Summary
본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.
Abstract
병아리 배아 각막 상처는 완전하고 신속하게 재생하는 놀라운 능력을 나타내는 반면, 성인 상처 각막은 섬유성 흉터로 인해 투명성 상실을 경험합니다. 손상된 배아 각막의 조직 무결성은 검출 가능한 흉터 형성없이 본질적으로 회복됩니다. 접근성과 조작의 용이성을 감안할 때, 병아리 배아는 흉터가없는 각막 상처 복구를 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 계란은 초기 배아 나이에 눈에 접근하기 위해 창문을 만듭니다. 둘째, 각막의 세 세포층이 형성되는 경우에 해당하는 발달의 후기 단계를 통해 눈에 대한 접근이 유지되도록 보장하기 위해 일련의 난 소 내 물리적 조작이 수행됩니다. 셋째, 외부 상피층과 전방 스트로마를 관통하는 선형 각막 상처는 미세 외과 용 나이프를 사용하여 만들어집니다. 재생 과정 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있다. 이 모델을 사용한 지금까지의 연구에 따르면 상처 입은 배아 각막은 각질세포 분화의 활성화를 나타내며, ECM 단백질을 본래의 입체 거대 구조로 조율 리모델링하고, 각막 감각 신경에 의해 적절하게 재 신경을 과민 반응시키는 것으로 나타났습니다. 미래에는 재생 과정에 대한 내인성 또는 외인성 요인의 잠재적 인 영향을 조직 이식, 전기 천공, 레트로 바이러스 감염 또는 비드 이식과 같은 발달 생물학 기술을 사용하여 각막 치유에서 분석 할 수 있습니다. 현재의 전략은 배아 병아리를 흉터가없는 각막 상처 치유를 조정하는 분자 및 세포 인자를 해명하기위한 중요한 실험 패러다임으로 식별합니다.
Introduction
각막은 시력에 도움이되는 빛을 전달하고 굴절시키는 눈의 투명하고 가장 바깥 쪽 조직입니다. 성인 각막에서, 각막 기질에 대한 손상 또는 감염은 각질세포 증식, 섬유증, 사이토카인-유도된 아폽토시스로 이어지는 염증 증가, 수복 근섬유아세포의 생성, 및 세포외 기질(ECM)의 전반적인 리모델링을 특징으로 하는 신속하고 강력한 상처 치유 반응을 유도한다1,2 . 손상 후, 이러한 각막 조직 복구는 각막 투명성을 감소시키고 빛의 통과를 방해하는 불투명 한 흉터 조직을 초래하여 시력을 왜곡시키고 가장 심한 경우에는 각막 실명으로 이어진다3. 따라서, 상처 치유의 복잡성을 해결하고 상처 폐쇄 및 조직 재생을 담당하는 세포 및 분자 인자를 확인하기 위해 신뢰할 수 있는 동물 모델을 개발할 필요가 분명히 있다.
현재까지 각 막 상처 치유를 조사하는 대부분의 연구는 출생 후4 또는 성인 동물 모델1,2,5,6,7을 활용했습니다. 이러한 연구들이 각막 상처 치유 반응과 흉터 형성의 근간이 되는 메커니즘에 대한 이해에 상당한 발전을 가져왔지만, 이러한 치유 모델에서 손상된 각막 조직은 완전히 재생되지 못하고, 따라서 각막 형태학 및 손상 후 구조를 완전히 되풀이하는 분자 인자 및 세포 메커니즘을 확인하는 데 그 유용성을 제한한다. 대조적으로, 배아 병아리 각막에서 칼로 생성된 태아 상처는 흉터가 없는 방식으로 완전히 치유될 수 있는 내재적 능력을 가지고 있다8. 구체적으로, 배아 병아리 각막은 세포외 기질 구조 및 신경 과민 패턴 8,9의 완전한 재회고와 함께 비섬유성 재생을 나타낸다.
본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 데 관련된 일련의 단계를 기술한다. 첫째, 난자는 배아에 쉽게 접근 할 수 있도록 초기 배아 시대에 창문이 있습니다. 둘째, 각막의 세 세포층이 형성되고 상처가 필요할 때 상응하는 발달의 후기 단계를 통해 눈에 대한 접근이 유지되도록하기 위해 배아 외 막에 대한 일련의 물리적 조작이 수행됩니다. 셋째, 각막 상피를 관통하고 전방 스트로마로 침투하는 선형 중앙 각막 절개는 미세 외과 용 나이프를 사용하여 만들어집니다. 재생 과정 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용 된 계란의 균주는 White Leghorn이었으며 모든 동물 절차는 일리노이 웨슬리안 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 병아리 알의 부화
- 발달을 멈추기 위해 알을 낳은 후 최대 1 주 동안 ~ 10 °C에서 유지하십시오. 병아리 배아 발달을 시작할 준비가되면 상온의 물로 포화 된 보풀이없는 물티슈 ( 재료 표 참조)로 달걀 껍질 전체를 닦아 먼지와 파편을 제거하십시오.
- 달걀 껍질이 소독되었는지 확인하십시오. 70 % 에탄올로 적신 보풀이없는 물티슈로 계란 표면 전체를 닦으십시오. 에탄올을 빨리 닦아 난자를 말리고 달걀 껍질을 통해 배아에 에탄올 흡수를 피하십시오.
