Summary
Den nåværende protokollen demonstrerer de forskjellige trinnene som er involvert i å skade hornhinnen til en embryonal kylling i ovo. De regenererende eller fullt restaurerte hornhinnene kan analyseres for regenerativt potensial ved hjelp av ulike cellulære og molekylære teknikker etter sårprosedyren.
Abstract
Chick embryonale hornhinne sår viser en bemerkelsesverdig kapasitet til å fullstendig og raskt regenerere, mens voksne sårede hornhinner opplever tap av gjennomsiktighet på grunn av fibrotisk arrdannelse. Vevsintegriteten til skadede embryonale hornhinner er iboende gjenopprettet uten påvisbar arrdannelse. Gitt sin tilgjengelighet og enkle manipulasjon, er kyllingembryoet en ideell modell for å studere arrfri hornhinnesårreparasjon. Denne protokollen demonstrerer de forskjellige trinnene som er involvert i å skade hornhinnen til en embryonal kylling i ovo. Først blir egg windowed på tidlig embryonale aldre for å få tilgang til øyet. For det andre utføres en serie in ovo fysiske manipulasjoner til de ekstraembryoniske membranene for å sikre at tilgangen til øyet opprettholdes gjennom senere utviklingsstadier, tilsvarende når de tre cellulære lagene i hornhinnen dannes. For det tredje er lineære hornhinnesår som trenger inn i det ytre epitellaget og det fremre stroma laget ved hjelp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprosessen eller fullt restaurerte hornhinner kan analyseres for regenerativt potensial ved hjelp av ulike cellulære og molekylære teknikker etter sårprosedyren. Studier til dags dato ved hjelp av denne modellen har vist at sårede embryonale hornhinner viser aktivering av keratocytdifferensiering, gjennomgår koordinert ombygging av ECM-proteiner til deres opprinnelige tredimensjonale makrostruktur, og blir tilstrekkelig re-innervert av hornhinde sensoriske nerver. I fremtiden kan den potensielle effekten av endogene eller eksogene faktorer på den regenerative prosessen analyseres i helbredende hornhinner ved hjelp av utviklingsbiologiske teknikker, for eksempel vevtransplantasjon, elektroporering, retroviral infeksjon eller perleimplantasjon. Den nåværende strategien identifiserer den embryonale kyllingen som et avgjørende eksperimentelt paradigme for å belyse de molekylære og cellulære faktorene som koordinerer arrfri hornhinnenes sårheling.
Introduction
Hornhinnen er det gjennomsiktige, ytre vevet i øyet som overfører og bryter lys som bidrar til synsskarphet. I den voksne hornhinnen fører skade eller infeksjon på hornhinnen til en rask og robust sårhelingsrespons karakterisert ved keratocyttproliferasjon, fibrose, økt betennelse som fører til cytokinindusert apoptose, generering av reparasjonsmyofibroblaster og generell ombygging av den ekstracellulære matriksen (ECM)1,2 . Etter skade resulterer slik reparasjon av hornhinnevev i ugjennomsiktig arrvev som reduserer hornhinnens gjennomsiktighet og okkluderer lysets passasje, og dermed forvrenger synet og i de alvorligste tilfellene fører til hornhindeblindhet3. Dermed er det et klart behov for å utvikle pålitelige dyremodeller for å takle kompleksiteten i sårheling og å identifisere de cellulære og molekylære faktorene som er ansvarlige for sårlukking og vevregenerering.
Til dags dato har de fleste studier som undersøker hornhinnenes sårheling benyttet postnatal4 eller voksne dyremodeller 1,2,5,6,7. Selv om disse studiene har ført til en betydelig fremgang i forståelsen av hornhinnenes sårhelingsrespons og mekanismene som ligger til grunn for arrdannelse, klarer ikke det skadede hornhinnevevet i disse helbredende modellene å regenerere fullt ut, og begrenser dermed deres nytte for å identifisere molekylære faktorer og cellulære mekanismer som er ansvarlige for fullstendig rekapitulering av hornhindemorfologi og struktur etter skade. Derimot har fostersår generert med en kniv i den embryonale kyllinghornhinnen en egen evne til å helbrede fullt ut på en arrfri måte8. Spesielt utviser den embryonale kyllinghornhinnen nonfibrotisk regenerering med fullstendig rekapitulering av den ekstracellulære matriksstrukturen og innerveringsmønstrene 8,9.
Den nåværende protokollen beskriver en sekvens av trinn involvert i å skade hornhinnen til en embryonal kylling i ovo. For det første blir egg vindut i tidlig embryonal alder for å lette tilgangen til embryoet. For det andre utføres en serie in ovo fysiske manipulasjoner til de ekstraembryoniske membranene for å sikre at tilgangen til øyet opprettholdes gjennom senere utviklingsstadier, tilsvarende når de tre cellulære lagene i hornhinnen dannes og sår er ønsket. For det tredje er lineære sentrale hornhinneinnsnitt som trenger gjennom hornhinneepitelet og inn i det fremre stroma laget ved hjelp av en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprosessen eller fullt restaurerte hornhinner kan analyseres for regenerativt potensial ved hjelp av ulike cellulære og molekylære teknikker etter sårprosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Stammen av egg som ble brukt i denne protokollen var White Leghorn, og alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Illinois Wesleyan University.
