Summary
Настоящий протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Регенерирующая или полностью восстановленная роговица может быть проанализирована на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранения.
Abstract
Эмбриональные раны роговицы цыплят демонстрируют замечательную способность к полной и быстрой регенерации, тогда как взрослые раненые роговицы испытывают потерю прозрачности из-за фиброзного рубцевания. Тканевая целостность поврежденных эмбриональных роговиц восстанавливается без обнаружения образования рубцов. Учитывая его доступность и простоту манипуляций, эмбрион цыпленка является идеальной моделью для изучения заживления ран роговицы без шрамов. Этот протокол демонстрирует различные этапы, связанные с ранением роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте для доступа к глазу. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда формируются три клеточных слоя роговицы. В-третьих, линейные раны роговицы, которые проникают во внешний эпителиальный слой и переднюю строму, изготавливаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования. Исследования, проведенные на сегодняшний день с использованием этой модели, показали, что раненые эмбриональные роговицы демонстрируют активацию дифференцировки кератоцитов, подвергаются скоординированному ремоделированию белков ECM в их родную трехмерную макроструктуру и адекватно реиннервируются сенсорными нервами роговицы. В будущем потенциальное влияние эндогенных или экзогенных факторов на регенеративный процесс может быть проанализировано при заживлении роговицы с использованием методов биологии развития, таких как пересадка тканей, электропорация, ретровирусная инфекция или имплантация бусин. Текущая стратегия определяет эмбрионального цыпленка как важнейшую экспериментальную парадигму для выяснения молекулярных и клеточных факторов, координирующих заживление ран роговицы без шрамов.
Introduction
Роговица - это прозрачная, самая внешняя ткань глаза, которая пропускает и преломляет свет, способствующий остроте зрения. Во взрослой роговице повреждение или инфекция стромы роговицы приводит к быстрой и надежной реакции заживления ран, характеризующейся пролиферацией кератоцитов, фиброзом, усилением воспаления, приводящего к цитокин-индуцированному апоптозу, генерацией репарации миофибробластов и общим ремоделированием внеклеточного матрикса (ECM)1,2 . После травмы такое восстановление ткани роговицы приводит к непрозрачной рубцовой ткани, которая снижает прозрачность роговицы и закупоривает прохождение света, тем самым искажая зрение и, в наиболее тяжелых случаях, приводя к слепоте роговицы3. Таким образом, существует явная необходимость в разработке надежных животных моделей для решения сложных проблем заживления ран и выявления клеточных и молекулярных факторов, ответственных за закрытие раны и регенерацию тканей.
На сегодняшний день в большинстве исследований, изучающих заживление ран роговицы, использовались послеродовыемодели 4 или взрослых животных 1,2,5,6,7. Хотя эти исследования привели к значительному прогрессу в понимании реакции заживления раны роговицы и механизмов, лежащих в основе образования рубцов, поврежденные ткани роговицы в этих моделях заживления не могут полностью регенерировать, что ограничивает их полезность для идентификации молекулярных факторов и клеточных механизмов, ответственных за полное повторение морфологии и структуры роговицы после травмы. Напротив, раны плода, полученные ножом в эмбриональной роговице цыпленка, обладают внутренней способностью полностью заживать без шрамов8. В частности, эмбриональная роговица цыпленка демонстрирует нефибротическую регенерацию с полной рекапитуляцией структуры внеклеточного матрикса и паттернами иннервации 8,9.
Настоящий протокол описывает последовательность этапов, участвующих в ранении роговицы эмбрионального цыпленка в ово. Во-первых, яйцеклетки открываются в раннем эмбриональном возрасте, чтобы облегчить доступ к эмбриону. Во-вторых , проводится серия in ovo физических манипуляций с внеэмбриональными мембранами, чтобы обеспечить поддержание доступа к глазу на более поздних стадиях развития, соответствующих тому, когда образуются три клеточных слоя роговицы и желательна ранение. В-третьих, линейные центральные разрезы роговицы, проникающие через эпителий роговицы и в переднюю строму, делаются с помощью микрохирургического ножа. Процесс регенерации или полностью восстановленная роговица могут быть проанализированы на регенеративный потенциал с использованием различных клеточных и молекулярных методов после процедуры ранирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Штамм яиц, используемых в этом протоколе, был White Leghorn, и все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Иллинойса Уэслиан.
