Summary
הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
Abstract
פצעי הקרנית העובריים של אפרוחים מציגים יכולת יוצאת דופן להתחדש באופן מלא ומהיר, בעוד שקרניות פצועות בוגרות חוות אובדן שקיפות עקב הצטלקות פיברוטית. שלמות הרקמה של הקרנית העוברית הפצועה משוחזרת באופן מהותי ללא היווצרות צלקת הניתנת לזיהוי. בהתחשב בנגישותו ובקלות המניפולציה שלו, עובר האפרוח הוא מודל אידיאלי לחקר תיקון פצעי הקרנית ללא צלקות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים העובריים המוקדמים כדי לגשת לעין. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-אמבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבי התפתחות מאוחרים יותר, המתאימים למועד שבו נוצרות שלוש השכבות התאית של הקרנית. שלישית, פצעי קרנית ליניאריים החודרים לשכבת האפיתל החיצונית ולסטרומה הקדמית מיוצרים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה. מחקרים שנערכו עד כה באמצעות מודל זה גילו כי קרניות עובריות פצועות מציגות הפעלה של התמיינות קרטוציטים, עוברות שיפוץ מתואם של חלבוני ECM למבנה המאקרו התלת-ממדי הטבעי שלהן, והופכות להיות מופנמות מחדש כראוי על ידי עצבים חושיים של הקרנית. בעתיד, ניתן יהיה לנתח את ההשפעה הפוטנציאלית של גורמים אנדוגניים או אקסוגניים על תהליך ההתחדשות בריפוי קרניות באמצעות טכניקות ביולוגיות התפתחותיות, כגון השתלת רקמות, אלקטרופורציה, זיהום רטרו-ויראלי או השתלת חרוזים. האסטרטגיה הנוכחית מזהה את הגוזל העוברי כפרדיגמה ניסיונית מכרעת להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים המתאמים את ריפוי פצעי הקרנית ללא צלקות.
Introduction
הקרנית היא הרקמה השקופה והחיצונית ביותר של העין שמעבירה ושוברת אור התורם לחדות הראייה. בקרנית הבוגרת, נזק או זיהום לסטרומה הקרנית מובילים לתגובת ריפוי פצעים מהירה וחזקה המאופיינת בשגשוג קרטוסיטים, פיברוזיס, דלקת מוגברת המובילה לאפופטוזיס הנגרמת על ידי ציטוקינים, יצירת מיופיברובלסטים לתיקון, ושיפוץ כולל של המטריצה החוץ-תאית (ECM)1,2 . בעקבות הפציעה, תיקון רקמת הקרנית גורם לרקמת צלקת אטומה המפחיתה את שקיפות הקרנית ומונעת את מעבר האור, ובכך מעוותת את הראייה ובמקרים הקשים ביותר, מובילה לעיוורון הקרנית3. לפיכך, יש צורך ברור לפתח מודלים אמינים של בעלי חיים כדי לטפל במורכבות של ריפוי פצעים ולזהות את הגורמים התאיים והמולקולריים האחראים לסגירת פצעים ולהתחדשות רקמות.
עד כה, רוב המחקרים שבחנו ריפוי פצעי קרנית השתמשו במודלים של בעלי חיים לאחר הלידה4 או בוגרים 1,2,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה הובילו להתקדמות משמעותית בהבנת תגובת ריפוי פצעי הקרנית והמנגנונים העומדים בבסיס היווצרות צלקות, רקמות הקרנית הפגועות במודלי ריפוי אלה אינן מצליחות להתחדש באופן מלא, ובכך מגבילות את התועלת שלהן לזיהוי הגורמים המולקולריים והמנגנונים התאיים האחראים לשיקום מלא של המורפולוגיה והמבנה הקרנית לאחר הפציעה. לעומת זאת, פצעים עובריים הנוצרים באמצעות סכין בקרנית האפרוח העוברי הם בעלי יכולת פנימית להחלים באופן מלא בצורה נטולת צלקות8. באופן ספציפי, קרנית האפרוח העוברית מציגה התחדשות לא-פיברוטית עם שחזור מלא של מבנה המטריצה החוץ-תאית ודפוסי העצבנות 8,9.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר רצף של שלבים המעורבים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ראשית, ביצים נזרקות בגילים עובריים מוקדמים כדי להקל על הגישה לעובר. שנית, סדרה של מניפולציות פיזיקליות באובו לממבריות החוץ-ממבריוניות מתבצעות כדי להבטיח שהגישה לעין נשמרת בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, המתאימים לזמן שבו נוצרות שלוש השכבות התאיות של הקרנית ורצוי פצע. שלישית, חתכי קרנית מרכזיים ליניאריים החודרים דרך אפיתל הקרנית ולתוך הסטרומה הקדמית נעשים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית. ניתן לנתח את תהליך ההתחדשות או הקרנית המשוחזרת במלואה לפוטנציאל רגנרטיבי באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זן הביצים ששימש בפרוטוקול זה היה White Leghorn, וכל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי ווסליאן.
1. דגירה של ביצי אפרוחים
- יש לשמור על הביצים בטמפרטורה של כ-10 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לאחר הטלתן כדי לעצור את ההתפתחות. כאשר אתם מוכנים להתחיל את התפתחות העובר של אפרוח, נגבו את כל קליפת הביצה במגבונים נטולי מוך (ראו טבלת חומרים) רוויים במים בטמפרטורת החדר כדי להסיר לכלוך ופסולת.
- ודאו שקליפת הביצה מחוטאת. נגבו את כל משטח הביצה במגבונים נטולי מוך עם 70% אתנול. נגבו במהירות את האתנול כדי לייבש את הביצית והימנעו מספיגת אתנול דרך קליפת הביצית אל העובר.
