Summary
Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. Rejenere veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.
Abstract
Civciv embriyonik kornea yaraları tamamen ve hızlı bir şekilde yenilenmek için dikkate değer bir kapasite gösterirken, yetişkin yaralı kornealar fibrotik skarlaşma nedeniyle şeffaflık kaybı yaşarlar. Yaralı embriyonik korneaların doku bütünlüğü, saptanabilir bir skar oluşumu olmadan içsel olarak restore edilir. Erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı göz önüne alındığında, civciv embriyosu, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir modeldir. Bu protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında yer alan farklı adımları göstermektedir. İlk olarak, yumurtalar göze erişmek için erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncüsü, dış epitel tabakasına ve anterior stromaya nüfuz eden lineer kornea yaraları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir. Bu modeli kullanarak bugüne kadar yapılan çalışmalar, yaralı embriyonik korneaların keratosit farklılaşmasının aktivasyonunu gösterdiğini, ECM proteinlerinin doğal üç boyutlu makroyapılarına koordineli bir şekilde yeniden şekillendiğini ve kornea duyu sinirleri tarafından yeterince yeniden innerve edildiğini ortaya koymuştur. Gelecekte, endojen veya eksojen faktörlerin rejeneratif süreç üzerindeki potansiyel etkisi, doku aşılama, elektroporasyon, retroviral enfeksiyon veya boncuk implantasyonu gibi gelişimsel biyoloji teknikleri kullanılarak iyileşen kornealarda analiz edilebilir. Mevcut strateji, embriyonik civcivleri, skarsız kornea yara iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için çok önemli bir deneysel paradigma olarak tanımlamaktadır.
Introduction
Kornea, görme keskinliğine elverişli ışığı ileten ve kıran gözün şeffaf, en dıştaki dokusudur. Yetişkin korneada, kornea stromasına verilen hasar veya enfeksiyon, keratosit proliferasyonu, fibroz, sitokin kaynaklı apoptozise yol açan inflamasyon artışı, onarım miyofibroblastlarının oluşumu ve hücre dışı matriksin (ECM) genel olarak yeniden şekillenmesi ile karakterize hızlı ve sağlam bir yara iyileşme yanıtına yol açar1,2 . Yaralanmayı takiben, bu tür kornea dokusu onarımı, kornea saydamlığını azaltan ve ışığın geçişini engelleyen, böylece görüşü bozan ve en ciddi vakalarda kornea körlüğüne yol açan opak skar dokusu ile sonuçlanır3. Bu nedenle, yara iyileşmesinin karmaşıklığını ele almak ve yara kapanması ve doku yenilenmesinden sorumlu hücresel ve moleküler faktörleri tanımlamak için güvenilir hayvan modelleri geliştirmeye açık bir ihtiyaç vardır.
Bugüne kadar, kornea yarasının iyileşmesini inceleyen çoğu çalışmada doğum sonrası4 veya yetişkin hayvan modelleri 1,2,5,6,7 kullanılmıştır. Bu çalışmalar kornea yarası iyileşme yanıtının ve skar oluşumunun altında yatan mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir ilerlemeye yol açmış olsa da, bu iyileşme modellerindeki hasarlı kornea dokuları tam olarak yenilenememekte, böylece kornea morfolojisinin ve yaralanma sonrası yapının tam olarak özetlenmesinden sorumlu moleküler faktörlerin ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasındaki yararlılıklarını sınırlamaktadır. Buna karşılık, embriyonik civciv korneasında bıçakla oluşturulan fetal yaralar, yarasız bir şekilde tamamen iyileşmek için içsel bir kapasiteye sahiptir8. Spesifik olarak, embriyonik civciv korneası, hücre dışı matriks yapısının ve innervasyon paternlerinin tam özetlenmesiyle fibrotik olmayan rejenerasyon sergiler 8,9.
Mevcut protokol, ovo'daki embriyonik bir civcivin korneasının yaralanmasında rol oynayan bir dizi adımı tanımlamaktadır. İlk olarak, embriyoya erişimi kolaylaştırmak için yumurtalar erken embriyonik yaşlarda pencerelenir. İkincisi, korneanın üç hücresel tabakasının oluştuğu ve yaralanmanın istendiği zamana karşılık gelen, gelişimin sonraki aşamalarında göze erişimin korunmasını sağlamak için ekstraembriyonik membranlara bir dizi in ovo fiziksel manipülasyonu gerçekleştirilir. Üçüncü olarak, kornea epitelinden ve anterior stroma içine nüfuz eden lineer santral kornea insizyonları mikrocerrahi bıçak kullanılarak yapılır. Rejenerasyon süreci veya tamamen restore edilmiş kornealar, yaralama prosedürünü takiben çeşitli hücresel ve moleküler teknikler kullanılarak rejeneratif potansiyel açısından analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan yumurta suşu Beyaz Leghorn idi ve tüm hayvan prosedürleri Illinois Wesleyan Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Civciv yumurtalarının kuluçkalanması
- Yumurtaları, gelişimi durdurmak için serildikten sonra 1 haftaya kadar ~ 10 ° C'de tutun. Civciv embriyosu gelişimini başlatmaya hazır olduğunuzda, kir ve kalıntıları temizlemek için tüm yumurta kabuğunu oda sıcaklığında suya doyurulmuş tüy bırakmayan mendillerle ( Malzeme Tablosuna bakınız) silin.
- Yumurta kabuğunun sterilize edildiğinden emin olun. Tüm yumurta yüzeyini% 70 etanol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle silin. Yumurtayı kurutmak için etanolün hızla silin ve yumurta kabuğundan embriyoya etanol emilimini önleyin.
