الحاضنة لمزيد من التطوير ، مع الحفاظ على البويضة أفقية والحفاظ على وظيفة هزاز الحاضنة غير نشطة.
- كرر الخطوات 3.1.-3.8. لكل بيضة.
ملاحظة: سيمكن تشريح الغشاء خارج الجنين في E5.5 الموصوف أعلاه من الوصول إلى الجنين من خلال E7 ، وهو الوقت الذي يمكن فيه إجراء الجرح 8,9. بحلول E8 ، يبدأ النمو المستمر لأنسجة CAM في تغطية منطقة الجمجمة من الجنين ، وبالتالي منع المزيد من الوصول إلى القرنية. إذا كان المرء يرغب في إجراء جرح في القرنيات القديمة E8-E9 ، فمن الممكن إعادة وضع CAM البطني المتنامي فيما يتعلق بالجنين (الخطوة 3.10). إذا كان المرء يرغب في الجرح في E7 ، الخطوة 3.10. ليس من الضروري القيام به ويمكن للمرء أن ينتقل إلى الخطوة 4 ، جرح القرنية. - قم بإزالة بويضة E7 من الحاضنة التي تم تشريح أغشيتها خارج الجنين سابقا في E5.5 (الخطوات 3.1.-3.8). أمسك بالملقط المعقم أي أنسجة غشاء أمنيون متاحة تنصهر في CAM واسحب غشاء السلى بلطف بعيدا عن منطقة الجمجمة من الجنين في اتجاه بطني فيما يتعلق بالجنين.
ملاحظة: نظرا لأن الغشاء الأمنيوني الذي يتم إزاحته بعيدا عن الجنين يتم دمجه في CAM ، فإن CAM المتنامي وعالي الأوعية الدموية سيتبع ملقط الإمساك بالسلى ويبتعد عن منطقة الجمجمة. كرر هذه الخطوة يوميا لإزاحة الطب التكميلي والبديل باستمرار بعيدا عن الجنين حتى يكون الجنين في السن المطلوبة للجرح.
4. جرح القرنية
- احصل على بويضة من الحاضنة للجرح في العمر الجنيني المطلوب ، E7-E9. كشف الجنين عن طريق قطع الشريط بعيدا عن النافذة باستخدام مقص تشريح معقم. أضف بضع قطرات من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- استخدم سكين تشريح دقيق لإجراء شق يمتد على مدى قرنية العين اليمنى (نظرا لكيفية وضع الجنين في البويضة ، لا يمكن الوصول إلى العين اليسرى ولكن يمكن أن تكون بمثابة تحكم غير مصاب) ، وهو مواز ويتماشى مع الشق المشيمي (الشكل 1). سوف يجتاز القطع الأول ظهارة القرنية.
- استخدم سكين التشريح الدقيق لتمزيق القرنية مرة أخرى في نفس مكان الشق الأول 2x أكثر (على سبيل المثال ، ثلاثة جروح إجمالية ، مع قطع 2 وقطع 3 تحدث جنبا إلى جنب مع نفس الوضع في القرنية مثل القطع 1)11. سوف يجتاز التمزق الثاني الغشاء السفلي ، والثالث سوف يخترق السدى الأمامي.
ملاحظة: إذا استقر الجنين تحت CAM التشريح ، فيمكن للمرء استخدام ملقط قزحية منحني معقم لتحريك الرأس بعناية من تحت CAM. ضع ملقط القزحية المنحني أسفل الرأس ، مع ملامسة الجانب الأيسر من الرأس. احمل الرأس بالكامل فوق ملقط القزحية المنحني المغلق وارفع الرأس برفق حول الكاميرا وفوقها. للمساعدة في الجدوى، استخدم تقنية مماثلة مع ملقط القزحية المنحني لثني الجنين مرة أخرى تحت CAM بعد الجراحة لتعزيز النمو السليم ل CAM.
