Summary
Le présent protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Les cornées régénérantes ou entièrement restaurées peuvent être analysées pour leur potentiel de régénération à l’aide de diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.
Abstract
Les plaies cornéennes embryonnaires de poussins présentent une capacité remarquable à se régénérer complètement et rapidement, tandis que les cornées blessées adultes subissent une perte de transparence due à des cicatrices fibrotiques. L’intégrité tissulaire des cornées embryonnaires blessées est intrinsèquement restaurée sans formation de cicatrice détectable. Compte tenu de son accessibilité et de sa facilité de manipulation, l’embryon de poussin est un modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes sans cicatrice. Ce protocole démontre les différentes étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire en ovo. Tout d’abord, les œufs sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour accéder à l’œil. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil jusqu’aux stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées. Troisièmement, les plaies cornéennes linéaires qui pénètrent dans la couche épithéliale externe et le stroma antérieur sont fabriquées à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure. Les études à ce jour utilisant ce modèle ont révélé que les cornées embryonnaires blessées présentent une activation de la différenciation kératocytaire, subissent un remodelage coordonné des protéines ECM à leur macrostructure tridimensionnelle native et sont réintricées de manière adéquate par les nerfs sensoriels cornéens. À l’avenir, l’impact potentiel des facteurs endogènes ou exogènes sur le processus de régénération pourrait être analysé dans la guérison des cornées en utilisant des techniques de biologie du développement, telles que la greffe de tissus, l’électroporation, l’infection rétrovirale ou l’implantation de billes. La stratégie actuelle identifie le poussin embryonnaire comme un paradigme expérimental crucial pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires coordonnant la cicatrisation des plaies cornéennes sans cicatrice.
Introduction
La cornée est le tissu transparent et le plus externe de l’œil qui transmet et réfracte la lumière propice à l’acuité visuelle. Dans la cornée adulte, des dommages ou une infection du stroma cornéen entraînent une réponse rapide et robuste à la cicatrisation des plaies caractérisée par une prolifération kératocytaire, une fibrose, une inflammation accrue conduisant à une apoptose induite par les cytokines, la génération de myofibroblastes réparateurs et un remodelage global de la matrice extracellulaire (ECM)1,2 . Après une blessure, une telle réparation du tissu cornéen entraîne un tissu cicatriciel opaque qui réduit la transparence cornéenne et obstrue le passage de la lumière, déformant ainsi la vision et, dans les cas les plus graves, conduisant à la cécité cornéenne3. Ainsi, il est clairement nécessaire de développer des modèles animaux fiables pour aborder les complexités de la cicatrisation des plaies et identifier les facteurs cellulaires et moléculaires responsables de la fermeture des plaies et de la régénération des tissus.
À ce jour, la plupart des études portant sur la cicatrisation des plaies cornéennes ont utilisédes modèles animaux postnatals 4 ou adultes 1,2,5,6,7. Bien que ces études aient conduit à une avancée significative dans la compréhension de la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes et des mécanismes sous-jacents à la formation de cicatrices, les tissus cornéens endommagés dans ces modèles de guérison ne parviennent pas à se régénérer complètement, limitant ainsi leur utilité pour identifier les facteurs moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de la récapitulation complète de la morphologie et de la structure de la cornée après une blessure. En revanche, les plaies fœtales générées avec un couteau dans la cornée embryonnaire du poussin possèdent une capacité intrinsèque à guérir complètement de manière sans cicatrice8. Plus précisément, la cornée embryonnaire du poussin présente une régénération non fibrotique avec la récapitulation complète de la structure de la matrice extracellulaire et des modèles d’innervation 8,9.
Le présent protocole décrit une séquence d’étapes impliquées dans la blessure de la cornée d’un poussin embryonnaire in ovo. Tout d’abord, les ovules sont fenêtrés au début de l’âge embryonnaire pour faciliter l’accès à l’embryon. Deuxièmement, une série de manipulations in ovo physiques des membranes extraembryonnaires sont effectuées pour assurer le maintien de l’accès à l’œil à des stades ultérieurs de développement, correspondant au moment où les trois couches cellulaires de la cornée sont formées et où la blessure est souhaitée. Troisièmement, les incisions linéaires de la cornée centrale pénétrant à travers l’épithélium cornéen et dans le stroma antérieur sont faites à l’aide d’un couteau microchirurgical. Le processus de régénération ou les cornées entièrement restaurées peuvent être analysés pour le potentiel de régénération en utilisant diverses techniques cellulaires et moléculaires après la procédure de blessure.
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Protocol
La souche d’œufs utilisée dans ce protocole était White Leghorn, et toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Illinois Wesleyan University.
1. Incubation des œufs de poussins
- Gardez les œufs à ~10 °C jusqu’à 1 semaine après leur ponte pour arrêter le développement. Lorsque vous êtes prêt à lancer le développement de l’embryon de poussin, essuyez toute la coquille d’œuf avec des lingettes non pelucheuses (voir tableau des matériaux) saturées d’eau à température ambiante pour éliminer la saleté et les débris.
- Assurez-vous que la coquille d’œuf est désinfectée. Essuyez toute la surface de l’œuf avec des lingettes non pelucheuses humidifiées avec 70% d’éthanol. Essuyez rapidement l’éthanol pour sécher l’œuf et éviter l’absorption de l’éthanol par la coquille de l’œuf jusqu’à l’embryon.