1. Inkubasjon av kyllingegg
- Hold eggene ved ~10 °C i opptil 1 uke etter at de er lagt for å stoppe utviklingen. Når du er klar til å starte utvikling av kyllingembryo, tørk hele eggeskallet med lofrie våtservietter (se Materialtabell) mettet med romtemperatur vann for å fjerne smuss og rusk.
- Sørg for at eggeskallet er desinfisert. Tørk av hele eggoverflaten med lofrie våtservietter fuktet med 70 % etanol. Tørk raskt av etanolen for å tørke egget og unngå etanolabsorpsjon gjennom eggeskallet til embryoet.
- Ordne eggene horisontalt på et brett. Merk toppen av egget for å betegne embryoets forventede posisjon. Inkuber eggene horisontalt, med gyngefunksjonen aktivert, i en 38 °C fuktet inkubator.
2. Windowing eggene for å forberede seg på membran disseksjon
- Fjern egg fra inkubatoren på den tredje dagen av embryonal utvikling (E3). Steriliser toppen av eggene med lofrie våtservietter fuktet med 70% etanol. Tørk etanolen fra eggeskalloverflatene.
MERK: For å sikre at utviklingen ikke ble forsinket under vindusprosedyren, ble 6-12 egg fjernet, og prosedyren ble raskt utført på disse mens de resterende eggene ble igjen i inkubatoren. - Plasser et egg horisontalt i en sikker eggholder (se Materialtabell). Bruk den skarpe enden av dissekerende saks, lag et lite hull i toppen av eggeskallet nær den spisse enden av egget.
MERK: Dette hullet vil lette fjerningen av albumen, som er nødvendig for å slippe eggeplommen og embryoet bort fra den indre eggeskalloverflaten. For eggholdere ble papirmasse eggfyllerleiligheter, der eggene kommer sendt, brukt. - Gjennom hullet (trinn 2.2) setter du inn en 18 G skråstilt sprøytespiss. Med nålen presset til den nederste indre overflaten av egget og skråsiden av nålen vendt mot den spisse enden av egget (f.eks. vekk fra den forventede plasseringen av eggeplommen og embryoet nær midten av egget), fjern 2-3 ml albumen fra kyllingegget og kast det.
MERK: Hvis en nål hakker embryoet eller dets tilhørende vaskulatur i løpet av dette trinnet, vil det resultere i at blod blir aspirert med albumen. Dette vil resultere i embryodød. Videre, hvis eggeplommen utilsiktet aspireres sammen med albumen i løpet av dette trinnet, vil embryoet ikke være levedyktig. I begge tilfeller skal egget kastes hvis embryoet ikke umiddelbart kan brukes til andre formål. - Rengjør eggeskalloverflaten som omgir hullet med lofrie våtservietter lett fuktet med 70 % etanol og tørk av. Forsegl hullet laget for å fjerne albumen med klar tape.
- Med den skarpe enden av dissekerende saks, lag et nytt "vindu" hull i toppen av eggeskallet på merkestedet (trinn 1.3.). Sørg for at saksen ikke strekker seg for langt inn i eggeskallet for å unngå å kontakte og skade embryoet eller embryonal vaskulatur, som ofte vil bli plassert i egget rett under stedet for det andre hullet.
- Ved hjelp av buede iris tang, utvide "vinduet" hullet til å spenne ~ 2-3 cm i diameter og tjene som et "vindu" til den utviklende embryo under skallet.
- Sett den ene enden av tangen inn i hullet, hold den parallell med og tett sidestilt med eggeskallet. Med den andre tangenden plassert utenfor eggeskallet, klem forsiktig de to tangendene sammen, slik at de kan bryte og fjerne små biter av eggeskallet. Fortsett å bryte og fjerne eggeskallfragmenter til det gjenstår et 2-3 cm vindu som direkte legger over embryoet.
MERK: Egg der embryoer ikke ligger rett under hullet i trinn 2.6. må ikke brukes da de kommende membrandisseksjonene vil være utfordrende å fullføre. Selv med å vippe eggene horisontalt, er ca 10% av eggene ubrukelige på grunn av dårlig plassering av embryoet. Disse embryoene kan brukes til andre formål.
- Sett den ene enden av tangen inn i hullet, hold den parallell med og tett sidestilt med eggeskallet. Med den andre tangenden plassert utenfor eggeskallet, klem forsiktig de to tangendene sammen, slik at de kan bryte og fjerne små biter av eggeskallet. Fortsett å bryte og fjerne eggeskallfragmenter til det gjenstår et 2-3 cm vindu som direkte legger over embryoet.
- For å begrense bakteriell forurensning, tilsett gjennom vindushullet (f.eks. inn i egget) ~ 100-200 μL Ringers løsning (8 g NaCl, 0,37 g KCl og 0,23 g CaCl2,2H 20 per L destillert H20) som inneholder Penicillin / Streptomycin antibiotika (50 U / ml Penicillin og 50 μg / ml Streptomycin, se Materialtabell).
