Summary
本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与する様々なステップを実証する。再生または完全に回復した角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。
Abstract
ひよこの胚性角膜創傷は完全かつ迅速に再生する顕著な能力を示すが、成人の創傷角膜は線維性瘢痕化による透明性の喪失を経験する。損傷した胚性角膜の組織完全性は、検出可能な瘢痕形成なしに本質的に回復される。そのアクセス性と操作の容易さを考えると、ひよこ胚は瘢痕のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルです。このプロトコルは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与するさまざまなステップを示しています。第一に、卵子は初期胚期に窓を開けられ、眼にアクセスする。第二に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作が行われ、角膜の3つの細胞層が形成されるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にする。第三に、外側上皮層および前間質を貫通する線状角膜創傷は、顕微手術ナイフを用いて作製される。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。このモデルを用いたこれまでの研究では、創傷胚性角膜が角化細胞分化の活性化を示し、ECMタンパク質の天然の三次元マクロ構造への協調的なリモデリングを受け、角膜感覚神経によって適切に再神経支配されることが明らかになった。将来的には、再生プロセスに対する内因性または外因性因子の潜在的な影響は、組織移植、エレクトロポレーション、レトロウイルス感染、またはビーズ移植などの発生生物学技術を使用して、治癒角膜において分析することができる。現在の戦略は、胚性ひよこを、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的要因を解明するための重要な実験パラダイムとして特定している。
Introduction
角膜は、視力を助長する光を透過および屈折させる透明で、最も外側の眼の組織である。成人角膜において、角膜間質への損傷または感染は、角化細胞増殖、線維症、サイトカイン誘発アポトーシスにつながる炎症の増加、修復筋線維芽細胞の生成、および細胞外マトリックス(ECM)の全体的なリモデリングを特徴とする迅速かつ堅牢な創傷治癒応答をもたらす1,2.損傷後、このような角膜組織修復は、角膜の透明性を低下させ、光の通過を閉塞し、したがって視力を歪め、最も重篤な症例では角膜失明につながる不透明な瘢痕組織をもたらす3。したがって、創傷治癒の複雑さに対処し、創傷閉鎖および組織再生に関与する細胞因子および分子因子を同定するために、信頼できる動物モデルを開発することが明らかに必要である。
今日まで、角膜創傷治癒を調べるほとんどの研究は、出生後4または成体動物モデル1、2、5、6、7を利用してきた。これらの研究は、角膜創傷治癒応答および瘢痕形成の根底にあるメカニズムの理解において著しい進歩をもたらしたが、これらの治癒モデルにおける損傷した角膜組織は完全に再生できず、したがって、損傷後の角膜形態および構造を完全に反復させる分子因子および細胞機構を同定するための有用性を制限する。対照的に、胎児のひよこ角膜にナイフで生じた胎児の傷は、瘢痕のない方法で完全に治癒する固有の能力を有する8。具体的には、胚性ヒナギ角膜は、細胞外マトリックス構造の完全な反復および神経支配パターン8、9を有する非線維性再生を示す。
本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで巻き取ることに関与する一連のステップを記載する。第一に、卵子は、胚へのアクセスを容易にするために、初期胚期にウィンドウ化される。第2に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作は、角膜の3つの細胞層が形成され、創傷が望まれるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にするために行われる。第三に、角膜上皮を通って前足間質に貫通する線状中枢角膜切開は、顕微手術ナイフを用いて行われる。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。
