Summary
Das vorliegende Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte auf, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Die regenerierenden oder vollständig wiederhergestellten Hornhäute können nach dem Wundvorgang mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken auf Regenerationspotenzial analysiert werden.
Abstract
Embryonale Hornhautwunden von Küken zeigen eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich vollständig und schnell zu regenerieren, während erwachsene verwundete Hornhäute aufgrund fibrotischer Narbenbildung einen Verlust an Transparenz erfahren. Die Gewebeintegrität verletzter embryonaler Hornhäute wird intrinsisch wiederhergestellt, ohne dass Narbenbildung erkennbar ist. Aufgrund seiner Zugänglichkeit und einfachen Manipulation ist der Kükenembryo ein ideales Modell für die Untersuchung der narbenlosen Hornhautwundreparatur. Dieses Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Zuerst werden Eier im frühen Embryonalalter gefenstert, um Zugang zum Auge zu erhalten. Zweitens wird eine Reihe von physikalischen In-Ovo-Manipulationen an den extraembryonalen Membranen durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Zugang zum Auge in späteren Entwicklungsstadien aufrechterhalten wird, entsprechend dem Zeitpunkt, zu dem die drei Zellschichten der Hornhaut gebildet werden. Drittens werden lineare Hornhautwunden, die die äußere Epithelschicht und das vordere Stroma durchdringen, mit einem mikrochirurgischen Messer hergestellt. Der Regenerationsprozess oder vollständig wiederhergestellte Hornhäute können mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken nach dem Verwundungsverfahren auf Regenerationspotenzial analysiert werden. Bisherige Studien, die dieses Modell verwenden, haben gezeigt, dass verwundete embryonale Hornhäute eine Aktivierung der Keratozytendifferenzierung aufweisen, eine koordinierte Umgestaltung von ECM-Proteinen in ihre native dreidimensionale Makrostruktur durchlaufen und von sensorischen Hornhautnerven angemessen reinnerviert werden. In Zukunft könnte der mögliche Einfluss endogener oder exogener Faktoren auf den regenerativen Prozess bei heilenden Hornhäuten mit entwicklungsbiologischen Techniken wie Gewebetransplantation, Elektroporation, retroviraler Infektion oder Perlenimplantation analysiert werden. Die aktuelle Strategie identifiziert das embryonale Küken als ein entscheidendes experimentelles Paradigma zur Aufklärung der molekularen und zellulären Faktoren, die die heilung der narbenlosen Hornhautwunden koordinieren.
Introduction
Die Hornhaut ist das transparente, äußerste Gewebe des Auges, das Licht überträgt und bricht, was der Sehschärfe förderlich ist. In der adulten Hornhaut führt eine Schädigung oder Infektion des Hornhautstromas zu einer schnellen und robusten Wundheilungsreaktion, die durch Keratozytenproliferation, Fibrose, erhöhte Entzündung, die zu Zytokin-induzierter Apoptose führt, Erzeugung von Reparatur-Myofibroblasten und Gesamtumbau der extrazellulären Matrix (ECM) gekennzeichnet ist1,2 . Nach einer Verletzung führt eine solche Hornhautgewebereparatur zu undurchsichtigem Narbengewebe, das die Transparenz der Hornhaut verringert und den Lichtdurchgang verdeckt, wodurch das Sehvermögen verzerrt wird und in den schwersten Fällen zur Hornhautblindheitführt 3. Daher besteht ein klarer Bedarf, zuverlässige Tiermodelle zu entwickeln, um die Komplexität der Wundheilung anzugehen und die zellulären und molekularen Faktoren zu identifizieren, die für den Wundverschluss und die Geweberegeneration verantwortlich sind.
Bis heute haben die meisten Studien, die die Heilung von Hornhautwunden untersuchen, postnatale4- oder erwachsene Tiermodelle 1,2,5,6,7 verwendet. Während diese Studien zu einem signifikanten Fortschritt im Verständnis der Hornhautwundheilungsreaktion und der Mechanismen, die der Narbenbildung zugrunde liegen, geführt haben, können sich die beschädigten Hornhautgewebe in diesen Heilungsmodellen nicht vollständig regenerieren, wodurch ihr Nutzen für die Identifizierung der molekularen Faktoren und zellulären Mechanismen, die für die vollständige Rekapitulation der Hornhautmorphologie und -struktur nach der Verletzung verantwortlich sind, eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu besitzen fetale Wunden, die mit einem Messer in der embryonalen Kükenhornhaut erzeugt werden, eine intrinsische Fähigkeit, auf narbenlose Weise vollständig zu heilen8. Insbesondere zeigt die embryonale Kükenhornhaut eine nichtfibrotische Regeneration mit der vollständigen Rekapitulation der extrazellulären Matrixstruktur und der Innervationsmuster 8,9.
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Abfolge von Schritten, die an der Verwundung der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo beteiligt sind. Erstens werden die Eier im frühen Embryonalalter gefenstert, um den Zugang zum Embryo zu erleichtern. Zweitens wird eine Reihe von physikalischen In-Ovo-Manipulationen an den extraembryonalen Membranen durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Zugang zum Auge in späteren Entwicklungsstadien aufrechterhalten wird, je nachdem, wann die drei Zellschichten der Hornhaut gebildet werden und eine Verwundung gewünscht ist. Drittens werden lineare zentrale Hornhautschnitte, die durch das Hornhautepithel und in das vordere Stroma eindringen, mit einem mikrochirurgischen Messer durchgeführt. Der Regenerationsprozess oder vollständig wiederhergestellte Hornhäute können mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken nach dem Verwundungsverfahren auf Regenerationspotenzial analysiert werden.
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Protocol
Der in diesem Protokoll verwendete Eierstamm war White Leghorn, und alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Illinois Wesleyan University genehmigt.
1. Inkubation von Kükeneiern
- Halten Sie die Eier bis zu 1 Woche nach dem Legen bei ~ 10 ° C, um die Entwicklung zu stoppen. Wenn Sie bereit sind, die Entwicklung des Kükenembryos einzuleiten, wischen Sie die gesamte Eierschale mit fusselfreien Tüchern ab (siehe Materialtabelle), die mit Wasser bei Raumtemperatur gesättigt sind, um Schmutz und Ablagerungen zu entfernen.
