Summary
Den nuværende protokol demonstrerer de forskellige trin, der er involveret i at såre hornhinden hos en embryonal kylling i ovo. De regenererende eller fuldt restaurerede hornhinder kan analyseres for regenerativt potentiale ved hjælp af forskellige cellulære og molekylære teknikker efter sårproceduren.
Abstract
Chick embryonale hornhinde sår viser en bemærkelsesværdig evne til fuldt og hurtigt at regenerere, mens voksne sårede hornhinder oplever et tab af gennemsigtighed på grund af fibrotisk ardannelse. Vævsintegriteten af skadede embryonale hornhinder genoprettes iboende uden påviselig ardannelse. I betragtning af dets tilgængelighed og lette manipulation er kyllingeembryoet en ideel model til at studere reparation af arløse hornhindesår. Denne protokol demonstrerer de forskellige trin, der er involveret i at såre hornhinden af en embryonal kylling i ovo. For det første vinduesæg i tidlige embryonale aldre for at få adgang til øjet. For det andet udføres en række fysiske manipulationer af de ekstraembryoniske membraner for at sikre, at adgangen til øjet opretholdes gennem senere udviklingsstadier, svarende til når hornhindens tre cellulære lag dannes. For det tredje fremstilles lineære hornhindesår, der trænger ind i det ydre epitellag og det forreste stroma, ved hjælp af en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller fuldt restaurerede hornhinder kan analyseres for regenerativt potentiale ved hjælp af forskellige cellulære og molekylære teknikker efter sårproceduren. Undersøgelser til dato ved hjælp af denne model har afsløret, at sårede embryonale hornhinder viser aktivering af keratocytdifferentiering, gennemgår koordineret ombygning af ECM-proteiner til deres oprindelige tredimensionelle makrostruktur og bliver tilstrækkeligt re-innerveret af hornhinde sensoriske nerver. I fremtiden kan den potentielle indvirkning af endogene eller eksogene faktorer på den regenerative proces analyseres i helbredende hornhinder ved hjælp af udviklingsbiologiske teknikker, såsom vævstransplantation, elektroporation, retroviral infektion eller perleimplantation. Den nuværende strategi identificerer den embryonale kylling som et afgørende eksperimentelt paradigme til belysning af de molekylære og cellulære faktorer, der koordinerer arløs heling af hornhindesår.
Introduction
Hornhinden er det gennemsigtige, yderste væv i øjet, der transmitterer og bryder lys, der fremmer synsstyrken. Hos den voksne hornhinde fører beskadigelse eller infektion på hornhindestroma til en hurtig og robust sårhelingsrespons karakteriseret ved keratocytproliferation, fibrose, øget inflammation, der fører til cytokininduceret apoptose, generering af reparationsmyofibroblaster og generel ombygning af den ekstracellulære matrix (ECM)1,2 . Efter skade resulterer sådan reparation af hornhindevæv i uigennemsigtigt arvæv, der reducerer hornhindegennemsigtighed og okkluderer lysets passage og dermed forvrænger synet og i de mest alvorlige tilfælde fører til hornhindeblindhed3. Der er således et klart behov for at udvikle pålidelige dyremodeller for at løse kompleksiteten ved sårheling og identificere de cellulære og molekylære faktorer, der er ansvarlige for sårlukning og vævsregenerering.
Til dato har de fleste undersøgelser, der undersøger heling af hornhindesår, brugt postnatale4 eller voksne dyremodeller 1,2,5,6,7. Mens disse undersøgelser har ført til et betydeligt fremskridt i forståelsen af hornhindesårhelingsresponset og de mekanismer, der ligger til grund for ardannelse, undlader de beskadigede hornhindevæv i disse helbredende modeller fuldt ud at regenerere, hvilket begrænser deres anvendelighed til at identificere de molekylære faktorer og cellulære mekanismer, der er ansvarlige for fuldt ud at rekapitulere hornhindemorfologi og struktur efter skade. I modsætning hertil har fostersår genereret med en kniv i den embryonale kyllingehinden en iboende evne til at helbrede fuldt ud på en arløs måde8. Specifikt udviser den embryonale chick hornhinde nonfibrotisk regenerering med fuldstændig rekapitulering af den ekstracellulære matrixstruktur og innerveringsmønstre 8,9.
Den nuværende protokol beskriver en række trin, der er involveret i at såre hornhinden hos en embryonal kylling i ovo. For det første vindues æg i tidlige embryonale aldre for at lette adgangen til embryoet. For det andet udføres en række fysiske manipulationer af de ekstraembryoniske membraner for at sikre, at adgangen til øjet opretholdes gennem senere udviklingsstadier, svarende til når hornhindens tre cellulære lag dannes, og sår ønskes. For det tredje fremstilles lineære centrale hornhindeindsnit, der trænger gennem hornhindeepitelet og ind i det forreste stroma, ved hjælp af en mikrokirurgisk kniv. Regenereringsprocessen eller fuldt restaurerede hornhinder kan analyseres for regenerativt potentiale ved hjælp af forskellige cellulære og molekylære teknikker efter sårproceduren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den stamme af æg, der blev anvendt i denne protokol, var White Leghorn, og alle dyreprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Illinois Wesleyan University.