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Protocol
このプロトコルで使用された卵の株はホワイトレグホーンであり、すべての動物の手順はイリノイウェズリアン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1.ひよこの卵の孵化
- 卵を産卵後最大1週間〜10°Cに保ち、発育を停止します。ひよこの胚の発生を開始する準備ができたら、室温の水で飽和させた糸くずの出ないワイプ( 材料表を参照)で卵殻全体を拭き取り、汚れや破片を取り除きます。
- 卵の殻が消毒されていることを確認してください。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の表面全体を拭き取ります。エタノールをすばやく拭き取って卵を乾燥させ、卵殻から胚へのエタノール吸収を避けます。
- 卵をトレイの上に水平に配置します。卵の上部にマークを付けて、胚の予想される位置を示します。卵を水平にインキュベートし、ロッキング機能を有効にして、38°Cの加湿インキュベーター内で孵化させる。
2.膜解剖の準備のために卵を窓にする
- 胚発生の3日目(E3)にインキュベーターから卵を取り出す。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の上部を殺菌します。卵殻表面からエタノールを乾燥させる。
注:ウィンドウ手順中に発育が遅れないようにするために、6〜12個の卵を除去し、残りの卵をインキュベーターに残したまま、これらの卵に対して手順を迅速に実施した。 - 卵を安全な卵ホルダーに水平に置きます( 材料表を参照)。解剖ハサミの鋭い端を使用して、卵の尖った端の近くに卵殻の上部に小さな穴を開けます。
注:この穴は卵黄と胚を内側の卵殻表面から落とすために必要な卵白の除去を容易にします。卵所有者のために、卵が出荷される紙パルプ卵フィラーフラットが使用されました。 - 穴を通して(ステップ2.2)、18Gの斜めの皮下注射針を挿入します。針を卵の底部内面に押し込み、針の斜め側を卵の尖った端に向け(例えば、卵黄と胚の予想される位置から卵の真ん中近くから離して)、鶏の卵から2〜3mLの卵白を取り除き、捨てる。
注:このステップ中に針が胚またはそれに関連する血管系に刻まれると、卵白で血液が吸引されます。これは胚の死をもたらすでしょう。さらに、このステップ中に卵黄が卵白と一緒に誤って吸引された場合、胚は生存不能になる。いずれの場合も、胚を直ちに他の目的に使用できない場合は、卵子を捨てるべきです。 - 70%エタノールで軽く湿らせた糸くずの出ないワイプで穴を囲む卵殻の表面をきれいにし、乾いた拭き取ります。卵白を除去するために作った穴を透明なテープで密封します。
- 解剖ハサミの鋭い端で、マーキング部位の卵殻の上部に2番目の「窓」穴を開けます(ステップ1.3)。はさみが卵殻にあまりにも遠くまで伸びないようにして、胚または胚性血管系(しばしば卵の中に第2の穴の部位の真下に位置する)に接触して損傷するのを避けるようにする。
- 湾曲した虹彩鉗子を使用して、「窓」の穴を直径約2〜3cmに広げ、殻の下の発達中の胚への「窓」として機能します。
- 鉗子の一方の端を穴に挿入し、卵の殻と平行に、そして密接に並置するようにします。もう一方の鉗子の端を卵殻の外側に配置して、2つの鉗子の端を慎重につまんで、卵殻の小さな部分を壊して取り除くことができます。胚を直接覆う2〜3cmの窓が残るまで、卵殻の破片を壊して取り除き続けます。
注:ステップ2.6で作った穴の真下に胚が産まない卵。今後の膜解剖を完了するのが難しいため、使用しないでください。卵を水平に揺らしても、卵の約10%は胚の位置が悪いために使用できません。これらの胚は、他の目的に使用することができる。
- 鉗子の一方の端を穴に挿入し、卵の殻と平行に、そして密接に並置するようにします。もう一方の鉗子の端を卵殻の外側に配置して、2つの鉗子の端を慎重につまんで、卵殻の小さな部分を壊して取り除くことができます。胚を直接覆う2〜3cmの窓が残るまで、卵殻の破片を壊して取り除き続けます。