- Forsegl vindushullet med klar tape. Utfør eggforseglingen ved å justere et hjørne av båndet på hullets lange akse og trykke båndet til skallet ~ 1-2 cm fra kanten av hullet.
- Fortsett å forsegle rundt åpningen til en hengende klaff med tape er igjen på den ene siden. Trykk de to tapestykkene sammen, og lag en kuppelformet form over hullet, og trykk klaffen på overhengende tape til skallet for å fullføre forseglingen av egget.
MERK: Egg må åpnes på enten E2 eller E3. I henhold til erfaring resulterer vindu før E2 i lav embryo levedyktighet. Videre, ved E4, blir embryoet og ekstraembryoniske membraner festet til eggeskallet10, og eventuelle forsøk på å vindu på E4 eller senere resulterer ofte i embryoskade eller rive av ekstraembryoniske blodkar, med begge hendelser som fører til utfallet av embryodød.
- Fortsett å forsegle rundt åpningen til en hengende klaff med tape er igjen på den ene siden. Trykk de to tapestykkene sammen, og lag en kuppelformet form over hullet, og trykk klaffen på overhengende tape til skallet for å fullføre forseglingen av egget.
- Returner de "vindute" eggene til inkubatoren for videreutvikling. Sørg for å holde eggene horisontale og slå av inkubatorens gyngefunksjon.
- Gjenta trinn 2.2.-2.9. for hvert egg.
3. Mikrodisseksjoner av de ekstraembryoniske membranene
- Fjern et E5.5-vindusegg fra inkubatoren. Utsett embryoet ved å kutte båndet vekk fra vinduet med sterilisert dissekeringssaks.
- Bruk et dissekeringsmikroskop for å observere embryoet og dets ekstraembryoniske membraner gjennom vinduet. Bruk om nødvendig saks eller buet iris tang for å utvide vinduet slik at embryoet er godt plassert under vinduet, og pass på at du ikke skader den embryonale vaskulaturen.
- Tilsett to dråper Ringers løsning som inneholder Penicillin / Streptomycin antibiotika for å hydrere embryoet og sterilisere egget.
- Bruk et dissekeringsmikroskop for å sikre at embryoet er på riktig utviklingsstadium (Hamburger Hamilton stadium 27, ~ E5.5) 11,12 og finn posisjonene til den amikrooniske membranen (ACM) og den chorioallantoiske membranen (CAM).
MERK: På dette stadiet er embryoet omgitt av ACM, som består av fosterhinnen og den overliggende korionmembranen smeltet og delvis dekket av den høyt vaskulariserte allantoisen, som strekker seg fra embryoets tarmregion og smelter sammen med den overliggende korionen for å danne CAM11,12. ACM er ikke tungt vaskularisert, noe som gjør det mulig å dissekere disse membranene for å eksponere embryoet uten å skade blodårene og skade embryoet. - Utfør ekstraembryoniske membrandisseksjoner på dette stadiet (E5.5).
MERK: E5.5 er det ideelle tidspunktet for å utføre de ekstraembryoniske membrandisseksjonene. Dissekering av membranene tidligere (f.eks. ved E4) før CAM-dannelse reduserer embryotilgjengeligheten i senere stadier11. Videre, ved E5.5, er embryoet bare delvis dekket av den høyt vaskulariserte CAM, men i løpet av de neste 1-2 dagene omslutter CAM raskt og utelukker ytterligere tilgang til embryoet11,12. Av denne grunn er membrandisseksjon ved E6 eller senere utfordrende da risikoen for å rive blodkar øker.- Bruk et par steriliserte fine tang for å forsiktig gripe ACM og trekke den bort fra embryoet. Bruk deretter sterilisert mikrodiskerende saks for å kutte et hull i ACM rett over forbenet som strekker seg fra membranen som ligger over forbenet til membranen som ligger over hodet.
MERK: Dette trinnet slapper av korion- og amnionmembranene, og gjør dem dermed lettere å gripe og dissekere ytterligere med tang i de neste trinnene. Se figur 1 for et nyttig skjema for hvordan membraner dissekeres gjennom eggeskallvinduet.
- Bruk et par steriliserte fine tang for å forsiktig gripe ACM og trekke den bort fra embryoet. Bruk deretter sterilisert mikrodiskerende saks for å kutte et hull i ACM rett over forbenet som strekker seg fra membranen som ligger over forbenet til membranen som ligger over hodet.
- Bruk to par fine, sterile tang for å forsiktig ta tak i amnionen i to tilstøtende posisjoner mellom ACM og CAM (f.eks. et område mellom kuttet som er laget over forbenet og nærmeste kant av CAM).
- Flytt forsiktig hvert par tang, begge fast grep fosterhinnen, bort fra hverandre, med ett par som beveger seg dorsalt til embryoet og det andre ventralt.