- Stellen Sie sicher, dass die Eierschale desinfiziert ist. Wischen Sie die gesamte Eioberfläche mit fusselfreien Tüchern ab, die mit 70% Ethanol angefeuchtet sind. Wischen Sie das Ethanol schnell ab, um das Ei zu trocknen, und vermeiden Sie die Ethanolaufnahme durch die Eierschale zum Embryo.
- Ordnen Sie die Eier horizontal auf einem Tablett an. Markieren Sie die Oberseite des Eies, um die erwartete Position des Embryos anzuzeigen. Bebrüten Sie die Eier horizontal, wobei die Schaukelfunktion aktiviert ist, in einem 38 °C befeuchteten Inkubator.
2. Fenster der Eier, um sich auf die Membrandissektion vorzubereiten
- Entfernen Sie die Eier am dritten Tag der Embryonalentwicklung (E3) aus dem Inkubator. Sterilisieren Sie die Oberseite der Eier mit fusselfreien Tüchern, die mit 70% Ethanol angefeuchtet sind. Trocknen Sie das Ethanol von den Eierschalenoberflächen.
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Entwicklung während des Fenstervorgangs nicht verzögert wurde, wurden 6-12 Eier entfernt, und das Verfahren wurde schnell an diesen durchgeführt, während die verbleibenden Eier im Inkubator verblieben. - Positionieren Sie ein Ei horizontal in einem sicheren Eierhalter (siehe Materialtabelle). Erzeugen Sie mit dem scharfen Ende der Sezierschere ein kleines Loch in der Oberseite der Eierschale in der Nähe des spitzen Endes des Eies.
HINWEIS: Dieses Loch erleichtert die Entfernung von Albumin, das notwendig ist, um das Eigelb und den Embryo von der inneren Eierschalenoberfläche fallen zu lassen. Für Eierhalter wurden Papier-Zellstoff-Eierfüller-Flats verwendet, in die die Eier transportiert werden. - Durch das Loch (Schritt 2.2.) wird eine abgeschrägte Injektionsnadel mit 18 G eingeführt. Wenn die Nadel an die untere innere Oberfläche des Eies gedrückt wird und die Fasenseite der Nadel dem spitzen Ende des Eies zugewandt ist (z. B. weg von der erwarteten Position des Eigelbs und des Embryos in der Nähe der Mitte des Eies), entfernen Sie 2-3 ml Albumin aus dem Hühnerei und werfen Sie sie weg.
HINWEIS: Wenn die Nadel während dieses Schritts den Embryo oder das zugehörige Gefäßsystem einsticht, führt dies dazu, dass Blut mit dem Albumin abgesaugt wird. Dies führt zum Tod des Embryos. Wenn das Eigelb während dieses Schritts versehentlich zusammen mit dem Albumin abgesaugt wird, ist der Embryo nicht lebensfähig. In beiden Fällen sollte das Ei entsorgt werden, wenn der Embryo nicht sofort für andere Zwecke verwendet werden kann. - Reinigen Sie die Eierschalenoberfläche, die das Loch umgibt, mit fusselfreien Tüchern, die leicht mit 70% Ethanol angefeuchtet sind, und wischen Sie sie trocken. Verschließen Sie das Loch zum Entfernen von Albumin mit durchsichtigem Klebeband.
- Machen Sie mit dem scharfen Ende der Sezierschere ein zweites "Fenster" -Loch in die Oberseite der Eierschale an der Markierungsstelle (Schritt 1.3.). Stellen Sie sicher, dass die Schere nicht zu weit in die Eierschale hineinreicht, um zu vermeiden, dass der Embryo oder das embryonale Gefäßsystem berührt und beschädigt wird, das sich oft im Ei direkt unter der Stelle des zweiten Lochs befindet.
- Erweitern Sie mit einer gebogenen Irispinzette das "Fenster" -Loch auf einen Durchmesser von ~ 2-3 cm und dienen Sie als "Fenster" für den sich entwickelnden Embryo unter der Schale.
- Setzen Sie ein Ende der Pinzette in das Loch ein und halten Sie es parallel zur Eierschale und dicht nebeneinander. Wenn das andere Zangenende außerhalb der Eierschale positioniert ist, drücken Sie die beiden Pinzettenenden vorsichtig zusammen, damit sie kleine Stücke der Eierschale brechen und entfernen können. Brechen und entfernen Sie die Eierschalenfragmente weiter, bis ein 2-3 cm langes Fenster übrig bleibt, das den Embryo direkt überlagert.
HINWEIS: Eier, in denen Embryonen nicht direkt unter dem in Schritt 2.6 entstandenen Loch liegen. dürfen nicht verwendet werden, da die bevorstehenden Membrandissektionen schwierig zu vervollständigen wären. Selbst wenn die Eier horizontal geschaukelt werden, sind etwa 10% der Eier aufgrund der schlechten Positionierung des Embryos unbrauchbar. Diese Embryonen können für andere Zwecke verwendet werden.
- Setzen Sie ein Ende der Pinzette in das Loch ein und halten Sie es parallel zur Eierschale und dicht nebeneinander. Wenn das andere Zangenende außerhalb der Eierschale positioniert ist, drücken Sie die beiden Pinzettenenden vorsichtig zusammen, damit sie kleine Stücke der Eierschale brechen und entfernen können. Brechen und entfernen Sie die Eierschalenfragmente weiter, bis ein 2-3 cm langes Fenster übrig bleibt, das den Embryo direkt überlagert.
- Um die bakterielle Kontamination zu begrenzen, wird durch das Fensterloch (z. B. in das Ei) ~100-200 μL Ringer-Lösung (8 g NaCl, 0,37 g KCl und 0,23 g CaCl2,2H 20 pro L destilliertesH2 0) mit Penicillin/Streptomycin-Antibiotika (50 E/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin, siehe Materialverzeichnis).