- 쟁반에 수평으로 달걀을 배열하십시오. 배아의 예상 위치를 나타내기 위해 난자의 상단을 표시하십시오. 38°C 가습 인큐베이터에서 흔들기 기능이 활성화된 상태에서 알을 수평으로 인큐베이션한다.
2. 막 해부를 준비하기 위해 계란을 창으로 씌우기
- 배아 발달 3 일째 (E3)에 인큐베이터에서 알을 제거하십시오. 70 % 에탄올로 적신 보풀이없는 물티슈로 계란 상단을 살균하십시오. 달걀 껍질 표면에서 에탄올을 말리십시오.
참고 : 창 만들기 절차 중에 개발이 지연되지 않도록하기 위해 6-12 개의 알을 제거하고 나머지 알을 인큐베이터에 남겨 두는 동안 절차를 신속하게 수행했습니다. - 안전한 달걀 홀더에 달걀을 수평으로 놓습니다 ( 재료 표 참조). 해부 가위의 날카로운 끝을 사용하여 달걀의 뾰족한 끝 근처의 달걀 껍질 꼭대기에 작은 구멍을 만듭니다.
참고 :이 구멍은 알부민의 제거를 용이하게하며, 이는 노른자와 배아를 내부 달걀 껍질 표면에서 떨어 뜨리는 데 필요합니다. 계란 홀더의 경우, 계란이 배송되는 종이 펄프 달걀 필러 플랫이 사용되었습니다. - 구멍을 통해 (단계 2.2.), 경사진 피하 바늘 18 G를 삽입한다. 바늘을 난자의 밑바닥 내부 표면과 바늘의 베벨 쪽이 계란의 뾰족한 끝을 향하게되면 (예 : 난황과 난자의 중간 근처의 배아의 예상 위치로부터 멀리 떨어져) 닭 알에서 2-3 mL의 알부민을 제거하고 버립니다.
참고 :이 단계에서 바늘이 배아 또는 관련 혈관 구조를 닉닉하면 혈액이 알부민으로 흡입됩니다. 이것은 배아 사망을 초래할 것입니다. 또한,이 단계에서 노른자가 실수로 알부민과 함께 흡인되면 배아는 생존 할 수 없습니다. 두 경우 모두 배아를 다른 목적으로 즉시 사용할 수없는 경우 난자를 폐기해야합니다. - 보풀이 없는 물티슈로 구멍을 둘러싸고 있는 달걀 껍질 표면을 70% 에탄올로 가볍게 적신 후 닦아내십시오. 알부민을 제거하기 위해 만들어진 구멍을 투명한 테이프로 밀봉하십시오.
- 가위를 해부하는 날카로운 끝으로 마킹 부위의 달걀 껍질 상단에 두 번째 "창"구멍을 만듭니다 (1.3 단계). 가위가 달걀 껍질까지 너무 멀리 확장되어 배아 또는 배아 혈관 조직이 접촉하고 손상되지 않도록하십시오.이 혈관은 종종 두 번째 구멍 부위 바로 아래의 난자 내에 위치합니다.
- 곡선 홍채 집무를 사용하여 직경 ~ 2-3cm에 걸쳐 "창"구멍을 넓히고 껍질 아래의 발달중인 배아에 "창"역할을합니다.
- 포셉의 한쪽 끝을 구멍에 삽입하여 달걀 껍질과 평행하고 밀접하게 병치시킵니다. 달걀 껍질 바깥쪽에 다른 포셉 끝이 놓인 상태에서 두 포셉 끝을 조심스럽게 꼬집어 달걀 껍질의 작은 조각을 부수고 제거 할 수 있습니다. 배아를 직접 오버레이하는 2-3cm 창이 남을 때까지 달걀 껍질 조각을 계속 부수고 제거하십시오.
참고: 배아가 2.6단계에서 만든 구멍 바로 아래에 놓이지 않는 알. 다가오는 막 해부가 완료하기가 어려울 것이므로 사용해서는 안됩니다. 알을 수평으로 흔들더라도 배아의 위치가 좋지 않아 계란의 약 10 %를 사용할 수 없습니다. 이 배아는 다른 목적으로 사용될 수 있습니다.
- 포셉의 한쪽 끝을 구멍에 삽입하여 달걀 껍질과 평행하고 밀접하게 병치시킵니다. 달걀 껍질 바깥쪽에 다른 포셉 끝이 놓인 상태에서 두 포셉 끝을 조심스럽게 꼬집어 달걀 껍질의 작은 조각을 부수고 제거 할 수 있습니다. 배아를 직접 오버레이하는 2-3cm 창이 남을 때까지 달걀 껍질 조각을 계속 부수고 제거하십시오.
- 박테리아 오염을 제한하려면 페니실린/스트렙토마이신 항생제(페니실린 50U/mL, 스트렙토마이신 50μg/mL)가 들어있는 링거 용액(NaCl 8g, KCl 0.37g, 증류 H20 L 당CaCl2.2H200 0.23g)을 창 구멍을 통해 (예를 들어, 달걀에 넣음) 첨가하십시오. 자료 표 참조).
- 투명 접착 테이프를 사용하여 창 구멍을 밀봉하십시오. 테이프의 모서리를 구멍의 긴 축에 맞추고 테이프를 구멍의 가장자리에서 ~ 1-2cm 떨어진 쉘에 눌러 계란 밀봉을 수행하십시오.