- מסדרים את הביצים בצורה אופקית על מגש. סמן את החלק העליון של הביצית כדי לציין את המיקום הצפוי של העובר. דגירה אופקית של הביצים, כאשר פונקציית הנדנדה מופעלת, באינקובטור לח של 38 מעלות צלזיוס.
2. חלון הביצים כדי להתכונן לנתיחה של קרום
- מוציאים ביצים מהחממה ביום השלישי להתפתחות העוברית (E3). מעקרים את החלק העליון של הביצים עם מגבונים נטולי מוך שהורטבו עם 70% אתנול. מייבשים את האתנול ממשטחי קליפת הביצה.
הערה: כדי להבטיח שהפיתוח לא יתעכב במהלך הליך החלונות, הוסרו 6-12 ביצים, וההליך בוצע במהירות על אלה בזמן שהביצים הנותרות הושארו באינקובטור. - מקמו ביצה בצורה אופקית במחזיק ביצה מאובטח (ראו טבלת חומרים). באמצעות הקצה החד של מספריים ניתוח, ליצור חור קטן בחלק העליון של קליפת הביצה ליד הקצה המחודד של הביצה.
הערה: חור זה יקל על הסרת אלבומן, הנחוצה כדי להפיל את החלמון והעובר הרחק ממשטח קליפת הביצה הפנימי. עבור מחזיקי ביצים, נעשה שימוש בדירות מילוי ביצים עיסת נייר, שבתוכם נשלחות הביצים. - דרך החור (שלב 2.2.), הכניסו מחט היפודרמית משופעת של 18 גרם. כאשר המחט נדחפת אל המשטח הפנימי התחתון של הביצה והצד המשופע של המחט פונה לקצה המחודד של הביצה (למשל, הרחק מהמיקום הצפוי של החלמון והעובר ליד אמצע הביצה), יש להסיר 2-3 מ"ל של אלבומן מביצת התרנגולת ולהשליך.
הערה: אם המחט של האדם תניק את העובר או את כלי הדם הקשורים אליו במהלך שלב זה, זה יגרום לכך שהדם ישאף לאלבומן. זה יגרום למוות של עובר. יתר על כן, אם החלמון שואף בשוגג יחד עם האלבומן במהלך שלב זה, העובר לא יהיה בר קיימא. בכל מקרה, יש להשליך את הביצית אם לא ניתן להשתמש בעובר באופן מיידי למטרות אחרות. - נקו את משטח קליפת הביצה המקיף את החור עם מגבונים נטולי מוך שהורטבו קלות עם 70% אתנול ונגבו את הייבוש. אטום את החור שנועד להסרת אלבומן עם סרט שקוף.
- עם הקצה החד של ניתוח המספריים, צרו חור "חלון" שני בחלק העליון של קליפת הביצה באתר הסימון (שלב 1.3.). יש לוודא שהמספריים אינם מתרחבים רחוק מדי לתוך קליפת הביצית כדי להימנע ממגע ופגיעה בעובר או בכלי הדם העובריים, שלעתים קרובות ימוקמו בתוך הביצית ישירות מתחת לאתר החור השני.
- באמצעות מלקחיים מעוקלים של הקשתית, מרחיבים את חור ה"חלון" כך שיתפרש על פני כ-2-3 ס"מ קוטרם ומשמשים כ"חלון" לעובר המתפתח שמתחת לקליפה.
- הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה. ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של 2-3 ס"מ שמכסה ישירות את העובר.
הערה: ביצים שבהן העוברים אינם מוטלים ישירות מתחת לחור שנוצר בשלב 2.6. אסור להשתמש בהם מכיוון שניתוחי הממברנה הקרובים יהיו מאתגרים להשלמה. אפילו עם נדנדה אופקית של הביצים, כ -10% מהביצים אינן שמישות בשל המיקום הלקוי של העובר. עוברים אלה יכולים לשמש למטרות אחרות.
- הכניסו קצה אחד של המלקחיים לתוך החור, תוך שמירה עליו מקביל לקליפת הביצה וצמוד אליה. כאשר קצה המלקחיים האחרים ממוקם מחוץ לקליפת הביצה, צובטים בזהירות את שני קצוות המלקחיים יחד, ומאפשרים להם להישבר ולהסיר חתיכות קטנות מקליפת הביצה. ממשיכים לשבור ולהסיר שברי קליפות ביצים עד שנשאר חלון של 2-3 ס"מ שמכסה ישירות את העובר.
- כדי להגביל את הזיהום החיידקי, יש להוסיף דרך חור החלון (למשל, לתוך הביצה) ~ 100-200 μL של תמיסת רינגר (8 גרם של NaCl, 0.37 גרם של KCl, ו-0.23 גרם של CaCl2.2H 20 לכל L של H20 מזוקק) המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין (50 U/mL של פניצילין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין, ראה טבלת חומרים).
- אטמו את חור החלון באמצעות סרט דבק שקוף. בצע את איטום הביצה על ידי יישור פינה של הסרט על הציר הארוך של החור ולחיצה על הקלטת לקליפה במרחק של כ-1-2 ס"מ מקצה החור.
- ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הסרט יחד, יצרו צורה כיפה מעל החור, ולחצו על דש הסרט התלוי יתר על המידה על הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה.