- Yumurtaları yatay olarak bir tepsiye yerleştirin. Embriyonun beklenen pozisyonunu belirtmek için yumurtanın üstünü işaretleyin. Yumurtaları yatay olarak, sallama fonksiyonu etkinleştirildiğinde, 38 °C nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
2. Membran diseksiyonuna hazırlanmak için yumurtaların pencerelenmesi
- Embriyonik gelişimin üçüncü gününde (E3) kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın. Yumurtaların üst kısmını% 70 etanol ile nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle sterilize edin. Etanolün yumurta kabuğu yüzeylerinden kurutulması.
NOT: Pencereleme prosedürü sırasında gelişimin gecikmemesini sağlamak için, 6-12 yumurta çıkarıldı ve kalan yumurtalar inkübatörde bırakılırken prosedür bunlar üzerinde hızlı bir şekilde gerçekleştirildi. - Bir yumurtayı güvenli bir yumurta tutucuya yatay olarak yerleştirin (bkz. Diseksiyon makasının keskin ucunu kullanarak, yumurta kabuğunun tepesinde, yumurtanın sivri ucuna yakın küçük bir delik oluşturun.
NOT: Bu delik, yumurta sarısını ve embriyoyu iç yumurta kabuğu yüzeyinden uzağa bırakmak için gerekli olan albüminin çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. Yumurta tutucular için, yumurtaların sevk edildiği kağıt-kağıt hamuru yumurta dolgu daireleri kullanılmıştır. - Delikten (Adım 2.2.), 18 G eğimli hipodermik bir iğne yerleştirin. İğne yumurtanın alt iç yüzeyine itildiğinde ve iğnenin eğim tarafı yumurtanın sivri ucuna baktığında (örneğin, yumurta sarısının ve embriyonun yumurtanın ortasına yakın beklenen yerinden uzakta), tavuk yumurtasından 2-3 mL albümen çıkarın ve atın.
NOT: Bu adım sırasında kişinin iğnesi embriyoyu veya ilişkili vaskülatürünü keserse, albümen ile kanın aspire edilmesine neden olur. Bu embriyo ölümü ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, yumurta sarısı bu adımda albümen ile birlikte yanlışlıkla aspire edilirse, embriyo canlı olmayacaktır. Her iki durumda da, embriyo hemen başka amaçlar için kullanılamıyorsa, yumurta atılmalıdır. - Deliği çevreleyen yumurta kabuğu yüzeyini% 70 etanol ile hafifçe nemlendirilmiş tüy bırakmayan mendillerle temizleyin ve kurulayın. Albümeni çıkarmak için yapılan deliği şeffaf bantla kapatın.
- Diseksiyon makasının keskin ucuyla, işaretleme bölgesinde yumurta kabuğunun tepesinde ikinci bir "pencere" deliği açın (Adım 1.3.). Makasların, embriyoya veya embriyonik vaskülatüre temas etmekten ve zarar vermekten kaçınmak için yumurta kabuğuna çok fazla uzanmadığından emin olun, bu da genellikle yumurtanın içinde ikinci deliğin bulunduğu yerin hemen altına yerleştirilir.
- Kavisli iris forseps kullanarak, "pencere" deliğini ~ 2-3 cm çapında olacak şekilde genişletin ve kabuğun altındaki gelişmekte olan embriyoya bir "pencere" görevi görür.
- Forsepslerin bir ucunu deliğe yerleştirin, yumurta kabuğuna paralel ve yakından yan yana koyun. Diğer forseps ucu yumurta kabuğunun dışına yerleştirildiğinde, iki forseps ucunu dikkatlice sıkıştırarak yumurta kabuğunun küçük parçalarını kırmalarını ve çıkarmalarını sağlar. Embriyoyu doğrudan kaplayan 2-3 cm'lik bir pencere kalana kadar yumurta kabuğu parçalarını kırmaya ve çıkarmaya devam edin.
NOT: Embriyoların Adım 2.6'da yapılan deliğin hemen altına yatmadığı yumurtalar. Yaklaşan membran diseksiyonlarının tamamlanması zor olacağından kullanılmamalıdır. Yumurtaların yatay olarak sallanmasıyla bile, embriyonun zayıf konumlandırılması nedeniyle yumurtaların yaklaşık% 10'u kullanılamaz. Bu embriyolar başka amaçlar için kullanılabilir.
- Forsepslerin bir ucunu deliğe yerleştirin, yumurta kabuğuna paralel ve yakından yan yana koyun. Diğer forseps ucu yumurta kabuğunun dışına yerleştirildiğinde, iki forseps ucunu dikkatlice sıkıştırarak yumurta kabuğunun küçük parçalarını kırmalarını ve çıkarmalarını sağlar. Embriyoyu doğrudan kaplayan 2-3 cm'lik bir pencere kalana kadar yumurta kabuğu parçalarını kırmaya ve çıkarmaya devam edin.
- Bakteriyel kontaminasyonu sınırlamak için, pencere deliğinden (örneğin yumurtaya) ~100-200 μL Ringer çözeltisi (8 g NaCl, 0.37 g KCl ve damıtılmış H2 0'ınL başına 0.23 g CaCl 2.2H 20) içeren Penisilin / Streptomisin antibiyotikleri (50 U / mL Penisilin ve 50 μg / mL Streptomisin, Bkz. Malzeme Tablosu).
- Pencere deliğini şeffaf yapışkan bant kullanarak kapatın. Bandın bir köşesini deliğin uzun ekseni üzerinde hizalayarak ve bandı deliğin kenarından ~ 1-2 cm uzaktaki kabuğa bastırarak yumurta sızdırmazlığını gerçekleştirin.
