本プロトコールは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与する様々なステップを実証する。再生または完全に回復した角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。
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この記事について
サマリー
要約
ひよこの胚性角膜創傷は完全かつ迅速に再生する顕著な能力を示すが、成人の創傷角膜は線維性瘢痕化による透明性の喪失を経験する。損傷した胚性角膜の組織完全性は、検出可能な瘢痕形成なしに本質的に回復される。そのアクセス性と操作の容易さを考えると、ひよこ胚は瘢痕のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルです。このプロトコルは、胚性ひよこの角膜を ovoで傷つけることに関与するさまざまなステップを示しています。第一に、卵子は初期胚期に窓を開けられ、眼にアクセスする。第二に、胚外膜に対する一連の in ovo 物理的操作が行われ、角膜の3つの細胞層が形成されるときに対応する、発達の後期段階を通じて眼へのアクセスが維持されることを確実にする。第三に、外側上皮層および前間質を貫通する線状角膜創傷は、顕微手術ナイフを用いて作製される。再生プロセスまたは完全に復元された角膜は、創傷手順に続く様々な細胞および分子技術を用いて再生電位について分析することができる。このモデルを用いたこれまでの研究では、創傷胚性角膜が角化細胞分化の活性化を示し、ECMタンパク質の天然の三次元マクロ構造への協調的なリモデリングを受け、角膜感覚神経によって適切に再神経支配されることが明らかになった。将来的には、再生プロセスに対する内因性または外因性因子の潜在的な影響は、組織移植、エレクトロポレーション、レトロウイルス感染、またはビーズ移植などの発生生物学技術を使用して、治癒角膜において分析することができる。現在の戦略は、胚性ひよこを、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的要因を解明するための重要な実験パラダイムとして特定している。
概要
角膜は、視力を助長する光を透過および屈折させる透明で、最も外側の眼の組織である。成人角膜において、角膜間質への損傷または感染は、角化細胞増殖、線維症、サイトカイン誘発アポトーシスにつながる炎症の増加、修復筋線維芽細胞の生成、および細胞外マトリックス(ECM)の全体的なリモデリングを特徴とする迅速かつ堅牢な創傷治癒応答をもたらす1,2.損傷後、このような角膜組織修復は、角膜の透明性を低下させ、光の通過を閉塞し、したがって視力を歪め、最も重篤な症例では角膜失明につながる不透明な瘢痕組織をもたらす3。したがって、創傷治癒の複雑さに対処し、創傷閉鎖および組織再生に関与する細胞因子および分子因子を同定するために、信頼できる動物モデルを開発することが明らかに必要である。
今日まで、角膜創傷治癒を調べるほとんどの研究は、出生後4または成体動物モデル1、2、5、6、7を利用してきた。
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プロトコル
このプロトコルで使用された卵の株はホワイトレグホーンであり、すべての動物の手順はイリノイウェズリアン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1.ひよこの卵の孵化
- 卵を産卵後最大1週間〜10°Cに保ち、発育を停止します。ひよこの胚の発生を開始する準備ができたら、室温の水で飽和させた糸くずの出ないワイプ( 材料表を参照)で卵殻全体を拭き取り、汚れや破片を取り除きます。
- 卵の殻が消毒されていることを確認してください。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の表面全体を拭き取ります。エタノールをすばやく拭き取って卵を乾燥させ、卵殻から胚へのエタノール吸収を避けます。
- 卵をトレイの上に水平に配置します。卵の上部にマークを付けて、胚の予想される位置を示します。卵を水平にインキュベートし、ロッキング機能を有効にして、38°Cの加湿インキュベーター内で孵化させる。
2.膜解剖の準備のために卵を窓にする
- 胚発生の3日目(E3)にインキュベーターから卵を取り出す。70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないワイプで卵の上部を殺菌します。卵殻表面からエタノールを乾燥させる。
注:ウィンドウ手順中に発育が遅れないようにする....
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結果
E5.5でACMとCAMを早期に解剖して発育中の胚の頭蓋領域を露出させた後、E7中央角膜にまたがる一連の裂傷が 卵子で 行われました(図1)。角膜再生を研究するのに理想的な創傷は、それぞれが角膜の同じ場所で作られた3つの裂傷の後に起こる。第1の裂傷は角膜上皮を横断し、第2および第3の裂傷はそれぞれ下層の基底膜および前中質を貫通する。理想的な創傷を達成するには、鋭利な微小解剖ナイフ( 材料表を参照)を使用し、裂傷が作られるときに正しい量の圧力を加えることが重要です(図2、理想的な創傷を参照)。圧力が少なすぎると、前間質を十分に貫通せずに角膜上皮を引き裂く浅い創傷が生じる(図2、浅い創傷を参照)。しかし、あまりにも多くの圧力をかけると、全範囲創傷が間質全体を貫通し、房水を外部環境に曝すことになる(図2、全範囲創傷を参照)。
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ディスカッション
ひよこは胎児の、傷跡のない角膜創傷修復を研究するための理想的なモデルシステムです。哺乳類とは異なり、ひよこは、 ovo8または ex ovo戦略24を用いて、開発全体を通して容易にアクセス可能である。胚性のひよこ角膜はげっ歯類の角膜よりもはるかに大きく、頭蓋容積のほぼ50%が眼25に捧げられており、創傷などの物理的操作に非常に従順である。さらに、鶏の卵は一年中、しばしば地元の農場から容易に入手でき、費用対効果が高く、開発をサポートするために謙虚なインキュベーターのみを必要とします。
このプロトコルは、胚性ひよこ角膜創傷を可能にする一連の手順を報告している。胚性ひよこ角膜に作られた創傷は完全に再生し、検出可能な瘢痕化なしで天然の角膜構造の完全な反復を可能にする。この技術により、胚性ヒナギは、瘢痕のない角膜創傷治癒を調整する分子的および細胞的因子を解明するための重要な動物モデルとなった。
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開示事項
著者は、この原稿で提示された情報に関して競合する金銭的利益を持っていません。
謝辞
この研究は、イリノイ・ウェズリアン大学からTSへの芸術的および学術的開発助成金によって支援され、NIH-R01EY022158(PL)によって部分的に資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 18 G 皮下注射針 | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 度角度付きマイクロダイセクティングナイフ | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor 標識二次抗体 | 分子プローブ塩化 | ||
| カルシウム二水和物(CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| エッグトレイ | GQF | O246 | |
| 剖鉗子、細い先端、鋸歯状 | VWR | 82027-408 | |
| 剖はさみ、鋭い先端 | VWR | 82027-578 | |
| アイリス1x2歯組織鉗子、全湾曲 | VWR | 100494-908 | |
| キワイプシ | グマ | Z188956 | |
| マイクロ解剖はさみ | VWR | 470315-228 | |
| マウス抗フィブロネクチン(IgG1) | 発生研究ハイブリドーマバンク | B3 / D6 | |
| マウス抗ラミニン(IgG1) | 発生研究ハイブリドーマバンク | 3H11 | |
| マウス抗ニューロン特異的&β;-チューブリン(Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| マウス抗テネイシン(IgG1) | 発生研究 ハイブリドーマバンク | M1-B4 | |
| パラホルムアルデヒド | Σ | 158127 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Σ P4333 | ||
| 塩化カリウム(KCl) | Σ | P5405 | |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | フィッシャーサイエンティフィック | BP358 | |
| マン1502卵インキュベータ | ーGQF1502 | ||
| 包装(1.88インチ幅) | スコッチ | N / A |
参考文献
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089(2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P.
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再版と許可