- 細菌汚染を制限するために、ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質(ペニシリン50U/mLおよびストレプトマイシン50μg/mL)を含むリンゲル溶液(NaCl8g、KCl0g、および蒸留H20 0 Lあたり0.23gのCaCl 2.2H 20)を窓の穴から(例えば卵の中に)加え、 材料表を参照)。
- 窓の穴は透明な粘着テープでシールします。テープの角を穴の長軸に合わせ、穴の端から約1〜2cm離れたシェルにテープを押し付けて、卵のシールを行います。
- テープの垂れ下がったフラップが片側に残るまで、開口部の周りをシールし続けます。2枚のテープを一緒に押して穴の上にドーム型を作り、張り出したテープのフラップを殻に押し付けて卵を密封し終えます。
注:卵はE2またはE3のいずれかでウィンドウ化する必要があります。経験によると、E2の前にウィンドウイングすると、胚の生存率が低下します。さらに、E4によって、胚および胚外膜が卵殻10に付着し、E4以降で窓を張ろうとする試みは、しばしば胚損傷または胚外血管の引き裂きをもたらし、いずれかの事象が胚死の結果につながる。
- テープの垂れ下がったフラップが片側に残るまで、開口部の周りをシールし続けます。2枚のテープを一緒に押して穴の上にドーム型を作り、張り出したテープのフラップを殻に押し付けて卵を密封し終えます。
- さらなる発達のために「窓付きの」卵をインキュベーターに戻します。卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能をオフにしてください。
- 手順 2.2.-2.9 を繰り返します。各卵のために。
3. 胚外膜のマイクロダイセクション
- E5.5ウィンドウ付き卵をインキュベーターから取り出します。滅菌した解剖はさみで窓からテープを切断して胚を露出させます。
- 解剖顕微鏡を使用して、窓から胚とその胚外膜を観察します。必要に応じて、はさみまたは湾曲した虹彩鉗子を使用して窓を広げ、胚が窓の下によく配置されるようにし、胚の血管系を傷つけないように注意する。
- ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンガーの溶液を2滴加えて、胚を水和させ、卵子を滅菌する。
- 解剖顕微鏡を使用して、胚が適切な発生段階(ハンバーガーハミルトン段階27、〜E5.5)11,12にあることを確認し、羊膜(ACM)および脈絡膜(CAM)の位置を特定します。
注:この段階では、胚は、羊膜と融合した絨毛膜と、胚の腸領域から伸び、重ねられた絨毛膜と融合してCAM11,12を形成する高度に血管化されたアラントワによって部分的に覆われたACMに囲まれています。ACMは血管新生があまりないため、これらの膜を解剖して血管を損傷したり胚を傷つけたりすることなく胚を露出させることができます。 - この段階で胚外膜解剖を行う(E5.5)。
注:E5.5は、胚外膜解剖を行うのに理想的な時期です。CAM形成前に膜を早期に(例えばE4で)解剖すると、後の段階11で胚のアクセス性が低下する。さらに、E5.5では、胚は高度に血管化されたCAMによって部分的にしか覆われていないが、次の1〜2日間で、CAMはすぐに胚を包み込み、さらなるアクセスを妨げる11,12。このため、E6以降での膜解剖は、血管を裂くリスクが高まるため、困難である。- 滅菌した細い鉗子を使用してACMを優しくつかみ、胚から引き離します。次に、滅菌されたマイクロ解剖ハサミを使用して、前肢を覆う膜から頭部を覆う膜まで伸びる前肢の真上のACMの穴を切断する。
注:このステップは、絨毛膜および羊膜を弛緩させるため、次のステップで鉗子でつかんでさらに解剖することが容易になります。膜が卵殻窓を通してどのように解剖されるかの有用な概略については、 図1 を参照してください。
- 滅菌した細い鉗子を使用してACMを優しくつかみ、胚から引き離します。次に、滅菌されたマイクロ解剖ハサミを使用して、前肢を覆う膜から頭部を覆う膜まで伸びる前肢の真上のACMの穴を切断する。
- ACMとCAMの間の2つの隣接する位置(例えば、前肢の上に作られた切り込みとCAMの最も近い端との間の領域)で羊膜を優しくつかむために、2対の微細で滅菌された鉗子を使用する。
- 羊膜をしっかりと把持している各ペアの鉗子を慎重に動かし、一方のペアを胚に対して背方向に動かし、もう一方を腹側に移動します。