- Bir tarafta asılı bir bant kapağı kalana kadar açıklığın etrafında sızdırmazlık sağlamaya devam edin. İki bant parçasını birbirine bastırın, deliğin üzerinde kubbeli bir şekil oluşturun ve yumurtayı kapatmayı bitirmek için asılı bant kapağını kabuğa bastırın.
NOT: Yumurtaların E2 veya E3'te pencerelenmesi gerekir. Deneyimlere göre, E2'den önce pencereleme düşük embriyo canlılığı ile sonuçlanır. Dahası, E4 ile, embriyo ve ekstraembriyonik zarlar yumurta kabuğu10'a bağlanır ve E4'te veya daha sonra pencereleme girişimleri genellikle embriyo hasarı veya ekstraembriyonik kan damarlarının yırtılması ile sonuçlanır ve her iki olay da embriyo ölümünün sonucuna yol açar.
- Bir tarafta asılı bir bant kapağı kalana kadar açıklığın etrafında sızdırmazlık sağlamaya devam edin. İki bant parçasını birbirine bastırın, deliğin üzerinde kubbeli bir şekil oluşturun ve yumurtayı kapatmayı bitirmek için asılı bant kapağını kabuğa bastırın.
- Daha fazla gelişme için "pencereli" yumurtaları inkübatöre iade edin. Yumurtaları yatay tuttuğunuzdan ve inkübatörün sallanma işlevini kapattığınızdan emin olun.
- 2.2.-2.9 numaralı adımları yineleyin. her yumurta için.
3. Ekstraembriyonik membranların mikrodiseksiyonları
- Bir E5.5 pencereli yumurtayı inkübatörden çıkarın. Bandı sterilize edilmiş diseksiyon makası ile pencereden keserek embriyoyu ortaya çıkarın.
- Embriyoyu ve ekstraembriyonik zarlarını pencereden gözlemlemek için diseksiyon mikroskobu kullanın. Gerekirse, pencereyi genişletmek için makas veya kavisli iris forseps kullanın, böylece embriyo pencerenin altına iyi yerleştirilmiştir ve embriyonik vaskülatüre zarar vermemeye özen gösterin.
- Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için iki damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.
- Embriyonun uygun gelişim aşamasında olduğundan emin olmak için diseksiyon mikroskobu kullanın (Hamburger Hamilton evre 27, ~ E5.5)11,12 ve amniyotoryonik membranın (ACM) ve koryoalantoik membranın (CAM) konumlarını bulun.
NOT: Bu aşamada, embriyo, embriyonun bağırsak bölgesinden uzanan ve CAM11,12'yi oluşturmak için üst üste binen koryon ile kaynaşan ve kısmen yüksek vaskülarize allantoz ile kaynaşmış amniyotik membran ve üstteki koryonik membrandan oluşan ACM ile çevrilidir. ACM ağır vaskülarize değildir, bu da kan damarlarına zarar vermeden ve embriyoya zarar vermeden embriyoyu açığa çıkarmak için bu zarların disseke edilmesini sağlar. - Bu aşamada ekstraembriyonik membran diseksiyonları yapın (E5.5).
NOT: E5.5, ekstraembriyonik membran diseksiyonlarını gerçekleştirmek için ideal zamandır. TAT oluşumundan önce membranların daha erken diseke edilmesi (örneğin, E4'te) daha sonraki aşamalarda embriyo erişilebilirliğini azaltır11. Dahası, E5.5'te, embriyo sadece kısmen yüksek vaskülarize CAM tarafından kaplanır, ancak önümüzdeki 1-2 gün boyunca, TAT embriyo11,12'ye daha fazla erişimi hızla sarar, engeller. Bu nedenle, E6 veya daha sonra membran diseksiyonu, kan damarlarının yırtılma riski arttıkça zordur.- ACM'yi nazikçe kavramak ve embriyodan uzaklaştırmak için bir çift sterilize edilmiş ince forseps kullanın. Daha sonra, ACM'de ön ayağın hemen üstünde, ön ayağın üzerindeki zardan başın üzerindeki zara kadar uzanan bir delik açmak için sterilize edilmiş mikro diseksiyon makası kullanın.
NOT: Bu adım, koryon ve amniyon membranlarını gevşetir, böylece sonraki adımlarda forseps ile tutulmalarını ve daha fazla diseksiyon yapmalarını kolaylaştırır. Membranların yumurta kabuğu penceresinden nasıl diseke edildiğine dair yararlı bir şema için Şekil 1'e bakın.
- ACM'yi nazikçe kavramak ve embriyodan uzaklaştırmak için bir çift sterilize edilmiş ince forseps kullanın. Daha sonra, ACM'de ön ayağın hemen üstünde, ön ayağın üzerindeki zardan başın üzerindeki zara kadar uzanan bir delik açmak için sterilize edilmiş mikro diseksiyon makası kullanın.
- Amniyonu, ACM ve CAM arasındaki iki bitişik pozisyonda nazikçe tutmak için iki çift ince, steril forseps kullanın (örneğin, ön ayağın üzerinde yapılan kesim ile CAM'ın en yakın kenarı arasındaki bir alan).
- Her ikisi de amniyotik zarı sıkıca kavrayan her bir forseps çiftini birbirinden uzaklaştırın, bir çift dorsal olarak embriyoya ve diğeri ventralal olarak hareket eder.
NOT: Bu hareket, amniyonun daha da yırtılmasına hizmet ederken, aynı zamanda ACM'yi (embriyoya göre dorsal yönde bir çift forseps tarafından çekilir) ve TAT (diğer forseps çifti tarafından embriyoya göre ventral yönde çekilir) ayırır. - TAT artık embriyoyu örtmediğinde ve embriyonik bağırsaktan CAM'a yayılan allantoik arter ve venin kolayca görülebildiğinden membranların ayrıldığından emin olun.
