Summary
O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.
Abstract
As feridas na córneas embrionárias do pintinho apresentam uma capacidade notável de se regenerarem totalmente e rapidamente, enquanto as córneas feridas adultas experimentam uma perda de transparência devido a cicatrizes fibrosas. A integridade tecidual das córneas embrionárias feridas é intrinsecamente restaurada sem formação detectável de cicatrizes. Dada a sua acessibilidade e facilidade de manipulação, o embrião de filhotes é um modelo ideal para estudar o reparo da ferida córnea sem cicatrizes. Este protocolo demonstra os diferentes passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para acessar o olho. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas. Terceiro, feridas lineares de córnea que penetram na camada epitelial externa e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir. Estudos até o momento usando este modelo revelaram que as córneas embrionárias feridas exibem ativação da diferenciação de ceratocitos, passam por remodelação coordenada de proteínas ECM à sua macroestrutura tridimensional nativa e tornam-se adequadamente re-inervadas por nervos sensoriais córneas. No futuro, o impacto potencial de fatores endógenos ou exógenos no processo regenerativo poderia ser analisado na cura de córneas usando técnicas de biologia do desenvolvimento, como enxerto de tecido, eletroporação, infecção retroviral ou implantação de contas. A estratégia atual identifica o filhote embrionário como um paradigma experimental crucial para elucidar os fatores moleculares e celulares que coordenam a cicatrização da ferida córnea.
Introduction
A córnea é o tecido transparente, mais externo do olho que transmite e refrata a luz propícia à acuidade visual. Na córnea adulta, danos ou infecções no estroma córnea leva a uma resposta rápida e robusta de cicatrização de feridas caracterizada pela proliferação de ceratocitos, fibrose, aumento da inflamação que leva à apoptose induzida por citocina, geração de miofibroblasts de reparação e remodelação geral da matriz extracelular (ECM)1,2 . Após a lesão, tal reparação do tecido córnea resulta em tecido cicatrizado opaco que reduz a transparência da córnea e oclui a passagem da luz, distorcendo assim a visão e, nos casos mais graves, levando à cegueira corneal3. Assim, há uma clara necessidade de desenvolver modelos animais confiáveis para abordar as complexidades da cicatrização das feridas e identificar os fatores celulares e moleculares responsáveis pelo fechamento da ferida e regeneração tecidual.
Até o momento, a maioria dos estudos que examinam a cicatrização de feridas córneas utilizaram modelos de animais pós-natal4 ou adultos 1,2,5,6,7. Embora esses estudos tenham levado a um avanço significativo na compreensão da resposta de cura da ferida córnea e dos mecanismos subjacentes à formação da cicatriz, os tecidos córneas danificados nesses modelos de cura não se regeneram totalmente, limitando assim sua utilidade para identificar os fatores moleculares e mecanismos celulares responsáveis pela recapitulação completa da morfologia cornela e da estrutura pós-lesão. Em contraste, as feridas fetais geradas com uma faca na córnea do pintinho embrionário possuem uma capacidade intrínseca de curar totalmente de forma sem cicatrizes8. Especificamente, a córnea de pintinho embrionário apresenta regeneração não fibritic com a recapitulação completa da estrutura da matriz extracelular e padrões de inervação 8,9.
O presente protocolo descreve uma sequência de passos envolvidos na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. Primeiro, os ovos são janelas em idades embrionárias precoces para facilitar o acesso ao embrião. Em segundo lugar, uma série de manipulações físicas de ovo para as membranas extraembriônicas são conduzidas para garantir que o acesso ao olho seja mantido através de estágios posteriores de desenvolvimento, correspondendo a quando as três camadas celulares da córnea são formadas e o ferimento é desejado. Terceira, incisões lineares de córnea central penetrando através do epitélio córnea e no estroma anterior são feitas usando uma faca microcirúrgica. O processo de regeneração ou córneas totalmente restauradas pode ser analisado para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.
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Protocol
A variedade de ovos usados neste protocolo foi White Leghorn, e todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Wesleyan de Illinois.
1. Incubação de ovos de pintinhos
- Mantenha os ovos a ~10 °C por até 1 semana depois que eles são colocados para parar o desenvolvimento. Quando estiver pronto para iniciar o desenvolvimento de embriões de filhotes, limpe toda a casca de ovo com lenços sem fiapos (ver Tabela de Materiais) saturados com água de temperatura ambiente para remover sujeira e detritos.
- Certifique-se de que a casca de ovo está higienizada. Limpe toda a superfície do ovo com lenços umedecidos sem fiapos com 70% de etanol. Limpe rapidamente o etanol para secar o ovo e evite a absorção de etanol através da casca de ovo para o embrião.