הערה: ביצים צריכות להיות בחלון E2 או E3. לפי הניסיון, חלון לפני E2 גורם לכדאיות עוברית נמוכה. יתר על כן, על ידי E4, העובר והממבריונים החוץ-אמבריוניים נקשרים לקליפת הביצה10, וכל ניסיון לחלון E4 או מאוחר יותר גורם לעתים קרובות לפגיעה בעוברים או לקריעה של כלי דם חוץ-ממבריוניים, כאשר כל אחד מהאירועים מוביל לתוצאה של מוות עוברי.
- ממשיכים לאטום סביב הפתח עד שנשאר דש תלוי של סרט הדבקה בצד אחד. לחצו על שתי פיסות הסרט יחד, יצרו צורה כיפה מעל החור, ולחצו על דש הסרט התלוי יתר על המידה על הקליפה כדי לסיים את איטום הביצה.
- להחזיר את הביצים "החלונות" לחממה להמשך פיתוח. הקפידו לשמור על הביצים אופקיות ולכבות את פונקציית הנדנדה של האינקובטור.
- חזור על שלבים 2.2.-2.9. עבור כל ביצה.
3. מיקרו-דיסקציות של הקרומים החוץ-ממבריוניים
- הסר ביצה עם חלונות E5.5 מהאינקובטור. חשוף את העובר על ידי חיתוך הסרט מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקרים.
- השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לצפות בעובר ובקרומים החוץ-ממבריוניים שלו דרך החלון. במידת הצורך, השתמשו במספריים או במלקחיים מעוקלים של הקשתית כדי להרחיב את החלון כך שהעובר ימוקם היטב מתחת לחלון, תוך הקפדה שלא לפגוע בכלי הדם העובריים.
- הוסיפו שתי טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לוודא שהעובר נמצא בשלב ההתפתחותי הנכון (המבורגר המילטון שלב 27, ~E5.5)11,12 ואתר את מיקומם של קרום השפיר (ACM) והממברנה הכוריואלנטואית (CAM).
הערה: בשלב זה, העובר מוקף ב-ACM, הכולל את קרום מי השפיר ואת הממברנה הכוריונית העילית המתמזגת ומכוסה חלקית באלנטואה בעלת כלי הדם הגבוהים, המשתרעת מאזור המעיים של העובר ומתמזגת עם כוריון הכיסוי ליצירת CAM11,12. ה-ACM אינו בעל כלי דם כבדים, מה שמאפשר לנתח את הממברנות הללו כדי לחשוף את העובר מבלי לפגוע בכלי הדם ולפגוע בעובר. - בצע ניתוחי קרום חוץ-אמבריוניים בשלב זה (E5.5).
הערה: E5.5 הוא הזמן האידיאלי לבצע את ניתוחי הממברנה החוץ-אמבריונית. ניתוח הממברנות מוקדם יותר (למשל, ב-E4) לפני היווצרות CAM מפחית את נגישות העוברים בשלבים מאוחרים יותר11. יתר על כן, ב- E5.5, העובר מכוסה רק באופן חלקי על ידי ה- CAM בעל כלי הדם הגבוהים, אך במהלך 1-2 הימים הבאים, ה- CAM עוטף במהירות ומונע גישה נוספת לעובר11,12. מסיבה זו, כריתת ממברנה ב- E6 ואילך מאתגרת ככל שהסיכון לקריעת כלי דם עולה.- השתמשו בזוג מלקחיים עדינים מעוקרים כדי לתפוס בעדינות את ה-ACM ולהרחיק אותו מהעובר. לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור ב- ACM ישירות מעל המצח המשתרע מהממברנה מעל הממברנה שמעל המצח ועד לממברנה שמעל הראש.
הערה: צעד זה מרגיע את קרום הכוריון והאמניון, ובכך מקל על אחיזתם וניתוחם עוד יותר עם מלקחיים בשלבים הבאים. ראו איור 1 לשרטוט מועיל של האופן שבו מנתחים את הממברנות דרך חלון קליפת הביצה.
- השתמשו בזוג מלקחיים עדינים מעוקרים כדי לתפוס בעדינות את ה-ACM ולהרחיק אותו מהעובר. לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים של מיקרו-ניתוח כדי לחתוך חור ב- ACM ישירות מעל המצח המשתרע מהממברנה מעל הממברנה שמעל המצח ועד לממברנה שמעל הראש.
- השתמש בשני זוגות של מלקחיים עדינים וסטריליים כדי לתפוס בעדינות את השן בשתי תנוחות סמוכות בין ה-ACM ל-CAM (למשל, אזור בין החתך שנעשה מעל ה-forelimb לקצה הקרוב ביותר של ה-CAM).
- הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה, כאשר זוג אחד נע בגב אל העובר והשני בגחון.
הערה: תנועה זו משמשת לקריעת השן עוד יותר תוך הפרדת ה-ACM (הנמשך בכיוון הגב ביחס לעובר על ידי זוג מלקחיים אחד) לבין ה-CAM (הנמשך בכיוון הגחון ביחס לעובר על ידי זוג המלקחיים השני). - יש לוודא שהממברנות מופרדות כאשר ה-CAM אינו מכסה עוד את העובר, והעורק והווריד האלנטואיים, הנובעים מהמעיים העובריים אל ה-CAM, נראים לעין בקלות.
- הזיזו בזהירות כל זוג מלקחיים, שניהם אוחזים בחוזקה בקרום מי השפיר, הרחק זה מזה, כאשר זוג אחד נע בגב אל העובר והשני בגחון.
- השתמש במלקחיים עדינים מעוקרים כדי לנתח ולהסיר את כל קרום השן שנותר המכסה את העובר. זה נפוץ ביותר ציין כי אמנון הנותרים יכסה חלקית את המחצית הקאודלית של העובר.
- באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את השמניון ליד אזור אמצע הגולגולת של העובר ומשכו בזהירות את האמניון בכיוון קאודלי ביחס לעובר לכיוון ה-CAM שנעקר מוקדם יותר. העובר ייחשף כעת באופן מלא, וצמיחה נוספת של ה-CAM תתרחש בעיקר הרחק מהעובר המתפתח.
הערה: ראה איור 1 לקבלת סכמות מועילות לגבי האופן שבו העובר שנחשף יופיע לאחר כריתת ממברנה. כמו כן, עיין בדוח11 שפורסם בעבר לקבלת דיאגרמות סכמטיות מועילות של שלבים 3.3.-3.6.
- באמצעות מלקחיים מעוקרים, תפסו את השמניון ליד אזור אמצע הגולגולת של העובר ומשכו בזהירות את האמניון בכיוון קאודלי ביחס לעובר לכיוון ה-CAM שנעקר מוקדם יותר. העובר ייחשף כעת באופן מלא, וצמיחה נוספת של ה-CAM תתרחש בעיקר הרחק מהעובר המתפתח.
- הוסיפו כמה טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- אטום מחדש את חור החלון באמצעות סרט שקוף, כמתואר בשלב 2.8. מחזירים את הביצה לחממה להמשך פיתוח, שומרים על הביצה אופקית ושומרים על תפקוד הנדנדה של האינקובטור מושבת.
- חזור על שלבים 3.1.-3.8. עבור כל ביצה.
הערה: ניתוחי הממברית החוץ-אמבריונית ב-E5.5 שתוארו לעיל יאפשרו גישה לעובר דרך E7, כלומר כאשר ניתן לבצע פציעה 8,9. על ידי E8, הצמיחה המתמשכת של רקמת CAM מתחילה לכסות את אזור הגולגולת של העובר, ובכך מונעת גישה נוספת לקרנית. אם רוצים לבצע פציעה בקרניות E8-E9 ישנות יותר, ניתן למקם מחדש את הגחון של CAM הגדל ביחס לעובר (שלב 3.10)." אם רוצים לפצוע ב-E7, שלב 3.10. אין צורך לבצע ואפשר להמשיך לשלב 4, פציעת הקרנית. - הסר ביצת E7 מהאינקובטור שהקרום החוץ-אמבריוני שלה נותח בעבר ב- E5.5 (שלבים 3.1.-3.8.). תפסו עם מלקחיים מעוקרים כל רקמות קרום אמניון זמינות שהתמזגו עם ה-CAM ומשכו בעדינות את קרום האניון הרחק מאזור הגולגולת של העובר בכיוון הגחון ביחס לעובר.
הערה: מכיוון שקרום השפיר שנעקר מהעובר מתמזג עם ה-CAM, ה-CAM הגדלה והסקולרית מאוד תעקוב אחר המלקחיים האוחזים באמניון ותתרחק מאזור הגולגולת. חזור על שלב זה מדי יום כדי להרחיק את ה- CAM ללא הרף מהעובר עד שהעובר נמצא בגיל הרצוי לפציעה.
4. פציעת קרנית
- קבל ביצה מהחממה לפציעה בגיל העוברי הרצוי, E7-E9. חשוף את העובר על ידי חיתוך הסרט מהחלון עם מספריים ניתוח מעוקרים. הוסיפו כמה טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- השתמשו בסכין מיקרו-ניתוחית כדי ליצור חתך שמשתרע על פני היקף הקרנית של עין ימין (בשל האופן שבו העובר מטיל את הביצית, עין שמאל אינה נגישה אך יכולה לשמש כבקרה שאינה פצועה), המקבילה לסדק הכורואידי (איור 1) ובהתאם לו. החתך הראשון יחצה את אפיתל הקרנית.
- השתמש בסכין המיקרו-ניתוח כדי לחתוך שוב את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון פי 2 יותר (למשל, שלושה חתכים בסך הכל, כאשר חתך 2 וחתך 3 מתרחשים יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו חתך 1)11. החתך השני יחצה את קרום המרתף, והשלישי יחדור את הסטרומה הקדמית.
הערה: אם העובר התיישב תחת ה-CAM המנותח, ניתן להשתמש במלקחיים מעוקלים מעוגלים מעוגלים מעוקרים של הקשתית כדי להזיז בזהירות את הראש החוצה מתחת ל-CAM. מקם את מלקחי הקשתית המעוקלים מתחת לראש, תוך יצירת מגע עם הצד השמאלי של הראש. ערסלו את כל הראש על גבי מלקחיים סגורים מעוקלים של הקשתית והרימו בעדינות את הראש סביב ומעל ה-CAM. כדי לסייע בכדאיות, השתמש בטכניקה דומה עם מלקחיי הקשתית המעוקלים כדי לתחוב את העובר בחזרה מתחת ל- CAM לאחר הניתוח כדי לקדם צמיחה נכונה של ה- CAM.
- השתמש בסכין המיקרו-ניתוח כדי לחתוך שוב את הקרנית באותה נקודה כמו החתך הראשון פי 2 יותר (למשל, שלושה חתכים בסך הכל, כאשר חתך 2 וחתך 3 מתרחשים יחד עם אותה תנוחה בקרנית כמו חתך 1)11. החתך השני יחצה את קרום המרתף, והשלישי יחדור את הסטרומה הקדמית.
- הוסיפו 3-4 טיפות של תמיסת רינגר המכילה אנטיביוטיקה מפניצילין/סטרפטומיצין כדי להעניק לחות לעובר ולעקר את הביצית.