- استخدم سكين التشريح الدقيق لتمزيق القرنية مرة أخرى في نفس مكان الشق الأول 2x أكثر (على سبيل المثال ، ثلاثة جروح إجمالية ، مع قطع 2 وقطع 3 تحدث جنبا إلى جنب مع نفس الوضع في القرنية مثل القطع 1)11. سوف يجتاز التمزق الثاني الغشاء السفلي ، والثالث سوف يخترق السدى الأمامي.
- أضف 3-4 قطرات من محلول رينجر الذي يحتوي على مضادات حيوية البنسلين / الستربتومايسين لترطيب الجنين وتعقيم البويضة.
- أعد إغلاق فتحة النافذة بشريط شفاف والعودة إلى الحاضنة ، تاركا البيضة أفقية. اسمح للجنين بالتطور ولجرح القرنية بالشفاء للفترة المطلوبة (على سبيل المثال ، 0.5-11 يوما) ، ثم قم بالقتل الرحيم للجنين إنسانيا عن طريق قطع الرأس.
- استخدم ملقط القزحية المنحني لحصاد العين من جنين تم قتله الرحيم يطفو في طبق بتري من محلول رينجر الملحي عن طريق الإمساك بالعين بلطف على جانبها الخلفي ، حيث تلتقي العين وأنسجة الوجه ، ورفع العين بالكامل بعناية بعيدا وخالية من أنسجة الوجه.
- استخدم ملقط ناعم لكزة ثقب صغير (3-5 سم) في الجزء الخلفي من العين بأكملها وإصلاح العين بأكملها في 4٪ بارافورمالديهايد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع إثارة خفيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد التشريح السابق ل ACM و CAM في E5.5 لفضح منطقة الجمجمة للجنين النامي ، تم إجراء سلسلة من التمزقات التي امتدت عبر القرنية المركزية E7 في البويضة (الشكل 1). يحدث الجرح المثالي لدراسة تجديد القرنية بعد ثلاثة تمزقات ، كل منها مصنوع في نفس موقع القرنية. يجتاز التمزق الأول ظهارة القرنية ، بينما يخترق التمزقان الثاني والثالث الغشاء السفلي الأساسي والسدى الأمامي ، على التوالي. لتحقيق جرح مثالي ، من الأهمية بمكان استخدام سكين تشريح دقيق حاد (انظر جدول المواد) وتطبيق الكمية الصحيحة من الضغط أثناء إجراء التمزق (الشكل 2 ، انظر الجرح المثالي). سيؤدي الضغط القليل جدا إلى جرح ضحل يمزق ظهارة القرنية دون اختراق السدى الأمامي بشكل كاف (الشكل 2 ، انظر الجرح الضحل). ومع ذلك ، فإن تطبيق الكثير من الضغط يؤدي إلى جرح كامل المدى يخترق السدى بأكمله ويعرض الفكاهة المائية للبيئة الخارجية (الشكل 2 ، انظر الجرح الكامل المدى).
ينتج عن إجراء شقوق التمزق المناسبة جرحا مثاليا (الشكل 2) يتضخم في البداية (0-3 أيام بعد الجرح)8 (الشكل 3). وقد افترض أن مرحلة تضخم الجرح التي تحدث عن طريق جرح قرنيات الدجاج E7 ترتبط بالتوسع السريع لحجم العين في هذه المرحلة الجنينية8. تنمو عيون الدجاج الجنينية بمعدل أسرع بكثير من E4 إلى E10 مقارنة بنمو العين من E10 إلى الفقس. تعزى هذه المراحل السريعة المبكرة من نمو العين إلى النمو المرتفع المعتمد على ضغط العين (IOP)13. لذلك ، من المحتمل أن معدل النمو السريع للعين إلى جانب IOP المرتفع يعزز تراجع الجرح خلال المراحل المبكرة من عملية الشفاء (0-3 أيام بعد الجرح) ، وهو أمر فريد من نوعه لتطور التئام جروح القرنية الجنينية. بعد ذلك ، تحدث إعادة الظهارة وتشكيل أنسجة جديدة (4-9 أيام بعد الجرح) لإغلاق الجرح في النهاية بطريقة خالية من الندوب لمدة 11 يوما بعد الجرح8 (الشكل 3A).