- Disponha os ovos horizontalmente em uma bandeja. Marque o topo do ovo para denotar a posição esperada do embrião. Incubar os ovos horizontalmente, com a função de balanço ativada, em uma incubadora umidificada de 38 °C.
2. Janelas dos ovos para preparar para dissecção da membrana
- Remova os ovos da incubadora no terceiro dia de desenvolvimento embrionário (E3). Esterilize a parte superior dos ovos com lenços umedecidos sem fiapos com 70% de etanol. Seque o etanol das superfícies da casca de ovo.
NOTA: Para garantir que o desenvolvimento não fosse adiado durante o procedimento de janela, 6-12 ovos foram removidos, e o procedimento foi rapidamente realizado sobre estes enquanto os ovos restantes foram deixados na incubadora. - Posicione um ovo horizontalmente em um suporte de ovo seguro (ver Tabela de Materiais). Usando a ponta afiada da tesoura dissecando, crie um pequeno buraco no topo da casca de ovo perto da extremidade pontiaguda do ovo.
NOTA: Este orifício facilitará a remoção do albumen, que é necessário para soltar a gema e o embrião longe da superfície interna da casca de ovo. Para os portadores de ovos, foram utilizados os planos de enchimento de ovos de papel-polpa, dentro dos quais os ovos são enviados. - Através do orifício (Passo 2.2.), insira uma agulha hipodérmica chanfrada de 18 G. Com a agulha empurrada para a superfície interna inferior do ovo e o lado de bisel da agulha voltado para a extremidade pontiaguda do ovo (por exemplo, longe da localização esperada da gema e do embrião perto do meio do ovo), remova 2-3 mL de albumen do ovo de galinha e descarte.
NOTA: Se a agulha cortar o embrião ou sua vasculatura associada durante esta etapa, resultará em sangue aspirado com o albumen. Isso resultará em morte de embrião. Além disso, se a gema for inadvertidamente aspirada junto com o albumen durante esta etapa, o embrião não será viável. Em ambos os casos, o ovo deve ser descartado se o embrião não puder ser usado imediatamente para outros fins. - Limpe a superfície da casca de ovo ao redor do orifício com lenços sem fiapos levemente umedecidos com 70% de etanol e limpe. Sele o orifício feito para remover albumen com fita clara.
- Com a ponta afiada da tesoura dissecando, faça um segundo buraco de "janela" no topo da casca de ovo no local de marcação (Passo 1.3.). Certifique-se de que a tesoura não se estenda muito até a casca de ovo para evitar o contato e danificar o embrião ou vasculatura embrionária, que muitas vezes será posicionado dentro do ovo diretamente abaixo do local do segundo orifício.
- Usando fórceps de íris curvas, amplie o orifício "janela" para se estender ~2-3 cm de diâmetro e servir como uma "janela" para o embrião em desenvolvimento sob a concha.
- Insira uma extremidade das fórceps no orifício, mantendo-a paralela e justaposta com a casca de ovo. Com a outra extremidade fórceps posicionada fora da casca de ovo, belisque cuidadosamente as duas extremidades fórceps juntas, permitindo que eles quebrem e removam pequenos pedaços da casca de ovo. Continue quebrando e removendo fragmentos de casca de ovo até que permaneça uma janela de 2-3 cm que sobrepõe diretamente o embrião.
NOTA: Os ovos em que os embriões não se colocam diretamente abaixo do orifício feito na Etapa 2.6. não deve ser usado, pois as próximas dissecções de membrana seriam desafiadoras para completar. Mesmo com o balanço horizontal dos ovos, cerca de 10% dos ovos são inutilizáveis devido ao mau posicionamento do embrião. Esses embriões podem ser usados para outros fins.
- Insira uma extremidade das fórceps no orifício, mantendo-a paralela e justaposta com a casca de ovo. Com a outra extremidade fórceps posicionada fora da casca de ovo, belisque cuidadosamente as duas extremidades fórceps juntas, permitindo que eles quebrem e removam pequenos pedaços da casca de ovo. Continue quebrando e removendo fragmentos de casca de ovo até que permaneça uma janela de 2-3 cm que sobrepõe diretamente o embrião.
- Para limitar a contaminação bacteriana, adicione através do orifício da janela (por exemplo, no ovo) ~100-200 μL da solução de Ringer (8 g de NaCl, 0,37 g de KCl, e 0,23 g de CaCl2.2H 20 por L de h20destilado) contendo antibióticos penicilina/estreptomicina (50 U/mL de Penicilina e 50 μg/mL de Estreptomicina, ver Tabela de Materiais).
- Sele o orifício da janela usando fita adesiva clara. Execute a vedação do ovo alinhando um canto da fita no longo eixo do orifício e pressionando a fita para a casca ~1-2 cm de distância da borda do orifício.