- 매달린 테이프 플랩이 한쪽에 남을 때까지 개구부 주위를 밀봉을 계속하십시오. 두 개의 테이프를 함께 눌러 구멍 위에 돔형 모양을 만들고 껍질에 돌출 된 테이프의 플랩을 눌러 계란 밀봉을 마칩니다.
참고 : 계란은 E2 또는 E3에서 창을 만들어야합니다. 경험에 따르면, E2 이전의 윈도잉은 배아 생존력을 낮춘다. 더욱이, E4에 의해, 배아 및 배아 외막은 달걀 껍질10에 부착되고, E4 또는 그 이후에 창으로 시도하려는 시도는 종종 배아 손상 또는 배아 외 혈관의 찢어짐을 초래하며, 어느 한 사건이 배아 사망의 결과로 이어진다.
- 매달린 테이프 플랩이 한쪽에 남을 때까지 개구부 주위를 밀봉을 계속하십시오. 두 개의 테이프를 함께 눌러 구멍 위에 돔형 모양을 만들고 껍질에 돌출 된 테이프의 플랩을 눌러 계란 밀봉을 마칩니다.
- 추가 개발을 위해 "창문이있는"알을 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 계란을 수평으로 유지하고 인큐베이터의 흔들림 기능을 끄십시오.
- 2.2.-2.9단계를 반복합니다. 각 달걀에 대해.
3. 배아외 막의 미세 해부
- 인큐베이터에서 E5.5 창문이있는 달걀을 제거하십시오. 멸균 된 해부 가위로 창문에서 테이프를 잘라 배아를 노출시킵니다.
- 해부 현미경을 사용하여 창을 통해 배아와 배아 외막을 관찰하십시오. 필요한 경우 가위 또는 곡선 홍채 포셉을 사용하여 창을 넓혀 배아가 창 아래에 잘 배치되도록 배아 혈관 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 두 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
- 해부 현미경을 사용하여 배아가 적절한 발달 단계 (햄버거 해밀턴 단계 27, ~ E5.5)11,12에 있는지 확인하고 양수 이온막 (ACM)과 chorioallantoic 막 (CAM)의 위치를 찾습니다.
참고 :이 단계에서 배아는 양막과 융모 성 막이 융합되고 부분적으로 배아의 장 영역에서 연장되고 오버레이 chorion과 융합되어 CAM11,12를 형성하는 고혈관화 된 알란토이스로 덮인 ACM으로 둘러싸여 있습니다. ACM은 심하게 혈관화되지 않으므로 혈관을 손상시키지 않고 배아를 손상시키지 않고 배아를 노출시키기 위해이 막을 해부 할 수 있습니다. - 이 단계에서 배아외 막 해부를 수행합니다 (E5.5).
참고 : E5.5는 배아 외 막 해부를 수행하기에 이상적인 시간입니다. CAM 형성 전에 막을 더 일찍 해부(예를 들어, E4에서)하는 것은 후기 단계11에서 배아 접근성을 감소시킨다. 더욱이, E5.5에서, 배아는 고도로 혈관화된 CAM에 의해 부분적으로만 커버되지만, 다음 1-2일 동안, CAM은 배아11,12에 대한 더 이상의 접근을 빠르게 감싸고 배제한다. 이러한 이유로 E6 이상에서의 막 해부는 혈관이 찢어질 위험이 증가함에 따라 어렵습니다.- 한 쌍의 멸균 된 미세 포셉을 사용하여 ACM을 부드럽게 잡고 배아에서 떼어냅니다. 그런 다음 멸균 된 마이크로 해부 가위를 사용하여 앞다리 바로 위의 ACM에 구멍을 뚫어 앞다리가 덮인 막에서 머리 위에 놓인 막까지 뻗어 있습니다.
참고: 이 단계는 chorion 및 양막이 이완되어 다음 단계에서 포셉으로 쉽게 잡고 해부할 수 있도록 합니다. 달걀 껍질 창을 통해 멤브레인이 어떻게 해부되는지에 대한 유용한 개략도는 그림 1 을 참조하십시오.
- 한 쌍의 멸균 된 미세 포셉을 사용하여 ACM을 부드럽게 잡고 배아에서 떼어냅니다. 그런 다음 멸균 된 마이크로 해부 가위를 사용하여 앞다리 바로 위의 ACM에 구멍을 뚫어 앞다리가 덮인 막에서 머리 위에 놓인 막까지 뻗어 있습니다.
- 두 쌍의 미세한 멸균 포셉을 사용하여 ACM과 CAM 사이의 두 개의 인접한 위치(예를 들어, 앞다리 위에 만들어진 절단과 CAM의 가장 가까운 가장자리 사이의 영역)에서 양수를 부드럽게 잡으십시오.
- 조심스럽게 양막을 단단히 잡고, 양막을 단단히 잡고, 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 심실로 움직입니다.
참고 :이 운동은 ACM (한 쌍의 포셉에 의해 배아에 대해 등쪽 방향으로 당겨짐)과 CAM (다른 한 쌍의 포셉에 의해 배아에 대해 복부 방향으로 당겨짐)을 분리하면서 양수를 더 찢는 역할을합니다. - CAM이 더 이상 배아를 덮지 않을 때 막이 분리되고 배아 내장에서 CAM으로 방출되는 알란토 동맥과 정맥이 쉽게 드러납니다.