1. Инкубация куриных яиц
- Держите яйца при ~ 10 ° C в течение 1 недели после их откладывания, чтобы остановить развитие. Когда вы будете готовы начать развитие эмбриона цыпленка, протрите всю яичную скорлупу безворсовыми салфетками (см. Таблицу материалов), насыщенными водой комнатной температуры, чтобы удалить грязь и мусор.
- Убедитесь, что яичная скорлупа продезинфицирована. Протрите всю поверхность яйца безворсовыми салфетками, смоченными 70% этанолом. Быстро вытрите этанол, чтобы высушить яйцо и избежать поглощения этанола через яичную скорлупу эмбрионом.
- Расположите яйца горизонтально на подносе. Отметьте верхнюю часть яйцеклетки, чтобы обозначить ожидаемое положение эмбриона. Инкубируйте яйца горизонтально, с включенной функцией раскачивания, в увлажненном инкубаторе при температуре 38 °C.
2. Оконная обработка яиц для подготовки к рассечению мембраны
- Вынимайте яйца из инкубатора на третий день эмбрионального развития (Е3). Стерилизуйте верхнюю часть яиц безворсовыми салфетками, смоченными 70% этанолом. Высушите этанол с поверхности яичной скорлупы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать, что развитие не задерживалось во время процедуры окна, было удалено 6-12 яиц, и процедура была быстро проведена на них, в то время как оставшиеся яйца были оставлены в инкубаторе. - Расположите яйцо горизонтально в надежном держателе для яиц (см. Таблицу материалов). Используя острый конец рассекающих ножниц, создайте небольшое отверстие в верхней части яичной скорлупы возле заостренного конца яйца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это отверстие облегчит удаление белка, который необходим для удаления желтка и эмбриона от внутренней поверхности яичной скорлупы. Для держателей яиц использовались бумажные целлюлозные наполнители для яиц, в которые отправляются яйца. - Через отверстие (Этап 2.2.) вставьте скошенную иглу для подкожных инъекций весом 18 г. Прижав иглу к нижней внутренней поверхности яйца и конической стороне иглы, обращенной к заостренному концу яйца (например, вдали от ожидаемого расположения желтка и эмбриона около середины яйца), удалите 2-3 мл белка из куриного яйца и выбросьте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла проткнет эмбрион или связанную с ним сосудистую систему во время этого этапа, это приведет к аспирации крови с белком. Это приведет к гибели эмбриона. Кроме того, если желток непреднамеренно аспирируется вместе с белком во время этой стадии, эмбрион не будет жизнеспособным. В любом случае яйцеклетка должна быть выброшена, если эмбрион не может быть немедленно использован для других целей. - Очистите поверхность яичной скорлупы, окружающую отверстие, безворсовыми салфетками, слегка смоченными 70% этанолом, и вытрите насухо. Запечатайте отверстие, предназначенное для удаления белка, прозрачной лентой.
- Острым концом рассечения ножницами сделайте второе «оконное» отверстие в верхней части яичной скорлупы на месте маркировки (Шаг 1.3.). Убедитесь, что ножницы не простираются слишком далеко в яичную скорлупу, чтобы избежать контакта и повреждения эмбриона или эмбриональной сосудистой системы, которая часто будет расположена внутри яйца непосредственно под местом второго отверстия.
- Используя изогнутые щипцы радужной оболочки, расширьте «оконное» отверстие до ~2-3 см в диаметре и послужит «окном» для развивающегося эмбриона под оболочкой.
- Вставьте один конец щипцов в отверстие, удерживая его параллельно и близко сопоставляя с яичной скорлупой. Когда конец других щипцов расположен за пределами яичной скорлупы, осторожно зажмите два конца щипцов вместе, позволяя им сломать и удалить небольшие кусочки яичной скорлупы. Продолжайте разбивать и удалять фрагменты яичной скорлупы до тех пор, пока не останется окно размером 2-3 см, которое непосредственно накладывается на эмбрион.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца, в которых эмбрионы не лежат непосредственно под отверстием, сделанным на этапе 2.6. не должны использоваться, поскольку предстоящие мембранные вскрытия будут сложными для завершения. Даже при раскачивании яиц горизонтально около 10% яиц непригодны для использования из-за плохого позиционирования эмбриона. Эти эмбрионы могут быть использованы и для других целей.