- Continue selando ao redor da abertura até que uma aba de fita pendurada seja deixada de um lado. Pressione as duas peças de fita juntas, criando uma forma de domed sobre o orifício, e pressione a aba da fita sobre-pendurada na casca para terminar de selar o ovo.
NOTA: Os ovos precisam ser janelas no E2 ou no E3. De acordo com a experiência, a janela antes do E2 resulta em baixa viabilidade de embriões. Além disso, por E4, o embrião e as membranas extraembriônicas tornam-se ligados à cascade ovo 10, e qualquer tentativa de janela no E4 ou mais tarde muitas vezes resulta em danos embriões ou rasgos de vasos sanguíneos extraembrínicos, com qualquer evento levando ao resultado da morte do embrião.
- Continue selando ao redor da abertura até que uma aba de fita pendurada seja deixada de um lado. Pressione as duas peças de fita juntas, criando uma forma de domed sobre o orifício, e pressione a aba da fita sobre-pendurada na casca para terminar de selar o ovo.
- Devolva os ovos "com janelas" à incubadora para maior desenvolvimento. Certifique-se de manter os ovos horizontais e desligue a função de balanço da incubadora.
- Repetir as etapas 2.2.-2.9. para cada ovo.
3. Microdisseções das membranas extraembriônicas
- Remova um ovo com janelas E5.5 da incubadora. Exponha o embrião cortando a fita da janela com uma tesoura dissecando esterilizada.
- Use um microscópio dissecando para observar o embrião e suas membranas extraembriônicas através da janela. Se necessário, use tesouras ou fórceps de íris curvados para ampliar a janela para que o embrião esteja bem posicionado sob a janela, tomando cuidado para não danificar a vasculatura embrionária.
- Adicione duas gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
- Use um microscópio de dissecação para garantir que o embrião esteja no estágio de desenvolvimento adequado (Hamburger Hamilton estágio 27, ~E5.5)11,12 e localize as posições da membrana amicooquicoçônica (ACM) e da membrana corioallantónica (CAM).
NOTA: Nesta fase, o embrião é cercado pelo ACM, que compreende a membrana amniótica e a membrana coriônica constrói e parcialmente coberta pela allantois altamente vascularizada, que se estende da região intestinal do embrião e se funde com o acorde sobreposto para formar a CAM11,12. O ACM não é fortemente vascularizado, o que permite dissecar essas membranas para expor o embrião sem danificar os vasos sanguíneos e prejudicar o embrião. - Realizar dissecções de membrana extraembriônica nesta fase (E5.5).
NOTA: E5.5 é o momento ideal para realizar as dissecções de membrana extraembriônica. Dissecando as membranas anteriormente (por exemplo, no E4) antes que a formação cam reduza a acessibilidade de embriões nos estágiosposteriores 11. Além disso, em E5.5, o embrião é apenas parcialmente coberto pela CAM altamente vascularizada, mas nos próximos 1-2 dias, o CAM rapidamente envolve e impede mais acesso ao embrião11,12. Por essa razão, a dissecção da membrana no E6 ou posterior é desafiadora à medida que o risco de rasgar os vasos sanguíneos aumenta.- Use um par de fórceps finos esterilizados para agarrar suavemente o ACM e puxá-lo para longe do embrião. Em seguida, use uma tesoura de micro dissecação esterilizada para cortar um orifício no ACM diretamente acima do membro dianteiro que se estende da membrana sobredissendo o membro dianteiro até a membrana sobredissendo a cabeça.
NOTA: Esta etapa relaxa as membranas de chorão e amnion, tornando-as mais fáceis de agarrar e dissecar ainda mais com fórceps nos próximos passos. Consulte a Figura 1 para obter um esquema útil de como as membranas são dissecadas através da janela da casca de ovo.
- Use um par de fórceps finos esterilizados para agarrar suavemente o ACM e puxá-lo para longe do embrião. Em seguida, use uma tesoura de micro dissecação esterilizada para cortar um orifício no ACM diretamente acima do membro dianteiro que se estende da membrana sobredissendo o membro dianteiro até a membrana sobredissendo a cabeça.
- Use dois pares de fórceps finos e estéreis para agarrar suavemente o amnion em duas posições adjacentes entre o ACM e o CAM (por exemplo, uma área entre o corte feito acima do membro dianteiro e a borda mais próxima da CAM).
- Mova cuidadosamente cada par de fórceps, ambos firmemente segurando a membrana amniótica, longe um do outro, com um par movendo-se dorsalmente para o embrião e o outro ventricamente.
NOTA: Este movimento serve para rasgar ainda mais o amnion, separando também o ACM (que é puxado na direção dorsal em relação ao embrião por um par de fórceps) e o CAM (que é puxado na direção ventral em relação ao embrião pelo outro par de fórceps). - Certifique-se de que as membranas são separadas quando a CAM não cobre mais o embrião e a artéria e veia allantónica, que emanam do intestino embrionário para a CAM, são prontamente aparentes.