كان من الممكن إجراء مزيد من التحليل لعمق الجرح وتجديده عن طريق تلطيخ المقاطع العرضية بجسم مضاد من اللامينين يميز الغشاء السفلي الغني باللامينين ومواجهة تلطيخ الأقسام بالعلامة النووية DAPI ، والتي تكشف عن مدى الجرح من خلال ظهارة القرنية8. أظهرت القرنيات المصابة مؤخرا (0 dpw) وتلك التي هي في وقت مبكر من عملية التجديد (3 dpw) أن الجرح اخترق الطبقة الظهارية والغشاء السفلي ، كما يتضح من تلطيخ العلامة النووية DAPI داخل ظهارة القرنية وعدم وجود تلطيخ الأجسام المضادة laminin ، والذي يمثل الغشاء السفلي الغني ب laminin بين ظهارة القرنية والسدى الأساسي8 (الشكل 3B ). ومع ذلك، كشفت المقاطع العرضية من خلال 11 قرنية DPW ملطخة بالأجسام المضادة DAPI و laminin عن قرنية ملتئمة تماما تم إعادة ظهارتها وتحتوي على غشاء قبو مستمر غني باللامينين في موقع الجرحالمجدد 8 (الشكل 3B).
بعد شق القرنية ، تم إنجاز توصيف مفصل لعملية التئام الجروح عن طريق إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على أنسجة القرنية المجزأة والمصابة. ترتبط بروتينات المصفوفة خارج الخلية فيبرونيكتين وتيناسكين بهجرة الخلايا الظهارية والقرنية إلى شفاء جروح القرنية البالغة14,15. التوطين الزماني المكاني لبروتينات المصفوفة خارج الخلية والفيبرونيكتين والتيناسين واضح داخل الجرح الشافي ووجد أنه مرتفع في نقاط زمنية تتوافق مع إعادة ظهارة القرنية (5 أيام بعد الجرح)8 (الشكل 4). يشير هذا التحليل إلى أهمية الفيبرونيكتين والتيناسين لإغلاق الجرح ، وعلى وجه التحديد ، مشاركتهما في هجرة الخلايا الظهارية والبقاء على قيد الحياة ، بما يتفق مع هذه الوظائف في جروح القرنية البالغة16،17.
بدءا من E8-E9 ، تصبح القرنية معصبة بكثافة بواسطة الألياف العصبية الحسية ثلاثية التوائم التي تنبعث من حلقة عصبية حول القرنية وتمر عبر السدى الأمامي أثناء سقوطها نحو مركز القرنية وظهارة القرنية بواسطة E1218,19,20. نظرا لأن جروح القرنية في هذا النموذج تتم في E7 ، قبل وقت قصير من إسقاط العصب في القرنية ، فإن هذا النموذج يحقق بشكل أكبر في أعصاب القرنية أثناء تنقلهم في القرنية الشافية بعد الإهانة. باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الكاملة لتتبع أعصاب القرنية باستخدام الأجسام المضادة للتوبولين العصبي المضاد β (Tuj1)21 ، من الواضح أن الأعصاب يتم تثبيطها مؤقتا من أنسجة القرنية الشافية التي تجاور القرنية المركزية المصابة مباشرة (5 أيام بعد الجرح)8 (الشكل 5A ، B). على الرغم من التثبيط السابق ، فإن أعصاب القرنية في النهاية تعصب أنسجة القرنية الملتئمة بالكامل (11 يوما بعد الجرح) إلى مستويات كثافة مماثلة وفي أنماط مماثلة للضوابط غير المصابة (E18C) (الشكل 5C ، D).