1. Inkubation af kyllingæg
- Opbevar æggene ved ~ 10 ° C i op til 1 uge efter, at de er lagt for at standse udviklingen. Når du er klar til at starte udviklingen af kyllingembryb, skal du tørre hele æggeskallen med fnugfri klude (se Materialetabel) mættet med vand ved stuetemperatur for at fjerne snavs og snavs.
- Sørg for, at æggeskallen er desinficeret. Tør hele æggeoverfladen af med fnugfri klude fugtet med 70% ethanol. Tør hurtigt ethanolen af for at tørre ægget og undgå ethanolabsorption gennem æggeskallen til embryoet.
- Arranger æggene vandret på en bakke. Marker toppen af ægget for at angive embryoets forventede position. Æggene inkuberes vandret med vuggefunktionen aktiveret i en befugtet inkubator på 38 °C.
2. Vindue æggene for at forberede sig på membrandissektion
- Fjern æg fra inkubatoren på den tredje dag af embryonal udvikling (E3). Steriliser toppen af æggene med fnugfri klude fugtet med 70% ethanol. Tør ethanolen fra æggeskallens overflader.
BEMÆRK: For at sikre, at udviklingen ikke blev forsinket under vinduesproceduren, blev 6-12 æg fjernet, og proceduren blev hurtigt udført på disse, mens de resterende æg blev efterladt i inkubatoren. - Placer et æg vandret i en sikker ægholder (se Materialetabel). Brug den skarpe ende af dissekeringssaksen til at skabe et lille hul i toppen af æggeskallen nær den spidse ende af ægget.
BEMÆRK: Dette hul letter fjernelsen af albumen, hvilket er nødvendigt for at droppe æggeblommen og embryoet væk fra den indre æggeskaloverflade. Til ægholdere blev der anvendt papirmasse ægfylderflader, inden for hvilke æggene kommer afsendt. - Gennem hullet (trin 2.2) indsættes en 18 G skrå kanyle. Med nålen skubbet til æggets nederste indre overflade og nålens skråside vendt mod æggets spidse ende (f.eks. væk fra den forventede placering af æggeblommen og embryoet nær midten af ægget), skal du fjerne 2-3 ml albumen fra kyllingægget og kassere.
BEMÆRK: Hvis ens nål hakker embryoet eller dets tilhørende vaskulatur under dette trin, vil det resultere i, at blod bliver aspireret med albumen. Dette vil resultere i embryodød. Yderligere, hvis æggeblommen utilsigtet aspireres sammen med albumen under dette trin, vil embryoet ikke være levedygtigt. I begge tilfælde skal ægget kasseres, hvis embryoet ikke umiddelbart kan anvendes til andre formål. - Rengør æggeskallens overflade omkring hullet med fnugfri klude, der er let fugtet med 70% ethanol, og tør den af. Forsegl hullet til fjernelse af albumen med klart tape.
- Med den skarpe ende af dissekeringssaksen laves et andet "vindueshul" i toppen af æggeskallen på markeringsstedet (trin 1.3.). Sørg for, at saksen ikke strækker sig for langt ind i æggeskallen for at undgå at kontakte og beskadige embryoet eller embryonal vaskulatur, som ofte vil blive placeret i ægget direkte under stedet for det andet hul.
- Brug buede iristang til at udvide "vindueshullet" til at spænde ~ 2-3 cm i diameter og tjene som et "vindue" til det udviklende embryo under skallen.
- Indsæt den ene ende af tangen i hullet, og hold den parallelt med og tæt sidestillet med æggeskallen. Med den anden pincet ende placeret uden for æggeskallen, skal du forsigtigt klemme de to pincetender sammen, så de kan bryde og fjerne små stykker af æggeskallen. Fortsæt med at bryde og fjerne æggeskalfragmenter, indtil der er et 2-3 cm vindue, der direkte overlejrer embryoet.
BEMÆRK: Æg, hvor embryoner ikke ligger direkte under hullet i trin 2.6. må ikke bruges, da de kommende membrandisektioner ville være udfordrende at gennemføre. Selv med at ryste æggene vandret er ca. 10% af æggene ubrugelige på grund af embryoets dårlige placering. Disse embryoner kan bruges til andre formål.
- Indsæt den ene ende af tangen i hullet, og hold den parallelt med og tæt sidestillet med æggeskallen. Med den anden pincet ende placeret uden for æggeskallen, skal du forsigtigt klemme de to pincetender sammen, så de kan bryde og fjerne små stykker af æggeskallen. Fortsæt med at bryde og fjerne æggeskalfragmenter, indtil der er et 2-3 cm vindue, der direkte overlejrer embryoet.
- For at begrænse bakteriel forurening tilsættes gennem vindueshullet (f.eks. i ægget) ~ 100-200 μL Ringers opløsning (8 g NaCl, 0,37 g KCl og 0,23 g CaCl2,2H 20 pr. L destilleret H20) indeholdende Penicillin / Streptomycin antibiotika (50 U / ml Penicillin og 50 μg / ml Streptomycin, se Materialetabel).