- 조심스럽게 양막을 단단히 잡고, 양막을 단단히 잡고, 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 배아로, 다른 한 쌍은 심실로 움직입니다.
- 멸균 된 미세 포셉을 사용하여 배아를 덮고있는 남아있는 양막을 해부하고 제거하십시오. 나머지 양수가 배아의 꼬리 절반을 부분적으로 덮을 것이라는 것이 가장 일반적으로 관찰됩니다.
- 멸균 된 포셉을 사용하여 배아의 중간 두개골 영역 근처의 양수를 잡고 배아에 대해 꼬리 방향으로 양수를 조심스럽게 당겨 초기 변위 CAM쪽으로 당깁니다. 배아는 이제 완전히 노출 될 것이며, CAM의 추가 성장은 주로 발달중인 배아에서 멀리 떨어져서 발생할 것입니다.
참고 : 노출 된 배아가 막 해부 후 어떻게 나타나는지에 대한 유용한 개략도는 그림 1 을 참조하십시오. 또한 3.3.-3.6단계의 유용한 개략도에 대해서는 이전에 게시된 보고서11 을 참조하십시오.
- 멸균 된 포셉을 사용하여 배아의 중간 두개골 영역 근처의 양수를 잡고 배아에 대해 꼬리 방향으로 양수를 조심스럽게 당겨 초기 변위 CAM쪽으로 당깁니다. 배아는 이제 완전히 노출 될 것이며, CAM의 추가 성장은 주로 발달중인 배아에서 멀리 떨어져서 발생할 것입니다.
- 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 몇 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
- 2.8단계에서 설명한 대로 투명 테이프를 사용하여 창 구멍을 다시 밀봉합니다. 추가 개발을 위해 달걀을 인큐베이터로 돌려 보내고, 달걀을 수평으로 유지하고 인큐베이터의 흔들림 기능을 비활성화하십시오.
- 3.1.-3.8단계를 반복합니다. 각 달걀에 대해.
참고 : 위에서 설명한 E5.5에서 배아외 막 해부는 E7을 통해 배아에 접근 할 수있게 해주 며, 이는 상처가 8,9 일 때 수행 될 수 있습니다. E8에 의해, CAM 조직의 지속적인 성장은 배아의 두개골 영역을 덮기 시작하여, 각막에 대한 더 이상의 접근을 배제한다. 오래된 E8-E9 각막에서 상처를 수행하고자 하는 경우, 성장하는 CAM을 배아에 대하여 심실로 재배치할 수 있다(단계 3.10.). E7에서 상처를 입으려면 3.10 단계를 수행하십시오. 를 수행할 필요는 없으며 각막 상처 단계 4로 진행할 수도 있다. - E5.5에서 이전에 배아외 막이 해부된 인큐베이터에서 E7 난자를 제거한다(단계 3.1.-3.8.). CAM에 융합된 사용 가능한 양막 조직을 멸균된 포셉으로 잡고 배아에 대하여 배아의 두개골 영역에서 양막의 양을 부드럽게 당겨 배아에 대하여 복부 방향으로 떼어낸다.
참고 : 배아에서 멀리 옮겨지는 양이온 막이 CAM에 융합되기 때문에 성장하고 고도로 혈관화 된 CAM은 양이온 포셉을 따라 두개골 영역에서 멀어집니다. 이 단계를 매일 반복하여 배아가 상처에 원하는 나이가 될 때까지 CAM을 배아에서 계속 대체하십시오.
4. 각막 상처
- 원하는 배아 연령, E7-E9에서 상처를 입히기 위한 인큐베이터로부터 난자를 얻는다. 멸균 된 해부 가위로 창문에서 테이프를 잘라 배아를 노출시킵니다. 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 몇 방울을 추가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
- 마이크로 해부 칼을 사용하여 오른쪽 눈의 각막의 정도에 걸친 절개를 만듭니다 (배아가 난자에 누워있는 방식 때문에 왼쪽 눈은 접근 할 수 없지만 상처가없는 대조군으로 작용할 수 있음), 맥락막 균열과 평행하고 일치합니다 (그림 1). 첫 번째 절단은 각막 상피를 횡단합니다.
- 마이크로 해부 나이프를 사용하여 첫 번째 절개와 동일한 지점에서 각막을 다시 2 배 더 레이스 시키십시오 (예를 들어, 절단 2 및 절단 3이 각막에서 동일한 위치와 함께 발생하는 총 3 컷 1)11. 두 번째 열상은 지하실 막을 가로 지르고 세 번째 열상은 전방 스트로마를 관통합니다.
참고 : 배아가 해부 된 CAM에 정착 한 경우 멸균 된 곡선 홍채 포셉을 사용하여 머리를 CAM 아래에서 조심스럽게 움직일 수 있습니다. 구부러진 아이리스 포셉을 머리 아래에 위치시켜 머리 왼쪽과 접촉시킵니다. 닫힌 곡선 아이리스 포셉 위에 머리 전체를 크래들링하고 CAM 주위와 위에서 머리를 부드럽게 들어 올립니다. 생존력을 돕기 위해 곡선 홍채 포셉과 유사한 기술을 사용하여 CAM의 적절한 성장을 촉진하기 위해 수술 후 배아를 CAM 아래에 다시 집어 넣으십시오.