- Her ikisi de amniyotik zarı sıkıca kavrayan her bir forseps çiftini birbirinden uzaklaştırın, bir çift dorsal olarak embriyoya ve diğeri ventralal olarak hareket eder.
- Embriyoyu kaplayan kalan amniyon zarını diseke etmek ve çıkarmak için sterilize edilmiş ince forseps kullanın. En yaygın olarak, kalan amniyonun embriyonun kaudal yarısını kısmen kapsayacağı gözlenir.
- Sterilize forseps kullanarak, embriyonun orta kraniyal bölgesinin yakınındaki amniyonu kavrayın ve amniyonu, embriyoya göre daha önce yer değiştirmiş CAM'a doğru kaudal bir yönde dikkatlice çekin. Embriyo şimdi tamamen açığa çıkacak ve TAT'ın daha da büyümesi esas olarak gelişmekte olan embriyodan uzakta gerçekleşecektir.
NOT: Membran diseksiyonunu takiben maruz kalan embriyonun nasıl görüneceğine dair yararlı bir şema için Şekil 1'e bakınız. Ayrıca, Adım 3.3.-3.6'nın yararlı şematik diyagramları için daha önce yayımlanmış bir rapor11'e bakın.
- Sterilize forseps kullanarak, embriyonun orta kraniyal bölgesinin yakınındaki amniyonu kavrayın ve amniyonu, embriyoya göre daha önce yer değiştirmiş CAM'a doğru kaudal bir yönde dikkatlice çekin. Embriyo şimdi tamamen açığa çıkacak ve TAT'ın daha da büyümesi esas olarak gelişmekte olan embriyodan uzakta gerçekleşecektir.
- Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için birkaç damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.
- Adım 2.8'de açıklandığı gibi şeffaf bant kullanarak pencere deliğini yeniden kapatın. Daha fazla gelişme için yumurtayı inkübatöre geri verin, yumurtayı yatay tutun ve inkübatörün sallanma işlevini devre dışı bırakın.
- 3.1.-3.8 arasındaki adımları yineleyin. her yumurta için.
NOT: Yukarıda tarif edilen E5.5'teki ekstraembriyonik membran diseksiyonları, embriyoya E7 yoluyla erişim sağlayacaktır, bu da yaralamanın 8,9 yapılabileceği zamandır. E8 ile, TAT dokusunun devam eden büyümesi embriyonun kraniyal bölgesini örtmeye başlar, böylece korneaya daha fazla erişimi engeller. Daha yaşlı E8-E9 kornealarında yaralama yapmak istenirse, büyüyen TAT ventrallisini embriyoya göre yeniden konumlandırmak mümkündür (Adım 3.10.). E7'de yara almak istenirse, Adım 3.10. gerçekleştirmek gerekli değildir ve kişi Adım 4, kornea yaralanmasına devam edebilir. - Ekstraembriyonik membranları daha önce E5.5'te diseke edilmiş olan inkübatörden bir E7 yumurtasını çıkarın (Adım 3.1.-3.8.). CAM ile kaynaşmış mevcut amniyon membran dokularını sterilize forseps ile kavrayın ve amniyon zarını embriyoya göre ventral yönde embriyonun kafatası bölgesinden yavaşça çekin.
NOT: Embriyodan uzaklaşan amniyonik membran CAM ile kaynaştırıldığından, büyüyen ve yüksek oranda vaskülarize olmuş TAT amniyon kavrayan forsepsleri takip edecek ve kraniyal bölgeden uzaklaşacaktır. Embriyo yaralanma için istenen yaşa gelene kadar TAT'ı embriyodan sürekli olarak uzaklaştırmak için bu adımı günlük olarak tekrarlayın.
4. Kornea yaralanması
- İstenilen embriyonik yaşta, E7-E9'da yaralama için inkübatörden bir yumurta alın. Bandı sterilize edilmiş diseksiyon makası ile pencereden keserek embriyoyu ortaya çıkarın. Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için birkaç damla Penisilin / Streptomisin antibiyotik içeren Ringer çözeltisi ekleyin.
- Koroid fissüre paralel ve onunla aynı doğrultuda olan sağ gözün korneasının derecesini kapsayan bir kesi yapmak için mikro diseksiyon bıçağı kullanın (embriyonun yumurtada nasıl yattığına bağlı olarak, sol göze erişilemez, ancak yaralanmamış bir kontrol görevi görebilir) (Şekil 1). İlk kesim kornea epitelini geçecektir.
- Korneayı ilk kesi ile aynı noktada 2 kat daha fazla bağlamak için mikro diseksiyon bıçağını kullanın (örneğin; toplam üç kesik, kesilmiş 2 ve kesilmiş 3, korneada kesilmiş 1)11 ile aynı pozisyonda meydana gelir. İkinci yırtılma bazal membrandan geçecek ve üçüncüsü anterior stromaya nüfuz edecektir.
NOT: Embriyo disseke edilmiş CAM'ın altına yerleşmişse, kafayı CAM'ın altından dikkatlice hareket ettirmek için sterilize edilmiş kavisli iris forseps kullanılabilir. Kavisli iris forsepslerini başın altına yerleştirin ve başın sol tarafıyla temas ettirin. Tüm kafayı kapalı kavisli iris forsepslerinin üzerine yerleştirin ve kafayı yavaşça CAM'ın etrafına ve üstüne kaldırın. Canlılığa yardımcı olmak için, CAM'ın düzgün büyümesini teşvik etmek için ameliyattan sonra embriyoyu TAT'ın altına geri çekmek için kavisli iris forseps ile benzer bir teknik kullanın.