- Forsegl vindueshullet ved hjælp af klar tape. Udfør ægforseglingen ved at justere et hjørne af båndet på hullets lange akse og trykke båndet på skallen ~ 1-2 cm væk fra hullets kant.
- Fortsæt med at forsegle omkring åbningen, indtil en hængende tapeklap er tilbage på den ene side. Tryk de to stykker tape sammen, og skab en kuplet form over hullet, og tryk klappen af overhængende tape mod skallen for at afslutte forseglingen af ægget.
BEMÆRK: Æg skal vinduesses på enten E2 eller E3. Erfaringsmæssigt resulterer vinduesdannelse før E2 i lav embryolevedygtighed. Desuden bliver embryoet og ekstraembryoniske membraner ved E4 fastgjort til æggeskallen10, og ethvert forsøg på vindue på E4 eller senere resulterer ofte i embryoskade eller rivning af ekstraembryoniske blodkar, hvor begge begivenheder fører til resultatet af embryodød.
- Fortsæt med at forsegle omkring åbningen, indtil en hængende tapeklap er tilbage på den ene side. Tryk de to stykker tape sammen, og skab en kuplet form over hullet, og tryk klappen af overhængende tape mod skallen for at afslutte forseglingen af ægget.
- Returner de "vindueede" æg til inkubatoren for yderligere udvikling. Sørg for at holde æggene vandrette og sluk for inkubatorens gyngefunktion.
- Gentag trin 2.2.-2.9. for hvert æg.
3. Mikrodissektioner af de ekstraembryoniske membraner
- Fjern et E5.5 vinduesæg fra inkubatoren. Udsæt embryoet ved at skære båndet væk fra vinduet med steriliseret dissekeringssaks.
- Brug et dissekeringsmikroskop til at observere embryoet og dets ekstraembryoniske membraner gennem vinduet. Brug om nødvendigt saks eller buede iristang til at udvide vinduet, så embryoet er godt placeret under vinduet, og pas på ikke at beskadige den embryonale vaskulatur.
- Tilsæt to dråber Ringers opløsning indeholdende Penicillin / Streptomycin antibiotika for at hydrere embryoet og sterilisere ægget.
- Brug et dissekeringsmikroskop for at sikre, at embryoet er på det rette udviklingsstadium (Hamburger Hamilton trin 27, ~ E5.5)11,12 og lokalisere positionerne for amniochorionic membranen (ACM) og chorioallantoic membranen (CAM).
BEMÆRK: På dette stadium er embryoet omgivet af ACM, som omfatter fosterhinden og den overliggende chorionmembran smeltet og delvist dækket af den stærkt vaskulariserede allantois, der strækker sig fra embryoets tarmregion og smelter sammen med den overlejrende chorion for at danne CAM11,12. ACM er ikke stærkt vaskulariseret, hvilket gør det muligt at dissekere disse membraner for at udsætte embryoet uden at beskadige blodkar og skade embryoet. - Udfør ekstraembryoniske membrandissektioner på dette stadium (E5.5).
BEMÆRK: E5.5 er det ideelle tidspunkt at udføre de ekstraembryoniske membrandissektioner. Dissekering af membranerne tidligere (f.eks. ved E4) før CAM-dannelse reducerer embryotilgængeligheden på senere stadier11. Desuden er embryoet ved E5.5 kun delvist dækket af det stærkt vaskulariserede CAM, men i løbet af de næste 1-2 dage omslutter CAM hurtigt og forhindrer yderligere adgang til embryoet11,12. Af denne grund er membrandissektion ved E6 eller senere udfordrende, da risikoen for at rive blodkar øges.- Brug et par steriliserede fine tang til forsigtigt at gribe fat i ACM og trække den væk fra embryoet. Brug derefter steriliseret mikro-dissekering saks til at skære et hul i ACM direkte over forbenet, der strækker sig fra membranen, der ligger over forbenet til membranen, der ligger over hovedet.
BEMÆRK: Dette trin slapper af chorion- og amnionmembranerne, hvilket gør dem lettere at gribe og yderligere dissekere med tang i de næste trin. Se figur 1 for en nyttig skematisk oversigt over, hvordan membraner dissekeres gennem æggeskalsvinduet.
- Brug et par steriliserede fine tang til forsigtigt at gribe fat i ACM og trække den væk fra embryoet. Brug derefter steriliseret mikro-dissekering saks til at skære et hul i ACM direkte over forbenet, der strækker sig fra membranen, der ligger over forbenet til membranen, der ligger over hovedet.
- Brug to par fine, sterile tang til forsigtigt at gribe amnionen i to tilstødende positioner mellem ACM og CAM (f.eks. et område mellem snittet lavet over forbenet og den nærmeste kant af CAM).
- Flyt forsigtigt hvert par tang, begge fast greb om fosterhinden, væk fra hinanden, hvor det ene par bevæger sig dorsalt til embryoet og det andet ventralt.