ومن اللافت للنظر أن أنسجة القرنية المعاد ظهارتها بالكامل والتي شفيت بطريقة غير ليفية وخالية من الندوب تعرض تلخيصا كاملا لبنية أنسجة الكولاجين الطبيعية. كما يتضح من التصوير التوافقي من الجيل الثاني22,23 ، يتم ترتيب حزم من ألياف الكولاجين عبر أعماق مختلفة من منطقة جرح القرنية المركزية بشكل متعامد ، مطابقة للبنية الكلية الأصلية لأنسجة القرنية المركزية غير المصابة9 (الشكل 6).
الشكل 1: مخطط تشريح الغشاء خارج الجنين في البويضة وجرح القرنية. في E5.5 ، تتعرض المنطقة القحفية للجنين عن طريق تشريح أغشية ACM و CAM ووضع السلى و allantois بعيدا عن العين النامية. يتم إغلاق البيض وتحضينه إلى E7 عندما تكون القرنية المركزية مصابة ، باستخدام ملقط منحني كمهد لرأس الجنين حيث يقوم طرف سكين الجراحة المجهرية بعمل شق في القرنية المركزية. يتم توجيه الجرح بالتوازي مع الشق المشيمي (العلامة النجمية). لضمان وصول عمق الشق إلى السدى الأمامي ، يجب إجراء ثلاثة جروح متزامنة بالسكين ، كل منها في نفس الموضع النسبي ، واحدة على الأخرى. شريط المقياس = 1 مم. تم تكييف الشكل بإذن من المراجع 8,11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الاختلافات في الجروح المتولدة في البيض. (أ) بعد تشريح الغشاء عند E5.5 ، يمكن الوصول إلى العين اليمنى في البيض. (ب-د) الصور الملتقطة لجنين في البويضة مباشرة بعد تمزقات بدرجات متفاوتة تمتد على مدى القرنية وتتماشى مع الشق المشيمي (cf). (ب) بعد ثلاثة تمزقات تم فيها تطبيق ضغط ضعيف ، يظهر جرح ضحل. يشير رأس السهم إلى موقع في القرنية حيث تم قص الظهارة ولكن لم يتم اختراق السدى الأمامي. تشير رؤوس الأسهم إلى منطقة قرنية صغيرة حيث تم اختراق السدى الأمامي. (ج) بعد ثلاثة تمزقات تم فيها تطبيق كمية مثالية من الضغط ، يكون الجرح المثالي مرئيا. تشير رؤوس السهام إلى جرح يمتد على كامل نطاق القرنية حيث تم اختراق السدى الأمامي. (د) بعد ثلاثة تمزقات تم فيها الضغط المفرط ، يكون الجرح كامل المدى مرئيا ، وأصبحت الفكاهة المائية معرضة للبيئة الخارجية. الاختصارات: tca, الشريان الهدبي الصدغي; راجع ، الشق المشيمي. CAM ، غشاء chorioallantoic. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تطور التئام الجروح. (أ) يظهر تطور الشفاء في القرنيات المصابة مقارنة بالضوابط المتطابقة مع المرحلة من وقت الجرح (0 dpw) و 16 ساعة بعد الجرح (hrpw) من خلال 3-11 يوما بعد الجرح (dpw). تحدد رؤوس الأسهم الحدود الظهرية والبطنية للجرح ، مما يشير إلى فترة من تمدد الجرح (0-3 dpw) تليها إغلاق الجرح التدريجي (5-11 dpw). (ب) القرنيات المصابة المجزأة DAPI (الزرقاء) - واللامينين (الحمراء) الملطخة عند 0 و 3 و 11 dpw. توضح الأقواس مدى المنطقة المصابة ، والتي تكشف عن توسع الجرح بمقدار 3 DPW والإصلاح الكامل للقرنية المعاد ظهارتها بواسطة E11. تشير العلامات النجمية إلى المنطقة الملتئمة من القرنية. شريط المقياس هو (A) 1 مم ، (B) 100 ميكرومتر. تم تكييف الشكل بإذن من المرجع8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحليل النسيجي للقرنيات المصابة. المقاطع العرضية من خلال (A) 3 dpw و (B) 5 dpw. تكشف القرنيات