注:この動きは、ACM(1対の鉗子によって胚に対して背側に引っ張られる)とCAM(他の一対の鉗子によって胚に対して腹側に引っ張られる)を分離しながら、羊膜をさらに引き裂くのに役立つ。 - CAMが胚を覆わなくなったときに膜が分離され、胚の腸からCAMに発せられるアラント動脈および静脈が容易に明らかであることを確認する。
- 羊膜をしっかりと把持している各ペアの鉗子を慎重に動かし、一方のペアを胚に対して背方向に動かし、もう一方を腹側に移動します。
- 滅菌された細かい鉗子を使用して、胚を覆っている残りの羊膜を解剖して除去します。残りの羊膜が胚の尾半分を部分的に覆うことが最も一般的に観察される。
- 滅菌した鉗子を使用して、胚の頭蓋中央領域付近の羊膜をつかみ、胚に対して尾方向に羊膜を慎重に引っ張り、以前の変位したCAMに向かってください。胚は完全に露出し、CAMのさらなる成長は主に発達中の胚から離れて起こる。
注:膜解剖後に露出した胚がどのように現れるかについての有用な概略図については、 図1 を参照してください。また、ステップ 3.3.-3.6 の役立つ概略図については、以前に公開されたレポート11 を参照してください。
- 滅菌した鉗子を使用して、胚の頭蓋中央領域付近の羊膜をつかみ、胚に対して尾方向に羊膜を慎重に引っ張り、以前の変位したCAMに向かってください。胚は完全に露出し、CAMのさらなる成長は主に発達中の胚から離れて起こる。
- ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を数滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。
- ステップ 2.8 の説明に従って、透明なテープを使用して窓の穴を密封し直します。さらなる発達のために卵をインキュベーターに戻し、卵を水平に保ち、インキュベーターのロッキング機能を不活性化したままにする。
- 手順 3.1.-3.8 を繰り返します。各卵のために。
注:上記のE5.5での胚外膜解剖は、E7を介して胚へのアクセスを可能にするが、これは創傷を行うことができるときである8,9。E8によって、CAM組織の継続的な成長は胚の頭蓋領域を覆い始め、したがって角膜へのさらなるアクセスを排除する。古いE8-E9角膜で創傷を行いたい場合は、胚に対して成長中のCAMを腹側に再配置することが可能である(ステップ3.10。E7で巻きたい場合は、ステップ3.10。行う必要はなく、1つはステップ4、角膜創傷に進むことができる。 - E5.5で胚外膜を解剖したE7卵子をインキュベーターから取り出します(ステップ3.1.-3.8)。CAMに融合した利用可能な羊膜組織を滅菌鉗子でつかみ、胚に対して腹側方向に胚の頭蓋領域から羊膜を静かに引き離す。
注:胚から離れて移動している羊膜はCAMに融合されているため、成長し血管化されたCAMは羊膜をつかむ鉗子に追従し、頭蓋領域から離れます。このステップを毎日繰り返して、胚が創傷のための所望の年齢になるまで、CAMを胚から遠ざけ続ける。
4. 角膜損傷
- 所望の胚期に創傷するためのインキュベーターE7-E9から卵子を得る。滅菌した解剖はさみで窓からテープを切断して胚を露出させます。ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を数滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。
- マイクロ解剖ナイフを使用して、脈絡膜の亀裂に平行で、脈絡膜の亀裂に沿った右目の角膜の範囲にまたがる切開(胚が卵にどのように産むかのために、左目はアクセスできないが、創傷していない対照として役立つことができる)を行う(図1)。最初のカットは角膜上皮を横断します。
- マイクロ解剖ナイフを使用して、最初の切開と同じ場所で角膜を2倍以上裂傷(例えば、合計3回の切断、切断2および切断3が切断1と同じ位置で角膜内の同じ位置とともに生じる)11。第2の裂傷は基底膜を横断し、第3の裂傷は前間質を貫通する。
注:胚が解剖されたCAMの下に落ち着いた場合は、滅菌された湾曲した虹彩鉗子を使用して、CAMの下から頭を慎重に動かすことができます。湾曲した虹彩鉗子を頭の下に置き、頭の左側に接触させます。閉じた湾曲した虹彩鉗子の上に頭全体を抱きかかえ、CAMの周りと上に頭をそっと上げます。生存率を助けるために、湾曲した虹彩鉗子で同様の技術を使用して、CAMの適切な成長を促進するために、手術後に胚をCAMの下に戻す。