- Mova cuidadosamente cada par de fórceps, ambos firmemente segurando a membrana amniótica, longe um do outro, com um par movendo-se dorsalmente para o embrião e o outro ventricamente.
- Use fórceps finos esterilizados para dissecar e remover qualquer membrana de amnion restante que cubra o embrião. É mais comumente observado que o amnion restante cobrirá parcialmente a metade caudal do embrião.
- Usando fórceps esterilizados, segure o amnion perto da região central do embrião e puxe cuidadosamente o amnão em uma direção caudal em relação ao embrião em direção ao CAM deslocado anteriormente. O embrião será agora totalmente exposto, e o crescimento adicional da CAM ocorrerá principalmente longe do embrião em desenvolvimento.
NOTA: Consulte a Figura 1 para obter um esquema útil sobre como o embrião exposto aparecerá após a dissecação da membrana. Além disso, consulte um relatório publicado anteriormente11 para diagramas esquemáticos úteis das etapas 3.3.-3.6.
- Usando fórceps esterilizados, segure o amnion perto da região central do embrião e puxe cuidadosamente o amnão em uma direção caudal em relação ao embrião em direção ao CAM deslocado anteriormente. O embrião será agora totalmente exposto, e o crescimento adicional da CAM ocorrerá principalmente longe do embrião em desenvolvimento.
- Adicione algumas gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
- Resear o orifício da janela usando fita adesiva, conforme descrito na Etapa 2.8. Retorne o ovo à incubadora para maior desenvolvimento, mantendo o ovo horizontal e mantendo a função de balanço da incubadora inativada.
- Repetia as etapas 3.1.-3.8. para cada ovo.
NOTA: As dissecções de membrana extraembriônica no E5.5 descrito acima permitirão o acesso ao embrião através do E7, que é quando o ferimento pode ser realizado 8,9. Por E8, o crescimento contínuo do tecido CAM começa a cobrir a região craniana do embrião, impedindo assim um acesso adicional à córnea. Se desejar realizar ferimentos nas córneas E8-E9 mais antigas, é possível reposicionar o cam em crescimento ventrally em relação ao embrião (Passo 3.10.). Se alguém quiser ferir no E7, passo 3.10. não é necessário realizar e pode-se prosseguir para o Passo 4, ferida corneal. - Remova um ovo E7 da incubadora cujas membranas extraembriônicas foram previamente dissecadas em E5.5 (Etapas 3.1.-3.8.). Segure com fórceps esterilizados quaisquer tecidos de membrana de amnion disponíveis fundidos à CAM e puxe suavemente a membrana de amnion para longe da região craniana do embrião em uma direção ventral em relação ao embrião.
NOTA: Uma vez que a membrana amniônica que está sendo deslocada para longe do embrião é fundida para o CAM, o CAM em crescimento e altamente vascularizado seguirá as fórceps apreendidoras de amnion e se afastará da região craniana. Repita este passo diariamente para deslocar continuamente a CAM para longe do embrião até que o embrião esteja na idade desejada para ferir.
4. Ferida corneal
- Obtenha um óvulo da incubadora para ferimentos na idade embrionária desejada, E7-E9. Exponha o embrião cortando a fita da janela com uma tesoura dissecando esterilizada. Adicione algumas gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
- Use uma faca de micro-dissecação para fazer uma incisão que abrange a extensão da córnea do olho direito (devido à forma como o embrião está no ovo, o olho esquerdo não é acessível, mas pode servir como um controle não ferido), que é paralelo e em consonância com a fissura choroide (Figura 1). O primeiro corte atravessará o epitélio córnea.
- Use a faca de micro-dissecação para dilacerar novamente a córnea no mesmo local da primeira incisão 2x mais (por exemplo, três cortes totais, com corte 2 e corte 3 ocorrendo junto com a mesma posição na córnea como corte 1)11. A segunda laceração atravessará a membrana do porão, e a terceira penetrará no estroma anterior.
NOTA: Se o embrião se estabeleceu sob a CAM dissecada, pode-se usar fórceps de íris curvas esterilizados para mover cuidadosamente a cabeça para fora sob a CAM. Posicione as fórceps de íris curvas sob a cabeça, fazendo contato com o lado esquerdo da cabeça. Embale toda a cabeça em cima de fórceps de íris curvadas fechadas e levante suavemente a cabeça ao redor e acima da CAM. Para ajudar com a viabilidade, use uma técnica semelhante com os fórceps de íris curvados para colocar o embrião de volta sob a CAM após a cirurgia para promover o crescimento adequado da CAM.