المصابة الملطخة ب DAPI (الزرقاء) عن توطين الفيبرونيكتين (FN ، الأحمر) و Tenascin-C (TN-C ، الأخضر). تشير الأقواس الموجودة في (أ) و (ب) إلى المنطقة المصابة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الاختصارات: ep, ظهارة; ش ، سدى. en, البطانة. تم تكييف الشكل بإذن من المرجع8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تعصيب القرنيات المصابة. (A-D) تصور أعصاب القرنية بعد التوبولين العصبي المضاد β (Tuj1) المسطح بالكامل في (B) 5 dpw و (D) 11 dpw corneas ، وكذلك (A) E12 المطابق للمرحلة (E12C ، المرحلة المطابقة ل 5 dpw) و (C) E18 الضوابط (E18C ، المرحلة المطابقة ل 11 dpw). (ب) يشير الخط المكسور في القرنية 5 dpw إلى مدى الجرح. تشير المنطقة الموضوعة بين قوسين بجوار الجرح مباشرة إلى منطقة القرنية التي تنفر مؤقتا للأعصاب وتخضع بنشاط لإعادة الظهارة. (ب') يكشف الفحص البصري من خلال أنسجة القرنية الشافية المجاورة مباشرة للجرح المفتوح عن حزمة عصبية لحمية نادرة تمتد إلى الأنسجة (السهم) ومقاود الأعصاب الظهارية (رأس السهم). (ج، د) تعرض القرنيات المجددة بالكامل عند 11 نقطة في الساعة أنماط تعصيب مماثلة وكثافات عصبية مماثلة للضوابط المتطابقة مع المرحلة. اختصار: ث ، الجرح. تم تكييف الشكل بإذن من المرجع8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: البنية الفائقة للكولاجين في القرنيات الجنينية الملتئمة. (أ) مسح الوجه للقرنيات الملتئمة تماما 10 DPW وعناصر التحكم المتطابقة مع المراحل باستخدام الجيل الثاني من التصوير التوافقي (SGH). تتراوح أعماق المسح الضوئي من 2-66 ميكرومتر من السطح الأمامي للقرنية (0 ميكرومتر هي السدى الأكثر أمامية) ويتم سردها على يسار الصور المعنية. تتوافق الإدخالات الداخلية لكل صورة مع تحليل تحويل فورييه السريع لمنطقة الجرح المركزية لعمق المسح الضوئي المحدد. (ب) أكوام مجزأة يدويا من تحليل تحويل فورييه السريع ثنائي الأبعاد ، تمثل تنظيم الكولاجين داخل قرنية التحكم المصابة والمتطابقة مع المرحلة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تم تكييف الشكل بإذن من المرجع9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفرخ هو نظام نموذجي مثالي لدراسة إصلاح جرح القرنية الجنيني الخالي من الندوب. على عكس الثدييات ، يمكن الوصول بسهولة إلى الفرخ طوال فترة التطوير باستخدام استراتيجيات ovo 8 أو ex ovo 24. قرنية الفرخ الجنينية أكبر بكثير من قرنية القوارض ، مع ما يقرب من 50 ٪ من حجم الجمجمة المخصصة للعين25 ، مما يجعلها قابلة للغاية للتلاعبات الجسدية مثل الجرح. وعلاوة على ذلك، فإن بيض الدجاج متاح بسهولة على مدار السنة، وغالبا ما يكون من المزارع المحلية، وفعال من حيث التكلفة، ولا يتطلب سوى حاضنة مرطبة لدعم التنمية.
يقدم هذا البروتوكول سلسلة من الإجراءات التي تمكن من جرح قرنية الفرخ الجنيني. تتجدد الجروح التي تحدث في قرنية الفرخ الجنينية بشكل كامل ، مما يتيح تلخيصا كاملا لبنية القرنية الأصلية دون أي ندوب يمكن اكتشافها. جعلت هذه التقنية من الفرخ الجنيني نموذجا حيوانيا حيويا لتوضيح العوامل الجزيئية والخلوية التي تنسق التئام جروح القرنية بدون ندوب.