- Versiegeln Sie das Fensterloch mit klarem Klebeband. Führen Sie die Eiversiegelung durch, indem Sie eine Ecke des Bandes auf der Längsachse des Lochs ausrichten und das Band auf die Schale drücken ~ 1-2 cm vom Rand des Lochs entfernt.
- Schließen Sie die Öffnung weiter ab, bis auf einer Seite eine hängende Klebebandklappe übrig bleibt. Drücken Sie die beiden Stücke Klebeband zusammen, wodurch eine gewölbte Form über dem Loch entsteht, und drücken Sie die Klappe mit überhängendem Klebeband auf die Schale, um das Siegeln des Eies abzuschließen.
HINWEIS: Eier müssen entweder auf E2 oder E3 gefenstert werden. Erfahrungsgemäß führt das Fenstern vor E2 zu einer geringen Lebensfähigkeit des Embryos. Darüber hinaus werden durch E4 der Embryo und die extraembryonalen Membranen an der Eierschale10 befestigt, und alle Versuche, bei E4 oder später zu fenstern, führen oft zu Embryonenschäden oder zum Reißen extraembryonaler Blutgefäße, wobei beide Ereignisse zum Ergebnis des Embryonentodes führen.
- Schließen Sie die Öffnung weiter ab, bis auf einer Seite eine hängende Klebebandklappe übrig bleibt. Drücken Sie die beiden Stücke Klebeband zusammen, wodurch eine gewölbte Form über dem Loch entsteht, und drücken Sie die Klappe mit überhängendem Klebeband auf die Schale, um das Siegeln des Eies abzuschließen.
- Geben Sie die "gefensterten" Eier zur weiteren Entwicklung in den Inkubator zurück. Stellen Sie sicher, dass die Eier horizontal gehalten werden und schalten Sie die Schaukelfunktion des Inkubators aus.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.-2.9. für jedes Ei.
3. Mikrodissektionen der extraembryonalen Membranen
- Entfernen Sie ein E5.5-Ei mit Fenster aus dem Inkubator. Legen Sie den Embryo frei, indem Sie das Klebeband mit einer sterilisierten Sezierschere vom Fenster wegschneiden.
- Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um den Embryo und seine extraembryonalen Membranen durch das Fenster zu beobachten. Verwenden Sie bei Bedarf eine Schere oder eine gebogene Iriszange, um das Fenster zu verbreitern, so dass der Embryo gut unter dem Fenster positioniert ist, und achten Sie darauf, das embryonale Gefäßsystem nicht zu beschädigen.
- Fügen Sie zwei Tropfen Ringers Lösung hinzu, die Penicillin / Streptomycin-Antibiotika enthält, um den Embryo mit Feuchtigkeit zu versorgen und das Ei zu sterilisieren.
- Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass sich der Embryo im richtigen Entwicklungsstadium befindet (Hamburger Hamilton Stadium 27, ~E5.5)11,12 und lokalisieren Sie die Positionen der amniochorionischen Membran (ACM) und der chorioallantoischen Membran (CAM).
HINWEIS: In diesem Stadium ist der Embryo von der ACM umgeben, die die Amnionmembran und die darüber liegende Chorionmembran umfasst, die verschmolzen und teilweise von der hochvaskularisierten Allantois bedeckt sind, die sich von der Darmregion des Embryos erstreckt und mit dem überlagernden Chorion verschmilzt, um das CAM11,12 zu bilden. Das ACM ist nicht stark vaskularisiert, was es ermöglicht, diese Membranen zu sezieren, um den Embryo freizulegen, ohne Blutgefäße zu schädigen und den Embryo zu schädigen. - In diesem Stadium werden extraembryonale Membrandissektionen durchgeführt (E5.5).
HINWEIS: E5.5 ist der ideale Zeitpunkt für die Durchführung der extraembryonalen Membrandissektionen. Das Sezieren der Membranen früher (z. B. bei E4) vor der CAM-Bildung reduziert die Zugänglichkeit des Embryos in späteren Stadien11. Darüber hinaus ist der Embryo bei E5.5 nur teilweise von der hochvaskularisierten CAM bedeckt, doch in den nächsten 1-2 Tagen umhüllt und schließt die CAM schnell einen weiteren Zugang zum Embryoaus 11,12. Aus diesem Grund ist die Membrandissektion bei E6 oder höher eine Herausforderung, da das Risiko eines Reißens von Blutgefäßen zunimmt.- Verwenden Sie ein Paar sterilisierte feine Pinzetten, um die ACM sanft zu greifen und vom Embryo wegzuziehen. Verwenden Sie dann eine sterilisierte Mikrosezierungsschere, um ein Loch in das ACM direkt über dem Vorderglied zu schneiden, das sich von der Membran über dem Vorderglied bis zur Membran über dem Kopf erstreckt.
HINWEIS: Dieser Schritt entspannt die Chorion- und Amnionmembranen und erleichtert so das Greifen und weitere Sezieren mit einer Pinzette in den nächsten Schritten. In Abbildung 1 finden Sie ein hilfreiches Schema, wie Membranen durch das Eierschalenfenster seziert werden.
- Verwenden Sie ein Paar sterilisierte feine Pinzetten, um die ACM sanft zu greifen und vom Embryo wegzuziehen. Verwenden Sie dann eine sterilisierte Mikrosezierungsschere, um ein Loch in das ACM direkt über dem Vorderglied zu schneiden, das sich von der Membran über dem Vorderglied bis zur Membran über dem Kopf erstreckt.
- Verwenden Sie zwei Paare feiner, steriler Pinzetten, um das Amnion vorsichtig in zwei benachbarten Positionen zwischen dem ACM und dem CAM zu greifen (z. B. ein Bereich zwischen dem Schnitt über dem Vorderglied und der nächsten Kante des CAM).
- Bewegen Sie vorsichtig jedes Paar Pinzetten, die beide die Fruchtmembran fest greifen, voneinander weg, wobei sich ein Paar dorsal zum Embryo und das andere ventral bewegt.