- Disposer les œufs horizontalement sur un plateau. Marquez le haut de l’œuf pour indiquer la position attendue de l’embryon. Incuber les œufs horizontalement, avec la fonction de bascule activée, dans un incubateur humidifié à 38 °C.
2. Fenêtrer les œufs pour se préparer à la dissection de la membrane
- Retirer les œufs de l’incubateur le troisième jour du développement embryonnaire (E3). Stériliser le dessus des œufs avec des lingettes non pelucheuses humidifiées avec 70% d’éthanol. Séchez l’éthanol des surfaces de la coquille d’œuf.
REMARQUE: Pour s’assurer que le développement n’a pas été retardé pendant la procédure de fenêtrage, 6 à 12 œufs ont été retirés et la procédure a été rapidement effectuée sur ceux-ci pendant que les œufs restants étaient laissés dans l’incubateur. - Placez un œuf horizontalement dans un porte-œufs sécurisé (voir Table des matières). En utilisant l’extrémité tranchante des ciseaux de dissection, créez un petit trou dans le haut de la coquille d’œuf près de l’extrémité pointue de l’œuf.
REMARQUE: Ce trou facilitera l’élimination de l’albumen, ce qui est nécessaire pour faire tomber le jaune et l’embryon loin de la surface interne de la coquille d’œuf. Pour les porte-œufs, des plateaux de remplissage d’œufs en pâte à papier, dans lesquels les œufs sont expédiés, ont été utilisés. - À travers le trou (étape 2.2.), insérez une aiguille hypodermique biseautée de 18 G. Avec l’aiguille poussée vers la surface interne inférieure de l’œuf et le côté biseauté de l’aiguille face à l’extrémité pointue de l’œuf (par exemple, loin de l’emplacement prévu du jaune et de l’embryon près du milieu de l’œuf), retirez 2 à 3 ml d’albumine de l’œuf de poule et jetez-le.
REMARQUE: Si l’aiguille entaille l’embryon ou son système vasculaire associé au cours de cette étape, il en résultera une aspiration du sang avec l’albumen. Cela entraînera la mort de l’embryon. De plus, si le jaune est aspiré par inadvertance avec l’albumen au cours de cette étape, l’embryon ne sera pas viable. Dans les deux cas, l’ovule doit être jeté si l’embryon ne peut pas être immédiatement utilisé à d’autres fins. - Nettoyez la surface de la coquille d’œuf entourant le trou avec des lingettes non pelucheuses légèrement humidifiées avec de l’éthanol à 70% et essuyez-les. Scellez le trou fait pour enlever l’albumen avec du ruban adhésif transparent.
- Avec l’extrémité tranchante des ciseaux de dissection, faites un deuxième trou de « fenêtre » dans le haut de la coquille d’œuf sur le site de marquage (étape 1.3.). Assurez-vous que les ciseaux ne s’étendent pas trop loin dans la coquille de l’œuf pour éviter de contacter et d’endommager l’embryon ou le système vasculaire embryonnaire, qui sera souvent positionné dans l’œuf directement sous le site du deuxième trou.
- À l’aide de pinces à iris incurvées, élargissez le trou de la « fenêtre » pour s’étendre sur environ 2 à 3 cm de diamètre et servir de « fenêtre » à l’embryon en développement sous la coquille.
- Insérez une extrémité de la pince dans le trou, en la gardant parallèle et étroitement juxtaposée à la coquille d’œuf. Avec l’autre extrémité de la pince positionnée à l’extérieur de la coquille d’œuf, pincez soigneusement les deux extrémités de la pince ensemble, ce qui leur permet de se briser et d’enlever de petits morceaux de la coquille d’œuf. Continuez à casser et à retirer les fragments de coquille d’œuf jusqu’à ce qu’il reste une fenêtre de 2 à 3 cm qui recouvre directement l’embryon.
REMARQUE: Oeufs dans lesquels les embryons ne pondent pas directement sous le trou fait à l’étape 2.6. ne doit pas être utilisé car les dissections membranaires à venir seraient difficiles à réaliser. Même en berçant les œufs horizontalement, environ 10% des œufs sont inutilisables en raison du mauvais positionnement de l’embryon. Ces embryons peuvent être utilisés à d’autres fins.
- Insérez une extrémité de la pince dans le trou, en la gardant parallèle et étroitement juxtaposée à la coquille d’œuf. Avec l’autre extrémité de la pince positionnée à l’extérieur de la coquille d’œuf, pincez soigneusement les deux extrémités de la pince ensemble, ce qui leur permet de se briser et d’enlever de petits morceaux de la coquille d’œuf. Continuez à casser et à retirer les fragments de coquille d’œuf jusqu’à ce qu’il reste une fenêtre de 2 à 3 cm qui recouvre directement l’embryon.
- Pour limiter la contamination bactérienne, ajouter par le trou de la fenêtre (par exemple, dans l’œuf) ~ 100-200 μL de solution de Ringer (8 g de NaCl, 0,37 g de KCl et 0,23 g de CaCl2,2H 20 par L de H20 distillé) contenant des antibiotiques à base de pénicilline/streptomycine (50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine, voir Tableau des matériaux).