BEMÆRK: Denne bevægelse tjener til at rive amnionen yderligere, samtidig med at den adskiller ACM (som bliver trukket i dorsal retning med hensyn til embryoet af et par tang) og CAM (som bliver trukket i ventral retning med hensyn til embryoet af det andet par tang). - Sørg for, at membranerne adskilles, når CAM ikke længere dækker embryoet, og den allantoiske arterie og vene, der stammer fra den embryonale tarm til CAM, er let synlige.
- Flyt forsigtigt hvert par tang, begge fast greb om fosterhinden, væk fra hinanden, hvor det ene par bevæger sig dorsalt til embryoet og det andet ventralt.
- Brug steriliserede fine pincet til at dissekere og fjerne eventuelle resterende amnionmembraner, der dækker embryoet. Det er mest almindeligt observeret, at den resterende amnion delvist vil dække den kaudale halvdel af embryoet.
- Brug steriliserede pincet til at gribe amnionen nær embryoets midtkraniale område og træk forsigtigt amnionen i en kaudal retning i forhold til embryoet mod den tidligere forskudte CAM. Embryoet vil nu være fuldt eksponeret, og yderligere vækst af CAM vil hovedsageligt forekomme væk fra det udviklende embryo.
BEMÆRK: Se figur 1 for et nyttigt skema over, hvordan det eksponerede embryo vil se ud efter membrandissektion. Se også en tidligere offentliggjort rapport11 for nyttige skematiske diagrammer over trin 3.3.-3.6.
- Brug steriliserede pincet til at gribe amnionen nær embryoets midtkraniale område og træk forsigtigt amnionen i en kaudal retning i forhold til embryoet mod den tidligere forskudte CAM. Embryoet vil nu være fuldt eksponeret, og yderligere vækst af CAM vil hovedsageligt forekomme væk fra det udviklende embryo.
- Tilsæt et par dråber Ringers opløsning indeholdende Penicillin / Streptomycin antibiotika for at hydrere embryoet og sterilisere ægget.
- Gensegl vindueshullet ved hjælp af klar tape som beskrevet i trin 2.8. Returner ægget til inkubatoren for yderligere udvikling, hold ægget vandret og hold inkubatorens gyngefunktion inaktiveret.
- Gentag trin 3.1.-3.8. for hvert æg.
BEMÆRK: De ekstraembryoniske membrandissektioner ved E5.5, der er beskrevet ovenfor, giver adgang til embryoet gennem E7, hvilket er, når sår kan udføres 8,9. Ved E8 begynder den fortsatte vækst af CAM-vævet at dække embryonets kraniale region, hvilket udelukker yderligere adgang til hornhinden. Hvis man ønsker at udføre sår i ældre E8-E9 hornhinder, er det muligt at omplacere den voksende CAM ventralt i forhold til embryoet (Trin 3.10.). Hvis man ønsker at såre ved E7, trin 3.10. er ikke nødvendigt at udføre, og man kan gå videre til trin 4, hornhindesår. - Et E7-æg fjernes fra inkubatoren, hvis ekstraembryoniske membraner tidligere er blevet dissekeret ved E5.5 (trin 3.1.-3.8.). Tag fat med steriliserede pincet ethvert tilgængeligt amnionmembranvæv, der er smeltet til CAM, og træk forsigtigt amnionmembranen væk fra embryoets kraniale område i ventral retning i forhold til embryoet.
BEMÆRK: Da den amnioniske membran, der forskydes væk fra embryoet, smeltes sammen med CAM, vil den voksende og stærkt vaskulariserede CAM følge de amnion-gribende tang og bevæge sig væk fra kranialområdet. Gentag dette trin dagligt for løbende at fortrænge CAM væk fra embryoet, indtil embryoet er i den ønskede alder for sår.
4. Sår på hornhinden
- Få et æg fra inkubatoren til sår i den ønskede embryonale alder, E7-E9. Udsæt embryoet ved at skære båndet væk fra vinduet med steriliseret dissekeringssaks. Tilsæt et par dråber Ringers opløsning indeholdende Penicillin / Streptomycin antibiotika for at hydrere embryoet og sterilisere ægget.
- Brug en mikrodiskeringskniv til at lave et snit, der spænder over omfanget af hornhinden i højre øje (på grund af hvordan embryoet ligger i ægget, er venstre øje ikke tilgængeligt, men kan tjene som en ikke-såret kontrol), som er parallel med og i overensstemmelse med choroidfissuren (figur 1). Det første snit vil krydse hornhindeepitelet.
- Brug mikrodiskeringskniven til igen at flænge hornhinden på samme sted som det første snit 2 gange mere (f.eks. tre snit i alt, hvor snit 2 og snit 3 forekommer sammen med samme position i hornhinden som skåret 1)11. Den anden laceration vil krydse kældermembranen, og den tredje vil trænge ind i den forreste stroma.