- Use a faca de micro-dissecação para dilacerar novamente a córnea no mesmo local da primeira incisão 2x mais (por exemplo, três cortes totais, com corte 2 e corte 3 ocorrendo junto com a mesma posição na córnea como corte 1)11. A segunda laceração atravessará a membrana do porão, e a terceira penetrará no estroma anterior.
- Adicione 3-4 gotas da solução de Ringer contendo antibióticos penicilina/estreptomicina para hidratar o embrião e esterilizar o ovo.
- Recaça o orifício da janela com fita adesiva e retorne à incubadora, deixando o ovo horizontal. Permita que o embrião se desenvolva e a ferida córnea se cure por um período desejado (por exemplo, 0,5-11 dias), e então eutanize humanamente o embrião por decapitação.
- Use fórceps de íris curvas para colher o olho de um embrião eutanizado flutuando em uma placa de Petri da solução salina de Ringer, agarrando suavemente o olho em seu lado posterior, onde o olho e o tecido facial se encontram, e cuidadosamente levantando todo o olho para longe e livre do tecido facial.
- Use fórceps finos para fazer um pequeno orifício (3-5 cm) na parte de trás do olho inteiro e fixar o olho inteiro em 4% de paraformaldeído a 4 °C durante a noite com leve agitação.
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Representative Results
Após a dissecação anterior do ACM e cam em E5.5 para expor a região craniana do embrião em desenvolvimento, uma série de lacerações que abrangeram a córnea central E7 foi feita em ovo (Figura 1). Uma ferida ideal para estudar a regeneração da córnea ocorre após três lacerações, cada uma feita no mesmo local da córnea. A primeira laceração atravessa o epitélio córnea, enquanto a segunda e terceira lacerações penetram na membrana do porão subjacente e no estroma anterior, respectivamente. Para alcançar uma ferida ideal, é crucial usar uma faca de microdiscção afiada (ver Tabela de Materiais) e aplicar a quantidade correta de pressão à medida que a laceração é feita (Figura 2, ver ferida ideal). Aplicar pouca pressão resultará em uma ferida rasa que rasga o epitélio córnea sem penetrar suficientemente o estroma anterior (Figura 2, ver ferida rasa). No entanto, aplicar muita pressão resulta em uma ferida de extensão total penetrando todo o estroma e expondo o humor aquoso ao ambiente externo (Figura 2, ver ferida de extensão total).
A realização das incisões laceradoras adequadas produz uma ferida ideal (Figura 2) que inicialmente aumenta (0-3 dias após o ferimento)8 (Figura 3). Foi postulado que a fase de alargamento da ferida que ocorre pela ferida de córneas de frango E7 está relacionada à rápida expansão do tamanho dos olhos neste estágio embrionário8. Os olhos de galinha embrionária crescem a uma taxa significativamente mais rápida de E4 para E10 em comparação com o crescimento dos olhos do E10 para a eclosão. Essas fases rápidas iniciais de crescimento dos olhos são atribuídas ao crescimento dependente da pressão intraocular elevada (IOP)13. Portanto, é provável que a rápida taxa de crescimento do olho juntamente com o IOP elevado promova a retração da ferida durante as fases iniciais do processo de cicatrização (0-3 dias após o ferimento), que é única para a progressão de cicatrização da ferida de córnea embrionária. Depois disso, a reetelialização e a nova formação de tecidos ocorrem (4-9 dias após o ferimento) para, finalmente, fechar a ferida de forma sem cicatrizes por 11 dias após o ferimento8 (Figura 3A).
Uma análise mais aprofundada da profundidade e regeneração da ferida foi possível colorindo seções transversais com um anticorpo laminin que marca a membrana do porão rica em laminina e contra-manchando as seções com o marcador nuclear DAPI, que revela a extensão da ferida através do epitélio córnea8. Córneas recentemente feridas (0 dpw) e aquelas que estão no início do processo de regeneração (3 dpw) mostraram que a ferida penetrou na camada epitelial e na membrana do porão, como evidenciado pela coloração do marcador nuclear DAPI dentro do epitélio córnea e a ausência de manchas de anticorpos lamininas, que marca a membrana de porão rica em lamininos entre o epitélio córnea e o estroma8 subjacente (Figura 3B ). No entanto, seções transversais através de 11 córneas dpw manchadas com anticorpo DAPI e laminina revelaram uma córnea completamente curada que havia sido re-epitelializada e continha uma membrana contínua de porão rica em laminina no local da ferida regenerada8 (Figura 3B).
Após a incisão da córnea, a caracterização detalhada do processo de cicatrização da ferida foi realizada com a realização de imunohistoquímica em tecidos córneas seccionados e feridos. As proteínas da matriz extracelular fibronectina e tenascina estão associadas à migração de células epiteliais e ceratocitos para curar feridas corneais adultas14,15. A localização esposotemporal das proteínas da matriz extracelular, fibronectina e tenascina é aparente dentro da ferida curativa e foi encontrada elevada em pontos de tempo correspondentes à re-epitelialização da córnea (5 dias após o ferimento)8 (Figura 4). Tal análise sugere a importância da fibronectina e da tenascina para o fechamento da ferida e, especificamente, seu envolvimento na migração e sobrevivência das células epiteliais, consistentes com tais funções em feridas corneais adultas16,17.