- Вставьте один конец щипцов в отверстие, удерживая его параллельно и близко сопоставляя с яичной скорлупой. Когда конец других щипцов расположен за пределами яичной скорлупы, осторожно зажмите два конца щипцов вместе, позволяя им сломать и удалить небольшие кусочки яичной скорлупы. Продолжайте разбивать и удалять фрагменты яичной скорлупы до тех пор, пока не останется окно размером 2-3 см, которое непосредственно накладывается на эмбрион.
- Чтобы ограничить бактериальное загрязнение, добавьте через оконное отверстие (например, в яйцо) ~100-200 мкл раствора Рингера (8 г NaCl, 0,37 г KCl и 0,23 г CaCl2,2H 20 на л дистиллированногоH20), содержащего антибиотики пенициллина/стрептомицина (50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, см. Таблицу материалов).
- Закройте отверстие в окне с помощью прозрачной клейкой ленты. Выполните герметизацию яйца, выровняв угол ленты по длинной оси отверстия и прижав ленту к скорлупе ~1-2 см от края отверстия.
- Продолжайте герметизацию вокруг отверстия до тех пор, пока с одной стороны не останется висячий клапан ленты. Прижмите два куска ленты вместе, создав куполообразную форму над отверстием, и прижмите лоскут нависающей ленты к скорлупе, чтобы закончить запечатывание яйца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца должны быть ококулены на E2 или E3. Согласно опыту, окошко до E2 приводит к низкой жизнеспособности эмбриона. Кроме того, к E4 эмбрион и внеэмбрионарные мембраны прикрепляются к яичной скорлупе10, и любые попытки проникнуть в E4 или позже часто приводят к повреждению эмбриона или разрыву внеэмбриональных кровеносных сосудов, причем любое из этих событий приводит к смерти эмбриона.
- Продолжайте герметизацию вокруг отверстия до тех пор, пока с одной стороны не останется висячий клапан ленты. Прижмите два куска ленты вместе, создав куполообразную форму над отверстием, и прижмите лоскут нависающей ленты к скорлупе, чтобы закончить запечатывание яйца.
- Верните «оконные» яйца в инкубатор для дальнейшего развития. Убедитесь, что яйца остаются горизонтальными и выключают функцию раскачивания инкубатора.
- Повторите шаги 2.2.-2.9. за каждое яйцо.
3. Микродиссекции внеэмбриональных мембран
- Извлеките из инкубатора яйцо с окнами E5.5. Обнажите эмбрион, отрезав ленту от окна стерилизованными рассекающими ножницами.
- Используйте рассекающий микроскоп для наблюдения за эмбрионом и его внеэмбриональными мембранами через окно. При необходимости используйте ножницы или изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы расширить окно так, чтобы эмбрион хорошо располагался под окном, заботясь о том, чтобы не повредить эмбриональную сосудистую систему.
- Добавьте две капли раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина / стрептомицина, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
- Используйте рассекающий микроскоп, чтобы убедиться, что эмбрион находится на правильной стадии развития (стадия Гамбургера Гамильтона 27, ~ E5.5)11,12 и определить положения амниохориональной мембраны (ACM) и хориоаллантоической мембраны (CAM).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии эмбрион окружен ACM, который содержит амниотическую мембрану и вышележащую хорионическую мембрану, слитую и частично покрытую высоковаскуляризированным аллантоисом, который простирается от области кишечника эмбриона и сливается с накладным хорионом, образуя CAM11,12. ACM не сильно васкуляризирован, что позволяет рассечь эти мембраны, чтобы обнажить эмбрион, не повреждая кровеносные сосуды и не нанося вреда эмбриону. - На этом этапе выполняют экстраэмбриональные рассечения мембран (Е5.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: E5.5 является идеальным временем для проведения экстраэмбриональных мембранных рассечений. Рассечение мембран ранее (например, при E4) до образования CAM снижает доступность эмбриона на более поздних стадиях11. Более того, при E5.5 эмбрион лишь частично покрывается высоковаскуляризированным CAM, но в течение следующих 1-2 дней CAM быстро обволакивает и исключает дальнейший доступ к эмбриону11,12. По этой причине рассечение мембраны при E6 или более позднем уровне является сложной задачей, поскольку риск разрыва кровеносных сосудов увеличивается.- Используйте пару стерилизованных тонких щипцов, чтобы осторожно схватить ACM и оттянуть его от эмбриона. Затем используйте стерилизованные микродиссекции ножницы, чтобы вырезать отверстие в ACM непосредственно над передней конечностью, которое простирается от мембраны, покрывающей переднюю часть, до мембраны, покрывающей голову.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг расслабляет мембраны хориона и амниона, тем самым облегчая их захват и дальнейшее рассечение щипцами на следующих шагах. Смотрите рисунок 1 для полезной схемы того, как мембраны рассекаются через окно яичной скорлупы.