على الرغم من الوعد الواضح المتأصل في نموذج التئام جروح الجنين الموصوف هنا ، تجدر الإشارة إلى أن هناك اختلافات واضحة بين التئام جروح القرنية الجنينية والبالغين. تعبر القرنية الجنينية عن عوامل النمو والإشارات المورفوجينية التي يتم إسكاتها أو غيابها في الأنسجة البالغة26. علاوة على ذلك ، تظهر أنسجة القرنية البالغة المصابة تليفا وتشكل أنسجة ندبية ، على الأرجح بسبب استجابة التهابية متزايدة بوساطة السيتوكينات وعوامل النمو27 ، والتي يتم تخفيفها أو لم يتم تحديدها بعد في المراحل الجنينية. مثل هذه الاختلافات المرتبطة بالعمر داخل أنسجة القرنية يمكن أن تعقد الجهود المبذولة لاستعادة الأنسجة الجريحة البالغة بالكامل. ومع ذلك ، فإن تحديد العوامل الجزيئية الرئيسية وبروتينات المصفوفة التي تنظم التئام الجروح الجنيني بدون ندوب سيمهد الطريق للعلاجات التي تعزز عملية شفاء أكثر تصالحية مع ندوب أقل وتلخيص أفضل لبنية الأنسجة الطبيعية.
تعتمد طريقة الجرح الموصوفة هنا على تقنية طورها Spurlin et al.11 لأول مرة للوصول إلى أجنة الفرخ في المراحل المتأخرة (على سبيل المثال ، >E6). من خلال تظلييل البويضة وتشريح الأغشية خارج الجنين بعيدا عن منطقة الجمجمة ، يمكن الوصول إلى العين الجنينية إلى مراحل متأخرة من E7. كما ذكرنا سابقا ، فإن إزالة وتشريد الأغشية السلوية والمشيمية ، على التوالي ، لا تؤثر على التطور الجنيني11. الأجنة المكشوفة قابلة للحياة وقابلة للتلاعب المادي بسهولة. في هذه المرحلة ، تحتوي القرنية على ثلاث طبقات متميزة (الظهارة ، السدى ، والبطانة) ، مما يجعلها مناسبة لدراسات التئام الجروح بعد الشق الخطي في السدى الأمامي. تجدر الإشارة إلى أنه بسبب زيادة نمو allantois بمرور الوقت ، يتم سد الوصول إلى العين في النهاية في E8. للتحايل على هذه المشكلة ، إذا كان الوصول إلى عيون المرحلة اللاحقة للجرح أمرا مرغوبا فيه ، فقد وجدنا أنه يمكن الحفاظ على الوصول إلى العين من خلال E9 عن طريق إجراء معالجة يومية للأغشية خارج الجنين (على سبيل المثال ، في E7 ، E8 ، إلخ) ، حيث يتم إعادة وضع allantois بعناية بعيدا عن منطقة الجمجمة لضمان حدوث نموها في الاتجاه بعيدا عن الجنين. وهذا يمكن القرنيات من الإصابة في هذه المراحل اللاحقة (على سبيل المثال، بعد التعصيب).