- Scellez le trou de la fenêtre à l’aide de ruban adhésif transparent. Effectuez le scellement des œufs en alignant un coin du ruban sur le long axe du trou et en pressant le ruban sur la coquille à environ 1-2 cm du bord du trou.
- Continuez à sceller autour de l’ouverture jusqu’à ce qu’un rabat de ruban adhésif suspendu soit laissé d’un côté. Pressez les deux morceaux de ruban adhésif ensemble, créant une forme de dôme sur le trou, et appuyez sur le rabat de ruban adhésif trop suspendu à la coquille pour finir de sceller l’œuf.
REMARQUE: Les œufs doivent être fenêtrés à E2 ou E3. Selon l’expérience, le fenêtrage avant E2 entraîne une faible viabilité embryonnaire. De plus, par E4, l’embryon et les membranes extraembryonnaires se fixent à la coquille d’œuf10, et toute tentative de fenêtre à E4 ou plus tard entraîne souvent des dommages embryonnaires ou une déchirure des vaisseaux sanguins extraembryonnaires, l’un ou l’autre événement conduisant à l’issue de la mort de l’embryon.
- Continuez à sceller autour de l’ouverture jusqu’à ce qu’un rabat de ruban adhésif suspendu soit laissé d’un côté. Pressez les deux morceaux de ruban adhésif ensemble, créant une forme de dôme sur le trou, et appuyez sur le rabat de ruban adhésif trop suspendu à la coquille pour finir de sceller l’œuf.
- Retournez les œufs « fenêtrés » à l’incubateur pour un développement ultérieur. Assurez-vous de garder les œufs horizontaux et de désactiver la fonction de bascule de l’incubateur.
- Répétez les étapes 2.2.-2.9. pour chaque œuf.
3. Microdissections des membranes extraembryonnaires
- Retirez un œuf fenêtré E5.5 de l’incubateur. Exposez l’embryon en coupant le ruban adhésif de la fenêtre avec des ciseaux à dissection stérilisés.
- Utilisez un microscope à dissection pour observer l’embryon et ses membranes extraembryonnaires à travers la fenêtre. Si nécessaire, utilisez des ciseaux ou des pinces à iris incurvées pour élargir la fenêtre afin que l’embryon soit bien positionné sous la fenêtre, en prenant soin de ne pas endommager le système vasculaire embryonnaire.
- Ajouter deux gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
- Utilisez un microscope à dissection pour vous assurer que l’embryon est au bon stade de développement (hamburger Hamilton stade 27, ~ E5.5)11,12 et localiser les positions de la membrane amniochorionique (ACM) et de la membrane chorioallantoïque (CAM).
REMARQUE: À ce stade, l’embryon est entouré par l’ACM, qui comprend la membrane amniotique et la membrane chorionique sus-jacente fusionnée et partiellement recouverte par l’allantoïde hautement vascularisé, qui s’étend de la région intestinale de l’embryon et fusionne avec le chorion superposé pour former le CAM11,12. L’ACM n’est pas fortement vascularisé, ce qui permet de disséquer ces membranes pour exposer l’embryon sans endommager les vaisseaux sanguins et nuire à l’embryon. - Effectuer des dissections membranaires extraembryonnaires à ce stade (E5.5).
REMARQUE: E5.5 est le moment idéal pour effectuer les dissections de membrane extraembryonnaire. La dissection des membranes plus tôt (p. ex., à E4) avant la formation de la CAM réduit l’accessibilité de l’embryon aux stadesultérieurs 11. De plus, à E5.5, l’embryon n’est que partiellement couvert par la CAM hautement vascularisée, mais au cours des 1-2 jours suivants, la CAM enveloppe rapidement et empêche tout accès ultérieur à l’embryon11,12. Pour cette raison, la dissection membranaire à E6 ou plus tard est difficile car le risque de déchirure des vaisseaux sanguins augmente.- Utilisez une paire de pinces fines stérilisées pour saisir doucement l’ACM et l’éloigner de l’embryon. Utilisez ensuite des ciseaux à micro-dissection stérilisés pour percer un trou dans l’ACM directement au-dessus du membre antérieur qui s’étend de la membrane recouvrant le membre antérieur à la membrane recouvrant la tête.
REMARQUE: Cette étape détend les membranes chorion et amnion, les rendant ainsi plus faciles à saisir et à disséquer davantage avec des pinces dans les étapes suivantes. Voir la figure 1 pour un schéma utile de la façon dont les membranes sont disséquées à travers la fenêtre de la coquille d’œuf.
- Utilisez une paire de pinces fines stérilisées pour saisir doucement l’ACM et l’éloigner de l’embryon. Utilisez ensuite des ciseaux à micro-dissection stérilisés pour percer un trou dans l’ACM directement au-dessus du membre antérieur qui s’étend de la membrane recouvrant le membre antérieur à la membrane recouvrant la tête.
- Utilisez deux paires de pinces fines et stériles pour saisir doucement l’amnion dans deux positions adjacentes entre l’ACM et le CAM (par exemple, une zone entre la coupe faite au-dessus du membre antérieur et le bord le plus proche du CAM).
- Déplacez soigneusement chaque paire de pinces, les deux saisissant fermement la membrane amniotique, loin l’une de l’autre, l’une se déplaçant dorsalement vers l’embryon et l’autre ventralement.