- Используйте пару стерилизованных тонких щипцов, чтобы осторожно схватить ACM и оттянуть его от эмбриона. Затем используйте стерилизованные микродиссекции ножницы, чтобы вырезать отверстие в ACM непосредственно над передней конечностью, которое простирается от мембраны, покрывающей переднюю часть, до мембраны, покрывающей голову.
- Используйте две пары тонких стерильных щипцов, чтобы осторожно захватить амнион в двух соседних положениях между ACM и CAM (например, область между срезом, сделанным над передней конечностью и ближайшим краем CAM).
- Осторожно переместите каждую пару щипцов, которые крепко захватывают амниотическую мембрану, подальше друг от друга, причем одна пара движется дорсально к эмбриону, а другая вентрально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это движение служит для дальнейшего разрыва амниона, а также для разделения ACM (который тянется в дорсальном направлении по отношению к эмбриону одной парой щипцов) и CAM (который тянется в вентральном направлении по отношению к эмбриону другой парой щипцов). - Убедитесь, что мембраны разделены, когда CAM больше не покрывает эмбрион, и аллантоидная артерия и вена, которые исходят от эмбрионального кишечника к CAM, легко очевидны.
- Осторожно переместите каждую пару щипцов, которые крепко захватывают амниотическую мембрану, подальше друг от друга, причем одна пара движется дорсально к эмбриону, а другая вентрально.
- Используйте стерилизованные тонкие щипцы для рассечения и удаления оставшейся амнионной мембраны, покрывающей эмбрион. Чаще всего наблюдается, что оставшийся амнион частично покрывает каудальную половину эмбриона.
- Используя стерилизованные щипцы, захватите амнион около средней черепной области эмбриона и осторожно потяните амнион в каудальном направлении по отношению к эмбриону к ранее смещенному CAM. Эмбрион теперь будет полностью обнажен, и дальнейший рост CAM будет в основном происходить вдали от развивающегося эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для полезной схемы о том, как будет выглядеть обнаженный эмбрион после рассечения мембраны. Кроме того, обратитесь к ранее опубликованному отчету11 для получения полезных принципиальных схем шагов 3.3.-3.6.
- Используя стерилизованные щипцы, захватите амнион около средней черепной области эмбриона и осторожно потяните амнион в каудальном направлении по отношению к эмбриону к ранее смещенному CAM. Эмбрион теперь будет полностью обнажен, и дальнейший рост CAM будет в основном происходить вдали от развивающегося эмбриона.
- Добавьте несколько капель раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина / стрептомицина, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
- Повторно запечатайте оконное отверстие с помощью прозрачной ленты, как описано в Шаге 2.8. Верните яйцо в инкубатор для дальнейшего развития, сохраняя яйцо горизонтальным и сохраняя функцию раскачивания инкубатора инактивированной.
- Повторите шаги 3.1.-3.8. за каждое яйцо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстраэмбриональные мембранные рассечения на E5.5, описанные выше, обеспечат доступ к эмбриону через E7, то есть при ранении можно проводить 8,9. К E8 продолжающийся рост ткани CAM начинает покрывать черепную область эмбриона, что исключает дальнейший доступ к роговице. При желании провести ранение в более старых роговицах Е8-Е9 можно перепозиционировать растущую КАМ вентрально по отношению к эмбриону (Шаг 3.10.). Если кто-то хочет замотать на E7, шаг 3.10. нет необходимости выполнять, и можно перейти к шагу 4, ранение роговицы. - Извлеките из инкубатора яйцо E7, внеэмбрионные мембраны которого были предварительно рассечены на E5.5 (шаги 3.1.-3.8.). Захватите стерилизованными щипцами любые доступные ткани амнионной мембраны, слитые с КАМ, и осторожно оттяните амнионную мембрану от черепной области эмбриона в вентральном направлении по отношению к эмбриону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку амнионная мембрана, смещаемая от эмбриона, сливается с КАМ, растущая и сильно васкуляризированная КАМ будет следовать за щипцами, хватающими амнионы, и удаляться от черепной области. Повторяйте этот шаг ежедневно, чтобы постоянно вытеснять КАМ от эмбриона до тех пор, пока эмбрион не достигнет желаемого возраста для ранения.