- אטום מחדש את חור החלון בנייר דבק שקוף וחזור לחממה, תוך השארת הביצה אופקית. אפשרו לעובר להתפתח ולפצע הקרנית להחלים לתקופה הרצויה (למשל, 0.5-11 יום), ולאחר מכן להרדים את העובר באופן הומני על ידי עריפת ראשים.
- השתמשו במלקחי קשתית מעוקלים כדי לקצור את העין מעובר המתת חסד שצף בצלחת פטרי של תמיסת המלח של רינגר על ידי אחיזה עדינה של העין בצד האחורי שלה, היכן שהעין ורקמת הפנים נפגשות, והרמת העין כולה בזהירות הרחק והשתחררות מרקמת הפנים.
- השתמש במלקחיים עדינים כדי לתקוע חור קטן (3-5 ס"מ) בחלק האחורי של העין כולה ולתקן את כל העין ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C ב הלילה עם תסיסה קלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הניתוח המוקדם יותר של ACM ו-CAM ב-E5.5 כדי לחשוף את אזור הגולגולת של העובר המתפתח, נוצרה באובו סדרה של חתכים שהשתרעו על פני הקרנית המרכזית E7 (איור 1). פצע אידיאלי לחקר התחדשות הקרנית מתרחש בעקבות שלושה חתכים, שכל אחד מהם מיוצר באותו מיקום של הקרנית. החתך הראשון חוצה את אפיתל הקרנית, ואילו החתכים השני והשלישי חודרים לקרום המרתף שמתחתיו ולסטרומה הקדמית, בהתאמה. כדי להשיג פצע אידיאלי, חשוב להשתמש בסכין מיקרו-דיסקציה חדה (ראו טבלת חומרים) ולהפעיל את כמות הלחץ הנכונה בעת ביצוע החתך (איור 2, ראו פצע אידיאלי). הפעלת לחץ קטן מדי תגרום לפצע רדוד שקורע את אפיתל הקרנית מבלי לחדור מספיק לסטרומה הקדמית (איור 2, ראו פצע רדוד). עם זאת, הפעלת לחץ רב מדי גורמת לפצע בהיקף מלא החודר לכל הסטרומה וחושף את ההומור המיימי לסביבה החיצונית (איור 2, ראו פצע בהיקף מלא).
ביצוע החתכים המתאימים יוצר פצע אידיאלי (איור 2) שבתחילה גדל (0-3 ימים לאחר הפציעה)8 (איור 3). ההנחה היא ששלב הגדלת הפצע המתרחש על ידי פציעת קרנית עוף E7 קשור להתרחבות המהירה של גודל העין בשלב עוברי זה8. עיני עוף עובריות גדלות בקצב מהיר משמעותית מ-E4 ל-E10 בהשוואה לצמיחת העיניים מ-E10 לבקיעה. שלבים מהירים מוקדמים אלה של צמיחת העיניים מיוחסים לצמיחה מוגברת התלויה בלחץ תוך עיני (IOP)13. לכן, סביר להניח שקצב הגדילה המהיר של העין יחד עם ה-IOP המוגבה מקדם נסיגה של פצעים בשלבים המוקדמים של תהליך הריפוי (0-3 ימים לאחר הפציעה), שהיא ייחודית להתקדמות ריפוי פצע הקרנית העוברית. לאחר מכן, אפיתליזציה מחדש ויצירת רקמות חדשות מתרחשות (4-9 ימים לאחר הפציעה) כדי לסגור בסופו של דבר את הפצע בצורה נטולת צלקות ב-11 ימים לאחר הפצע8 (איור 3A).
ניתוח נוסף של עומק הפצע וההתחדשות התאפשר על ידי צביעת חתכים בנוגדן למינין המסמן את קרום המרתף העשיר בלאמינין וכתם נגדי של המקטעים בסמן הגרעיני DAPI, החושף את היקף הפצע דרך אפיתל הקרנית8. קרניות שנפצעו לאחרונה (0 dpw) ואלה שנמצאות בשלב מוקדם בתהליך ההתחדשות (3 dpw) הראו כי הפצע חדר לשכבת האפיתל ולממברנת המרתף, כפי שמעידים צביעת הפריצה של הסמן הגרעיני DAPI בתוך אפיתל הקרנית והיעדר צביעת נוגדנים למינין, המסמנת את קרום המרתף העשיר בלמינין בין אפיתל הקרנית לסטרומה8 (איור 3B ). עם זאת, חתכי רוחב דרך קרניות 11 dpw מוכתמות ב-DAPI ובנוגדן למינין חשפו קרנית שנרפאה לחלוטין, שעברה אפיתלציה מחדש והכילה קרום מרתף רציף עשיר בלמינין באתר הפצע המחודש8 (איור 3B).
בעקבות חתך הקרנית, נעשה אפיון מפורט של תהליך ריפוי הפצע על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמות הקרנית החתוכיות והפצועות. חלבוני המטריצה החוץ-תאית פיברונקטין וטנסין קשורים לנדידת אפיתל ותאי קרטוציטים לריפוי פצעי קרנית בוגרים14,15. לוקליזציה מרחבית-טמפורלית של חלבוני המטריצה החוץ-תאית, פיברונקטין וטנאסין ניכרת בתוך הפצע המרפא ונמצאה גבוהה בנקודות זמן המתאימות לאפיתליזציה מחדש של הקרנית (5 ימים לאחר הפציעה)8 (איור 4). ניתוח כזה מצביע על חשיבותם של פיברונקטין וטנסין לסגירת פצעים, ובמיוחד על מעורבותם בנדידת תאי אפיתל ובהישרדותם, בהתאם לתפקודים כאלה בפצעים בקרנית בוגרים16,17.