- 마이크로 해부 나이프를 사용하여 첫 번째 절개와 동일한 지점에서 각막을 다시 2 배 더 레이스 시키십시오 (예를 들어, 절단 2 및 절단 3이 각막에서 동일한 위치와 함께 발생하는 총 3 컷 1)11. 두 번째 열상은 지하실 막을 가로 지르고 세 번째 열상은 전방 스트로마를 관통합니다.
- 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제가 들어있는 링거 용액 3-4 방울을 첨가하여 배아에 수분을 공급하고 난자를 살균하십시오.
- 투명 테이프로 창문 구멍을 다시 밀봉하고 인큐베이터로 돌아가서 계란을 수평으로 남겨 둡니다. 배아가 발달하고 각막 상처가 원하는 기간 (예 : 0.5-11 일) 동안 치유되도록 허용 한 다음 감금에 의해 배아를 인간적으로 안락사시킵니다.
- 구부러진 홍채 포셉을 사용하여 눈과 얼굴 조직이 만나는 후방의 눈을 부드럽게 잡고 조심스럽게 눈 전체를 들어 올려 얼굴 조직에서 벗어나 Ringer의 식염수 인 페트리 접시에 떠있는 안락사 된 배아에서 눈을 수확하십시오.
- 미세한 포셉을 사용하여 전체 눈 뒤쪽의 작은 구멍 (3-5cm)을 찌르고 가벼운 교반으로 밤새 4 °C에서 4 % 파라 포름 알데히드에 전체 눈을 고정시킵니다.
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Representative Results
발달중인 배아의 두개골 영역을 노출시키기 위해 E5.5에서 ACM과 CAM을 일찍 해부한 후, E7 중앙 각막에 걸친 일련의 열상이 ovo에서 이루어졌습니다 (그림 1). 각막 재생을 연구하는 이상적인 상처는 각막의 동일한 위치에서 만들어진 세 개의 열상 후에 발생합니다. 첫 번째 열상은 각막 상피를 횡단하는 반면, 두 번째 및 세 번째 열상은 각각 기저 기저막과 전방 스트로마를 관통합니다. 이상적인 상처를 얻으려면 날카로운 마이크로 해부 나이프 ( 재료 표 참조)를 사용하고 열상이 이루어질 때 정확한 양의 압력을 가하는 것이 중요합니다 (그림 2, 이상적인 상처 참조). 너무 적은 압력을 가하면 전방 스트로마를 충분히 관통하지 않고 각막 상피를 찢는 얕은 상처가 생깁니다 (그림 2, 얕은 상처 참조). 그러나 너무 많은 압력을 가하면 전체 스트로마에 침투하여 수성 유머가 외부 환경에 노출되는 상처가 발생합니다 (그림 2, 전체 상처 참조).
적절한 레이스 절개를 수행하면 처음에는 확대되는 이상적인 상처(그림 2)가 생성됩니다(상처 후 0-3일)8(그림 3). E7 닭 각막을 상처 입음으로써 발생하는 상처 확대 단계는이 배아단계 8에서 눈 크기의 급속한 확장과 관련이 있다고 가정되었습니다. 배아 닭 눈은 E10에서 부화까지의 눈 성장에 비해 E4에서 E10까지 훨씬 빠른 속도로 자랍니다. 안구 성장의 이러한 초기 급속한 단계는 상승된 안압(IOP)-의존적 성장(13)에 기인한다. 따라서, 상승된 IOP와 결합된 안구의 빠른 성장 속도는 배아 각막 상처 치유 진행에 고유한 치유 과정의 초기 단계(상처 후 0-3일) 동안 상처 수축을 촉진할 가능성이 있다. 그 후, 재상피화 및 새로운 조직 형성이 일어나고(상처 후 4-9일) 궁극적으로 상처 후8일 후 11일까지 흉터가 없는 방식으로 상처를 닫는다(도 3A).
상처 깊이 및 재생의 추가 분석은 라미닌이 풍부한 기저막을 표시하는 라미닌 항체로 단면을 염색하고 절편을 핵 마커 DAPI로 역염색함으로써 가능했으며, 이는 각막 상피를 통한 상처의 정도를 밝혀냅니다8. 최근에 상처 입은 각막 (0 dpw)과 재생 과정 초기에 있던 것들 (3 dpw)은 각막 상피 내의 핵 마커 DAPI의 브레이크 인 염색과 라미닌 항체 염색의 부재에 의해 입증 된 바와 같이 상처가 상피층과 기저막을 관통하는 것으로 나타났습니다 (도 3B 이는 각막 상피와 기저 스트로마8 사이의 라미닌이 풍부한 기저막을 표시합니다 (도 3B ). 그러나, DAPI 및 라미닌 항체로 염색된 11 dpw 각막을 통한 단면은 재상피화되고 재생된 상처부위 에 연속적인 라미닌이 풍부한 기저막을 함유한 완전히 치유된 각막을 밝혀냈다(도 3B).