MERK: Denne bevegelsen tjener til å rive amnionen ytterligere, samtidig som den skiller ACM (som blir trukket i dorsal retning med hensyn til embryoet med ett par tang) og CAM (som blir trukket i ventral retning med hensyn til embryoet av det andre tangparet). - Sørg for at membranene skilles når CAM ikke lenger dekker embryoet, og den allantoiske arterien og venen, som kommer fra den embryonale tarmen til CAM, er lett synlige.
- Flytt forsiktig hvert par tang, begge fast grep fosterhinnen, bort fra hverandre, med ett par som beveger seg dorsalt til embryoet og det andre ventralt.
- Bruk steriliserte fine tang for å dissekere og fjerne gjenværende amnionmembran som dekker embryoet. Det er oftest observert at gjenværende amnion delvis vil dekke den kaudale halvdelen av embryoet.
- Ved hjelp av steriliserte tang, ta tak i amnion nær den midterste kraniale regionen av embryoet og trekk amnionen forsiktig i en kaudal retning med hensyn til embryoet mot den tidligere fordrevne CAM. Embryoet vil nå være fullt eksponert, og videre vekst av CAM vil hovedsakelig skje vekk fra det utviklende embryoet.
MERK: Se figur 1 for et nyttig skjematisk om hvordan det eksponerte embryoet vil se ut etter membrandisseksjon. Se også en tidligere publisert rapport11 for nyttige skjematiske diagrammer i trinn 3.3.-3.6.
- Ved hjelp av steriliserte tang, ta tak i amnion nær den midterste kraniale regionen av embryoet og trekk amnionen forsiktig i en kaudal retning med hensyn til embryoet mot den tidligere fordrevne CAM. Embryoet vil nå være fullt eksponert, og videre vekst av CAM vil hovedsakelig skje vekk fra det utviklende embryoet.
- Tilsett noen dråper Ringers løsning som inneholder Penicillin / Streptomycin antibiotika for å hydrere embryoet og sterilisere egget.
- Lukk vindushullet på nytt med klar tape, som beskrevet i trinn 2.8. Returner egget til inkubatoren for videre utvikling, hold egget horisontalt og hold inkubatorens gyngefunksjon inaktivert.
- Gjenta trinn 3.1.-3.8. for hvert egg.
MERK: De ekstraembryoniske membrandisseksjonene ved E5.5 beskrevet ovenfor vil muliggjøre tilgang til embryoet gjennom E7, som er når sår kan utføres 8,9. Ved E8 begynner den fortsatte veksten av CAM-vevet å dekke kranialområdet til embryoet, og utelukker dermed ytterligere tilgang til hornhinnen. Hvis man ønsker å utføre sårdannelse i eldre E8-E9 hornhinner, er det mulig å reposisjonere den voksende CAM ventralt med hensyn til embryoet (trinn 3.10.). Hvis man ønsker å såre på E7, trinn 3.10. er ikke nødvendig å utføre, og man kan gå videre til trinn 4, hornhinnenes sår. - Fjern et E7-egg fra inkubatoren hvis ekstraembryoniske membraner tidligere ble dissekert ved E5.5 (trinn 3.1.-3.8).). Ta tak i med steriliserte tanger alle tilgjengelige amnionmembranvev smeltet til CAM og trekk forsiktig amnionmembranen bort fra kranialområdet til embryoet i en ventral retning med hensyn til embryoet.
MERK: Siden den amnioniske membranen som blir forskjøvet bort fra embryoet, er smeltet til CAM, vil den voksende og svært vaskulariserte CAM følge de amnion-gripende tangene og bevege seg bort fra kranialområdet. Gjenta dette trinnet daglig for kontinuerlig å fortrenge CAM bort fra embryoet til embryoet er i ønsket alder for sårdannelse.
4. Hornhinnen sår
- Få et egg fra inkubatoren for såring i ønsket embryonal alder, E7-E9. Utsett embryoet ved å kutte båndet vekk fra vinduet med sterilisert dissekeringssaks. Tilsett noen dråper Ringers løsning som inneholder Penicillin / Streptomycin antibiotika for å hydrere embryoet og sterilisere egget.
- Bruk en mikrodiskerende kniv for å lage et snitt som spenner over omfanget av hornhinnen på høyre øye (på grunn av hvordan embryoet ligger i egget, er venstre øye ikke tilgjengelig, men kan tjene som en ikke-såret kontroll), som er parallell med og i tråd med choroidfissuren (figur 1). Det første kuttet vil krysse hornhinneepitelet.
- Bruk mikrodiskeringskniven til igjen å snøre hornhinnen på samme sted som det første snittet 2x mer (f.eks. tre kutt totalt, med kutt 2 og kutt 3 som forekommer sammen med samme posisjon i hornhinnen som kutt 1) 11. Den andre lacerasjonen vil krysse kjellermembranen, og den tredje vil trenge inn i det fremre stroma.