החל מ-E8-E9, הקרנית מתעצבנת בצפיפות על ידי סיבי עצב חושיים טריגמינליים הנובעים מטבעת עצבים פריקורניאלית וחוצים את הסטרומה הקדמית כשהם מקרינים לעבר מרכז הקרנית ואפיתל הקרנית על ידי E12 18,19,20. מאחר שפצעי הקרנית במודל זה מיוצרים ב-E7, זמן קצר לפני הקרנית, זמן קצר לפני הקרנית, מודל זה חוקר עוד יותר את עצבי הקרנית כשהם מנווטים בקרנית מרפאת בעקבות עלבון. על-ידי שימוש באימונוהיסטוכימיה של כל הגוף כדי להתחקות אחר עצבי הקרנית באמצעות נוגדנים אנטי-β עצביים לטובולין (Tuj1)21, ניכר כי עצבים מעוכבים באופן זמני מרקמת הקרנית המרפאת, הממזגת ישירות את הקרנית המרכזית הפצועה (5 ימים לאחר הפציעה)8 (איור 5A,B). למרות עיכובים מוקדמים יותר, עצבי הקרנית מעצימים בסופו של דבר את רקמת הקרנית שנרפאה לחלוטין (11 ימים לאחר הפציעה) לרמות צפיפות דומות ובדפוסים דומים לבקרים תואמי שלבים שאינם פצועים (E18C) (איור 5C,D).
באופן מדהים, רקמות הקרנית שעברו אפיתל מחדש לחלוטין, שהחלימו בצורה לא-פיברוטית ונטולת צלקות, מציגות שחזור מלא של ארכיטקטורת רקמת הקולגן הרגילה. כפי שמעידה הדמיה הרמונית מהדור השני22,23, צרורות של סיבי קולגן בעומקים משתנים של אזור הפצע המרכזי בקרנית מסודרים בצורה אורתוגונלית, ומתאימים למבנה המאקרו-מבנה הטבעי של רקמת הקרנית המרכזית שאינה פצועה9 (איור 6).
איור 1: סכמטית של ניתוחי ממברנה חוץ-אמבריונית באובו ופציעת קרנית. ב- E5.5, אזור הגולגולת של העובר נחשף על ידי ניתוח ממברנות ACM ו- CAM ומיקום האניון והאלנטואה הרחק מהעין המתפתחת. הביצים אטומות ומודגרות ל-E7 כאשר הקרנית המרכזית נפצעת, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כעריסה לראש העובר כאשר קצה של סכין מיקרו-כירורגית מבצע חתך בקרנית המרכזית. הפצע מכוון במקביל לסדק הכורואידי (כוכבית). כדי להבטיח שעומק החתך יגיע לסטרומה הקדמית, יש לבצע שלושה חתכים בו-זמניים עם הסכין, כל אחד באותה תנוחה יחסית, אחד על השני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. הנתון מותאם באישור הפניות 8,11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שינויים בפצעים הנוצרים ב-ovo. (A) בעקבות ניתוחי ממברנה ב-E5.5, עין ימין נגישה באובו. (ב-ד) תמונות שצולמו של עובר אובו מיד לאחר חתכים בדרגות שונות המשתרעות על פני היקף הקרנית ותואמות את הסדק הכורואידי (cf). (ב) לאחר שלושה חתכים שבהם הופעל לחץ חלש, נראה פצע רדוד. ראש החץ מסמן אתר בקרנית שבו האפיתל נגזז אך הסטרומה הקדמית לא חדרה. ראשי חץ מציינים אזור קרנית קטן שבו חדרו לסטרומה הקדמית. (C) לאחר שלוש חתכים שבהם הופעלה כמות אידיאלית של לחץ, ניתן לראות פצע אידיאלי. ראשי חץ מציינים פצע המשתרע על כל היקף הקרנית שבה חדרו לסטרומה הקדמית. (ד) בעקבות שלושה חתכים שבהם הופעל לחץ מוגזם, ניתן להבחין בפצע בהיקף מלא, וההומור המיימי נחשף לסביבה החיצונית. קיצורים: tca, עורק סילארי טמפורלי; cf, סדק כורואידי; CAM, קרום chorioallantoic. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: התקדמות ריפוי הפצע. (A) התקדמות הריפוי בקרניות הפצועות בהשוואה לבקרות תואמות שלבים מוצגת מזמן הפציעה (0 dpw) ו-16 שעות לאחר הפצע (hrpw) ועד 3-11 ימים לאחר הפציעה (dpw). ראשי חץ תוחמים את הגבולות הגביים והגחוניים ביותר של הפצע, מה שמצביע על תקופה של התפשטות הפצע (0-3 dpw) ואחריה סגירת פצעים הדרגתית (5-11 dpw). (B) קרניות פצועות מוכתמות DAPI (כחולות) ולמינין (אדומות) מוכתמות ב-0, 3 ו-11 dpw. הסוגריים מראים את היקף האזור הפצוע, החושף את התפשטות הפצע ב-3 dpw ותיקון מלא של הקרנית המחודשת על ידי E11. כוכביות מציינות את האזור הנרפא של הקרנית. סרגל קנה המידה הוא (A) 1 מ"מ, (B) 100 מיקרומטר. האיור מותאם באישור הפניה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניתוח היסטולוגי של קרניות פצועות. חתכים רוחביים דרך (A) 3 dpw ו-(B) 5 dpw. קרניות פצועות מוכתמות DAPI (כחולות) חושפות לוקליזציה של פיברונקטין (FN, אדום) וטנסין-C (TN-C, ירוק). סוגריים ב- (A) ו- (B) מציינים את האזור הפצוע. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. קיצורים: ep, אפיתל; רחוב, סטרומה; en, אנדותל. האיור מותאם באישור הפניה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: עצבנות של קרניות פצועות. (A-D) הדמיה של עצבי הקרנית בעקבות טובולין עצבי אנטי-β (Tuj1) חיסון בהרכבה שלמה ב-(B) 5 dpw ו-(D) 11 קרניות dpw, כמו גם (A) E12 (E12C) תואם שלבים E12 (E12C, מותאם שלבים עבור 5 dpw) ו-(C) פקדי E18 (E18C, מותאמי שלבים עבור 11 dpw). (B) הקו השבור בקרנית 5 dpw מציין את היקף הפצע. האזור הסוגר הסמוך ישירות לפצע מציין את אזור הקרנית הדוחה באופן זמני את העצבים ועובר באופן פעיל אפיתליזציה מחדש. (ב') סריקה אופטית דרך רקמת הקרנית המרפאת הסמוכה ישירות לפצע הפתוח מגלה צרור עצבים סטרומלי נדיר המשתרע לתוך הרקמה (חץ) ורצועות עצב אפיתל (ראש חץ). (ג,ד) קרניות מתחדשות במלואן ב-11 dpw מציגות דפוסי עצבנות דומים וצפיפות עצבים דומה לבקרים תואמי שלבים. קיצור: w, פצע. האיור מותאם באישור הפניה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: מבנה-על של קולגן בקרניות עובריות שנרפאו. (A) סריקת פנים של קרניות 10 dpw שנרפאו במלואן ובקרות מותאמות שלבים באמצעות הדמיה הרמונית מהדור השני (SGH). עומקי הסריקה נעים בין 2-66 מיקרומטר מהמשטח הקדמי של הקרנית (0 מיקרומטר הוא הסטרומה הקדמית ביותר) והם רשומים משמאל לתמונות המתאימות. ערכות עבור כל תמונה מתאימות לניתוח התמרת Fast Fourier של אזור הפצע המרכזי עבור עומק סריקה מסוים זה. (B) ערימות מפולחות באופן ידני של ניתוח התמרת Fast Fourier דו-ממדי, המייצגות את ארגון הקולגן בתוך קרנית הבקרה הפצועה והתאמת שלבים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. האיור מותאם באישור הפניה9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האפרוח הוא מערכת מודל אידיאלית לחקר תיקון פצעי קרנית עובריים, ללא צלקות. בניגוד ליונקים, האפרוח נגיש בקלות לאורך כל הפיתוח באמצעות אסטרטגיות אובו8 או אקס אובו 24. הקרנית של האפרוח העוברי גדולה בהרבה מהקרניות של מכרסמים, כאשר כמעט 50% מנפח הגולגולת מוקדש לעין25, מה שהופך אותה למקובלת מאוד על מניפולציות פיזיות כמו פציעה. יתר על כן, ביצי עוף זמינות בקלות כל השנה, לעתים קרובות מחוות מקומיות, וחסכוניות, ודורשות רק חממה צנועה כדי לתמוך בפיתוח.
פרוטוקול זה מדווח על סדרה של הליכים המאפשרים פציעת קרנית של אפרוחים עובריים. פצעים העשויים בקרנית האפרוח העוברית מתחדשים במלואם, ומאפשרים שחזור מלא של מבנה הקרנית המקומי ללא צלקות הניתנות לזיהוי. טכניקה זו הפכה את הגוזל העוברי למודל חייתי חיוני להבהרת הגורמים המולקולריים והתאיים המתאמים את ריפוי פצע הקרנית ללא צלקות.
למרות ההבטחה הברורה הטבועה במודל ריפוי פצעי העובר המתואר כאן, ראוי לציין כי ישנם הבדלים ברורים בין ריפוי פצעי הקרנית העובריים והבוגרים. הקרנית העוברית מבטאת גורמי גדילה ואותות מורפוגנטיים המושתקים או נעדרים ברקמות בוגרות26. יתר על כן, רקמות קרנית בוגרות פצועות מציגות פיברוזיס ויוצרות רקמת צלקת, ככל הנראה בשל תגובה דלקתית מוגברת המתווכת על ידי ציטוקינים וגורמי גדילה27, אשר מדוכאים או עדיין לא נקבעו בשלבים עובריים. הבדלים כאלה הקשורים לגיל בתוך רקמת הקרנית עלולים לסבך את המאמצים לשקם את הרקמה הפצועה הבוגרת באופן מלא. עם זאת, קביעת גורמים מולקולריים מרכזיים וחלבוני מטריצה המווסתים ריפוי פצעים ללא צלקות עובריות תסלול את הדרך לטיפולים המטפחים תהליך ריפוי משקם יותר עם פחות הצטלקות וסיכום טוב יותר של ארכיטקטורת הרקמה הרגילה.