각막 절개 후, 상처 치유 과정의 상세한 특성화는 절편화되고 상처 입은 각막 조직에 대한 면역 조직 화학을 수행함으로써 달성되었다. 세포외 매트릭스 단백질 피브로넥틴 및 테나신은 치유성인 각막 상처14,15로의 상피 및 각질세포 세포 이동과 관련된다. 세포외 매트릭스 단백질, 피브로넥틴 및 테나신의 시공간 국소화는 치유 상처 내에서 명백하고, 각막 재상피화(상처 후 5일)에 상응하는 시점에서 상승되는 것으로 밝혀졌다(도 4). 이러한 분석은 상처 폐쇄에 대한 피브로넥틴 및 테나신의 중요성, 특히 상피 세포 이동 및 생존에 대한 이들의 관여를 시사하며, 이는 성인 각막 상처에서의 이러한 기능과 일치한다16,17.
E8-E9에서 시작하여, 각막은 각막 주위 신경 고리에서 방출되는 삼차 감각 신경 섬유에 의해 조밀하게 신경을 공급받으며 E12 18,19,20에 의해 각막의 중심과 각막 상피를 향해 투사되면서 전방 스트로마를 통과합니다. 이 모델의 각막 상처는 각막으로 신경이 투사되기 직전에 E7에서 만들어지기 때문에이 모델은 모욕 후 치유 각막을 탐색 할 때 각막 신경을 추가로 조사합니다. 항β 신경 튜불린 (Tuj1) 항체21로 각막 신경을 추적하기 위해 전체 탑재 면역 조직화학을 사용함으로써, 신경이 상처 입은 중추 각막 (상처 후 5 일)8 (도 5A, B)을 직접 병치시키는 치유 각막 조직으로부터 일시적으로 억제된다는 것이 명백하다. 이전의 억제에도 불구하고, 각막 신경은 결국 완전히 치유 된 각막 조직 (상처 후 11 일)을 비슷한 밀도 수준과 비슷한 패턴으로 단계 일치, 상처가없는 대조군 (E18C)과 비슷한 패턴으로 신경을 씁니다 (그림 5C, D).
놀랍게도, 비섬유성, 흉터없는 방식으로 치유 된 완전히 재 상피화 된 각막 조직은 정상적인 콜라겐 조직 구조의 완전한 회고를 보여줍니다. 2세대 고조파 이미징22,23에 의해 입증된 바와 같이, 중앙 각막 상처 영역의 다양한 깊이에 걸쳐 콜라겐 섬유의 다발이 직교로 배열되어, 상처가 없는 중앙 각막 조직(9)의 천연 거대 구조와 일치한다(도 6).
도 1: 난소 배아외 막 해부 및 각막 상처의 개략도. E5.5에서, 배아의 두개골 영역은 ACM 및 CAM 막을 해부하고 양수와 알란투아를 발달 눈으로부터 멀리 떨어 뜨려 노출됩니다. 계란은 밀봉되어 중앙 각막이 손상되었을 때 E7로 배양되며, 미세 외과 칼의 끝으로 배아 머리의 요람으로 곡선 포셉을 사용하여 중앙 각막을 절개합니다. 상처는 맥락막 균열 (별표)과 평행하게 배향됩니다. 절개 깊이가 전방 스트로마에 도달하도록하려면 칼로 세 개의 동시 절단을 만들어야하며, 각각 동일한 상대 위치에 하나씩 절단해야합니다. 스케일 바 = 1mm. 도면은 참조 8,11의 허가를 받아 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 오보에서 발생하는 상처의 변화. (A) E5.5에서 막 박리에 이어 오른쪽 눈은 오보에서 접근 할 수 있습니다. (B-D) 각막의 정도에 걸쳐 있고 맥락막 균열 (cf)과 일치하는 다양한 정도의 열상 직후에 난소 배아에서 찍은 이미지. (B) 약한 압력이 가해진 세 번의 열상 후, 얕은 상처가 보인다. 화살촉은 각막의 상피가 깎여졌지만 전방 스트로마가 침투되지 않은 부위를 표시합니다. 화살촉은 전방 스트로마가 침투 한 작은 각막 영역을 나타냅니다. (C) 이상적인 양의 압력이 가해진 세 번의 열상 후에 이상적인 상처가 보입니다. 화살촉은 전방 스트로마가 침투 한 각막의 전체 범위에 걸친 상처를 나타냅니다. (D) 과도한 압력이 가해진 세 번의 열상 후, 전체 정도의 상처가 보이고, 수성 유머가 외부 환경에 노출되었다. 약어: tca, 측두엽 섬모 동맥; cf, 맥락막 균열; CAM, chorioallantoic 막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 상처 치유 진행. (A) 단계 일치 대조군과 비교하여 상처 입은 각막에서의 치유의 진행은 상처 발생 시점(0 dpw) 및 16시간 상처 후(hrpw)부터 상처 후 3-11일(dpw)까지 나타난다. 화살촉은 상처의 등쪽 및 복부 최다 경계를 묘사하여 상처 확장 기간 (0-3 dpw)과 진행성 상처 폐쇄 (5-11 dpw)를 나타냅니다. (b) 절편화된 DAPI (청색)- 및 라미닌 (적색)-염색된 상처 각막을 0, 3 및 11 dpw에서 염색하였다. 브래킷은 상처 부위의 정도를 보여 주며, 이는 3dpw에 의한 상처 확장과 E11에 의한 재상피화 각막의 완전한 복구를 보여줍니다. 별표는 각막의 치유 된 영역을 나타냅니다. 