BEMÆRK: Hvis embryoet har lagt sig under den dissekerede CAM, kan man bruge steriliserede buede iristang til forsigtigt at flytte hovedet ud under CAM. Placer de buede iristang under hovedet, og kontakt med venstre side af hovedet. Hold hele hovedet oven på lukkede buede iristang, og hæv forsigtigt hovedet rundt om og over CAM'en. For at hjælpe med levedygtigheden skal du bruge en lignende teknik med de buede iristang til at gemme embryoet tilbage under CAM efter operationen for at fremme korrekt vækst af CAM.
- Brug mikrodiskeringskniven til igen at flænge hornhinden på samme sted som det første snit 2 gange mere (f.eks. tre snit i alt, hvor snit 2 og snit 3 forekommer sammen med samme position i hornhinden som skåret 1)11. Den anden laceration vil krydse kældermembranen, og den tredje vil trænge ind i den forreste stroma.
- Tilsæt 3-4 dråber Ringers opløsning indeholdende Penicillin / Streptomycin antibiotika for at hydrere embryoet og sterilisere ægget.
- Gense vindueshullet med klart tape og vend tilbage til inkubatoren, og lad ægget være vandret. Lad embryoet udvikle sig og hornhindesåret hele i en ønsket periode (f.eks. 0,5-11 dage), og afliv derefter embryoet humant ved halshugning.
- Brug buede iristang til at høste øjet fra et aflivet embryo, der flyder i en petriskål af Ringers saltopløsning ved forsigtigt at gribe øjet på dets bageste side, hvor øjet og ansigtsvævet mødes, og forsigtigt løfte hele øjet væk og fri fra ansigtsvævet.
- Brug fine tang til at stikke et lille hul (3-5 cm) bag på hele øjet og fastgør hele øjet i 4% paraformaldehyd ved 4 °C natten over med let omrøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den tidligere dissektion af ACM og CAM ved E5.5 for at afsløre kranieområdet i det udviklende embryo blev der lavet en række flænger, der strakte sig over E7 central hornhinden i ovo (figur 1). Et ideelt sår til at studere hornhinderegenerering opstår efter tre lacerations, hver lavet på samme sted af hornhinden. Den første laceration krydser hornhindeepitelet, mens den anden og tredje laceration trænger ind i henholdsvis den underliggende kældermembran og forreste stroma. For at opnå et ideelt sår er det afgørende at bruge en skarp mikrodissektionskniv (se Materialetabel) og anvende den korrekte mængde tryk, når flængen er lavet (figur 2, se ideelt sår). Anvendelse af for lidt tryk vil resultere i et lavt sår, der river hornhindeepitelet uden tilstrækkeligt at trænge ind i det forreste stroma (figur 2, se lavt sår). Alligevel resulterer for meget tryk i et sår i fuldt omfang, der trænger ind i hele stromaet og udsætter den vandige humor for det ydre miljø (figur 2, se sår i fuld udstrækning).
Udførelse af de korrekte lacerating snit producerer et ideelt sår (figur 2), der oprindeligt forstørres (0-3 dage efter sår)8 (figur 3). Det er blevet postuleret, at fasen med sårforstørrelse, der opstår ved at såre E7 kyllingehornhinder, er relateret til den hurtige udvidelse af øjenstørrelsen på dette embryonale stadium8. Embryonale kyllingeøjne vokser betydeligt hurtigere fra E4 til E10 sammenlignet med øjenvæksten fra E10 til udklækning. Disse tidlige hurtige faser af øjenvækst tilskrives forhøjet intraokulært tryk (IOP) -afhængig vækst13. Derfor er det sandsynligt, at øjets hurtige vækstrate kombineret med den forhøjede IOP fremmer sårretraktion i de tidlige faser af helingsprocessen (0-3 dage efter sår), hvilket er unikt for den embryonale hornhinde sårhelingsprogression. Derefter forekommer re-epitelisering og dannelse af nyt væv (4-9 dage efter sår) for i sidste ende at lukke såret på en arfri måde med 11 dage efter sår8 (figur 3A).
Yderligere analyse af sårdybde og regenerering var mulig ved farvning af tværsnit med et lamininantistof, der markerer den lamininrige kældermembran og modfarvning af sektionerne med atommarkøren DAPI, som afslører sårets omfang gennem hornhindeepitelet8. Nyligt sårede hornhinder (0 dpw) og dem, der er tidligt i regenereringsprocessen (3 dpw), viste, at såret trængte ind i epitellaget og kældermembranen, som det fremgår af indbrudsfarvningen af kernemarkøren DAPI i hornhindeepitelet og fraværet af lamininantistoffarvning, som markerer den lamininrige kældermembran mellem hornhindeepitelet og underliggende stroma8 (figur 3B ). Tværsnit gennem 11 dpw hornhinder farvet med DAPI og laminin antistof afslørede imidlertid en fuldstændig helet hornhinde, der var blevet re-epithelialiseret og indeholdt en kontinuerlig laminin-rig kældermembran på stedet for det regenererede sår8 (figur 3B).