- マイクロ解剖ナイフを使用して、最初の切開と同じ場所で角膜を2倍以上裂傷(例えば、合計3回の切断、切断2および切断3が切断1と同じ位置で角膜内の同じ位置とともに生じる)11。第2の裂傷は基底膜を横断し、第3の裂傷は前間質を貫通する。
- ペニシリン/ストレプトマイシン系抗生物質を含むリンゲル溶液を3〜4滴加えて、胚を水和させ、卵子を殺菌する。
- 透明なテープで窓の穴を再シールし、卵を水平のままインキュベーターに戻します。胚が発達し、角膜創傷が所望の期間(例えば、0.5〜11日)治癒するのを許し、次いで断頭によって胚を人道的に安楽死させる。
- 湾曲した虹彩鉗子を使用して、リンガーの生理食塩水の入ったペトリ皿に浮かぶ安楽死胚から目を収穫するには、目と顔の組織が出会う後側の目を優しくつかみ、目全体を慎重に持ち上げて顔の組織から解放します。
- 細かい鉗子を使用して、目の後ろの小さな穴(3〜5cm)を突いて、軽度の攪拌で一晩4°Cで4%パラホルムアルデヒドに目全体を固定します。
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Representative Results
E5.5でACMとCAMを早期に解剖して発育中の胚の頭蓋領域を露出させた後、E7中央角膜にまたがる一連の裂傷が 卵子で 行われました(図1)。角膜再生を研究するのに理想的な創傷は、それぞれが角膜の同じ場所で作られた3つの裂傷の後に起こる。第1の裂傷は角膜上皮を横断し、第2および第3の裂傷はそれぞれ下層の基底膜および前中質を貫通する。理想的な創傷を達成するには、鋭利な微小解剖ナイフ( 材料表を参照)を使用し、裂傷が作られるときに正しい量の圧力を加えることが重要です(図2、理想的な創傷を参照)。圧力が少なすぎると、前間質を十分に貫通せずに角膜上皮を引き裂く浅い創傷が生じる(図2、浅い創傷を参照)。しかし、あまりにも多くの圧力をかけると、全範囲創傷が間質全体を貫通し、房水を外部環境に曝すことになる(図2、全範囲創傷を参照)。
適切な裂傷切開を行うと、理想的な創傷(図2)が生まれ、最初に(創傷後0〜3日)8 が拡大します(図3)。E7ニワトリ角膜を創傷することによって生じる創傷拡大の段階は、この胚期8における眼サイズの急速な拡大に関連していると仮定されている。胚性ニワトリの目は、E10から孵化までの眼の成長と比較して、E4からE10への有意に速い速度で成長する。眼の成長のこれらの初期の急速な段階は、眼内圧(IOP)依存性成長の上昇に起因する13。したがって、眼の急速な成長速度とIOPの上昇が相まって、胚性角膜創傷治癒進行に特有の治癒過程の初期段階(創傷後0〜3日)に創傷収縮を促進する可能性が高い。その後、再上皮化および新しい組織形成が起こり(創傷後4〜9日)、創傷後11日目までに創傷を瘢痕のない様式で最終的に閉鎖する8 (図3A)。
ラミニンに富む基底膜をマークするラミニン抗体で断面を染色し、角膜上皮8を通る創傷の程度を明らかにする核マーカーDAPIで切片を対比染色することにより、創傷の深さおよび再生のさらなる分析が可能であった。最近創傷した角膜(0dpw)および再生過程の初期段階にある角膜(3dpw)は、角膜上皮内の核マーカーDAPIの侵入染色および角膜上皮と下層間質との間のラミニンに富む基底膜を示すラミニン抗体染色の不在によって証明されるように、創傷が上皮層および基底膜に浸透したことを示した(図3B).しかし、DAPIおよびラミニン抗体で染色された11dpw角膜を通る断面は、再上皮化され、再生創傷8の部位に連続したラミニンに富む基底膜を含む完全に治癒した角膜を明らかにした(図3B)。
角膜切開に続いて、切片化された創傷角膜組織に対して免疫組織化学を行うことによって、創傷治癒プロセスの詳細な特性評価が達成された。フィブロネクチンおよびテナスシンの細胞外マトリックスタンパク質は、治癒した成人角膜創傷への上皮細胞および角化細胞移動と関連している14,15。細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチンおよびテナスシンの時空間局在は、治癒創傷内で明らかであり、角膜再上皮化に対応する時点(創傷後5日目)に上昇することがわかった8(図4)。このような分析は、創傷閉鎖に対するフィブロネクチンおよびテナスシンの重要性、特に上皮細胞遊走および生存におけるそれらの関与を示唆しており、成人角膜創傷におけるそのような機能と一致する16,17。