Começando em E8-E9, a córnea torna-se densamente inervatada por fibras nervosas sensoriais trigêmeas que emanam de um anel nervoso pericorneal e atravessam o estroma anterior enquanto projetam em direção ao centro da córnea e ao epitélio da córnea por E12 18,19,20. Uma vez que as feridas da córnea neste modelo são feitas no E7, pouco antes da projeção nervosa para a córnea, este modelo investiga ainda mais os nervos da córnea enquanto navegam por uma córnea curativa após o insulto. Ao usar a imunohistoquímica de montagem inteira para traçar nervos córneas com anticorpos anti-β tubulina neural (Tuj1)21, é evidente que os nervos são temporariamente inibidos do tecido córnea curativo que justapõe diretamente os feridos, córnea central (5 dias após a ferida)8 (Figura 5A,B). Apesar da inibição anterior, os nervos da córnea eventualmente inervam o tecido córnea totalmente curado (11 dias após a ferida) a níveis de densidade semelhantes e em padrões semelhantes aos controles não feridos (E18C) (Figura 5C,D).
Surpreendentemente, tecidos córneas totalmente re-epitelializados que cicatrizaram de forma não fibrotic, sem cicatrizes, exibem uma recapitulação completa da arquitetura normal do tecido de colágeno. Como evidenciado pela imagem harmônica de segunda geração22,23, pacotes de fibras de colágeno em diferentes profundidades da área central da ferida da córnea são dispostos ortogonalmente, combinando a macroestrutura nativa do tecido córnea central não ferido 9 (Figura 6).
Figura 1: Esquema de dissecações de membrana extraembriônica ovo e woundamento corneo. Em E5.5, a região craniana do embrião é exposta dissecando as membranas ACM e CAM e posicionando a amônio e allantois longe do olho em desenvolvimento. Os ovos são selados e incubados para E7 quando a córnea central é ferida, usando fórceps curvos como berço para a cabeça de embrião como a ponta de uma faca microcirúrgica faz uma incisão na córnea central. A ferida é orientada paralelamente à fissura coroide (asterisco). Para garantir que a profundidade da incisão atinja o estroma anterior, três cortes simultâneos precisam ser feitos com a faca, cada um na mesma posição relativa, um sobre o outro. Barra de escala = 1 mm. O valor é adaptado com permissão das referências 8,11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Variações nas feridas geradas no ovo. (A) Após dissecções de membrana no E5.5, o olho direito é acessível em ovo. (B-D) Imagens tiradas de um embrião em ovo imediatamente após lacerações de graus variados que abrangem a extensão da córnea e estão em consonância com a fissura coroide (cf). (B) Após três lacerações em que a pressão fraca foi aplicada, uma ferida rasa é visível. A ponta da flecha marca um local na córnea onde o epitélio foi corteado, mas o estroma anterior não foi penetrado. Pontas de flecha denotam uma pequena região de córnea onde o estroma anterior foi penetrado. (C) Após três lacerações em que uma quantidade ideal de pressão foi aplicada, uma ferida ideal é visível. Pontas de flecha denotam uma ferida que abrange toda a extensão da córnea onde o estroma anterior foi penetrado. (D) Após três lacerações em que a pressão excessiva foi aplicada, uma ferida de extensão total é visível, e o humor aquoso tornou-se exposto ao ambiente externo. Abreviaturas: tca, artéria ciliar temporal; cf, fissura coroóide; CAM, membrana corioallantónica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Progressão de cicatrização de feridas. (A) A progressão da cicatrização em córneas feridas em comparação com os controles de estágio é mostrada desde o momento do ferimento (0 dpw) e 16 h pós-ferimento (hrpw) até 3-11 dias após o ferimento (dpw). As pontas das flechas delineiam as bordas dorsal e ventral-mais da ferida, indicando um período de expansão da ferida (0-3 dpw) seguido de fechamento progressivo da ferida (5-11 dpw). (B) DAPI seccionado (azul)- e laminina (vermelha) cornésias feridas manchadas em 0, 3 e 11 dpw. Os suportes mostram a extensão da região ferida, que revela a expansão da ferida em 3 dpw e o reparo completo da córnea re-epitelializada pelo E11. Asteriscos denotam a região curada da córnea. A barra de escala é (A) 1 mm, (B) 100 μm. A figura é adaptada com permissão da referência8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise histológica das córneas feridas. Seções