4. Ранение роговицы
- Получите яйцеклетку из инкубатора для ранения в желаемом эмбриональном возрасте, Е7-Е9. Обнажите эмбрион, отрезав ленту от окна стерилизованными рассекающими ножницами. Добавьте несколько капель раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина / стрептомицина, чтобы увлажнить эмбрион и стерилизовать яйцеклетку.
- Используйте нож для микропарекции, чтобы сделать разрез, который охватывает протяженность роговицы правого глаза (из-за того, как эмбрион откладывается в яйце, левый глаз недоступен, но может служить в качестве нераненого контроля), который параллельен и соответствует трещине сосудистой оболочки (рисунок 1). Первый срез будет пересекать эпителий роговицы.
- Используйте нож для микропарирования, чтобы снова разорвать роговицу в том же месте, что и первый разрез в 2 раза больше (например, три разреза всего, с отрубом 2 и разрезом 3, происходящим вместе с тем же положением в роговице, что и разрез 1)11. Вторая рваная рана будет проходить через базальную мембрану, а третья будет проникать в переднюю строму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эмбрион оседал под рассеченным CAM, можно использовать стерилизованные изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы осторожно вывести головку из-под CAM. Расположите изогнутые щипцы радужки под головой, соприкоснувшись с левой стороной головы. Подложите всю голову поверх закрытых изогнутых щипцов радужной оболочки и осторожно поднимите голову вокруг и над CAM. Чтобы помочь с жизнеспособностью, используйте аналогичную технику с изогнутыми щипцами радужной оболочки, чтобы вернуть эмбрион обратно под CAM после операции, чтобы способствовать правильному росту CAM.
- Используйте нож для микропарирования, чтобы снова разорвать роговицу в том же месте, что и первый разрез в 2 раза больше (например, три разреза всего, с отрубом 2 и разрезом 3, происходящим вместе с тем же положением в роговице, что и разрез 1)11. Вторая рваная рана будет проходить через базальную мембрану, а третья будет проникать в переднюю строму.
- Добавьте 3-4 капли раствора Рингера, содержащего антибиотики пенициллина/стрептомицина, для гидратации эмбриона и стерилизации яйцеклетки.
- Запечатайте отверстие в окне прозрачной лентой и вернитесь в инкубатор, оставив яйцо горизонтальным. Дайте эмбриону развиться и ране роговицы зажить в течение желаемого периода (например, 0,5-11 дней), а затем гуманно усыпить эмбрион путем обезглавливания.
- Используйте изогнутые щипцы радужной оболочки, чтобы извлечь глаз из усыпленного эмбриона, плавающего в чашке Петри с солевым раствором Рингера, осторожно захватив глаз на его заднюю сторону, где встречаются глаз и лицевая ткань, и осторожно подняв весь глаз от ткани лица.
- Используйте тонкие щипцы, чтобы просунуть небольшое отверстие (3-5 см) в задней части всего глаза и зафиксировать весь глаз в 4% параформальдегиде при 4 °C на ночь с легким перемешиванием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После более раннего рассечения ACM и CAM на E5.5 для обнажения черепной области развивающегося эмбриона, серия рваных ран, которые охватывали центральную роговицу E7, была сделана в ovo (рисунок 1). Идеальная рана для изучения регенерации роговицы происходит после трех рваных ран, каждая из которых сделана в одном и том же месте роговицы. Первая рваная рана проходит через эпителий роговицы, в то время как вторая и третья рваные раны проникают в подлежащую базальную мембрану и переднюю строму соответственно. Для достижения идеальной раны крайне важно использовать острый нож для микродисперсирования (см. Таблицу материалов) и применять правильное количество давления при рваной ране (рисунок 2, см. идеальную рану). Применение слишком малого давления приведет к неглубокой ране, которая разрывает эпителий роговицы без достаточного проникновения в переднюю строму (рисунок 2, см. неглубокую рану). Тем не менее, применение слишком большого давления приводит к тому, что рана полной степени проникает во всю строму и подвергает водную влагу внешней среде (рисунок 2, см. рану полной протяженности).