Efter hornhindeindsnittet blev detaljeret karakterisering af sårhelingsprocessen opnået ved at udføre immunohistokemi på snittede, sårede hornhindevæv. De ekstracellulære matrixproteiner fibronectin og tenascin er forbundet med epitel- og keratocytcellemigration til helbredende voksne hornhindesår14,15. Spatiotemporal lokalisering af de ekstracellulære matrixproteiner, fibronectin og tenascin er tydelig i det helbredende sår og viste sig at være forhøjet ved tidspunkter svarende til hornhinderepitelisering (5 dage efter sår)8 (figur 4). En sådan analyse antyder betydningen af fibronectin og tenascin for sårlukning og specifikt deres involvering i epitelcellemigration og overlevelse, i overensstemmelse med sådanne funktioner i voksne hornhindesår16,17.
Fra E8-E9 bliver hornhinden tæt innerveret af trigeminus sensoriske nervefibre, der stammer fra en pericorneal nervering og krydser gennem den forreste stroma, når de projicerer mod hornhindens centrum og hornhindeepitelet med E12 18,19,20. Da hornhindesår i denne model er lavet på E7, kort før nerveprojektion i hornhinden, undersøger denne model yderligere hornhindenerver, når de navigerer i en helbredende hornhinde efter fornærmelse. Ved at bruge helmonteret immunhistokemi til at spore hornhindenerver med anti-β neural tubulin (Tuj1) antistoffer21, er det tydeligt, at nerver midlertidigt hæmmes fra det helbredende hornhindevæv, der direkte sidestiller den sårede, centrale hornhinde (5 dage efter sår)8 (figur 5A, B). På trods af tidligere hæmning innerverer hornhindenerver til sidst det fuldt helede hornhindevæv (11 dage efter sår) til lignende tæthedsniveauer og i lignende mønstre til scenematchede, ikke-sårede kontroller (E18C) (figur 5C, D).
Påfaldende viser fuldt re-epithelialiserede hornhindevæv, der er helet på en ikke-fibrotisk, arløs måde, en komplet rekapitulering af den normale kollagenvævsarkitektur. Som det fremgår af anden generations harmonisk billeddannelse22,23, er bundter af kollagenfibre gennem varierende dybder af det centrale hornhindesårområde arrangeret ortogonalt, hvilket matcher den oprindelige makrostruktur af ikke-såret centralt hornhindevæv9 (figur 6).
Figur 1: Skematisk af in ovo ekstraembryoniske membrandisektioner og hornhindesår. Ved E5.5 eksponeres embryonets kraniale område ved at dissekere ACM- og CAM-membranerne og placere amnion og allantois væk fra det udviklende øje. Æg forsegles og inkuberes til E7, når den centrale hornhinde er såret, ved hjælp af buede tang som vugge til embryohovedet, da spidsen af en mikrokirurgisk kniv gør et snit i den centrale hornhinde. Såret er orienteret parallelt med choroidfissuren (stjerne). For at sikre, at snitdybden når den forreste stroma, skal der foretages tre samtidige snit med kniven, hver i samme relative position, den ene over den anden. Skala bar = 1 mm. Figuren er tilpasset med tilladelse frareferencerne 8,11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Variationer i sår genereret i ovo. (A) Efter membrandissektion ved E5.5 er højre øje tilgængeligt i ovo. (B-D) Billeder taget af et in ovo embryo umiddelbart efter flænger af varierende grad, der spænder over hornhindens udstrækning og er i overensstemmelse med choroidfissuren (jf. (B) Efter tre flænger, hvor svagt tryk blev påført, er et lavt sår synligt. Pilespidsen markerer et sted i hornhinden, hvor epitelet er blevet klippet, men det forreste stroma ikke er blevet penetreret. Pilespidser betegner en lille hornhinderegion, hvor den forreste stroma er blevet penetreret. (C) Efter tre flænger, hvor der blev påført en ideel mængde tryk, er et ideelt sår synligt. Pilespidser betegner et sår, der spænder over hele hornhinden, hvor det forreste stroma er blevet penetreret. (D) Efter tre flænger, hvor der blev påført for stort tryk, er et sår i fuldt omfang synligt, og den vandige humor er blevet udsat for det ydre miljø. Forkortelser: tca, temporal ciliary arterie; jf. choroid sprække; CAM, chorioallantoic membran. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sårhelingsprogression. (A) Progression af heling i sårede hornhinder sammenlignet med fasematchede kontroller er vist fra sårtidspunktet (0 dpw) og 16 timer efter sår (hrpw) til 3-11 dage efter sår (dpw). Pilespidser afgrænser sårets dorsale og ventrale grænser, hvilket indikerer en periode med sårudvidelse (0-3 dpw) efterfulgt af progressiv sårlukning (5-11 dpw). (B) Sektionsopdelte DAPI (blå)- og laminin (rød)-farvede sårede hornhinder ved 0, 3 og 11 dpw. Parenteser viser omfanget af den sårede region, som afslører sårudvidelse med 3 dpw og fuld reparation af den re-epithelialiserede hornhinde af E11. Stjerner betegner hornhindens helbrede region. Skalabjælken er (A) 1 mm, (B) 100 μm. Figuren er tilpasset med tilladelse fra reference8. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Histologisk analyse af sårede hornhinder. Tværsnit til (A) 3 dpw og (B) 5 dpw. DAPI-farvede (blå) sårede hornhinder afslører lokaliseringen af fibronectin (FN, rød) og Tenascin-C (TN-C, grøn). Parenteser i (A) og (B) angiver det sårede område. Skala bar: 100 μm. Forkortelser: ep, epitel; st, stroma; da, endotel. Figuren er tilpasset med tilladelse fra reference8. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Innervering af sårede hornhinder. (A-D) Visualisering af hornhindenerverne efter anti-β neural tubulin (Tuj1) helmonteret immunstaining i (B) 5 dpw og (D) 11 dpw hornhinder samt (A) trinmatchet E12 (E12C, stage-matched for 5 dpw) og (C) E18 kontroller (E18C, stage-matched for 11 dpw). (B) Den brudte linje i hornhinden på 5 dpw angiver sårets omfang. Det parentesede område direkte ved siden af såret betegner hornhindeområdet, der midlertidigt er frastødende for nerver og aktivt gennemgår re-epitelisering. (B') Optisk scanning gennem det helbredende hornhindevæv direkte ved siden af det åbne sår afslører et sjældent stromalt nervebundt, der strækker sig ind i vævet (pil) og epitelnervensnore (pilespids). (C,D) Fuldt regenererede hornhinder ved 11 dpw viser lignende innerveringsmønstre og sammenlignelige nervetætheder til scenematchede kontroller. Forkortelse: w, sår. Figuren er tilpasset med tilladelse fra reference8. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kollagen ultrastruktur i helede embryonale hornhinder. (A) En ansigtsscanning af fuldt helede 10 dpw hornhinder og scenematchede kontroller ved hjælp af anden generations harmonisk billeddannelse (SGH). Scanningsdybder spænder fra 2-66 μm fra hornhindens forreste overflade (0 μm er den mest forreste stroma) og er angivet til venstre for de respektive billeder. Indsatser for hvert billede svarer til Fast Fourier-transformationsanalysen af det centrale sårområde for den pågældende scanningsdybde. (B) Manuelt segmenterede stakke af todimensionel Fast Fourier-transformationsanalyse, der repræsenterer kollagenorganisation inden for den sårede og scenematchede kontrolhornhinde. Skala bar = 50 μm. Figuren er tilpasset med tilladelse fra reference9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kyllingen er et ideelt modelsystem til undersøgelse af føtal, arløs hornhinde sårreparation. I modsætning til pattedyr er kyllingen let tilgængelig under hele udviklingen ved hjælp af ovo8 eller ex ovo strategier24. Den embryonale kyllingehinden er meget større end gnaverhornhinder, med næsten 50% af kranialvolumenet dedikeret til øjet25, hvilket gør det meget modtageligt for fysiske manipulationer såsom sår. Desuden er kyllingæg let tilgængelige året rundt, ofte fra lokale gårde, og omkostningseffektive, hvilket kun kræver en ydmyget inkubator til støtte for udviklingen.
Denne protokol rapporterer en række procedurer, der muliggør embryonal chick hornhinde sår. Sår lavet til den embryonale chick hornhinde regenererer fuldt ud, hvilket muliggør en fuldstændig rekapitulering af den oprindelige hornhindestruktur uden påviselig ardannelse. Denne teknik har gjort den embryonale kylling til en vital dyremodel til belysning af de molekylære og cellulære faktorer, der koordinerer arløs heling af hornhindesår.
På trods af det klare løfte, der er forbundet med den føtale sårhelingsmodel, der er beskrevet heri, er det værd at bemærke, at der er klare forskelle mellem foster- og voksen hornhindesårheling. Den embryonale hornhinde udtrykker vækstfaktorer og morfogenetiske signaler, der er tavse eller fraværende i voksne væv26. Desuden udviser sårede voksne hornhindevæv fibrose og danner arvæv, sandsynligvis på grund af en øget inflammatorisk respons medieret af cytokiner og vækstfaktorer27, som er dæmpet eller endnu ikke etableret på embryonale stadier. Sådanne aldersrelaterede forskelle i hornhindevævet kan komplicere bestræbelserne på at genoprette voksent såret væv fuldt ud. Ikke desto mindre vil bestemmelse af nøglemolekylære faktorer og matrixproteiner, der regulerer føtal arløs sårheling, bane vejen for terapier, der fremmer en mere genoprettende helingsproces med mindre ardannelse og bedre rekapitulering af den normale vævsarkitektur.