REMARQUE: Ce mouvement sert à déchirer davantage l’amnion tout en séparant l’ACM (qui est tiré dans la direction dorsale par rapport à l’embryon par une paire de pinces) et le CAM (qui est tiré dans la direction ventrale par rapport à l’embryon par l’autre paire de forceps). - Assurez-vous que les membranes sont séparées lorsque le CAM ne recouvre plus l’embryon et que l’artère et la veine allantoïques, qui émanent de l’intestin embryonnaire au CAM, sont facilement apparentes.
- Déplacez soigneusement chaque paire de pinces, les deux saisissant fermement la membrane amniotique, loin l’une de l’autre, l’une se déplaçant dorsalement vers l’embryon et l’autre ventralement.
- Utilisez des pinces fines stérilisées pour disséquer et retirer toute membrane d’amnion restante recouvrant l’embryon. On observe le plus souvent que l’amnion restant couvrira partiellement la moitié caudale de l’embryon.
- À l’aide d’une pince stérilisée, saisissez l’amnion près de la région mi-crânienne de l’embryon et tirez soigneusement l’amnion dans une direction caudale par rapport à l’embryon vers la CAM déplacée antérieurement. L’embryon sera maintenant complètement exposé et la croissance ultérieure du CAM se produira principalement loin de l’embryon en développement.
REMARQUE : Voir la figure 1 pour un schéma utile sur la façon dont l’embryon exposé apparaîtra après la dissection de la membrane. Reportez-vous également à un rapport11 publié précédemment pour obtenir des diagrammes schématiques utiles des étapes 3.3.-3.6.
- À l’aide d’une pince stérilisée, saisissez l’amnion près de la région mi-crânienne de l’embryon et tirez soigneusement l’amnion dans une direction caudale par rapport à l’embryon vers la CAM déplacée antérieurement. L’embryon sera maintenant complètement exposé et la croissance ultérieure du CAM se produira principalement loin de l’embryon en développement.
- Ajouter quelques gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
- Refermez le trou de la fenêtre à l’aide de ruban adhésif transparent, comme décrit à l’étape 2.8. Retournez l’œuf dans l’incubateur pour un développement ultérieur, en gardant l’œuf horizontal et en maintenant la fonction de bascule de l’incubateur inactivée.
- Répétez les étapes 3.1.-3.8. pour chaque œuf.
REMARQUE: Les dissections de membrane extraembryonnaire à E5.5 décrites ci-dessus permettront l’accès à l’embryon par E7, c’est-à-dire lorsque la blessure peut être effectuée 8,9. À l’E8, la croissance continue du tissu CAM commence à couvrir la région crânienne de l’embryon, empêchant ainsi un accès ultérieur à la cornée. Si l’on souhaite effectuer des plaies dans des cornées E8-E9 plus âgées, il est possible de repositionner le CAM en croissance par rapport à l’embryon (étape 3.10.). Si l’on souhaite blesser à E7, étape 3.10. n’est pas nécessaire à effectuer et on peut passer à l’étape 4, plaie cornéenne. - Retirer un œuf E7 de l’incubateur dont les membranes extraembryonnaires ont été précédemment disséquées à E5.5 (étapes 3.1.-3.8.). Saisissez avec des pinces stérilisées tous les tissus membranaires amnion disponibles fusionnés au CAM et éloignez doucement la membrane amnion de la région crânienne de l’embryon dans une direction ventrale par rapport à l’embryon.
REMARQUE: Étant donné que la membrane amnionique déplacée loin de l’embryon est fusionnée au CAM, le CAM en croissance et hautement vascularisé suivra la pince à amnion et s’éloignera de la région crânienne. Répétez cette étape quotidiennement pour déplacer continuellement le CAM loin de l’embryon jusqu’à ce que l’embryon soit à l’âge souhaité pour la blessure.
4. Blessure cornéenne
- Obtenez un ovule de l’incubateur pour la blessure à l’âge embryonnaire souhaité, E7-E9. Exposez l’embryon en coupant le ruban adhésif de la fenêtre avec des ciseaux à dissection stérilisés. Ajouter quelques gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
- Utilisez un couteau à micro-dissection pour faire une incision qui couvre l’étendue de la cornée de l’œil droit (en raison de la façon dont l’embryon pond dans l’œuf, l’œil gauche n’est pas accessible mais peut servir de contrôle non blessé), qui est parallèle et en ligne avec la fissure choroïde (Figure 1). La première coupe traversera l’épithélium cornéen.
- Utilisez le couteau à micro-dissection pour lacérer à nouveau la cornée au même endroit que la première incision 2x plus (par exemple, trois coupes au total, avec la coupe 2 et la coupe 3 se produisant avec la même position dans la cornée que la coupe 1)11. La deuxième lacération traversera la membrane basale et la troisième pénétrera dans le stroma antérieur.
REMARQUE: Si l’embryon s’est installé sous le CAM disséqué, on peut utiliser une pince à iris incurvée stérilisée pour déplacer soigneusement la tête sous le CAM. Placez les pinces à iris incurvées sous la tête, en entrant en contact avec le côté gauche de la tête. Bercez toute la tête sur des pinces à iris incurvées fermées et soulevez doucement la tête autour et au-dessus du CAM. Pour aider à la viabilité, utilisez une technique similaire avec les pinces à iris incurvées pour recoller l’embryon sous le CAM après la chirurgie afin de favoriser la bonne croissance du CAM.