MERK: Hvis embryoet har bosatt seg under den dissekerte CAM, kan man bruke steriliserte buede iris tang for å forsiktig flytte hodet ut fra under CAM. Plasser de buede iristanglene under hodet, og ta kontakt med venstre side av hodet. Vugge hele hodet på toppen av lukket buet iris tang og forsiktig heve hodet rundt og over CAM. For å hjelpe med levedyktighet, bruk en lignende teknikk med de buede iristangene for å stikke embryoet tilbake under CAM etter operasjonen for å fremme riktig vekst av CAM.
- Bruk mikrodiskeringskniven til igjen å snøre hornhinnen på samme sted som det første snittet 2x mer (f.eks. tre kutt totalt, med kutt 2 og kutt 3 som forekommer sammen med samme posisjon i hornhinnen som kutt 1) 11. Den andre lacerasjonen vil krysse kjellermembranen, og den tredje vil trenge inn i det fremre stroma.
- Tilsett 3-4 dråper Ringers løsning som inneholder Penicillin / Streptomycin antibiotika for å hydrere embryoet og sterilisere egget.
- Lukk vindushullet med klart tape og gå tilbake til inkubatoren, og la egget være horisontalt. La embryoet utvikle seg og hornhinnens sår leges i en ønsket periode (f.eks. 0,5-11 dager), og avliv deretter embryoet humant ved halshugging.
- Bruk buede iris tang for å høste øyet fra et avlivet embryo som flyter i en petriskål av Ringers saltoppløsning ved forsiktig å gripe øyet på den bakre siden, hvor øyet og ansiktsvevet møtes, og forsiktig løfte hele øyet bort og fri fra ansiktsvevet.
- Bruk fin tang til å stikke et lite hull (3-5 cm) på baksiden av hele øyet og fest hele øyet i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C over natten med mild agitasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter tidligere disseksjon av ACM og CAM ved E5.5 for å eksponere kranialområdet til det utviklende embryoet, ble det laget en serie sårskader som spenner over E7 sentrale hornhinnen i ovo (figur 1). Et ideelt sår for å studere hornhinnen regenerering oppstår etter tre lacerations, hver laget på samme sted av hornhinnen. Den første lacerasjonen krysser hornhinneepitelet, mens den andre og tredje lacerasjonen trenger inn i henholdsvis den underliggende kjellermembranen og fremre stroma. For å oppnå et ideelt sår er det avgjørende å bruke en skarp mikrodisseksjonskniv (se materialtabell) og påføre riktig mengde trykk når sårskaden er laget (figur 2, se ideelt sår). For lavt trykk vil resultere i et grunt sår som hornhinneepitelet uten å trenge tilstrekkelig inn i fremre stroma (figur 2, se grunt sår). Likevel, å påføre for mye trykk resulterer i full grad sår som trenger inn i hele stroma og utsetter den vandige humoren for det ytre miljø (figur 2, se full grad sår).
Ved å utføre de riktige sårsnittene får man et ideelt sår (figur 2) som først forstørres (0-3 dager etter såret)8 (figur 3). Det har blitt postulert at fasen av sårforstørrelse som oppstår ved å såre E7 kyllinghornhinner, er relatert til den raske utvidelsen av øyestørrelse på dette embryonalestadiet 8. Embryonale kyllingøyne vokser betydelig raskere fra E4 til E10 sammenlignet med øyeveksten fra E10 til klekking. Disse tidlige raske fasene av øyevekst tilskrives forhøyet intraokulært trykk (IOP) avhengig vekst13. Derfor er det sannsynlig at den raske vekstraten i øyet kombinert med forhøyet IOP fremmer sårretraksjon i de tidlige faser av helbredelsesprosessen (0-3 dager etter sår), noe som er unikt for den embryonale hornhinnenes sårhelingsprogresjon. Deretter oppstår reepitelialisering og ny vevsdannelse (4-9 dager etter sår) for til slutt å lukke såret på en arrfri måte med 11 dager etter sår8 (figur 3A).
Videre analyse av sårdybde og regenerering var mulig ved å farge tverrsnitt med et lamininantistoff som markerer den lamininrike kjellermembranen og motfarging av seksjonene med kjernemarkøren DAPI, som avslører sårets utstrekning gjennomhornhinneepitelet 8. Nylig sårede hornhinner (0 dpw) og de som er tidlig i regenereringsprosessen (3 dpw) viste at såret trengte inn i epitellaget og kjellermembranen, noe som fremgår av innbruddsfargingen av kjernemarkøren DAPI i hornhinneepitelet og fraværet av lamininantistofffarging, som markerer den lamininrike kjellermembranen mellom hornhinneepitelet og underliggende stroma8 (figur 3B ). Tverrsnitt gjennom 11 dpw hornhinner farget med DAPI og lamininantistoff viste imidlertid en fullstendig helbredet hornhinne som hadde blitt reepitelialisert og inneholdt en kontinuerlig lamininrik kjellermembran på stedet for det regenererte såret8 (figur 3B).