- Korneayı ilk kesi ile aynı noktada 2 kat daha fazla bağlamak için mikro diseksiyon bıçağını kullanın (örneğin; toplam üç kesik, kesilmiş 2 ve kesilmiş 3, korneada kesilmiş 1)11 ile aynı pozisyonda meydana gelir. İkinci yırtılma bazal membrandan geçecek ve üçüncüsü anterior stromaya nüfuz edecektir.
- Embriyoyu nemlendirmek ve yumurtayı sterilize etmek için Penisilin / Streptomisin antibiyotikleri içeren 3-4 damla Ringer çözeltisi ekleyin.
- Pencere deliğini şeffaf bantla tekrar kapatın ve yumurtayı yatay bırakarak inkübatöre geri dönün. Embriyonun gelişmesine ve kornea yarasının istenen bir süre boyunca iyileşmesine izin verin (örneğin, 0.5-11 gün) ve daha sonra embriyoyu dekapitasyon yoluyla insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
- Ringer'ın salin çözeltisinin Petri kabında yüzen ötenazi embriyosundan gözü toplamak için kavisli iris forseps kullanın, gözü göz ve yüz dokusunun buluştuğu arka tarafında hafifçe kavrayarak ve tüm gözü dikkatlice kaldırarak yüz dokusundan kurtarın.
- Tüm gözün arkasında küçük bir delik (3-5 cm) dürtmek için ince forseps kullanın ve tüm gözü hafif ajitasyonla gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gelişmekte olan embriyonun kraniyal bölgesini ortaya çıkarmak için E5.5'te ACM ve TAT'ın daha önce diseksiyonunu takiben, ovo'da E7 merkezi korneasını kapsayan bir dizi yırtılma yapıldı (Şekil 1). Kornea rejenerasyonunu incelemek için ideal bir yara, her biri korneanın aynı yerinde yapılan üç yırtılmayı takiben ortaya çıkar. İlk yırtılma kornea epitelini geçerken, ikinci ve üçüncü yırtıklar sırasıyla altta yatan bazal membrana ve anterior stromaya nüfuz eder. İdeal bir yara elde etmek için, keskin bir mikro diseksiyon bıçağı kullanmak ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve yırtılma yapılırken doğru miktarda basınç uygulamak çok önemlidir (Şekil 2, ideal yaraya bakınız). Çok az basınç uygulamak, anterior stromaya yeterince nüfuz etmeden kornea epitelini yırtan sığ bir yaraya neden olacaktır (Şekil 2, sığ yaraya bakınız). Bununla birlikte, çok fazla basınç uygulanması, tüm stromaya nüfuz eden ve sulu mizahı dış ortama maruz bırakan tam ölçüde bir yara ile sonuçlanır (Şekil 2, tam ölçüde yaraya bakınız).
Uygun yırtıcı insizyonların yapılması, başlangıçta genişleyen (yaralamadan 0-3 gün sonra) ideal bir yara oluşturur (Şekil 2)8 (Şekil 3). E7 tavuk kornealarının yaralanmasıyla oluşan yara büyümesi evresinin, bu embriyonik evre8'de göz büyüklüğünün hızla genişlemesi ile ilişkili olduğu ileri sürülmüştür. Embriyonik tavuk gözleri, E10'dan yumurtadan çıkmaya kadar göz büyümesine kıyasla E4'ten E10'a kadar önemli ölçüde daha hızlı büyür. Göz büyümesinin bu erken hızlı fazları, yüksek göz içi basıncına (GİB) bağımlı büyümeye atfedilir13. Bu nedenle, gözün hızlı büyüme hızının, yüksek GİB ile birleştiğinde, embriyonik kornea yarasının iyileşme ilerlemesine özgü olan iyileşme sürecinin erken aşamalarında (yaralanmadan 0-3 gün sonra) yara retraksiyonunu teşvik etmesi muhtemeldir. Bundan sonra, yeniden epitelizasyon ve yeni doku oluşumu meydana gelir (yaralanmadan 4-9 gün sonra), yarayı yaralamasonrası 8'den 11 gün sonra yara izi bırakmadan bir şekilde kapatmak için (Şekil 3A).
Yara derinliği ve rejenerasyonunun daha ileri analizi, laminin bakımından zengin bazal membranı işaretleyen bir laminin antikoru ile kesitlerin boyanması ve kesitlerin kornea epiteli8 yoluyla yaranın derecesini ortaya koyan nükleer belirteç DAPI ile karşı boyanmasıyla mümkün olmuştur. Son zamanlarda yaralanan kornealar (0 dpw) ve rejenerasyon sürecinin başlarında olanlar (3 dpw), kornea epiteli içindeki nükleer belirteç DAPI'nin kırılma boyaması ve kornea epiteli ile altta yatan stroma8 arasındaki laminin bakımından zengin bazal membranı gösteren laminin antikor boyamasının olmaması ile kanıtlandığı gibi, yaranın epitel tabakasına ve bazal membrana nüfuz ettiğini göstermiştir (Şekil 3B ). Bununla birlikte, DAPI ve laminin antikoru ile boyanmış 11 dpw korneadan yapılan kesitler, yeniden epitelize edilmiş ve rejenere yara8 bölgesinde sürekli laminin bakımından zengin bir bazal membran içeren tamamen iyileşmiş bir kornea ortaya çıkardı (Şekil 3B).