- Utilisez le couteau à micro-dissection pour lacérer à nouveau la cornée au même endroit que la première incision 2x plus (par exemple, trois coupes au total, avec la coupe 2 et la coupe 3 se produisant avec la même position dans la cornée que la coupe 1)11. La deuxième lacération traversera la membrane basale et la troisième pénétrera dans le stroma antérieur.
- Ajouter 3-4 gouttes de la solution de Ringer contenant des antibiotiques pénicilline/streptomycine pour hydrater l’embryon et stériliser l’ovule.
- Refermez le trou de la fenêtre avec du ruban adhésif transparent et retournez à l’incubateur, en laissant l’œuf à l’horizontale. Laissez l’embryon se développer et la plaie cornéenne guérir pendant la période souhaitée (par exemple, 0,5 à 11 jours), puis euthanasiez l’embryon sans cruauté par décapitation.
- Utilisez des pinces à iris incurvées pour prélever l’œil d’un embryon euthanasié flottant dans une boîte de Pétri de la solution saline de Ringer en saisissant doucement l’œil sur son côté postérieur, où l’œil et le tissu facial se rencontrent, et en soulevant soigneusement tout l’œil loin et libre du tissu facial.
- Utilisez une pince fine pour percer un petit trou (3-5 cm) à l’arrière de l’œil entier et fixez tout l’œil dans du paraformaldéhyde à 4% à 4 ° C pendant la nuit avec une légère agitation.
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Representative Results
À la suite de la dissection antérieure de l’ACM et du CAM à E5.5 pour exposer la région crânienne de l’embryon en développement, une série de lacérations qui couvraient la cornée centrale E7 a été faite en ovo (Figure 1). Une plaie idéale pour étudier la régénération de la cornée se produit après trois lacérations, chacune faite au même endroit de la cornée. La première lacération traverse l’épithélium cornéen, tandis que les deuxième et troisième lacérations pénètrent respectivement dans la membrane basale sous-jacente et le stroma antérieur. Pour obtenir une plaie idéale, il est crucial d’utiliser un couteau à micro-dissection tranchant (voir tableau des matériaux) et d’appliquer la bonne quantité de pression au fur et à mesure que la lacération est faite (Figure 2, voir plaie idéale). L’application d’une pression trop faible entraînera une plaie peu profonde qui déchire l’épithélium cornéen sans pénétrer suffisamment dans le stroma antérieur (Figure 2, voir plaie peu profonde). Pourtant, l’application d’une trop grande pression entraîne une plaie complète pénétrant dans tout le stroma et exposant l’humeur aqueuse à l’environnement extérieur (Figure 2, voir plaie complète).
La réalisation des incisions lacérées appropriées produit une plaie idéale (Figure 2) qui s’agrandit initialement (0-3 jours après la blessure)8 (Figure 3). Il a été postulé que la phase d’élargissement de la plaie qui se produit en blessant les cornées de poulet E7 est liée à l’expansion rapide de la taille des yeux à ce stade embryonnaire8. Les yeux embryonnaires de poulet se développent à un rythme beaucoup plus rapide de E4 à E10 par rapport à la croissance oculaire de E10 à l’éclosion. Ces premières phases rapides de la croissance oculaire sont attribuées à une croissance élevée dépendante de la pression intraoculaire (PIO)13. Par conséquent, il est probable que le taux de croissance rapide de l’œil associé à la PIO élevée favorise la rétraction de la plaie pendant les premières phases du processus de guérison (0-3 jours après la blessure), ce qui est unique à la progression de la cicatrisation de la plaie cornéenne embryonnaire. Après cela, une réépithélialisation et la formation de nouveaux tissus se produisent (4 à 9 jours après la blessure) pour finalement fermer la plaie sans cicatrice 11 jours après la blessure8 (Figure 3A).
Une analyse plus approfondie de la profondeur et de la régénération de la plaie a été possible en colorant les sections transversales avec un anticorps à base de laminine qui marque la membrane basale riche en laminine et en contre-colorant les sections avec le marqueur nucléaire DAPI, qui révèle l’étendue de la plaie à travers l’épithélium cornéen8. Les cornées récemment blessées (0 dpw) et celles qui sont au début du processus de régénération (3 dpw) ont montré que la plaie a pénétré dans la couche épithéliale et la membrane basale, comme en témoigne la coloration par effraction du marqueur nucléaire DAPI dans l’épithélium cornéen et l’absence de coloration par anticorps de laminine, qui marque la membrane basale riche en laminine entre l’épithélium cornéen et le stromasous-jacent 8 (Figure 3B ). Cependant, des coupes transversales à travers 11 cornées dpw colorées avec DAPI et anticorps de laminine ont révélé une cornée complètement guérie qui avait été réépithélialisée et contenait une membrane basale continue riche en laminine sur le site de la plaie régénérée8 (Figure 3B).