스케일 바는 (A) 1 mm, (B) 100 μm이다. 그림은 참조8의 허가를 받아 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상처 입은 각막의 조직학적 분석. 횡단면은 (A) 3dpw 및 (B) 5dpw를 통과합니다. DAPI 염색 (파란색) 상처 각막은 피브로넥틴 (FN, 빨간색)과 Tenascin-C (TN-C, 녹색)의 국소화를 나타냅니다. (A) 및 (B)의 브라켓은 상처 부위를 나타낸다. 스케일 바: 100 μm. 약어: ep, 상피; st, 스트로마; en, 내피. 그림은 참조8의 허가를 받아 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 상처 입은 각막의 신경과민. (A-D) (B) 5dpw 및 (D) 11dpw 각막에서 항β 신경 튜불린 (Tuj1) 전체 마운트 면역염색에 따른 각막 신경의 시각화, (A) 스테이지 매칭 E12 (E12C, 5 dpw에 대한 스테이지 매칭) 및 (C) E18 대조군 (E18C, 11 dpw에 대한 스테이지 매칭). (b) 5 dpw 각막의 파선은 상처의 정도를 나타낸다. 상처에 직접 인접한 브라켓 영역은 일시적으로 신경에 반발하고 재상피화를 적극적으로 겪고있는 각막 영역을 나타냅니다. (B') 열린 상처에 직접 인접한 치유 각막 조직을 통한 광학 스캔은 조직(화살표) 및 상피 신경 가죽 끈(화살촉)으로 연장되는 희귀한 기질 신경 다발을 드러낸다. (C,D) 11dpw에서 완전히 재생된 각막은 유사한 신경 과민 패턴과 단계적 일치 대조군에 필적하는 신경 밀도를 표시합니다. 약어 : w, 상처. 그림은 참조8의 허가를 받아 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 치유된 배아 각막의 콜라겐 울트라구조. (A) 완전히 치유된 10dpw 각막의 얼굴 스캔과 2세대 고조파 이미징(SGH)을 사용한 단계 일치 대조군. 스캔 깊이는 각막의 전방 표면으로부터 2-66 μm 범위(0 μm는 가장 앞쪽 스트로마임)이며 각 이미지의 왼쪽에 나열된다. 각 이미지에 대한 인셋은 특정 스캔 깊이에 대한 중앙 상처 영역의 Fast Fourier 변환 분석에 해당합니다. (B) 이차원 Fast Fourier 변환 분석의 수동으로 분할된 스택으로, 상처 입은 대조군 각막 내의 콜라겐 조직을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 도면은 참조9의 허가를 받아 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
병아리는 태아, 흉터가없는 각막 상처 수리를 연구하기위한 이상적인 모델 시스템입니다. 포유동물과는 달리, 병아리는 ovo 8 또는 ex ovo 전략(24)을 사용하여 개발 전반에 걸쳐 쉽게 접근할 수 있다. 배아 병아리 각막은 설치류 각막보다 훨씬 크며, 두개골 부피의 거의 50 %가 눈25에 전념하여 상처와 같은 신체적 조작에 매우 적합합니다. 또한, 닭고기 달걀은 일년 내내 쉽게 구할 수 있으며 종종 지역 농장에서 구할 수 있으며 비용 효율적이므로 개발을 지원하기 위해 굴욕적인 인큐베이터 만 있으면됩니다.
이 프로토콜은 배아 병아리 각막 상처를 가능하게하는 일련의 절차를보고합니다. 배아 병아리 각막에 만들어진 상처는 완전히 재생되어 검출 가능한 흉터없이 네이티브 각막 구조를 완전히 되돌릴 수 있습니다. 이 기술은 배아 병아리를 흉터가없는 각막 상처 치유를 조정하는 분자 및 세포 인자를 해명하기위한 중요한 동물 모델로 만들었습니다.
본원에 기재된 태아 상처 치유 모델에 내재된 명확한 약속에도 불구하고, 태아와 성인 각막 상처 치유 사이에 명백한 차이가 있다는 점은 주목할 가치가 있다. 배아 각막은 성인 조직(26)에서 침묵되거나 부재하는 성장 인자 및 형태형성 신호를 발현한다. 더욱이, 상처 입은 성인 각막 조직은 섬유증을 나타내며 흉터 조직을 형성하는데, 이는 배아 단계에서 약화되거나 아직 확립되지 않은 사이토카인 및 성장 인자27에 의해 매개되는 염증 반응이 증가했기 때문일 가능성이 큽니다. 각막 조직 내의 이러한 연령 관련 차이는 성인 상처 조직을 완전히 복원하려는 노력을 복잡하게 만들 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 태아 흉터없는 상처 치유를 조절하는 핵심 분자 인자와 매트릭스 단백질을 결정하는 것은 흉터가 적고 정상 조직 구조의 더 나은 회복으로보다 회복적인 치유 과정을 육성하는 치료법의 길을 열어 줄 것입니다.