Kornea insizyonunu takiben, kesitli, yaralı kornea dokularına immünohistokimya yapılarak yara iyileşme sürecinin detaylı karakterizasyonu gerçekleştirildi. Hücre dışı matriks proteinleri fibronektin ve tenassin, yetişkin kornea yaralarının iyileşmesine epitel ve keratosit hücre göçü ile ilişkilidir14,15. Hücre dışı matriks proteinleri, fibronektin ve tenassinin spatiotemporal lokalizasyonu iyileşen yara içinde belirgindir ve kornea yeniden epitelizasyonuna karşılık gelen zaman noktalarında yükselmiş bulunmuştur (yaralanmadan 5 gün sonra)8 (Şekil 4). Bu tür analizler, fibronektin ve tenasisinin yara kapanmasında önemini ve özellikle epitel hücre göçü ve sağkalımına katılımlarını, yetişkin kornea yaralarındaki bu işlevlerle tutarlı olarak göstermektedir16,17.
E8-E9'dan başlayarak, kornea, bir perikorneal sinir halkasından çıkan ve E12 18,19,20 tarafından korneanın merkezine ve kornea epiteline doğru ilerlerken anterior stromadan geçen trigeminal duyusal sinir lifleri tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir. Bu modeldeki kornea yaraları E7'de, korneaya sinir projeksiyonundan kısa bir süre önce yapıldığından, bu model aşağılamanın ardından iyileşen bir korneada gezinirken kornea sinirlerini daha da araştırır. Kornea sinirlerini anti-β nöral tübülin (Tuj1) antikorları21 ile izlemek için tam montajlı immünohistokimya kullanılarak, sinirlerin yaralı, merkezi korneayı (yaralanmadan 5 gün sonra) doğrudan yan yana getiren iyileşen kornea dokusundan geçici olarak inhibe edildiği açıktır.8 (Şekil 5A, B). Daha önceki inhibisyona rağmen, kornea sinirleri sonunda tamamen iyileşmiş kornea dokusunu (yaralanmadan 11 gün sonra) benzer yoğunluk seviyelerine ve evre eşli, yaralanmamış kontrollere (E18C) benzer modellerde innerve eder (Şekil 5C, D).
Çarpıcı bir şekilde, fibrotik olmayan, yarasız bir şekilde iyileşen tamamen yeniden epitelize edilmiş kornea dokuları, normal kollajen doku mimarisinin tam bir özetini göstermektedir. İkinci nesil harmonik görüntüleme22,23 ile kanıtlandığı gibi, merkezi kornea yara alanının değişen derinlikleri boyunca kollajen lifi demetleri, yaralanmamış merkezi kornea dokusunun doğal makroyapısına uygun olarak ortogonal olarak düzenlenmiştir9 (Şekil 6).
Şekil 1: In ovo ekstraembriyonik membran diseksiyonları ve kornea yaralanmalarının şeması. E5.5'te, embriyonun kraniyal bölgesi, ACM ve CAM zarlarının diseksiyonu ve amniyon ve allantozun gelişmekte olan gözden uzağa konumlandırılmasıyla ortaya çıkar. Merkezi kornea yaralandığında yumurtalar kapatılır ve E7'ye inkübe edilir, mikrocerrahi bir bıçağın ucu orta korneada bir kesi yaparken embriyo başı için beşik olarak kavisli forseps kullanılır. Yara, koroid fissüre (yıldız işareti) paralel olarak yönlendirilir. Kesinin derinliğinin anterior stromaya ulaşmasını sağlamak için, bıçakla her biri aynı göreceli pozisyonda, birbiri üzerine üç eşzamanlı kesim yapılması gerekir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Şekil, 8,11 referanslarının izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ovo'da oluşan yaralardaki varyasyonlar. (A) E5.5'teki membran diseksiyonlarını takiben, sağ göze ovo'da erişilebilir. (B-D) Korneanın derecesini kapsayan ve koroid fissür (cf) ile uyumlu olan çeşitli derecelerdeki yırtılmaların hemen ardından bir in ovo embriyosundan alınan görüntüler. (B) Zayıf basıncın uygulandığı üç yırtılmayı takiben, sığ bir yara görülür. Ok ucu, korneada epitelin kesildiği, ancak anterior stromanın delinmediği bir yeri işaretler. Ok uçları, anterior stromanın nüfuz ettiği küçük bir kornea bölgesini gösterir. (C) İdeal miktarda basıncın uygulandığı üç yırtılmayı takiben, ideal bir yara görülebilir. Ok uçları, anterior stromanın nüfuz ettiği korneanın tüm kapsamını kapsayan bir yarayı ifade eder. (D) Aşırı basıncın uygulandığı üç yırtılmayı takiben, tam bir yara görülür ve sulu mizah dış ortama maruz kalır. Kısaltmalar: tca, temporal siliyer arter; cf, koroid fissür; CAM, koryoallantoik membran. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yara iyileşmesinin ilerlemesi. (A) Yaralı kornealarda iyileşme sürecinin, evre uyumlu kontrollere kıyasla ilerlemesi, yaralanma zamanından (0 dpw) ve yara sonrası 16 saatten (hrpw) 3-11 gün sonrasına (dpw) kadar gösterilmiştir. Ok uçları, yaranın dorsal ve ventral en sınırlarını çizer, yara genişlemesi dönemini (0-3 dpw) ve ardından ilerleyici yara kapanışını (5-11 dpw) gösterir. (B) Kesitli DAPI (mavi) ve laminin (kırmızı) lekeli yaralı kornealar 0, 3 ve 11 dpw'de. Braketler yaralı bölgenin derecesini gösterir, bu da yara genişlemesini 3 dpw ve yeniden epitelize edilmiş korneanın E11 ile tam onarımını ortaya çıkarır. Yıldız işaretleri korneanın iyileşmiş bölgesini gösterir. Ölçek çubuğu (A) 1 mm, (B) 100 μm'dir. Şekil, referans8'den izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yaralı korneaların histolojik analizi. (A) 3 dpw ve (B) 5 dpw üzerinden kesitler. DAPI boyalı (mavi) yaralı kornealar fibronektin (FN, kırmızı) ve Tenascin-C'nin (tn-C, yeşil) lokalizasyonunu ortaya çıkarır. (A) ve (B)'deki parantezler yaralı bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Kısaltmalar: ep, epitel; st, stroma; en, endotel. Şekil, referans8'den izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yaralı korneaların innervasyonu. (A-D) (B) 5 dpw ve (D) 11 dpw kornealarda anti-β nöral tübülin (Tuj1) tam mount immün boyama sonrası kornea sinirlerinin görselleştirilmesi ve ayrıca (A) evre uyumlu E12 (E12C, 5 dpw için evre eşleştirilmiş) ve (C) E18 kontrolleri (E18C, 11 dpw için evre eşli). (B) 5 dpw korneadaki kırık çizgi, yaranın boyutunu gösterir. Yaraya doğrudan bitişik olan parantezli alan, geçici olarak sinirlere itici olan ve aktif olarak yeniden epitelizasyon geçiren kornea bölgesini gösterir. (B') Açık yaraya doğrudan bitişik iyileşen kornea dokusundan yapılan optik tarama, dokuya (ok) ve epitel sinir tasmalarına (ok ucu) uzanan nadir bir stromal sinir demetini ortaya çıkarır. (C,D) 11 dpw'de tamamen rejenere olmuş kornealar, benzer innervasyon paternlerini ve evre uyumlu kontrollerle karşılaştırılabilir sinir yoğunluklarını gösterir. Kısaltma: w, yara. Şekil, referans8'den izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İyileşmiş embriyonik kornealarda kollajen ultrayapısı . (A) Tam iyileşmiş 10 dpw korneaların en yüz taraması ve ikinci nesil harmonik görüntüleme (SGH) kullanılarak evre uyumlu kontroller. Tarama derinlikleri korneanın ön yüzeyinden 2-66 μm arasında değişir (0 μm en ön stromadır) ve ilgili görüntülerin solunda listelenir. Her görüntünün iç kısımları, söz konusu tarama derinliği için merkezi yara alanının Hızlı Fourier dönüşüm analizine karşılık gelir. (B) Yaralı ve aşama uyumlu kontrol korneasındaki kollajen organizasyonunu temsil eden iki boyutlu Hızlı Fourier dönüşüm analizinin manuel olarak bölümlere ayrılmış yığınları. Ölçek çubuğu = 50 μm. Şekil, referans9'dan izin alınarak uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Civciv, fetal, yarasız kornea yara onarımını incelemek için ideal bir model sistemdir. Memelilerin aksine, civciv, ovo 8 veya ex ovo stratejileri24 kullanılarak gelişim boyunca kolayca erişilebilir. Embriyonik civciv korneası, kemirgen kornealarından çok daha büyüktür, kafatası hacminin yaklaşık% 50'si göze25'e adanmıştır ve bu da onu yaralama gibi fiziksel manipülasyonlara oldukça uygun hale getirir. Dahası, tavuk yumurtası yıl boyunca, genellikle yerel çiftliklerden kolayca temin edilebilir ve uygun maliyetlidir, bu da gelişimi desteklemek için sadece humifiye bir inkübatör gerektirir.
Bu protokol, embriyonik civciv kornea yaralanmasını sağlayan bir dizi prosedürü rapor eder. Embriyonik civciv korneasına yapılan yaralar tamamen yenilenir ve tespit edilebilir bir yara izi olmadan doğal kornea yapısının tam bir özetini sağlar. Bu teknik, embriyonik civcivi, skarsız kornea yarasının iyileşmesini koordine eden moleküler ve hücresel faktörleri aydınlatmak için hayati bir hayvan modeli haline getirmiştir.
Burada açıklanan fetal yara iyileşmesi modelinin doğasında bulunan açık vaatlere rağmen, fetal ve yetişkin kornea yara iyileşmesi arasında açık farklılıklar olduğunu belirtmek gerekir. Embriyonik kornea, yetişkin dokularda susturulan veya bulunmayan büyüme faktörlerini ve morfogenetik sinyalleri ifade eder26. Dahası, yaralı yetişkin kornea dokuları fibroz sergiler ve muhtemelen embriyonik aşamalarda nemlendirilmiş veya henüz kurulmamış sitokinler ve büyüme faktörleri27 tarafından aracılık edilen artmış bir enflamatuar yanıt nedeniyle skar dokusu oluşturur. Kornea dokusundaki yaşa bağlı bu tür farklılıklar, yetişkin yaralı dokuyu tamamen restore etme çabalarını zorlaştırabilir. Bununla birlikte, fetal skarsız yara iyileşmesini düzenleyen anahtar moleküler faktörlerin ve matriks proteinlerinin belirlenmesi, daha az yara izi ve normal doku mimarisinin daha iyi özetlenmesi ile daha restoratif bir iyileşme sürecini teşvik eden tedavilerin yolunu açacaktır.