При проведении правильных рваных разрезов получается идеальная рана (рисунок 2), которая первоначально увеличивается (через 0-3 дня после ранения)8 (рисунок 3). Было постулировано, что фаза увеличения раны, которая происходит при ранении роговицы курицы E7, связана с быстрым расширением размера глаз на этой эмбриональной стадии8. Эмбриональные куриные глаза растут значительно быстрее от E4 до E10 по сравнению с ростом глаз от E10 до вылупления. Эти ранние быстрые фазы роста глаз объясняются повышенным внутриглазным давлением (ВГД), зависящим от роста13. Поэтому вполне вероятно, что быстрая скорость роста глаза в сочетании с повышенным ВГД способствует втягиванию раны на ранних этапах процесса заживления (0-3 дня после ранения), что является уникальным для прогрессирования заживления ран эмбриональной роговицы. После этого происходит реэпителизация и образование новых тканей (через 4-9 дней после ранирования), чтобы в конечном итоге закрыть рану без рубцов на 11 дней после ранирования8 (рисунок 3A).
Дальнейший анализ глубины раны и регенерации был возможен путем окрашивания поперечных сечений ламининовым антителом, которое отмечает богатую ламинином базальную мембрану, и контрокрашения срезов ядерным маркером DAPI, который выявляет протяженность раны через эпителий роговицы8. Недавно раненые роговицы (0 dpw) и те, которые находятся на ранней стадии процесса регенерации (3 dpw), показали, что рана проникла в эпителиальный слой и базальную мембрану, о чем свидетельствует окрашивание ядерного маркера DAPI в эпителии роговицы и отсутствие окрашивания антитела к ламинину, которое отмечает богатую ламинином базальную мембрану между эпителием роговицы и нижележащей стромой8 (рисунок 3B ). Однако поперечные сечения через 11 dpw роговицы, окрашенные DAPI и ламининовыми антителами, выявили полностью зажившую роговицу, которая была повторно эпителизирована и содержала непрерывную богатую ламинином базальную мембрану в месте регенерированной раны8 (рисунок 3B).
После разреза роговицы детальная характеристика процесса заживления ран была выполнена путем проведения иммуногистохимии на секционированных, раненых тканях роговицы. Белки внеклеточного матрикса фибронектин и тенасцин связаны с миграцией эпителиальных и кератоцитарных клеток в заживающие раны роговицы у взрослых14,15. Пространственно-временная локализация белков внеклеточного матрикса, фибронектина и тенасцина проявляется в заживающей ране и, как было установлено, повышена во временных точках, соответствующих реэпителизации роговицы (через 5 дней после ранения)8 (рисунок 4). Такой анализ свидетельствует о важности фибронектина и тенасцина для закрытия ран и, в частности, их участия в миграции и выживании эпителиальных клеток, что согласуется с такими функциями во взрослых ранах роговицы16,17.
Начиная с E8-E9, роговица становится плотно иннервируемой тройничными сенсорными нервными волокнами, которые исходят из перикорнеального нервного кольца и проходят через переднюю строму, когда они проецируются к центру роговицы и эпителию роговицы на E12 18,19,20. Поскольку раны роговицы в этой модели производятся в E7, незадолго до проекции нерва в роговицу, эта модель дополнительно исследует нервы роговицы, когда они перемещаются по заживающей роговице после инсульта. Используя цельную иммуногистохимию для отслеживания нервов роговицы антителами21 против β нервного тубулина (Tuj1), очевидно, что нервы временно ингибируются из заживающей ткани роговицы, которая непосредственно сопоставляет раненую центральную роговицу (через 5 дней после ранения)8 (рисунок 5A, B). Несмотря на более раннее торможение, нервы роговицы в конечном итоге иннервируют полностью зажившую ткань роговицы (через 11 дней после ранения) до аналогичных уровней плотности и в аналогичных паттернах с контрольными группами (E18C) (Рисунок 5C, D).
Поразительно, что полностью реэпителиализованные ткани роговицы, которые зажили нефиброзным, без шрамов образом, демонстрируют полную рекапитуляцию нормальной архитектуры коллагеновой ткани. Как свидетельствует гармоническая визуализация второго поколения22,23, пучки коллагеновых волокон на различной глубине области раны центральной роговицы расположены ортогонально, что соответствует нативной макроструктуре нераненой центральной ткани роговицы9 (рисунок 6).