Après l’incision cornéenne, une caractérisation détaillée du processus de cicatrisation des plaies a été réalisée en effectuant une immunohistochimie sur des tissus cornéens sectionnés et blessés. Les protéines de la matrice extracellulaire fibronectine et ténascine sont associées à la migration des cellules épithéliales et kératocytaires dans la cicatrisation des plaies cornéennes adultes14,15. La localisation spatio-temporelle des protéines de la matrice extracellulaire, de la fibronectine et de la ténascine est apparente dans la plaie cicatrisante et s’est avérée élevée à des moments correspondant à la réépithélialisation de la cornée (5 jours après la blessure)8 (figure 4). Une telle analyse suggère l’importance de la fibronectine et de la ténascine pour la fermeture des plaies et, en particulier, leur implication dans la migration et la survie des cellules épithéliales, ce qui correspond à de telles fonctions dans les plaies cornéennes adultes16,17.
À partir de E8-E9, la cornée devient densément innervée par des fibres nerveuses sensorielles trigéminales qui émanent d’un anneau nerveux péricornéen et traversent le stroma antérieur lorsqu’elles se projettent vers le centre de la cornée et l’épithélium cornéen par E12 18,19,20. Étant donné que les plaies cornéennes de ce modèle sont faites à E7, peu de temps avant la projection nerveuse dans la cornée, ce modèle étudie plus en détail les nerfs cornéens alors qu’ils naviguent dans une cornée cicatrisante après une insulte. En utilisant l’immunohistochimie de montage entier pour tracer les nerfs cornéens avec des anticorps anti-β de la tubuline neurale (Tuj1) 21, il est évident que les nerfs sont temporairement inhibés du tissu cornéen cicatrisant qui juxtapose directement la cornée centrale blessée (5 jours après la blessure)8 (Figure 5A, B). Malgré une inhibition antérieure, les nerfs cornéens finissent par innerver le tissu cornéen complètement guéri (11 jours après la blessure) à des niveaux de densité similaires et selon des schémas similaires à ceux des témoins non blessés (E18C) appariés au stade (Figure 5C, D).
De manière frappante, les tissus cornéens entièrement réépithélialisés qui ont guéri de manière non fibrotique et sans cicatrice affichent une récapitulation complète de l’architecture normale du tissu de collagène. Comme en témoigne l’imagerie harmonique de deuxième génération22,23, des faisceaux de fibres de collagène à différentes profondeurs de la zone de la plaie cornéenne centrale sont disposés orthogonalement, correspondant à la macrostructure native du tissu cornéen central non blessé9 (Figure 6).
Figure 1 : Schéma des dissections membranaires extraembryonnaires in ovo et des lésions cornéennes. À E5.5, la région crânienne de l’embryon est exposée en disséquant les membranes ACM et CAM et en positionnant l’amnion et l’allantoïde loin de l’œil en développement. Les œufs sont scellés et incubés à E7 lorsque la cornée centrale est blessée, en utilisant une pince incurvée comme berceau pour la tête de l’embryon car la pointe d’un couteau microchirurgical fait une incision dans la cornée centrale. La plaie est orientée parallèlement à la fissure choroïde (astérisque). Pour s’assurer que la profondeur de l’incision atteint le stroma antérieur, trois coupes simultanées doivent être effectuées avec le couteau, chacune dans la même position relative, l’une sur l’autre. Barre d’échelle = 1 mm. La figure est adaptée avec la permission des références 8,11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Variations des plaies générées en ovo. (A) Après des dissections membranaires à E5.5, l’œil droit est accessible en ovo. (B-D) Images prises d’un embryon in ovo immédiatement après des lacérations de divers degrés qui couvrent l’étendue de la cornée et sont en ligne avec la fissure choroïde (cf). (B) Après trois lacérations dans lesquelles une faible pression a été appliquée, une plaie peu profonde est visible. La pointe de flèche marque un site dans la cornée où l’épithélium a été cisaillé mais le stroma antérieur n’a pas été pénétré. Les pointes de flèches désignent une petite région de la cornée où le stroma antérieur a été pénétré. (C) Après trois lacérations dans lesquelles une pression idéale a été appliquée, une plaie idéale est visible. Les pointes de flèche désignent une plaie couvrant toute l’étendue de la cornée où le stroma antérieur a été pénétré. (D) Après trois lacérations dans lesquelles une pression excessive a été appliquée, une plaie complète est visible et l’humeur aqueuse s’est exposée à l’environnement extérieur. Abréviations: tca, artère ciliaire temporale; cf, fissure choroïde; CAM, membrane chorioallantoïque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Progression de la cicatrisation des plaies. (A) La progression de la cicatrisation dans les cornées blessées par rapport aux témoins appariés au stade est montrée à partir du moment de la blessure (0 dpw) et de 16 h après la blessure (hrpw) jusqu’à 3-11 jours après la blessure (dpw). Les pointes de flèche délimitent les bords dorsaux et ventraux de la plaie, indiquant une période d’expansion de la plaie (0-3 dpw) suivie d’une fermeture progressive de la plaie (5-11 dpw). (B) Cornées blessées