Burada açıklanan yaralama yöntemi, ilk olarak Spurlin ve ark.11 tarafından geç evre civciv embriyolarına (örneğin, >E6) erişim sağlamak için geliştirilen bir tekniğe dayanmaktadır. Yumurtayı pencereleyerek ve ekstraembriyonik membranları kraniyal bölgeden uzağa diseke ederek, embriyonik göze E7 kadar geç aşamalara erişilebilir. Daha önce de bildirdiğimiz gibi, sırasıyla amniyotoryonik ve koryoallantoik membranların çıkarılması ve yer değiştirmesi embriyonik gelişimi etkilemez11. Maruz kalan embriyolar yaşayabilir ve fiziksel manipülasyona kolayca uygundur. Bu aşamada, korneanın üç ayrı tabakası vardır (epitel, stroma ve endotel), bu da onu anterior stromaya doğrusal insizyonu takiben yara iyileşmesi çalışmaları için uygun hale getirir. Zamanla artan allantoz büyümesi nedeniyle, göze erişimin sonunda E8'de tıkandığı belirtilmelidir. Bu sorunu atlatmak için, yaralanma için daha sonraki aşamadaki gözlere erişim arzu edilirse, ekstraembriyonik membranların günlük manipülasyonu (örneğin, E7, E8, vb.'de) gerçekleştirilerek göze erişimin E9 yoluyla sağlanabileceğini bulduk; burada allantoz, büyümesinin embriyodan yönlü olarak gerçekleşmesini sağlamak için kraniyal bölgeden dikkatlice yeniden konumlandırılır. Bu, korneaların bu sonraki aşamalarda (örneğin, innervasyonu takiben) yaralanmasını sağlar.
Genel olarak, bu teknikte embriyo canlılığı ve hayatta kalabilirliği, steril ve hidratlı bir yumurta ortamının korunmasını sağlamak ve embriyonik kan damarlarına veya allantoza zarar vermemek için daha fazla dikkat çekmek gibi çeşitli faktörlere dayanır. Steriliteyi korumak için tüm yumurta yüzeyi, pencerelemeden önce etanol ile sterilize edilmelidir. Bunun nedeni, genellikle mikroplarla dolu olan küçük yumurta kabuğu parçalarının, pencereleme prosedürü sırasında tipik olarak yumurtaya düşmesidir. Benzer şekilde, pencereleme, membran diseksiyonları ve kornea kesisinin yapılmasında rol oynayan tüm aletler, kullanımlarından önce etanol içinde iyice durulanmalı ve kurutulmalı veya alevle sterilize edilmelidir. Ayrıca, embriyo dış ortama maruz kaldığı her an yumurtaya antibiyotik eklenmelidir. Embriyonun pencereleme sonrası uygun hidrasyonu koruması daha da önemlidir. Pencerenin bantla tamamen kapatıldığından ve hava boşluklarının kalmadığından emin olmak için büyük özen gösterilmelidir. Bandın yumurta kabuğu yüzeyine tamamen yapışmış kalması ve deliği tamamen kapatması önemi göz önüne alındığında, deliği çevreleyen yumurta kabuğu yüzeyinin bandı uygulamadan önce temizlenmesi ve kurutulması gerekir. Son olarak, hiçbir kan damarının yanlışlıkla kesilmemesi ve embriyodan sıvı atıkları depolayan allantozun, embriyo dışı zarların diseksiyonu sırasında embriyo için ölümcül olduğu için zarar görmemesi zorunludur. Koryon ve amniyona daha küçük gözyaşları yapıldığında embriyo canlılığının daha yüksek olduğu belirtilmelidir, ancak gözyaşı ekstraembriyonik membranları kraniyal bölgeden uzağa yerleştirmek için yeterince büyük olmalıdır. Bu dikkatli adımlar membranların diseksiyonu ve yüksek kaliteli yumurtalardan çıkarılması sırasında atılırsa, embriyoların neredeyse tamamının pencereleme prosedüründe hayatta kalması beklenebilirken (~% 99), maruz kalan embriyoların ~% 40'ı E9'a ve ~% 30'u E1211'e hayatta kalır. Deneyimlerimize göre, E7-E9 zarı disseke edilmiş embriyoların kornealarının yaralanmasının embriyo canlılığı üzerinde çok az etkisi vardır ve bol miktarda embriyo E18 boyunca canlı kalır, bu noktada kornea yarası tamamen iyileşir.
Kornea epitelini geçen ve anterior stromaya nüfuz eden yaraların elde edilmesi, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için esastır. Yüksek kaliteli bir mikro diseksiyon bıçağı gereklidir, böylece çok az basınç uygulanması gerekir. Bir çift kavisli iris forseps kullanmak, yırtılma diğer elle yapıldığı için kafayı hafifçe sarmak için yararlı olabilir. Bu şekilde, kavisli iris forsepsleri bir backstop görevi görür, böylece kornea yaralanma sırasında sabit kalır. Yaranın stroma içine nüfuz etmesi, özellikle öğrenirken değişkendir, ancak araştırmacı kornea epitelini kırma hissini ve görünümünü öğrendikçe daha tekrarlanabilir hale gelir. Öğrenildiği gibi, yaralı korneaları enine kesitte görüntülemek yararlı olabilir, böylece kornea stromasına yara penetrasyonunun derinliği değerlendirilebilir (kornea yırtılmasından hemen sonra ideal yaralama derinliği gösteren kesitli bir kornea örneği için Şekil 3B'ye bakınız).
Doku greftleme ve boncuk implantasyonu gibi klasik gelişim biyolojisi teknikleri veya DNA elektroporasyonu ve retroviral enfeksiyon gibi gen manipülasyonu için modern yaklaşımlarla birleştirildiğinde, kornea rejenerasyonunun bu hayvan modeli, hasarı takiben kornea dokusunun tam iyileşmesini sağlamak için gerekli moleküler faktörleri ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmayı vaat etmektedir. Ayrıca, bu hayvan modeli, kornea rejenerasyonunu arttırmak için eksojen terapötik bileşiklerin potansiyel yararlılığını test etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu makalede sunulan bilgilerle ilgili olarak rakip finansal çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Illinois Wesleyan Üniversitesi aracılığıyla TS'ye verilen bir Sanatsal ve Bilimsel Gelişim hibesi ile desteklenmiş ve kısmen NIH-R01EY022158 (PL) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