Etter hornhinnesnittet ble detaljert karakterisering av sårhelingsprosessen oppnådd ved å utføre immunhistokjemi på seksjonert, såret hornhinnevev. De ekstracellulære matriksproteinene fibronektin og tenascin er assosiert med epitel- og keratocytcellemigrasjon til helbredende voksne hornhinnesår14,15. Spatiotemporal lokalisering av de ekstracellulære matriksproteinene fibronektin og tenascin er tydelig i det tilhelende såret og ble funnet å være forhøyet ved tidspunkter tilsvarende reepitelialisering av hornhinnen (5 dager etter såret)8 (figur 4). Slike analyser antyder betydningen av fibronektin og tenascin for sårlukking og spesielt deres involvering i epitelcellemigrasjon og overlevelse, i samsvar med slike funksjoner i voksne hornhinnesår16,17.
Ved oppstart ved E8-E9 blir hornhinnen tett innervert av trigeminale sensoriske nervefibre som kommer fra en pericorneal nervering og krysser gjennom fremre stroma når de projiserer mot hornhinnens senter og hornhinneepitelet ved E12 18,19,20. Siden hornhinnenesår i denne modellen er laget på E7, kort tid før nerveprojeksjon i hornhinnen, undersøker denne modellen videre hornhinnenervene når de navigerer i en helbredende hornhinne etter fornærmelse. Ved å bruke helmontert immunhistokjemi for å spore hornhinnenerver med anti-β nevrale tubulin (Tuj1) antistoffer21, er det tydelig at nerver midlertidig hemmes fra det helbredende hornhinnevevet som direkte sidestiller den sårede, sentrale hornhinnen (5 dager etter sår)8 (figur 5A, B). Til tross for tidligere inhibering, innerverer hornhinnenervene til slutt det fullstendig helbredede hornhinnevevet (11 dager etter såring) til lignende tetthetsnivåer og i lignende mønstre som stadiummatchede, ikke-sårede kontroller (E18C) (figur 5C, D).
Påfallende, fullstendig reepitelialisert hornhinnevev som har helbredet på en ikke-fibrotisk, arrfri måte, viser en fullstendig rekapitulering av den normale kollagenvevarkitekturen. Som det fremgår av andre generasjons harmonisk avbildning22,23, er bunter av kollagenfibre gjennom varierende dybder av det sentrale hornhinnens sårområde arrangert ortogonalt, som samsvarer med den opprinnelige makrostrukturen til ikke-såret sentralt hornhinnevev 9 (figur 6).
Figur 1 Skjematisk av in ovo ekstraembryoniske membrandisseksjoner og hornhinnenes sår. Ved E5.5 eksponeres kranialområdet til embryoet ved å dissekere ACM- og CAM-membranene og plassere amnion og allantois vekk fra det utviklende øyet. Egg forsegles og inkuberes til E7 når den sentrale hornhinnen er såret, ved hjelp av buede tang som en vugge for embryohodet som spissen av en mikrokirurgisk kniv gjør et snitt i den sentrale hornhinnen. Såret er orientert parallelt med choroid-sprekken (stjernen). For å sikre at dybden av snittet når den fremre stroma, må tre samtidige kutt gjøres med kniven, hver i samme relative posisjon, den ene over den andre. Skala bar = 1 mm. Figuren er tilpasset med tillatelse frareferansene 8,11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Variasjoner i sår generert i ovo. (A) Etter membrandisseksjoner ved E5.5 er høyre øye tilgjengelig i ovo. (B-D) Bilder tatt av et in ovo embryo umiddelbart etter sårdannelser av varierende grad som spenner over hornhinnens utstrekning og er i tråd med choroidfissuren (jf. (B) Etter tre sårskader der svakt trykk ble påført, er et grunt sår synlig. Pilspissen markerer et sted i hornhinnen der epitelet er skåret, men fremre stroma ikke er penetrert. Pilspisser betegner en liten hornhinneregion hvor fremre stroma har blitt penetrert. (C) Etter tre sårskader hvor en ideell mengde trykk ble påført, er et ideelt sår synlig. Pilspisser betegner et sår som spenner over hele omfanget av hornhinnen der den fremre stroma har blitt penetrert. (D) Etter tre sårskader hvor overdreven trykk ble påført, er et sår i full grad synlig, og den vandige humoren har blitt utsatt for det ytre miljø. Forkortelser: tca, temporal ciliary arterie; cf, choroid fissur; CAM, chorioallantoisk membran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Progresjon av sårtilheling. (A) Progresjon av tilheling i såret hornhinne sammenlignet med stadiummatchede kontroller er vist fra sårtidspunktet (0 dpw) og 16 timer etter sår (hrpw) til 3-11 dager etter sår (dpw). Pilspisser avgrenser sårets dorsale og ventrale grenser, noe som indikerer en periode med sårutvidelse (0-3 dpw) etterfulgt av progressiv sårlukking (5-11 dpw). (B) Seksjonerte DAPI (blå) - og laminin (rød) -farget såret hornhinne ved 0, 3 og 11 