שיטת הפציעה המתוארת כאן מתבססת על טכניקה שפותחה לראשונה על ידי Spurlin et al.11 כדי להשיג באובו גישה לעוברי אפרוחים בשלב מאוחר (למשל, >E6). על ידי חלון הביצה וניתוח ממבריות חוץ-אמבריוניות הרחק מאזור הגולגולת, העין העוברית נגישה לשלבים מאוחרים כמו E7. כפי שדיווחנו בעבר, ההסרה והתזוזה של הממברנות השפיריות והכוריואלנטואיות, בהתאמה, אינן משפיעות על ההתפתחות העוברית11. עוברים חשופים הם בני קיימא והם נוחים בקלות למניפולציה פיזית. בשלב זה, לקרנית יש שלוש שכבות נפרדות (אפיתל, סטרומה ואנדותל), מה שהופך אותה למתאימה למחקרי ריפוי פצעים בעקבות חתך ליניארי לסטרומה הקדמית. יש לציין כי בשל הגידול הגובר באלנטואה לאורך זמן, הגישה לעין בסופו של דבר נבלמת ב-E8. כדי לעקוף בעיה זו, אם הגישה לעיניים בשלב מאוחר יותר לצורך פציעה היא רצויה, מצאנו כי ניתן לשמור על גישה לעין באמצעות E9 על ידי ביצוע מניפולציה יומיומית של הממבריות החוץ-אמבריוניות (למשל, ב-E7, E8 וכו'), שבהן האלנטואה ממוקמת מחדש בזהירות הרחק מאזור הגולגולת כדי להבטיח שצמיחתה תתרחש בכיוון הרחק מהעובר. זה מאפשר לקרניות להיפצע בשלבים מאוחרים אלה (למשל, לאחר העצבנות).
באופן כללי, כדאיות העוברים ושרידותם בטכניקה זו מסתמכים על מספר גורמים, כגון הקפדה על שמירה על סביבת ביצים סטרילית ומלאת לחות תוך נקיטת זהירות נוספת שלא לגרום נזק לכלי הדם העובריים או לאלנטואה. יש לעקר את כל משטח הביצה באתנול לפני החלונות כדי לשמור על סטריליות. הסיבה לכך היא ששברי קליפות ביצים קטנות, שלעתים קרובות עמוסות בחיידקים, בדרך כלל ייפלו לתוך הביצה במהלך הליך החלונות. באופן דומה, כל הכלים המעורבים בחלונות, כריתת ממברנה וביצוע חתך הקרנית חייבים להיות שטופים היטב באתנול ומיובשים או מעוקרים להבה לפני השימוש בהם. יתר על כן, יש להוסיף אנטיביוטיקה לביצית בכל פעם שהעובר נחשף לסביבה החיצונית. חשוב עוד יותר שהעובר ישמור על הידרציה נכונה לאחר החלונות. יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שהחלון אטום במלואו בנייר דבק ושלא יישארו פערי אוויר. בהתחשב בחשיבותו של הקלטת להישאר דבוקה במלואה למשטח קליפת הביצה ולאטום לחלוטין את החור, יש לנקות ולייבש את משטח קליפת הביצה המקיף את החור לפני מריחת הקלטת. לבסוף, חובה על כך שכלי דם לא ייחתכו בשוגג ושהאלנטואה, המאחסנת פסולת נוזלית מהעובר, לא תינזק במהלך כריתת הקרומים החוץ-ממבריוניים שכן שניהם קטלניים לעובר. יש לציין כי כדאיות העובר גבוהה יותר כאשר נוצרות קרעים קטנים יותר בכוריון ובאמניון, אם כי הקרע חייב להיות גדול מספיק כדי למקם את הקרומים החוץ-אמבריוניים הרחק מאזור הגולגולת. אם ננקטים צעדים זהירים אלה במהלך כריתה והסרה של ממברנות מביציות איכותיות, ניתן לצפות שכמעט כל העוברים ישרדו את הליך ההדבקה (כ-99%), בעוד שכ-40% מהעוברים החשופים שורדים ל-E9 וכ-30% ל-E1211. מניסיוננו, לפציעת הקרניות של עוברים שנותחו בממברנת E7-E9 יש השפעה מועטה על כדאיות העוברים, ועוברים רבים נשארים בני קיימא עד E18, ואז פצע הקרנית נרפא לחלוטין.
השגת פצעים החוצים את אפיתל הקרנית וחודרים לסטרומה הקדמית חיונית כדי לייצר תוצאות אמינות וניתנות לשחזור. סכין מיקרו-ניתוח באיכות גבוהה נחוצה כדי שיהיה צורך להפעיל מעט מאוד לחץ. שימוש בזוג מלקחיים מעוקלים של קשתית יכול לעזור לערסל את הראש בעדינות בזמן שהחתך נעשה ביד השנייה. באופן זה, מלקחיי הקשתית המעוקלים משמשים כגב, כך שהקרנית נשארת נייחת במהלך הפציעה. חדירת הפצע לתוך הסטרומה משתנה, במיוחד בעת הלמידה, אך הופכת לניתנת לשחזור יותר ככל שהחוקר לומד את התחושה והמראה של שבירת אפיתל הקרנית. כפי שלומדים, ייתכן שיהיה זה מועיל לראות קרניות פצועות בחתך רוחב, כך שניתן יהיה להעריך את עומק חדירת הפצע לסטרומה הקרנית (ראו איור 3B לדוגמה של קרנית בחתך רוחב המציגה עומק פצע אידיאלי מיד לאחר חתך הקרנית).
בשילוב עם טכניקות ביולוגיה התפתחותית קלאסיות, כגון השתלת רקמות והשתלת חרוזים, או גישות מודרניות למניפולציה של גנים, כגון אלקטרופורציה של דנ"א וזיהום רטרו-ויראלי, מודל חייתי זה של התחדשות הקרנית מבטיח לחשוף את הגורמים המולקולריים והמנגנונים התאיים הדרושים כדי להשיג התאוששות מלאה של רקמת הקרנית בעקבות הנזק. יתר על כן, מודל זה של בעלי חיים יכול לשמש לבדיקת התועלת הפוטנציאלית של תרכובות טיפוליות אקסוגניות כדי להגביר את התחדשות הקרנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים בנוגע למידע המוצג בכתב יד זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח אמנותי ומלומד דרך אוניברסיטת אילינוי ווסליאן ל- TS ומומנה בחלקה על ידי NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