HINWEIS: Diese Bewegung dient dazu, das Amnion weiter zu zerreißen und gleichzeitig die ACM (die in Bezug auf den Embryo von einem Paar Pinzetten in die dorsale Richtung gezogen wird) und die CAM (die in Bezug auf den Embryo vom anderen Pinzettenpaar in ventrale Richtung gezogen wird) zu trennen. - Stellen Sie sicher, dass die Membranen getrennt sind, wenn das CAM den Embryo nicht mehr bedeckt und die Allantoikarterie und -vene, die vom embryonalen Darm zum CAM ausgehen, leicht erkennbar sind.
- Bewegen Sie vorsichtig jedes Paar Pinzetten, die beide die Fruchtmembran fest greifen, voneinander weg, wobei sich ein Paar dorsal zum Embryo und das andere ventral bewegt.
- Verwenden Sie sterilisierte feine Pinzetten, um die verbleibende Amnionmembran, die den Embryo bedeckt, zu sezieren und zu entfernen. Es wird am häufigsten beobachtet, dass das verbleibende Amnion die kaudale Hälfte des Embryos teilweise bedeckt.
- Greifen Sie mit sterilisierten Pinzetten das Amnion in der Nähe der mittleren Schädelregion des Embryos und ziehen Sie das Amnion vorsichtig in eine kaudale Richtung in Bezug auf den Embryo in Richtung der früher verschobenen CAM. Der Embryo wird nun vollständig exponiert sein, und das weitere Wachstum des CAM wird hauptsächlich außerhalb des sich entwickelnden Embryos stattfinden.
HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie ein hilfreiches Schema, wie der exponierte Embryo nach der Membrandissektion aussehen wird. Hilfreiche schematische Diagramme der Schritte 3.3.-3.6 finden Sie auch in einem zuvor veröffentlichten Bericht11.
- Greifen Sie mit sterilisierten Pinzetten das Amnion in der Nähe der mittleren Schädelregion des Embryos und ziehen Sie das Amnion vorsichtig in eine kaudale Richtung in Bezug auf den Embryo in Richtung der früher verschobenen CAM. Der Embryo wird nun vollständig exponiert sein, und das weitere Wachstum des CAM wird hauptsächlich außerhalb des sich entwickelnden Embryos stattfinden.
- Fügen Sie ein paar Tropfen Ringer-Lösung hinzu, die Penicillin / Streptomycin-Antibiotika enthält, um den Embryo mit Feuchtigkeit zu versorgen und das Ei zu sterilisieren.
- Verschließen Sie das Fensterloch wieder mit durchsichtigem Klebeband, wie in Schritt 2.8 beschrieben. Geben Sie das Ei zur weiteren Entwicklung in den Inkubator zurück, halten Sie das Ei horizontal und halten Sie die Schaukelfunktion des Inkubators deaktiviert.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.-3.8. für jedes Ei.
HINWEIS: Die oben beschriebenen extraembryonalen Membrandissektionen bei E5.5 ermöglichen den Zugang zum Embryo durch E7, wenn die Verwundung durchgeführt werden kann 8,9. Durch E8 beginnt das kontinuierliche Wachstum des CAM-Gewebes, die Schädelregion des Embryos zu bedecken, wodurch ein weiterer Zugang zur Hornhaut ausgeschlossen wird. Wenn man eine Verwundung in älteren E8-E9-Hornhäuten durchführen möchte, ist es möglich, die wachsende CAM ventral in Bezug auf den Embryo neu zu positionieren (Schritt 3.10.). Wenn man bei E7 verwundet werden möchte, Schritt 3.10. ist nicht notwendig, um durchzuführen, und man kann mit Schritt 4, Hornhautverwundung, fortfahren. - Ein E7-Ei wird aus dem Inkubator entfernt, dessen extraembryonale Membranen zuvor bei E5.5 seziert wurden (Schritte 3.1.-3.8.). Greifen Sie mit sterilisierten Pinzetten alle verfügbaren Amnionmembrangewebe, die mit dem CAM verschmolzen sind, und ziehen Sie die Amnionmembran vorsichtig von der Schädelregion des Embryos in einer ventralen Richtung in Bezug auf den Embryo weg.
HINWEIS: Da die Amnionmembran, die vom Embryo weg verschoben wird, mit dem CAM verschmolzen ist, folgt das wachsende und hochvaskularisierte CAM der amniongreifenden Zange und bewegt sich von der Schädelregion weg. Wiederholen Sie diesen Schritt täglich, um das CAM kontinuierlich vom Embryo weg zu verschieben, bis der Embryo das gewünschte Alter für die Verwundung erreicht hat.
4. Hornhautverwundung
- Erhalten Sie ein Ei aus dem Inkubator zur Wunde im gewünschten Embryonalalter, E7-E9. Legen Sie den Embryo frei, indem Sie das Klebeband mit einer sterilisierten Sezierschere vom Fenster wegschneiden. Fügen Sie ein paar Tropfen Ringer-Lösung hinzu, die Penicillin / Streptomycin-Antibiotika enthält, um den Embryo mit Feuchtigkeit zu versorgen und das Ei zu sterilisieren.
- Verwenden Sie ein Mikrosezierungsmesser, um einen Schnitt zu machen, der das Ausmaß der Hornhaut des rechten Auges überspannt (aufgrund der Art und Weise, wie der Embryo im Ei liegt, ist das linke Auge nicht zugänglich, kann aber als nicht verwundete Kontrolle dienen), die parallel zur Aderhautspalte verläuft und mit ihr übereinstimmt (Abbildung 1). Der erste Schnitt durchquert das Hornhautepithel.
- Verwenden Sie das Mikro-Seziermesser, um die Hornhaut an der gleichen Stelle wie der erste Schnitt 2x mehr wieder zu zerreißen (z. B. drei Schnitte insgesamt, wobei Schnitt 2 und Schnitt 3 zusammen mit der gleichen Position in der Hornhaut wie Schnitt 1) auftreten). Die zweite Platzwunde durchquert die Basalmembran und die dritte durchdringt das vordere Stroma.