transversais através (A) 3 dpw e (B) 5 dpw. Córneas feridas manchadas de DAPI (azul) revelam a localização da fibronectina (FN, vermelha) e Tenascin-C (TN-C, verde). Suportes em (A) e (B) denotam a região ferida. Barra de escala: 100 μm. Abreviaturas: ep, epitélio; st. stroma; en, endotélio. A figura é adaptada com permissão da referência8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Inervação de córneas feridas. (A-D) Visualização dos nervos córneas após tubulina neural anti-β (Tuj1) imunostaining de montagem inteira em (B) 5 dpw e (D) 11 córneas de dpw, assim como (A) os controles E12 (E12C, com fase igualada a 5 dpw) e (C) E18 (E18C, partida de palco para 11 dpw). (B) A linha quebrada na córnea de 5 dpw denota a extensão da ferida. A área de suporte diretamente adjacente à ferida denota a área da córnea que é temporariamente repulsiva aos nervos e se submete ativamente à re-epitelialização. (B') A varredura óptica através do tecido córnea curativo diretamente adjacente à ferida aberta revela um raro feixe de nervo estromal que se estende até o tecido (flecha) e coleiras nervosas epiteliais (ponta de flecha). (C,D) Córneas totalmente regeneradas em 11 dpw exibem padrões de inervação semelhantes e densidades nervosas comparáveis aos controles de estágio compatível. Abreviação: w, ferida. A figura é adaptada com permissão da referência8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Ultraestrutura de colágeno em córneas embrionárias curadas. (A) En tomografia facial de córneas de 10 dpw totalmente curadas e controles de estágio compatível com imagens harmônicas (SGH). As profundidades de varredura variam de 2-66 μm da superfície anterior da córnea (0 μm é o estroma mais anterior) e são listadas à esquerda das respectivas imagens. Os insets para cada imagem correspondem à análise de transformação fast fourier da área central da ferida para essa profundidade de varredura específica. (B) Pilhas segmentadas manualmente de análise de transformação fast fourier bidimensional, representando a organização de colágeno dentro da córnea de controle ferida e compatível com o estágio. Barra de escala = 50 μm. A figura é adaptada com permissão da referência9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O filhote é um sistema modelo ideal para estudar o reparo da ferida da córnea fetal e sem cicatrizes. Ao contrário dos mamíferos, o filhote é facilmente acessível durante todo o desenvolvimento usando em estratégias ovo8 ou ex ovo 24. A córnea de pintinho embrionário é muito maior que as córneas de roedores, com quase 50% do volume craniano dedicado ao olho25, tornando-a altamente favorável a manipulações físicas como ferimentos. Além disso, os ovos de galinha estão prontamente disponíveis durante todo o ano, muitas vezes de fazendas locais, e econômicos, exigindo apenas uma incubadora umsenficada para apoiar o desenvolvimento.
Este protocolo relata uma série de procedimentos que permitem ferimentos de córnea de pintinhos embrionários. As feridas feitas na córnea do pintinho embrionário regeneram-se totalmente, permitindo uma recapitulação completa da estrutura corneal nativa sem cicatrizes detectáveis. Esta técnica fez do filhote embrionário um modelo animal vital para elucidar os fatores moleculares e celulares que coordenam a cicatrização da ferida córnea.
Apesar da clara promessa inerente ao modelo de cura da ferida fetal aqui descrito, vale a pena notar que há diferenças claras entre a cicatrização da ferida fetal e adulta da córnea. A córnea embrionária expressa fatores de crescimento e sinais morfogenéticos que são silenciados ou ausentes nos tecidos adultos26. Além disso, os tecidos córneas adultos feridos apresentam fibrose e formam tecido cicatricial, provavelmente devido a uma resposta inflamatória aumentada mediada por citocinas e fatoresde crescimento 27, que são amortecidos ou ainda não estabelecidos em estágios embrionários. Tais diferenças relacionadas à idade dentro do tecido córnea podem complicar os esforços para restaurar totalmente o tecido ferido adulto. No entanto, determinar fatores moleculares chave e proteínas matriciais que regulam a cicatrização de feridas sem cicatrizes fetais abrirá caminho para terapias que promovam um processo de cura mais restaurador com menos cicatrizes e melhor recapitulação da arquitetura normal do tecido.