بشكل عام ، تعتمد صلاحية الجنين وبقائه على قيد الحياة في هذه التقنية على عدة عوامل ، مثل ضمان الحفاظ على بيئة بيض معقمة ورطبة مع توخي المزيد من الحذر لعدم إلحاق الضرر بالأوعية الدموية الجنينية أو allantois. يجب تعقيم سطح البويضة بالكامل بالإيثانول قبل النوافذ للحفاظ على العقم. وذلك لأن شظايا قشر البيض الصغيرة ، والتي غالبا ما تكون محملة بالميكروبات ، ستسقط عادة في البويضة أثناء إجراء النوافذ. وبالمثل ، يجب شطف جميع الأدوات المشاركة في النوافذ ، وتشريح الغشاء ، وإجراء شق القرنية جيدا بالإيثانول وتجفيفها أو تعقيمها باللهب قبل استخدامها. علاوة على ذلك ، يجب إضافة المضادات الحيوية إلى البويضة في أي وقت يتعرض فيه الجنين للبيئة الخارجية. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يحتفظ الجنين بالترطيب المناسب بعد النافذة. يجب توخي الحذر الشديد لضمان إغلاق النافذة بالكامل بشريط لاصق وعدم وجود فجوات هوائية. نظرا لأهمية بقاء الشريط ملتصقا تماما بسطح قشر البيض وإغلاق الثقب بالكامل ، يجب تنظيف سطح قشر البيض المحيط بالثقب وتجفيفه قبل تطبيق الشريط. وأخيرا، من الضروري عدم قطع أي أوعية دموية عن غير قصد وعدم تلف الألانتوا، الذي يخزن النفايات السائلة من الجنين، أثناء تشريح الأغشية خارج الجنين لأن أيا منهما قاتل للجنين. تجدر الإشارة إلى أن صلاحية الجنين تكون أعلى عندما يتم إجراء تمزقات أصغر في المشيمة والسلى ، على الرغم من أن التمزق يجب أن يكون كبيرا بما يكفي لوضع الأغشية خارج الجنين بعيدا عن منطقة الجمجمة. إذا تم اتخاذ هذه الخطوات الدقيقة أثناء تشريح وإزالة الأغشية من البيض عالي الجودة ، يمكن للمرء أن يتوقع أن تنجو جميع الأجنة تقريبا من إجراء النوافذ (~ 99٪) ، في حين أن ~ 40٪ من الأجنة المكشوفة تبقى على قيد الحياة إلى E9 و ~ 30٪ إلى E1211. في تجربتنا ، فإن جرح قرنيات الأجنة المشوهة بغشاء E7-E9 له تأثير ضئيل على صلاحية الجنين ، وتظل الأجنة الوافرة قابلة للحياة من خلال E18 ، وعند هذه النقطة يتم شفاء جرح القرنية بالكامل.
يعد تحقيق الجروح التي تجتاز ظهارة القرنية وتخترق السدى الأمامي أمرا ضروريا لإنتاج نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. من الضروري استخدام سكين تشريح دقيق عالي الجودة بحيث لا يحتاج إلى ضغط يذكر للغاية. يمكن أن يكون استخدام زوج من ملقط القزحية المنحني مفيدا في حمل الرأس بلطف لأن التمزق مصنوع من اليد الأخرى. وبهذه الطريقة ، تعمل ملقط القزحية المنحني كدعامة بحيث تظل القرنية ثابتة أثناء الجرح. إن تغلغل الجرح في السدى متغير ، خاصة عند التعلم ، ولكنه يصبح أكثر قابلية للتكرار حيث يتعلم الباحث شعور ومظهر كسر ظهارة القرنية. وكما يتعلم، قد يكون من المفيد عرض القرنيات المصابة في المقطع العرضي بحيث يمكن تقييم عمق اختراق الجرح في سدى القرنية (انظر الشكل 3 ب للحصول على مثال على قرنية مقطعية تظهر عمق جرح مثالي بعد تمزق القرنية مباشرة).
عندما يقترن هذا النموذج الحيواني لتجديد القرنية بتقنيات البيولوجيا التنموية الكلاسيكية ، مثل تطعيم الأنسجة وزرع الخرز ، أو الأساليب الحديثة للتلاعب بالجينات ، مثل كهربية الحمض النووي والعدوى الفيروسية الرجعية ، يعد هذا النموذج الحيواني لتجديد القرنية بالكشف عن العوامل الجزيئية والآليات الخلوية اللازمة لتحقيق الشفاء التام لأنسجة القرنية بعد الضرر. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج الحيواني لاختبار الفائدة المحتملة للمركبات العلاجية الخارجية لزيادة تجديد القرنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة فيما يتعلق بالمعلومات المقدمة في هذه المخطوطة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة التطوير الفني والعلمي من خلال جامعة إلينوي ويسليان إلى TS وبتمويل جزئي من NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