HINWEIS: Wenn sich der Embryo unter der sezierten CAM abgesetzt hat, kann man sterilisierte gekrümmte Iriszange verwenden, um den Kopf vorsichtig unter dem CAM herauszubewegen. Positionieren Sie die gebogene Iriszange unter dem Kopf und berühren Sie die linke Seite des Kopfes. Legen Sie den gesamten Kopf auf eine geschlossene, gebogene Iriszange und heben Sie den Kopf vorsichtig um und über die CAM an. Um die Lebensfähigkeit zu verbessern, verwenden Sie eine ähnliche Technik mit der gekrümmten Iriszange, um den Embryo nach der Operation wieder unter die CAM zu stecken, um das richtige Wachstum der CAM zu fördern.
- Verwenden Sie das Mikro-Seziermesser, um die Hornhaut an der gleichen Stelle wie der erste Schnitt 2x mehr wieder zu zerreißen (z. B. drei Schnitte insgesamt, wobei Schnitt 2 und Schnitt 3 zusammen mit der gleichen Position in der Hornhaut wie Schnitt 1) auftreten). Die zweite Platzwunde durchquert die Basalmembran und die dritte durchdringt das vordere Stroma.
- Fügen Sie 3-4 Tropfen Ringers Lösung hinzu, die Penicillin / Streptomycin-Antibiotika enthält, um den Embryo zu hydratisieren und das Ei zu sterilisieren.
- Verschließen Sie das Fensterloch wieder mit durchsichtigem Klebeband und kehren Sie zum Inkubator zurück, wobei das Ei horizontal bleibt. Lassen Sie den Embryo sich entwickeln und die Hornhautwunde für einen gewünschten Zeitraum (z. B. 0,5-11 Tage) heilen und euthanasieren Sie den Embryo dann auf humane Weise durch Enthauptung.
- Verwenden Sie gekrümmte Iriszangen, um das Auge von einem eingeschläferten Embryo zu ernten, der in einer Petrischale mit Ringers Kochsalzlösung schwimmt, indem Sie das Auge auf seiner hinteren Seite, wo sich das Augen- und Gesichtsgewebe treffen, sanft greifen und das ganze Auge vorsichtig wegheben und vom Gesichtsgewebe befreien.
- Verwenden Sie eine feine Pinzette, um ein kleines Loch (3-5 cm) in den Rücken des ganzen Auges zu stechen und fixieren Sie das ganze Auge in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C über Nacht mit leichter Erregung.
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Representative Results
Nach der früheren Sezierung von ACM und CAM bei E5.5, um die Schädelregion des sich entwickelnden Embryos freizulegen, wurde in Ovo eine Reihe von Platzwunden gemacht, die die zentrale Hornhaut E7 überspannten (Abbildung 1). Eine ideale Wunde, um die Regeneration der Hornhaut zu untersuchen, tritt nach drei Platzwunden auf, die jeweils an der gleichen Stelle der Hornhaut gemacht werden. Die erste Platzwunde durchquert das Hornhautepithel, während die zweite und dritte Platzwunde die darunter liegende Basalmembran bzw. das vordere Stroma durchdringen. Um eine ideale Wunde zu erreichen, ist es wichtig, ein scharfes Mikrodissektionsmesser zu verwenden (siehe Materialtabelle) und den richtigen Druck auszuüben, während die Platzwunde gemacht wird (Abbildung 2, siehe ideale Wunde). Wenn Sie zu wenig Druck ausüben, führt dies zu einer flachen Wunde, die das Hornhautepithel reißt, ohne das vordere Stroma ausreichend zu durchdringen (Abbildung 2, siehe flache Wunde). Wenn Sie jedoch zu viel Druck ausüben, führt dies dazu, dass eine Wunde mit vollem Ausmaß das gesamte Stroma durchdringt und den Kammerwasser der äußeren Umgebung aussetzt (Abbildung 2, siehe Vollwunde).
Die Durchführung der richtigen zerreißenden Schnitte erzeugt eine ideale Wunde (Abbildung 2), die sich zunächst vergrößert (0-3 Tage nach der Wunde)8 (Abbildung 3). Es wurde postuliert, dass die Phase der Wundvergrößerung, die durch die Verwundung von E7-Hühnerhornhäuten auftritt, mit der schnellen Ausdehnung der Augengröße in diesem Embryonalstadium8 zusammenhängt. Embryonale Hühneraugen wachsen signifikant schneller von E4 bis E10 im Vergleich zum Augenwachstum von E10 bis zum Schlüpfen. Diese frühen schnellen Phasen des Augenwachstums werden auf ein erhöhtes Augendruckwachstum (IOP) zurückgeführt13. Daher ist es wahrscheinlich, dass die schnelle Wachstumsrate des Auges in Verbindung mit dem erhöhten IOD den Wundrückzug in den frühen Phasen des Heilungsprozesses (0-3 Tage nach der Wunde) fördert, was für die embryonale Hornhaut-Wundheilungsprogression einzigartig ist. Danach kommt es zu einer Reepithelialisierung und Neubildung von Gewebe (4-9 Tage nach der Wunde), um die Wunde schließlich 11 Tage nach der Wundenarbenfrei zu schließen 8 (Abbildung 3A).
Eine weitere Analyse der Wundtiefe und Regeneration war möglich, indem Querschnitte mit einem Laminin-Antikörper, der die lamininreiche Basalmembran markiert, gefärbt und die Abschnitte mit dem Kernmarker DAPI gegengefärbt wurden, der das Ausmaß der Wunde durch das Hornhautepithel8 offenbart. Kürzlich verwundete Hornhäute (0 dpw) und solche, die sich in einem frühen Stadium des Regenerationsprozesses befinden (3 dpw), zeigten, dass die Wunde die Epithelschicht und die Basalmembran durchdringt, wie die einbrechende Färbung des Kernmarkers DAPI im Hornhautepith und das Fehlen einer Laminin-Antikörperfärbung zeigen, die die lamininreiche Basalmembran zwischen dem Hornhautepith und dem darunter liegenden Stroma8 markiert (Abbildung 3B ). Querschnitte durch 11 dpw Hornhäute, die mit DAPI und Laminin-Antikörpern gefärbt waren, zeigten jedoch eine vollständig verheilte Hornhaut, die reepithelialisiert worden war und eine kontinuierliche lamininreiche Basalmembran an der Stelle der regenerierten Wunde 8 enthielt (Abbildung 3B).