tachées de DAPI (bleu) et de laminine (rouge) à 0, 3 et 11 dpw. Les parenthèses montrent l’étendue de la région blessée, ce qui révèle l’expansion de la plaie de 3 dpw et la réparation complète de la cornée réépithélialisée par E11. Les astérisques désignent la région guérie de la cornée. La barre d’échelle est (A) 1 mm, (B) 100 μm. La figure est adaptée avec la permission de la référence8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse histologique des cornées blessées. Coupes transversales à travers (A) 3 dpw et (B) 5 dpw. Les cornées blessées tachées de DAPI (bleues) révèlent la localisation de la fibronectine (FN, rouge) et de la tenascine-C (TN-C, vert). Les parenthèses en (A) et (B) indiquent la région blessée. Barre d’échelle: 100 μm. Abréviations: ep, épithélium; st, stroma; en, endothélium. La figure est adaptée avec la permission de la référence8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Innervation des cornées blessées. (A-D) Visualisation des nerfs cornéens à la suite d’une immunocoloration globale de la tubuline neurale anti-β (Tuj1) dans (B) 5 dpw et (D) 11 dpw cornées, ainsi que (A) E12 (E12C, apparié au stade pour 5 dpw) et (C) E18 témoins (E18C, apparié au stade pour 11 dpw). (B) La ligne brisée dans la cornée de 5 dpw indique l’étendue de la plaie. La zone entre crochets directement adjacente à la plaie désigne la zone cornéenne qui est temporairement répulsive pour les nerfs et qui subit activement une réépithélialisation. (B') Le balayage optique à travers le tissu cornéen cicatrisant directement adjacent à la plaie ouverte révèle un faisceau nerveux stromal rare s’étendant dans le tissu (flèche) et les laisses du nerf épithélial (pointe de flèche). (C,D) Les cornées entièrement régénérées à 11 dpw présentent des schémas d’innervation similaires et des densités nerveuses comparables à celles des témoins appariés par stade. Abréviation : w, plaie. La figure est adaptée avec la permission de la référence8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Ultrastructure du collagène dans les cornées embryonnaires guéries. (A) Balayage du visage des cornées de 10 dpw entièrement guéries et contrôles appariés par étapes à l’aide de l’imagerie harmonique de deuxième génération (SGH). Les profondeurs de balayage vont de 2 à 66 μm de la surface antérieure de la cornée (0 μm est le stroma le plus antérieur) et sont répertoriées à gauche des images respectives. Les encarts de chaque image correspondent à l’analyse de la transformée de Fourier rapide de la zone centrale de la plaie pour cette profondeur de balayage particulière. (B) Piles segmentées manuellement d’analyse bidimensionnelle de la transformée de Fourier rapide, représentant l’organisation du collagène dans la cornée de contrôle blessée et appariée par étapes. Barre d’échelle = 50 μm. La figure est adaptée avec la permission de la référence9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le poussin est un système modèle idéal pour étudier la réparation des plaies cornéennes fœtales et sans cicatrice. Contrairement aux mammifères, le poussin est facilement accessible tout au long du développement en utilisant les stratégies in ovo8 ou ex ovo 24. La cornée embryonnaire du poussin est beaucoup plus grande que les cornées de rongeurs, avec près de 50% du volume crânien dédié à l’œil25, ce qui la rend très sensible aux manipulations physiques telles que les blessures. De plus, les œufs de poule sont facilement disponibles toute l’année, souvent dans les fermes locales, et rentables, ne nécessitant qu’un incubateur humifié pour soutenir le développement.
Ce protocole rapporte une série de procédures qui permettent la blessure de la cornée embryonnaire du poussin. Les plaies faites à la cornée embryonnaire du poussin se régénèrent complètement, permettant une récapitulation complète de la structure cornéenne native sans cicatrice détectable. Cette technique a fait du poussin embryonnaire un modèle animal essentiel pour élucider les facteurs moléculaires et cellulaires coordonnant la cicatrisation des plaies cornéennes sans cicatrice.
Malgré la promesse claire inhérente au modèle de cicatrisation des plaies fœtales décrit ici, il convient de noter qu’il existe des différences claires entre la cicatrisation des plaies cornéennes fœtales et adultes. La cornée embryonnaire exprime des facteurs de croissance et des signaux morphogénétiques qui sont réduits au silence ou absents dans les tissus adultes26. De plus, les tissus cornéens adultes blessés présentent une fibrose et forment du tissu cicatriciel, probablement en raison d’une réponse inflammatoire accrue médiée par des cytokines et des facteursde croissance 27, qui sont amortis ou pas encore établis aux stades embryonnaires. De telles différences liées à l’âge dans le tissu cornéen pourraient compliquer les efforts visant à restaurer complètement les tissus blessés adultes. Néanmoins, la détermination des facteurs moléculaires clés et des protéines matricielles qui régulent la cicatrisation des plaies fœtales sans cicatrice ouvrira la voie à des thérapies qui favorisent un processus de guérison plus réparateur avec moins de cicatrices et une meilleure récapitulation de l’architecture tissulaire normale.