E8-E9を起点として、角膜は角膜周囲神経環から発せられ、E12 18,19,20によって角膜の中心および角膜上皮に向かって突出する際に前間質を横断する三叉神経線維によって密に神経支配される。このモデルの角膜創傷は、角膜への神経突起の直前のE7で作られているため、このモデルは、侮辱に続いて治癒する角膜をナビゲートする際に角膜神経をさらに調査する。ホールマウント免疫組織化学を用いて、抗β神経チューブリン(Tuj1)抗体21で角膜神経をトレースすることにより、神経が創傷、中枢角膜を直接並置する治癒角膜組織から一時的に阻害されることは明らかである(創傷後5日目)8(図5A、B)。以前の阻害にもかかわらず、角膜神経は最終的に完全に治癒した角膜組織(創傷後11日)を、段階的に一致した非創傷対照(E18C)と同様の濃度レベルおよび同様のパターンで神経支配する(図5C、D)。
驚くべきことに、非線維性、瘢痕のない方法で治癒した完全に再上皮化された角膜組織は、正常なコラーゲン組織構造の完全な反復を示す。第2世代高調波画像化22、23によって証明されるように、中央角膜創傷領域の様々な深さにわたってコラーゲン線維の束が直交して配置され、非創傷中央角膜組織9の天然マクロ構造と一致する(図6)。
図1:胚外膜解剖および角膜創傷におけるオボの概略図。E5.5では、ACMおよびCAM膜を解剖し、羊膜およびアラントワを発達中の眼から遠ざけることによって、胚の頭蓋領域が露出する。卵は密封され、中央角膜が傷ついたときにE7に孵化させ、顕微鏡ナイフの先端が中央角膜に切開を行うように、湾曲した鉗子を胚頭のクレードルとして使用する。創傷は脈絡膜亀裂(アスタリスク)に平行に配向している。切開部の深さが前顎間質に達するようにするには、ナイフで3つの同時切断を行い、それぞれが同じ相対位置にあり、1つずつ他方に切開する必要があります。スケール バー = 1 mm。この図は、参考文献8,11からの許可を得て翻案されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ovoで発生した創傷の変動(A)E5.5での膜解剖後、右目はovoでアクセス可能です。(B-D)角膜の程度にまたがり、脈絡膜亀裂(cf)と一致する様々な程度の裂傷の直後に撮影された卵子胚の画像。(b)弱い圧力が加えられた3つの裂傷に続いて、浅い創傷が見える。矢じりは、上皮が剪断されたが前足間質が貫通されていない角膜内の部位を示す。矢じりは、前間質が貫通された小さな角膜領域を示す。(c)理想的な量の圧力が加えられた3つの裂傷に続いて、理想的な創傷が見える。矢じりは、前間質が貫通された角膜の全範囲にまたがる創傷を示す。(d)過度の圧力が加えられた3回の裂傷に続いて、完全な程度の創傷が目に見え、房水が外部環境にさらされた。略語:tca、側頭毛様動脈;cf, 脈絡膜亀裂;CAM、絨毛膜。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)創傷時(0dpw)および創傷後16時間(hrpw)から創傷後3〜11日(dpw)までの段階整合対照と比較した創傷角膜における治癒の進行を示す。矢じりは、創傷の背側および腹側の最端の境界を描き、創傷拡張(0〜3dpw)の期間を示し、続いて進行性の創傷閉鎖(5〜11dpw)を示す。(B)切片化されたDAPI(青)およびラミニン(赤)染色された創傷角膜を0、3、および11dpwで染色した。括弧は創傷領域の程度を示し、これは3dpwによる創傷拡張およびE11による再上皮化角膜の完全な修復を明らかにする。アスタリスクは角膜の治癒した領域を示す。スケールバーは、(A)1mm、(B)100μmである。この図は、参考文献8の許可を得て翻案されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:創傷角膜の組織学的分析 (A) 3 dpw および (B) 5 dpw を通る断面。DAPI染色(青色)創傷角膜は、フィブロネクチン(FN、赤色)およびテナシン-C(TN-C、緑色)の局在を明らかにする。(A)及び(B)の括弧内は、創傷領域を示す。スケールバー:100μm。略語: ep, 上皮;st, 間質;エン、内皮。