O método de wounding descrito aqui baseia-se em uma técnica desenvolvida pela primeira vez por Spurlin et al.11 para obter em ovo acesso a embriões de filhotes em estágio final (por exemplo, >E6). Ao janelas do ovo e dissecando membranas extraembriônicas longe da região craniana, o olho embrionário é acessível a estágios tão tardios quanto o E7. Como já noticiamos anteriormente, a remoção e o deslocamento das membranas amicooquionônicas e corioallantónicas, respectivamente, não afetam o desenvolvimento embrionário11. Embriões expostos são viáveis e são prontamente favoráveis à manipulação física. Nesta fase, a córnea possui três camadas distintas (epitélio, estroma e endotélio), tornando-a adequada para estudos de cicatrização de feridas após incisão linear no estroma anterior. Deve-se notar que, devido ao aumento do crescimento da allantois ao longo do tempo, o acesso ao olho acaba sendo ocluído no E8. Para contornar esse problema, se o acesso aos olhos posteriores para ferimentos for desejável, descobrimos que o acesso ao olho pode ser mantido através do E9, realizando manipulação diária das membranas extraembriônicas (por exemplo, na E7, E8, etc.), onde a allantois é cuidadosamente reposicionada para longe da região craniana para garantir que seu crescimento ocorra direcionalmente longe do embrião. Isso permite que córneas sejam feridas nestes estágios posteriores (por exemplo, seguindo a inervação).
No geral, a viabilidade e a sobrevivência dos embriões nesta técnica dependem de vários fatores, como garantir que um ambiente de ovos estéreis e hidratados seja mantido, tomando ainda mais cautela para não infligir danos aos vasos sanguíneos embrionários ou à allantois. Toda a superfície do ovo deve ser esterilizada com etanol antes da janela para manter a esterilidade. Isso ocorre porque pequenos fragmentos de casca de ovo, que muitas vezes são carregados com micróbios, normalmente caem no ovo durante o procedimento de janela. Da mesma forma, todas as ferramentas envolvidas em janelas, dissecções de membrana e fazer a incisão córnea devem ser completamente enxaguadas em etanol e secas ou esterilizadas por chamas antes de seu uso. Além disso, os antibióticos devem ser adicionados ao ovo sempre que o embrião for exposto ao ambiente externo. É ainda mais crítico que o embrião retenha a hidratação adequada pós-janela. É preciso ter muito cuidado para garantir que a janela esteja totalmente selada com fita adesiva e que não haja aberturas de ar. Dada a importância da fita permanecer totalmente aderida à superfície da casca de ovo e selar completamente o orifício, a superfície da casca de ovo ao redor do orifício precisa ser limpa e seca antes de aplicar a fita. Finalmente, é imperativo que nenhum vaso sanguíneo seja cortado inadvertidamente e que a allantois, que armazena resíduos líquidos do embrião, não seja danificada durante a dissecção das membranas extraembriônicas, pois qualquer uma delas é letal para o embrião. Deve-se notar que a viabilidade do embrião é maior quando pequenas lágrimas ao acorde e amnion são feitas, embora a lágrima deva ser suficientemente grande para posicionar as membranas extraembriônicas longe da região craniana. Se essas medidas cuidadosas forem tomadas durante a dissecção e remoção de membranas de ovos de alta qualidade, pode-se esperar que quase todos os embriões sobrevivam ao procedimento de janelas (~99%), enquanto ~40% dos embriões expostos sobrevivem ao E9 e ~30% ao E1211. Em nossa experiência, ferir as córneas dos embriões dissecados da membrana E7-E9 tem pouco impacto na viabilidade do embrião, e embriões amplos permanecem viáveis através do E18, momento em que a ferida da córnea está totalmente curada.
Alcançar feridas que atravessam o epitélio córnea e penetram no estroma anterior é essencial para produzir resultados confiáveis e reprodutíveis. Uma faca de micro dissecação de alta qualidade é necessária para que muito pouca pressão precise ser aplicada. O uso de um par de fórceps de íris curvados pode ser útil para embalar suavemente a cabeça, pois a laceração é feita com a outra mão. Desta forma, as fórceps de íris curvas servem como um backstop para que a córnea permaneça estacionária durante o ferimento. A penetração da ferida no estroma é variável, especialmente quando aprende, mas se torna mais reprodutível à medida que o pesquisador aprende a sensação e o olhar de quebrar o epitélio da córnea. Como se está aprendendo, pode ser útil ver córneas feridas em seção transversal para que a profundidade da penetração da ferida no estroma córnea possa ser avaliada (ver Figura 3B para um exemplo de córnea transversal exibindo profundidade de ferida ideal imediatamente após a laceração corneal).
Quando combinado com técnicas clássicas de biologia do desenvolvimento, como enxerto de tecidos e implantação de contas, ou abordagens modernas para manipulação genética, como eletroporação de DNA e infecção retroviral, este modelo animal de regeneração corneal promete revelar os fatores moleculares e mecanismos celulares necessários para alcançar a recuperação completa do tecido córnea após danos. Além disso, este modelo animal poderia ser usado para testar a utilidade potencial de compostos terapêuticos exógenos para aumentar a regeneração da córnea.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes em relação às informações apresentadas neste manuscrito.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Desenvolvimento Artístico e Acadêmico através da Universidade Wesleyan de Illinois para a TS e financiado em parte pelo NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
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