La méthode de blessure décrite ici s’appuie sur une technique développée pour la première fois par Spurlin et al.11 pour obtenir un accès ovo à des embryons de poussins à un stade avancé (par exemple, >E6). En faisant vitrer l’œuf et en disséquant les membranes extraembryonnaires loin de la région crânienne, l’œil embryonnaire est accessible à des stades aussi éloignés que E7. Comme nous l’avons déjà signalé, l’élimination et le déplacement des membranes amniochorionique et chorioallantoïque, respectivement, n’affectent pas le développement embryonnaire11. Les embryons exposés sont viables et se prêtent facilement à la manipulation physique. À ce stade, la cornée a trois couches distinctes (épithélium, stroma et endothélium), ce qui la rend appropriée pour les études de cicatrisation des plaies après une incision linéaire dans le stroma antérieur. Il est à noter que, en raison de l’augmentation de la croissance de l’allantoïde au fil du temps, l’accès à l’œil finit par être obstrué à E8. Pour contourner ce problème, si l’accès à des yeux à un stade avancé pour la blessure est souhaitable, nous avons constaté que l’accès à l’œil peut être maintenu par E9 en effectuant une manipulation quotidienne des membranes extraembryonnaires (par exemple, à E7, E8, etc.), dans laquelle l’allantoïde est soigneusement repositionné loin de la région crânienne pour s’assurer que sa croissance se produit de manière directionnelle loin de l’embryon. Cela permet aux cornées d’être blessées à ces stades ultérieurs (par exemple, après l’innervation).
Dans l’ensemble, la viabilité et la survie des embryons dans cette technique reposent sur plusieurs facteurs, tels que le maintien d’un environnement d’œuf stérile et hydraté tout en prenant soin de ne pas infliger de dommages aux vaisseaux sanguins embryonnaires ou à l’allantoïde. Toute la surface de l’œuf doit être stérilisée à l’éthanol avant le fenêtrage pour maintenir la stérilité. En effet, de petits fragments de coquille d’œuf, qui sont souvent chargés de microbes, tomberont généralement dans l’œuf pendant la procédure de fenêtrage. De même, tous les outils impliqués dans le fenêtrage, les dissections membranaires et l’incision cornéenne doivent être soigneusement rincés à l’éthanol et séchés ou stérilisés à la flamme avant leur utilisation. De plus, des antibiotiques doivent être ajoutés à l’œuf chaque fois que l’embryon est exposé à l’environnement extérieur. Il est en outre essentiel que l’embryon conserve une hydratation adéquate après le fenêtrage. Il faut prendre grand soin de s’assurer que la fenêtre est entièrement scellée avec du ruban adhésif et qu’il ne reste aucun espace d’air. Étant donné l’importance pour le ruban adhésif de rester entièrement adhéré à la surface de la coquille d’œuf et de sceller complètement le trou, la surface de la coquille d’œuf entourant le trou doit être nettoyée et séchée avant d’appliquer le ruban. Enfin, il est impératif qu’aucun vaisseau sanguin ne soit coupé par inadvertance et que l’allantoïde, qui stocke les déchets liquides de l’embryon, ne soit pas endommagé lors de la dissection des membranes extraembryonnaires car l’un ou l’autre est mortel pour l’embryon. Il est à noter que la viabilité de l’embryon est plus élevée lorsque de plus petites déchirures du chorion et de l’amnion sont faites, bien que la déchirure doive être suffisamment grande pour positionner les membranes extraembryonnaires loin de la région crânienne. Si ces mesures prudentes sont prises lors de la dissection et du retrait des membranes des œufs de haute qualité, on peut s’attendre à ce que presque tous les embryons survivent à la procédure de fenêtrage (~ 99%), tandis que ~ 40% des embryons exposés survivent à E9 et ~ 30% à E1211. D’après notre expérience, blesser les cornées des embryons disséqués par la membrane E7-E9 a peu d’impact sur la viabilité des embryons, et de nombreux embryons restent viables grâce à E18, moment auquel la plaie cornéenne est complètement guérie.
Obtenir des plaies qui traversent l’épithélium cornéen et pénètrent dans le stroma antérieur est essentiel pour produire des résultats fiables et reproductibles. Un couteau à micro-dissection de haute qualité est nécessaire pour que très peu de pression doive être appliquée. L’utilisation d’une paire de pinces à iris incurvées peut être utile pour bercer doucement la tête car la lacération est faite avec l’autre main. De cette manière, les pinces à iris incurvées servent de backstop afin que la cornée reste stationnaire pendant la blessure. La pénétration de la plaie dans le stroma est variable, en particulier lors de l’apprentissage, mais devient plus reproductible à mesure que le chercheur apprend la sensation et l’apparence de briser l’épithélium cornéen. Au fur et à mesure que l’on apprend, il peut être utile de voir les cornées blessées en coupe transversale afin que la profondeur de pénétration de la plaie dans le stroma cornéen puisse être évaluée (voir la figure 3B pour un exemple d’une cornée en coupe transversale présentant une profondeur de plaie idéale immédiatement après la lacération cornéenne).
Lorsqu’il est combiné avec des techniques classiques de biologie du développement, telles que la greffe de tissus et l’implantation de billes, ou des approches modernes de manipulation génique, telles que l’électroporation de l’ADN et l’infection rétrovirale, ce modèle animal de régénération cornéenne promet de révéler les facteurs moléculaires et les mécanismes cellulaires nécessaires pour obtenir une récupération complète du tissu cornéen après une lésion. De plus, ce modèle animal pourrait être utilisé pour tester l’utilité potentielle de composés thérapeutiques exogènes pour augmenter la régénération cornéenne.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents concernant les informations présentées dans ce manuscrit.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de développement artistique et savant de l’Illinois Wesleyan University à TS et financé en partie par NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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