この図は、参考文献8の許可を得て翻案されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A-D)抗β神経チューブリン(Tuj1)全マウント免疫染色後の角膜神経の可視化(B)5dpwおよび(D)11dpw角膜、ならびに(A)ステージマッチE12(E12C、5dpwのステージマッチ)および(C)E18コントロール(E18C、11dpwのステージマッチ)。(b)5dpw角膜中の破線は創傷の程度を示す。創傷に直接隣接する括弧で囲まれた領域は、一時的に神経に反発し、積極的に再上皮化を受けている角膜領域を示す。(B')開いた創傷に直接隣接する治癒角膜組織を通る光学的スキャンは、組織(矢印)および上皮神経ひも(矢じり)に延びるまれな間質神経束を明らかにする。(C,D)11dpwで完全に再生された角膜は、ステージマッチした対照と同様の神経支配パターンおよび同等の神経密度を示す。略語: w, 創傷.この図は、参考文献8の許可を得て翻案されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:治癒した胚性角膜におけるコラーゲン超構造(A)第2世代高調波イメージング(SGH)を用いた、完全に治癒した10dpw角膜およびステージマッチドコントロールのエンフェイススキャン。スキャン深度は角膜の前表面から2〜66μmの範囲(0μmが最も前側間質です)で、それぞれの画像の左側にリストされています。各画像のインセットは、その特定のスキャン深さに対する中央創傷領域の高速フーリエ変換解析に対応する。(B)2次元高速フーリエ変換解析の手動でセグメント化されたスタックを、創傷および段階整合対照角膜内のコラーゲン組織を表す。スケールバー = 50 μm。この図は、参考文献9の許可を得て翻案されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ひよこは胎児の、傷跡のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルシステムです。哺乳類とは異なり、ひよこは、 ovo8または ex ovo戦略24を用いて、開発全体を通して容易にアクセス可能である。胚性のひよこ角膜はげっ歯類の角膜よりもはるかに大きく、頭蓋容積のほぼ50%が眼25に捧げられており、創傷などの物理的操作に非常に従順である。さらに、鶏の卵は一年中、しばしば地元の農場から容易に入手でき、費用対効果が高く、開発をサポートするために謙虚なインキュベーターのみを必要とします。
このプロトコルは、胚性ひよこ角膜創傷を可能にする一連の手順を報告している。胚性ひよこ角膜に作られた創傷は完全に再生し、検出可能な瘢痕化なしで天然の角膜構造の完全な反復を可能にする。この技術により、胚性ヒナギは、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的因子を解明するための重要な動物モデルとなった。
本明細書に記載される胎児創傷治癒モデルに内在する明確な約束にもかかわらず、胎児および成人の角膜創傷治癒の間に明確な違いがあることは注目に値します。胚性角膜は、成体組織において沈黙または欠如している成長因子および形態形成シグナルを発現する26。さらに、創傷した成体角膜組織は線維症を示し、瘢痕組織を形成するが、これはおそらく、胚期において湿っているか、またはまだ確立されていないサイトカインおよび成長因子27によって媒介される炎症反応の増大に起因する。角膜組織内のこのような加齢関連の違いは、成人の創傷組織を完全に回復させる努力を複雑にする可能性がある。それにもかかわらず、胎児の瘢痕のない創傷治癒を調節する重要な分子因子およびマトリックスタンパク質を決定することは、より少ない瘢痕化および正常な組織構造のより良い反復を伴うより修復的な治癒プロセスを促進する治療法への道を開くであろう。
ここで説明する創傷方法は、後期段階のひよこ胚(例えば、>E6)への卵子アクセスを得るためにSpurlinらによって最初に開発された技術に基づいている。卵子を窓にし、胚外膜を頭蓋領域から遠ざけて解剖することにより、胚の目はE7までの段階までアクセス可能です。以前に報告したように、羊膜絨毛膜および絨毛膜の除去および変位は、それぞれ胚発生に影響を及ぼさない11。ばく露された胚は生存可能であり、物理的操作に容易に従順である。この段階では、角膜には3つの異なる層(上皮、間質、および内皮)があり、前間質への直線切開後の創傷治癒研究に適している。注意すべきことは、時間の経過とともにアラントワの成長が増加するため、眼へのアクセスは最終的にE8で閉塞される。この問題を回避するために、創傷のための後期段階の目へのアクセスが望ましい場合、我々は、胚外膜(例えば、E7、E8など)の毎日の操作を行うことによって、E9を介して眼へのアクセスを維持できることを見出した。これにより、角膜はこれらの後期段階(例えば、神経支配後)で創傷することができる。