dpw. Parenteser viser omfanget av den sårede regionen, som avslører sårutvidelse med 3 dpw og full reparasjon av den reepitelialiserte hornhinnen ved E11. Stjerner betegner den helbredede regionen av hornhinnen. Skalaen er (A) 1 mm, (B) 100 μm. Figuren er tilpasset med tillatelse fra referanse8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Histologisk analyse av sårede hornhinner. Tverrsnitt gjennom (A) 3 dpw og (B) 5 dpw. DAPI-fargede (blå) sårede hornhinner avslører lokaliseringen av fibronektin (FN, rød) og Tenascin-C (TN-C, grønn). Parenteser i (A) og (B) betegner det sårede området. Skala bar: 100 μm. Forkortelser: ep, epitel; st, stroma; nb, endotel. Figuren er tilpasset med tillatelse fra referanse8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Innervering av såret hornhinne. (A-D) Visualisering av hornhinnenes nerver etter anti-β nevrale tubulin (Tuj1) helmontert immunsekker i (B) 5 dpw og (D) 11 dpw hornhinner, samt (A) stadium-matchet E12 (E12C, stadium-matchet for 5 dpw) og (C) E18 kontroller (E18C, stadium-matchet for 11 dpw). (B) Den ødelagte linjen i hornhinnen på 5 dpw angir sårets utstrekning. Det brakede området rett ved siden av såret betegner hornhinneområdet som er midlertidig avstøtende for nerver og aktivt gjennomgår reepitelialisering. (B') Optisk skanning gjennom det helbredende hornhinnevevet rett ved siden av det åpne såret avslører en sjelden stromal nervebunt som strekker seg inn i vevet (pil) og epiteliale nervebånd (pilspiss). (C,D) Fullt regenererte hornhinner ved 11 dpw viser lignende innerveringsmønstre og sammenlignbare nervetettheter til scenematchede kontroller. Forkortelse: w, wound. Figuren er tilpasset med tillatelse fra referanse8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kollagen ultrastruktur i helbredede embryonale hornhinner. (A) En ansiktsskanning av fullstendig helbredet 10 dpw hornhinner og trinnmatchede kontroller ved bruk av andre generasjons harmonisk bildebehandling (SGH). Skannedybder varierer fra 2-66 μm fra hornhinnens fremre overflate (0 μm er den mest fremre stroma) og er oppført til venstre for de respektive bildene. Innfelt for hvert bilde tilsvarer Rask Fourier-transformasjonsanalyse av det sentrale sårområdet for den aktuelle skannedybden. (B) Manuelt segmenterte stabler med todimensjonal Fast Fourier-transformasjonsanalyse, som representerer kollagenorganisasjon i den sårede og trinnvise kontrollhornhinnen. Skala bar = 50 μm. Figuren er tilpasset med tillatelse fra referanse9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kyllingen er et ideelt modellsystem for å studere foster, arrfri hornhinne sårreparasjon. I motsetning til pattedyr er kyllingen lett tilgjengelig gjennom hele utviklingen ved hjelp av ovo8 eller ex ovo strategier24. Den embryonale kyllinghornhinnen er mye større enn gnagere hornhinner, med nesten 50% av kranialvolumet dedikert til øyet25, noe som gjør det svært mottagelig for fysiske manipulasjoner som sår. Videre er kyllingegg lett tilgjengelig året rundt, ofte fra lokale gårder, og kostnadseffektive, og krever bare en ydmyket inkubator for å støtte utviklingen.
Denne protokollen rapporterer en rekke prosedyrer som muliggjør embryonal kylling hornhinnen sår. Sår laget til den embryonale kyllinghornhinnen regenererer fullstendig, noe som muliggjør en fullstendig rekapitulering av den opprinnelige hornhinnestrukturen uten påvisbar arrdannelse. Denne teknikken har gjort den embryonale kyllingen til en viktig dyremodell for å belyse de molekylære og cellulære faktorene som koordinerer arrfri hornhinnenes sårheling.
Til tross for det klare løftet som ligger i fostersårhelingsmodellen beskrevet her, er det verdt å merke seg at det er klare forskjeller mellom foster og voksen hornhinne sårheling. Den embryonale hornhinnen uttrykker vekstfaktorer og morfogenetiske signaler som er stille eller fraværende i voksent vev26. Videre viser såret voksent hornhinnevev fibrose og danner arrvev, sannsynligvis på grunn av økt inflammatorisk respons mediert av cytokiner og vekstfaktorer27, som er dempet eller ennå ikke etablert i embryonale stadier. Slike aldersrelaterte forskjeller i hornhinnevevet kan komplisere arbeidet med å gjenopprette voksent såret vev fullt ut. Likevel vil bestemmelse av viktige molekylære faktorer og matriksproteiner som regulerer fosterets arrfrie sårheling bane vei for terapier som fremmer en mer restorativ helbredelsesprosess med mindre arrdannelse og bedre rekapitulering av den normale vevsarkitekturen.