Nach dem Hornhautschnitt wurde eine detaillierte Charakterisierung des Wundheilungsprozesses durch die Durchführung einer Immunhistochemie an geschnittenem, verwundetem Hornhautgewebe erreicht. Die extrazellulären Matrixproteine Fibronektin und Tenascin sind mit der Migration von Epithel- und Keratozytenzellen in heilende adulte Hornhautwundenassoziiert 14,15. Die raumzeitliche Lokalisation der extrazellulären Matrixproteine Fibronektin und Tenascin ist innerhalb der heilenden Wunde offensichtlich und es wurde festgestellt, dass sie zu Zeitpunkten, die der Reepithelialisierung der Hornhaut entsprechen (5 Tage nach der Verwundung), erhöht ist8 (Abbildung 4). Eine solche Analyse legt die Bedeutung von Fibronektin und Tenascin für den Wundverschluss und insbesondere ihre Beteiligung an der Migration und dem Überleben von Epithelzellen nahe, was mit solchen Funktionen bei erwachsenen Hornhautwunden übereinstimmt16,17.
Ab E8-E9 wird die Hornhaut dicht von trigeminalen sensorischen Nervenfasern innerviert, die von einem pericornealen Nervenring ausgehen und durch das vordere Stroma verlaufen, während sie durch E1218,19,20 in Richtung des Hornhautzentrums und des Hornhautepithels projizieren. Da Hornhautwunden in diesem Modell bei E7 hergestellt werden, kurz vor der Nervenprojektion in die Hornhaut, untersucht dieses Modell die Hornhautnerven weiter, während sie nach einer Beleidigung durch eine heilende Hornhaut navigieren. Durch die Verwendung von Ganzkörper-Immunhistochemie zur Verfolgung von Hornhautnerven mit Anti-β-Neuraltubuliin (Tuj1) -Antikörpern21 ist es offensichtlich, dass Nerven vorübergehend durch das heilende Hornhautgewebe gehemmt werden, das die verwundete, zentrale Hornhaut direkt nebeneinander stellt (5 Tage nach der Verwundung)8 (Abbildung 5A,B). Trotz früherer Hemmung innervieren Hornhautnerven schließlich das vollständig verheilte Hornhautgewebe (11 Tage nach der Verwundung) auf ähnliche Dichteniveaus und in ähnlichen Mustern wie stadienangepasste, nicht verwundete Kontrollen (E18C) (Abbildung 5C, D).
Auffallend ist, dass vollständig reepithelialisiertes Hornhautgewebe, das in einer nichtfibrotischen, narbenlosen Weise verheilt ist, eine vollständige Rekapitulation der normalen Kollagengewebearchitektur zeigt. Wie die harmonische Bildgebung der zweiten Generation22,23 zeigt, sind Bündel von Kollagenfasern in unterschiedlichen Tiefen des zentralen Hornhautwundbereichs orthogonal angeordnet und entsprechen der nativen Makrostruktur des nicht verwundeten zentralen Hornhautgewebes 9 (Abbildung 6).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der extraembryonalen Membrandissektionen in ovo und der Hornhautverwundung. Bei E5.5 wird die Schädelregion des Embryos freigelegt, indem die ACM- und CAM-Membranen seziert und das Amnion und der Allantois vom sich entwickelnden Auge entfernt positioniert werden. Eier werden versiegelt und zu E7 inkubiert, wenn die zentrale Hornhaut verwundet ist, wobei gebogene Pinzetten als Wiege für den Embryokopf verwendet werden, da die Spitze eines mikrochirurgischen Messers einen Schnitt in der zentralen Hornhaut macht. Die Wunde ist parallel zur Aderhautfissur (Sternchen) ausgerichtet. Um sicherzustellen, dass die Tiefe des Einschnitts das vordere Stroma erreicht, müssen drei gleichzeitige Schnitte mit dem Messer gemacht werden, jeder in der gleichen relativen Position, einer übereinander. Maßstabsleiste = 1 mm. Die Abbildung wurde mit Genehmigung aus den Referenzen 8,11 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Variationen der in ovo erzeugten Wunden. (A) Nach Membrandissektionen bei E5.5 ist das rechte Auge in ovo zugänglich. (B-D) Bilder eines In-Ovo-Embryos unmittelbar nach Platzwunden unterschiedlichen Grades, die das Ausmaß der Hornhaut überspannen und mit der Aderhautfissur übereinstimmen (vgl.). (B) Nach drei Platzwunden, bei denen schwacher Druck ausgeübt wurde, ist eine flache Wunde sichtbar. Die Pfeilspitze markiert eine Stelle in der Hornhaut, an der das Epithel geschoren wurde, aber das vordere Stroma nicht durchdrungen wurde. Pfeilspitzen bezeichnen eine kleine Hornhautregion, in der das vordere Stroma durchdrungen wurde. (C) Nach drei Platzwunden, bei denen ein idealer Druck ausgeübt wurde, ist eine ideale Wunde sichtbar. Pfeilspitzen bezeichnen eine Wunde, die sich über das gesamte Ausmaß der Hornhaut erstreckt, in der das vordere Stroma durchdrungen wurde. (D) Nach drei Platzwunden, bei denen übermäßiger Druck ausgeübt wurde, ist eine Wunde in vollem Umfang sichtbar, und der Kammerwasser ist der äußeren Umgebung ausgesetzt worden. Abkürzungen: tca, temporale Ziliararterie; CF, Aderhautfissur; CAM, chorioallantoische Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Progression der Wundheilung. (A) Das Fortschreiten der Heilung bei verwundeten Hornhäuten im Vergleich zu den stufenangepassten Kontrollen wird vom Zeitpunkt der Verwundung (0 dpw) und 16 h nach der Wunde (hrpw) bis 3-11 Tage nach der Wunde (dpw) gezeigt. Pfeilspitzen markieren die dorsal- und ventralsten Grenzen der Wunde und zeigen eine Periode der Wundausdehnung (0-3 dpw) an, gefolgt von einem progressiven Wundverschluss (5-11 dpw). (B) Geschnittene DAPI (blau)- und laminin (rot)-gefärbte verwundete Hornhäute bei 0, 3 und 11 dpw. Klammern zeigen das Ausmaß der verwundeten Region, die eine Wundausdehnung um 3 dpw und eine vollständige Reparatur der re-epithelialisierten Hornhaut durch E11 zeigt. Sternchen kennzeichnen die geheilte Region der Hornhaut. Die Skalenleiste beträgt (A) 1 mm, (B) 100 μm. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Referenz8 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Histologische Analyse von verwundeten Hornhäuten. Querschnitte durch (A) 3 dpw und (B) 5 dpw. DAPI-gefärbte (blaue) verwundete Hornhäute zeigen die Lokalisation von Fibronektin (FN, rot) und Tenascin-C (TN-C, grün). Klammern in (A) und (B) bezeichnen die verwundete Region. Maßstabsstab: 100 μm. Abkürzungen: ep, Epithel; St, Stroma; en, Endothel. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Referenz8 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Innervation verwundeter Hornhäute. (A-D) Visualisierung der Hornhautnerven nach Anti-β-Neuraltubuliin (Tuj1) ganzmontierender Immunfärbung in (B) 5 dpw und (D) 11 dpw Hornhäuten sowie (A) stufenangepassten E12 (E12C, stufenangepasst für 5 dpw) und (C) E18 Kontrollen (E18C, stufenangepasst für 11 dpw). (B) Die unterbrochene Linie in der 5 dpw Hornhaut bezeichnet das Ausmaß der Wunde. Der geklammerte Bereich, der direkt an die Wunde angrenzt, bezeichnet den Hornhautbereich, der vorübergehend für die Nerven abstoßend ist und sich aktiv einer Reepithelialisierung unterzieht. B') Der optische Scan durch das heilende Hornhautgewebe direkt neben der offenen Wunde zeigt ein seltenes Stromusnervenbündel, das sich in das Gewebe (Pfeil) und die epithelialen Nervenleinen (Pfeilspitze) erstreckt. (C,D) Vollständig regenerierte Hornhäute bei 11 dpw zeigen ähnliche Innervationsmuster und vergleichbare Nervendichten wie stadienangepasste Kontrollen. Abkürzung: w, Wunde. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Referenz8 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Kollagen-Ultrastruktur in geheilten embryonalen Hornhäuten. (A) En-Face-Scan von vollständig geheilten 10-dw-Hornhäuten und stufenangepassten Kontrollen unter Verwendung der harmonischen Bildgebung der zweiten Generation (SGH). Die Scantiefen reichen von 2-66 μm von der vorderen Oberfläche der Hornhaut (0 μm ist das vorderste Stroma) und sind links neben den jeweiligen Bildern aufgeführt. Einsätze für jedes Bild entsprechen der Fast-Fourier-Transformationsanalyse des zentralen Wundbereichs für diese bestimmte Scantiefe. (B) Manuell segmentierte Stapel zweidimensionaler Fast-Fourier-Transformationsanalysen, die die Kollagenorganisation innerhalb der verwundeten und stufenangepassten Kontrollhornhaut darstellen. Maßstabsleiste = 50 μm. Die Abbildung wurde mit Genehmigung von Referenz9 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das Küken ist ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der fetalen, narbenlosen Hornhautwundenreparatur. Im Gegensatz zu Säugetieren ist das Küken während der gesamten Entwicklung mit den Strategien in ovo 8 oder ex ovo 24 leicht zugänglich. Die embryonale Kükenhornhaut ist viel größer als die Hornhaut von Nagetieren, wobei fast 50% des Schädelvolumens dem Augegewidmet sind 25, was sie sehr anfällig für körperliche Manipulationen wie Verwundungen macht. Darüber hinaus sind Hühnereier das ganze Jahr über leicht verfügbar, oft von lokalen Bauernhöfen, und kostengünstig, so dass nur ein humifizierter Inkubator benötigt wird, um die Entwicklung zu unterstützen.
Dieses Protokoll berichtet über eine Reihe von Verfahren, die eine embryonale Hornhautverwundung ermöglichen. Wunden an der embryonalen Kükenhornhaut regenerieren sich vollständig und ermöglichen eine vollständige Rekapitulation der nativen Hornhautstruktur ohne nachweisbare Narbenbildung. Diese Technik hat das embryonale Küken zu einem wichtigen Tiermodell für die Aufklärung der molekularen und zellulären Faktoren gemacht, die die heilung der narbenlosen Hornhautwunden koordinieren.
Trotz des klaren Versprechens, das dem hier beschriebenen fetalen Wundheilungsmodell innewohnt, ist es erwähnenswert, dass es klare Unterschiede zwischen der Wundheilung des Fötus und der Hornhaut bei Erwachsenen gibt. Die embryonale Hornhaut exprimiert Wachstumsfaktoren und morphogenetische Signale, die in erwachsenen Geweben zum Schweigen gebracht werden oder fehlen26. Darüber hinaus zeigen verwundete adulte Hornhautgewebe Fibrose und bilden Narbengewebe, wahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Entzündungsreaktion, die durch Zytokine und Wachstumsfaktoren27 vermittelt wird, die im Embryonalstadium gedämpft oder noch nicht etabliert sind. Solche altersbedingten Unterschiede innerhalb des Hornhautgewebes könnten die Bemühungen zur vollständigen Wiederherstellung des verwundeten Gewebes bei Erwachsenen erschweren. Nichtsdestotrotz wird die Bestimmung wichtiger molekularer Faktoren und Matrixproteine, die die fetale narbenlose Wundheilung regulieren, den Weg für Therapien ebnen, die einen erholsameren Heilungsprozess mit weniger Narbenbildung und besserer Rekapitulation der normalen Gewebearchitektur fördern.