여기에 설명 된 상처 방법은 Spurlin et al.11 에 의해 최초로 개발 된 기술을 기반으로 말기 병아리 배아 (예 : >E6) 에 대한 난소 접근을 얻습니다. 난자를 창문으로 만들고 두개골 영역에서 멀리 떨어진 배아 외막을 해부함으로써 배아 눈은 E7만큼 늦은 단계에 접근 할 수 있습니다. 우리가 이전에 보고한 바와 같이, 양수 이온성 및 맥락알란토시스 막의 제거 및 변위는 각각 배아 발달에 영향을 미치지 않는다(11). 노출 된 배아는 생존 가능하며 물리적 조작에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 단계에서 각막은 세 개의 뚜렷한 층 (상피, 스트로마 및 내피)을 가지고있어 전방 스트로마로의 선형 절개 후 상처 치유 연구에 적합합니다. 시간이 지남에 따라 알란토이 성장이 증가하기 때문에 결국 E8에서 눈에 대한 접근이 차단된다는 점에 유의해야합니다. 이 문제를 피하기 위해, 상처에 대한 후기 단계 눈에 접근하는 것이 바람직하다면, 우리는 배아 외 막 (예 : E7, E8 등)의 매일 조작을 수행함으로써 E9를 통해 눈에 대한 접근이 유지 될 수 있음을 발견했으며, 여기서 알란토이스는 두개골 영역으로부터 조심스럽게 재배치되어 성장이 배아에서 멀어지는 방향으로 발생하도록합니다. 이것은 각막이 이러한 후기 단계 (예 : 신경 과민 후)에서 상처를 입을 수있게합니다.
전반적으로,이 기술에서 배아 생존력과 생존 가능성은 배아 혈관이나 알란토이스에 손상을 입히지 않도록주의하면서 멸균되고 수화 된 난자 환경이 유지되도록하는 것과 같은 몇 가지 요인에 의존합니다. 계란 표면 전체는 불임을 유지하기 위해 창문을 만들기 전에 에탄올로 멸균해야합니다. 이것은 종종 미생물로 가득 찬 작은 달걀 껍질 조각이 일반적으로 창 형성 과정에서 계란에 떨어지기 때문입니다. 마찬가지로, 창문, 막 해부 및 각막 절개 만들기와 관련된 모든 도구는 에탄올로 철저히 헹구고 사용하기 전에 건조 또는 화염 살균해야합니다. 또한, 항생제는 배아가 외부 환경에 노출 될 때마다 계란에 첨가되어야합니다. 배아가 윈도우 후 적절한 수분 공급을 유지하는 것이 더 중요합니다. 창문이 테이프로 완전히 밀봉되고 공극이 남아 있지 않은지 확인하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 테이프가 달걀 껍질 표면에 완전히 부착되어 구멍을 완전히 밀봉하는 것이 중요하다는 점을 감안할 때, 구멍을 둘러싼 달걀 껍질 표면을 테이프를 적용하기 전에 청소하고 말려야합니다. 마지막으로, 부주의하게 혈관을 절단하지 않고 배아에서 액체 폐기물을 저장하는 알란토이스가 배아에 치명적이기 때문에 배아 외막의 해부 중에 손상되지 않도록해야합니다. 쵸 리온과 양수에 대한 작은 눈물이 만들어 질 때 배아 생존율이 더 높다는 점에 유의해야하지만, 눈물은 두개골 영역에서 배아 외막을 위치시키기에 충분히 커야합니다. 고품질의 난자에서 막을 해부하고 제거하는 동안 이러한 신중한 조치를 취하면 거의 모든 배아가 윈도우 링 절차 (~ 99 %)에서 생존 할 것으로 기대할 수 있으며 노출 된 배아의 ~ 40 %는 E9로, ~ 30 %는 E1211로 생존합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, E7-E9 막 해부 된 배아의 각막을 상처 입히는 것은 배아 생존력에 거의 영향을 미치지 않으며, 충분한 배아는 E18을 통해 생존 할 수 있으며, 이때 각막 상처가 완전히 치유됩니다.
각막 상피를 통과하고 전방 스트로마에 침투하는 상처를 달성하는 것은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 생성하는 데 필수적입니다. 고품질의 마이크로 해부 나이프가 필요하므로 압력을 거의 가할 필요가 없습니다. 한 쌍의 곡선 홍채 포셉을 사용하면 열상이 다른 손으로 이루어질 때 머리를 부드럽게 감싸는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 방식으로, 구부러진 홍채 포셉은 백스톱 역할을 하여 각막이 상처 입은 동안 정지된 상태로 유지되도록 합니다. 상처가 스트로마에 침투하는 것은 특히 학습 할 때 가변적이지만 연구원이 각막 상피를 깨는 느낌과 모양을 배우면 재현 할 수 있습니다. 학습하는 중으로서, 각막 스트로마로의 상처 침투 깊이가 평가될 수 있도록 상처 각막을 단면으로 보는 것이 도움이 될 수 있다(각막 열상 직후에 이상적인 상처 깊이를 나타내는 단면 각막의 예는 도 3B 참조).
조직 이식 및 비드 이식과 같은 고전적인 발달 생물학 기술 또는 DNA 전기 천공 및 레트로 바이러스 감염과 같은 유전자 조작을위한 현대적인 접근법과 결합 될 때,이 각막 재생 동물 모델은 손상 후 각막 조직의 완전한 회복을 달성하는 데 필요한 분자 요인 및 세포 메커니즘을 밝힐 것을 약속합니다. 또한, 이 동물 모델은 각막 재생을 증강시키기 위한 외인성 치료 화합물의 잠재적인 유용성을 시험하는데 사용될 수 있었다.
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Disclosures
저자는이 원고에 제시된 정보와 관련하여 경쟁적인 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 일리노이 웨슬리안 대학을 통해 TS에 예술 및 학술 개발 보조금에 의해 지원되었으며 NIH-R01EY022158 (PL)이 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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