Sårmetoden som er beskrevet her, bygger på en teknikk som først ble utviklet av Spurlin et al.11 for å få tilgang til kyllingembryoer i sen fase (f.eks. >E6). Ved å vindu egget og dissekere ekstraembryoniske membraner vekk fra kranialområdet, er det embryonale øyet tilgjengelig for stadier så sent som E7. Som vi tidligere har rapportert, påvirker fjerning og forskyvning av henholdsvis amniochorionic og chorioallantoic membraner ikke embryonal utvikling11. Eksponerte embryoer er levedyktige og er lett mottagelige for fysisk manipulasjon. På dette stadiet har hornhinnen tre forskjellige lag (epitel, stroma og endotel), noe som gjør den egnet for sårhelingsstudier etter lineær snitt i fremre stroma. Det skal bemerkes at på grunn av økende allantoisvekst over tid, blir tilgangen til øyet til slutt okkludert ved E8. For å omgå dette problemet, hvis tilgang til senere stadium øyne for sår er ønskelig, har vi funnet ut at tilgang til øyet kan opprettholdes gjennom E9 ved å utføre daglig manipulering av de ekstraembryoniske membranene (f.eks. Ved E7, E8, etc.), hvor allantoisen forsiktig flyttes bort fra kranialområdet for å sikre at veksten skjer retningsbestemt bort fra embryoet. Dette gjør at hornhinner kan bli såret på disse senere stadiene (f.eks. Etter innervering).
Samlet sett er embryoets levedyktighet og overlevelsesevne i denne teknikken avhengig av flere faktorer, for eksempel å sikre at et sterilt og hydrert eggmiljø opprettholdes, samtidig som man tar forsiktighet for ikke å forårsake skade på embryonale blodkar eller allantois. Hele eggoverflaten skal steriliseres med etanol før vindu for å opprettholde steriliteten. Dette skyldes at små eggeskallfragmenter, som ofte er lastet med mikrober, vanligvis vil falle inn i egget under vindusprosedyren. På samme måte må alle verktøy som er involvert i vindu, membrandisseksjoner og fremstilling av hornhinneinnsnittet skylles grundig i etanol og tørkes eller flammesteriliseres før bruk. Videre bør antibiotika tilsettes egget når som helst embryoet blir utsatt for det ytre miljøet. Det er videre kritisk at embryoet beholder riktig hydrering etter vindu. Det må utvises stor forsiktighet for å sikre at vinduet er helt forseglet med tape og at det ikke er noen luftspalter igjen. Gitt viktigheten av at båndet forblir helt festet til eggeskalloverflaten og forsegler hullet helt, må eggeskalloverflaten rundt hullet rengjøres og tørkes før tapen påføres. Til slutt er det viktig at ingen blodkar utilsiktet kuttes, og at allantois, som lagrer flytende avfall fra embryoet, ikke blir skadet under disseksjonen av de ekstraembryoniske membranene, da begge er dødelige for embryoet. Det skal bemerkes at embryoets levedyktighet er høyere når mindre tårer til korion og amnion er laget, selv om tåren må være tilstrekkelig stor til å plassere de ekstraembryoniske membranene vekk fra kranialområdet. Hvis disse forsiktige trinnene tas under disseksjon og fjerning av membraner fra egg av høy kvalitet, kan man forvente at nesten alle embryoene overlever vindusprosedyren (~ 99%), mens ~ 40% av de eksponerte embryoene overlever til E9 og ~ 30% til E1211. Etter vår erfaring har såring av hornhinnene til E7-E9 membrandiskerte embryoer liten innvirkning på embryoets levedyktighet, og rikelig med embryoer forblir levedyktige gjennom E18, da hornhinnesåret er fullstendig helbredet.
Å oppnå sår som krysser hornhinneepitelet og trenger inn i fremre stroma er avgjørende for å produsere pålitelige og reproduserbare resultater. En mikrodiskeringskniv av høy kvalitet er nødvendig, slik at svært lite trykk må påføres. Ved hjelp av et par buede iris tang kan være nyttig å forsiktig vugge hodet som laceration er laget med den andre hånden. På denne måten tjener de buede iristangene som en backstop slik at hornhinnen forblir stasjonær under såret. Inntrengningen av såret i stroma er variabel, spesielt når du lærer, men blir mer reproduserbar ettersom forskeren lærer følelsen og utseendet til å bryte hornhinneepitelet. Som man lærer, kan det være nyttig å se sårede hornhinner i tverrsnitt slik at dybden av sårinntrengning i hornhinnen stroma kan vurderes (se figur 3B for et eksempel på en tverrsnitt hornhinne som viser ideell sårdybde umiddelbart etter hornhindeskader).
Når det kombineres med klassiske utviklingsbiologiske teknikker, som vevtransplantasjon og perleimplantasjon, eller moderne tilnærminger for genmanipulering, som DNA-elektroporering og retroviral infeksjon, lover denne dyremodellen for hornhinneregenerering å avsløre molekylære faktorer og cellulære mekanismer som er nødvendige for å oppnå fullstendig gjenoppretting av hornhinnen vev etter skade. Videre kan denne dyremodellen brukes til å teste den potensielle nytten av eksogene terapeutiske forbindelser for å øke hornhinnen regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser med hensyn til informasjonen som presenteres i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et kunstnerisk og vitenskapelig utviklingsstipend gjennom Illinois Wesleyan University til TS og finansiert delvis av NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird's eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