Die hier beschriebene Verwundungsmethode baut auf einer Technik auf, die zuerst von Spurlin et al.11 entwickelt wurde, um in Ovo Zugang zu Kükenembryonen im Spätstadium zu erhalten (z. B. >E6). Durch das Fenstern des Eies und das Sezieren extraembryonaler Membranen weg von der Schädelregion ist das embryonale Auge für Stadien bis zu E7 zugänglich. Wie wir bereits berichtet haben, haben die Entfernung und Verdrängung der amniochorionischen bzw. chorioallantoischen Membranen keinen Einfluss auf die Embryonalentwicklung11. Freiliegende Embryonen sind lebensfähig und leicht für körperliche Manipulation zugänglich. In diesem Stadium hat die Hornhaut drei verschiedene Schichten (Epithel, Stroma und Endothel), wodurch sie sich für Wundheilungsstudien nach linearem Einschnitt in das vordere Stroma eignet. Es ist zu beachten, dass aufgrund des zunehmenden Allantoiswachstums im Laufe der Zeit der Zugang zum Auge schließlich bei E8 verschlossen ist. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir, wenn der Zugang zu späteren Augen für die Verwundung wünschenswert ist, festgestellt, dass der Zugang zum Auge durch E9 aufrechterhalten werden kann, indem eine tägliche Manipulation der extraembryonalen Membranen (z. B. bei E7, E8 usw.) durchgeführt wird, wobei der Allantois vorsichtig von der Schädelregion weg positioniert wird, um sicherzustellen, dass sein Wachstum in Richtung vom Embryo entfernt erfolgt. Dadurch können Hornhäute in diesen späteren Stadien (z.B. nach Innervation) verwundet werden.
Insgesamt hängen die Lebensfähigkeit und Überlebensfähigkeit des Embryos bei dieser Technik von mehreren Faktoren ab, wie z.B. der Sicherstellung, dass eine sterile und hydratisierte Eiumgebung aufrechterhalten wird, während weiterhin darauf geachtet wird, embryonale Blutgefäße oder die Allantois nicht zu schädigen. Die gesamte Eioberfläche sollte vor dem Fenstern mit Ethanol sterilisiert werden, um die Sterilität zu erhalten. Dies liegt daran, dass kleine Eierschalenfragmente, die oft mit Mikroben beladen sind, während des Fenstervorgangs typischerweise in das Ei fallen. Ebenso müssen alle Werkzeuge, die an der Fensterung, der Membrandissektion und der Herstellung des Hornhautschnitts beteiligt sind, vor ihrer Verwendung gründlich in Ethanol gespült und getrocknet oder flammensterilisiert werden. Darüber hinaus sollten dem Ei Antibiotika hinzugefügt werden, wenn der Embryo der äußeren Umgebung ausgesetzt ist. Es ist weiterhin wichtig, dass der Embryo nach dem Fenstern eine angemessene Hydratation beibehält. Es muss sehr darauf geachtet werden, dass das Fenster vollständig mit Klebeband abgedichtet ist und keine Luftspalte verbleiben. Angesichts der Wichtigkeit, dass das Band vollständig an der Eierschalenoberfläche haftet und das Loch vollständig versiegelt, muss die Eierschalenoberfläche, die das Loch umgibt, vor dem Auftragen des Bandes gereinigt und getrocknet werden. Schließlich ist es unerlässlich, dass keine Blutgefäße versehentlich durchtrennt werden und dass die Allantois, die flüssige Abfälle aus dem Embryo speichert, während der Dissektion der extraembryonalen Membranen nicht beschädigt wird, da beide für den Embryo tödlich sind. Es ist zu beachten, dass die Lebensfähigkeit des Embryos höher ist, wenn kleinere Risse am Chorion und Amnion gemacht werden, obwohl der Riss groß genug sein muss, um die extraembryonalen Membranen von der Schädelregion weg zu positionieren. Wenn diese sorgfältigen Schritte während der Dissektion und Entfernung von Membranen aus hochwertigen Eiern unternommen werden, kann man erwarten, dass fast alle Embryonen das Windowing-Verfahren überleben (~ 99%), während ~ 40% der exponierten Embryonen bis E9 und ~ 30% bis E1211 überleben. Nach unserer Erfahrung hat die Verwundung der Hornhäute von E7-E9-membransezierten Embryonen wenig Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Embryos, und reichlich vorhandene Embryonen bleiben durch E18 lebensfähig, an welchem Punkt die Hornhautwunde vollständig verheilt ist.
Das Erreichen von Wunden, die das Hornhautepithel durchqueren und das vordere Stroma durchdringen, ist unerlässlich, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Ein hochwertiges Mikroseziermesser ist notwendig, so dass sehr wenig Druck ausgeübt werden muss. Die Verwendung einer gebogenen Irispinzette kann hilfreich sein, um den Kopf sanft zu wiegen, während die Platzwunde mit der anderen Hand gemacht wird. Auf diese Weise dient die gebogene Iriszange als Rücklaufsperre, so dass die Hornhaut während der Wunde stationär bleibt. Das Eindringen der Wunde in das Stroma ist variabel, besonders beim Lernen, wird aber reproduzierbarer, wenn der Forscher das Gefühl und das Aussehen des Brechens des Hornhautepithels lernt. Wie man lernt, kann es hilfreich sein, verwundete Hornhäute im Querschnitt zu betrachten, so dass die Tiefe des Wundeindringens in das Hornhautstroma beurteilt werden kann (siehe Abbildung 3B für ein Beispiel einer querschnittlichen Hornhaut, die unmittelbar nach der Hornhautplatzwunde eine ideale Wundtiefe aufweist).
In Kombination mit klassischen entwicklungsbiologischen Techniken wie Gewebetransplantation und Perlenimplantation oder modernen Ansätzen zur Genmanipulation wie DNA-Elektroporation und retroviraler Infektion verspricht dieses Tiermodell der Hornhautregeneration die molekularen Faktoren und zellulären Mechanismen aufzudecken, die notwendig sind, um eine vollständige Wiederherstellung des Hornhautgewebes nach einer Schädigung zu erreichen. Darüber hinaus könnte dieses Tiermodell verwendet werden, um die potenzielle Nützlichkeit exogener therapeutischer Verbindungen zur Steigerung der Hornhautregeneration zu testen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen in Bezug auf die in diesem Manuskript präsentierten Informationen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium für künstlerische und wissenschaftliche Entwicklung durch die Illinois Wesleyan University an TS unterstützt und teilweise von NIH-R01EY022158 (PL) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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