Den her beskrevne sårmetode bygger på en teknik, der først blev udviklet af Spurlin et al.11 for at få adgang til sene kyllingeembryoner (f.eks. >E6). Ved at vindue ægget og dissekere ekstraembryoniske membraner væk fra kranialområdet er det embryonale øje tilgængeligt for stadier så sent som E7. Som vi tidligere har rapporteret, påvirker fjernelsen og forskydningen af henholdsvis de amniochorioniske og chorioallantoiske membraner ikke embryonal udvikling11. Eksponerede embryoner er levedygtige og er let modtagelige for fysisk manipulation. På dette stadium har hornhinden tre forskellige lag (epitel, stroma og endotel), hvilket gør den velegnet til sårhelingsundersøgelser efter lineær snit i den forreste stroma. Det skal bemærkes, at på grund af stigende allantoisvækst over tid, er adgangen til øjet til sidst okkluderet på E8. For at omgå dette problem, hvis adgang til senere stadier af øjne til sår er ønskelig, har vi fundet ud af, at adgangen til øjet kan opretholdes gennem E9 ved at udføre daglig manipulation af de ekstraembryoniske membraner (f.eks. Ved E7, E8 osv.), Hvor allantois omhyggeligt omplaceres væk fra kranieområdet for at sikre, at dets vækst sker retningsmæssigt væk fra embryoet. Dette gør det muligt at såre hornhinder på disse senere stadier (f.eks. Efter innervering).
Samlet set er embryo levedygtighed og overlevelsesevne i denne teknik afhængig af flere faktorer, såsom at sikre, at et sterilt og hydreret ægmiljø opretholdes, samtidig med at man yderligere skal være forsigtig med ikke at påføre embryonale blodkar eller allantois skade. Hele ægoverfladen skal steriliseres med ethanol inden vindue for at opretholde sterilitet. Dette skyldes, at små æggeskalsfragmenter, som ofte er fyldt med mikrober, typisk vil falde ind i ægget under vinduesproceduren. På samme måde skal alle værktøjer, der er involveret i vindues-, membrandisektioner og fremstilling af hornhindeindsnittet, skylles grundigt i ethanol og tørres eller flammesteiliseres inden deres anvendelse. Desuden bør antibiotika tilsættes til ægget, når som helst embryoet udsættes for det ydre miljø. Det er endvidere afgørende, at embryoet bevarer korrekt hydrering efter vinduesåbning. Der skal udvises stor omhu for at sikre, at vinduet er helt forseglet med tape, og at der ikke er lufthuller tilbage. I betragtning af vigtigheden af, at båndet forbliver fuldt klæbet til æggeskallets overflade og forsegler hullet fuldstændigt, skal æggeskaloverfladen omkring hullet rengøres og tørres, inden båndet påføres. Endelig er det bydende nødvendigt, at ingen blodkar utilsigtet skæres, og at allantois, der opbevarer flydende affald fra embryoet, ikke beskadiges under dissektionen af de ekstraembryoniske membraner, da begge er dødelige for embryoet. Det skal bemærkes, at embryoets levedygtighed er højere, når der laves mindre tårer til chorion og amnion, selvom tåren skal være tilstrækkelig stor til at placere de ekstraembryoniske membraner væk fra kranialområdet. Hvis disse omhyggelige skridt tages under dissektion og fjernelse af membraner fra æg af høj kvalitet, kan man forvente, at næsten alle embryoner overlever vinduesproceduren (~ 99%), mens ~ 40% af de udsatte embryoner overlever til E9 og ~ 30% til E1211. Efter vores erfaring har sårning af hornhinderne af E7-E9-membran dissekerede embryoner ringe indflydelse på embryoets levedygtighed, og rigelige embryoner forbliver levedygtige gennem E18, på hvilket tidspunkt hornhindesåret er fuldt helet.
At opnå sår, der krydser hornhindeepitelet og trænger ind i det forreste stroma, er afgørende for at producere pålidelige og reproducerbare resultater. En mikro-dissekeringskniv af høj kvalitet er nødvendig, så der skal påføres meget lidt tryk. Brug af et par buede iristang kan være nyttigt at forsigtigt vugge hovedet, da lacerationen er lavet med den anden hånd. På denne måde tjener de buede iristang som bagstopper, så hornhinden forbliver stationær under såret. Sårets indtrængning i stroma er variabel, især når man lærer, men bliver mere reproducerbar, da forskeren lærer følelsen og udseendet af at bryde hornhindeepitelet. Som man lærer, kan det være nyttigt at se sårede hornhinder i tværsnit, så dybden af sårindtrængning i hornhindestroma kan vurderes (se figur 3B for et eksempel på en tværsnits hornhinde, der viser ideel sårdybde umiddelbart efter hornhindelakation).
Når det kombineres med klassiske udviklingsbiologiske teknikker, såsom vævstransplantation og perleimplantation, eller moderne tilgange til genmanipulation, såsom DNA-elektroporation og retroviral infektion, lover denne dyremodel af hornhinderegenerering at afsløre de molekylære faktorer og cellulære mekanismer, der er nødvendige for at opnå fuldstændig genopretning af hornhindevævet efter skade. Endvidere kan denne dyremodel bruges til at teste den potentielle anvendelighed af eksogene terapeutiske forbindelser til at øge hornhinderegenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser med hensyn til de oplysninger, der præsenteres i dette manuskript.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et kunstnerisk og videnskabeligt udviklingsstipendium gennem Illinois Wesleyan University til TS og finansieret delvist af NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