全体として、この技術における胚の生存率および生存可能性は、胚性血管またはアラントワに損傷を与えないようにさらに注意を払いながら、無菌および水和卵環境が維持されることを確実にするなど、いくつかの要因に依存する。無菌性を維持するために、窓を開ける前に卵の表面全体をエタノールで滅菌する必要があります。これは、しばしば微生物を積んだ小さな卵殻の断片が、典型的には窓の手順の間に卵に落ちるためである。同様に、窓、膜解剖、および角膜切開に関わるすべてのツールは、エタノールで十分にすすぎ、使用前に乾燥または火炎滅菌する必要があります。さらに、抗生物質は、胚が外部環境にさらされるときはいつでも卵に加えるべきである。さらに、胚がウィンドウイング後に適切な水和を保持することがさらに重要である。窓がテープで完全に密閉され、エアギャップが残らないように細心の注意を払わなければなりません。テープが卵殻表面に完全に接着されたままで穴を完全に密封することの重要性を考えると、テープを塗布する前に穴を囲む卵殻表面を洗浄し、乾燥させる必要があります。最後に、血管が誤って切断されることはなく、胚からの液体廃棄物を貯蔵するアラントワが、胚にとって致命的であるため、胚外膜の解剖中に損傷を受けないことが不可欠である。胚生存率は、絨毛膜および羊膜への小さな涙が作られるときに高くなるが、涙液は頭蓋領域から離れた胚外膜を配置するのに十分大きくなければならないことに留意すべきである。高品質の卵子からの膜の解剖および除去中にこれらの慎重な措置が取られれば、ほとんどすべての胚がウィンドウ化手順(〜99%)で生き残ることが期待でき、曝露された胚の約40%はE9まで、〜30%はE1211まで生存する。我々の経験では、E7-E9膜解剖胚の角膜を創傷しても胚の生存率にほとんど影響を及ぼさず、十分な胚はE18を通して生存可能なままであり、その時点で角膜創傷は完全に治癒する。
角膜上皮を横断し、前間質に浸透する創傷を達成することは、信頼性が高く再現性のある結果を生み出すために不可欠である。高品質のマイクロ解剖ナイフは、非常に少ない圧力を加える必要があるように必要です。湾曲した虹彩鉗子のペアを使用すると、もう一方の手で裂傷が作られるときに頭を優しく抱きしめるのに役立ちます。このようにして、湾曲した虹彩鉗子はバックストップとして機能し、角膜が創傷中に静止したままである。間質への創傷の浸透は、特に学習時には可変的であるが、研究者が角膜上皮を壊す感触および外観を学ぶにつれて、より再現性が高くなる。学習中は、角膜間質への創傷浸透の深さを評価できるように、創傷角膜を断面で見ることが有用であり得る(角膜裂傷の直後に理想的な創傷深さを示す断面角膜の例については 、図3B を参照のこと)。
組織移植やビーズ移植などの古典的な発生生物学技術、またはDNAエレクトロポレーションやレトロウイルス感染などの遺伝子操作のための現代的なアプローチと組み合わせると、角膜再生のこの動物モデルは、損傷後の角膜組織の完全な回復を達成するために必要な分子因子と細胞メカニズムを明らかにすることを約束します。さらに、この動物モデルは、角膜再生を増強するための外因性治療化合物の潜在的な有用性を試験するために使用され得る。
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Disclosures
著者は、この原稿で提示された情報に関して競合する金銭的利益を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、イリノイ・ウェズリアン大学からTSへの芸術的および学術的開発助成金によって支援され、NIH-R01EY022158(PL)によって部分的に資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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