Рисунок 1: Схема внутриэмбриональных расслоений мембраны и ранения роговицы. При E5.5 черепная область эмбриона подвергается воздействию путем рассечения мембран ACM и CAM и позиционирования амниона и аллантоиса вдали от развивающегося глаза. Яйца запечатываются и инкубируются до E7, когда центральная роговица ранена, используя изогнутые щипцы в качестве колыбели для головы эмбриона, поскольку кончик микрохирургического ножа делает разрез в центральной роговице. Рана ориентирована параллельно трещине сосудистой оболочки (звездочке). Чтобы глубина разреза достигала передней стромы, ножом необходимо сделать три параллельных разреза, каждый в одном и том же относительном положении, один над другим. Шкала = 1 мм. Цифра адаптирована с разрешения из ссылок 8,11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Вариации ран, образующихся в ovo. (A) После рассечения мембраны при E5.5 правый глаз доступен в ovo. (Б-Д) Снимки эмбриона in ovo сразу после рваных ран различной степени, которые охватывают протяженность роговицы и соответствуют трещине сосудистой оболочки (ср.). (B) После трех рваных ран, при которых было применено слабое давление, видна неглубокая рана. Наконечник стрелы отмечает участок в роговице, где эпителий был срезан, но передняя строма не была пронизана. Наконечники стрел обозначают небольшую область роговицы, куда проникла передняя строма. (C) После трех рваных ран, при которых было применено идеальное давление, видна идеальная рана. Наконечники стрел обозначают рану, охватывающую всю протяженность роговицы, куда была проникнута передняя строма. (D) После трех рваных ран, при которых было применено чрезмерное давление, видна рана полной протяженности, и водянистая влага стала подвергаться воздействию внешней среды. Сокращения: tca, височная цилиарная артерия; cf, трещина сосудистой оболочки; CAM, хориоаллантоическая мембрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Прогрессирование заживления ран. (A) Прогрессирование заживления в раненых роговицах по сравнению со стадиями контрольной группы показано с момента ранения (0 dpw) и 16 ч после ранения (hrpw) через 3-11 дней после ранения (dpw). Наконечники стрел очерчивают дорсальные и вентральные границы раны, указывая на период расширения раны (0-3 dpw) с последующим прогрессирующим закрытием раны (5-11 dpw). (B) Секционированные DAPI (синие) и ламининовые (красные) окрашенные раненые роговицы в 0, 3 и 11 dpw. Скобки показывают протяженность раненой области, которая показывает расширение раны на 3 dpw и полное восстановление повторно эпителизированной роговицы E11. Звездочки обозначают зажившую область роговицы. Шкала (A) 1 мм, (B) 100 мкм. Рисунок адаптирован с разрешения из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологический анализ раненой роговицы. Поперечные сечения через (A) 3 dpw и (B) 5 dpw. Окрашенные DAPI (синие) травмированные роговицы выявляют локализацию фибронектина (FN, красный) и Tenascin-C (TN-C, зеленый). Скобки в пунктах (A) и (B) обозначают раненый регион. Шкала: 100 мкм. Сокращения: ep, эпителий; ст, строма; en, эндотелий. Рисунок адаптирован с разрешения из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иннервация раненой роговицы. (A-D) Визуализация нервов роговицы после анти-β нервного тубулина (Tuj1) цельного иммуноокрашения в (B) 5 dpw и (D) 11 dpw роговицы, а также (A) stage-matched E12 (E12C, stage-matched for 5 dpw) и (C) E18 контрольной группе (E18C, сценическое соответствие для 11 dpw). (B) Ломаная линия в роговице 5 dpw обозначает протяженность раны. Брекетированная область, непосредственно прилегающая к ране, обозначает область роговицы, которая временно отталкивает нервы и активно подвергается реэпителизации. (Б') Оптическое сканирование через заживающую ткань роговицы, непосредственно прилегающую к открытой ране, выявляет редкий пучок стромального нерва, простирающийся в ткань (стрела) и поводки эпителиального нерва (наконечник стрелы). (С,Г) Полностью регенерированные роговицы при 11 dpw демонстрируют аналогичные паттерны иннервации и сопоставимые плотности нервов со сценическими контрольными группами. Аббревиатура: w, рана. Рисунок адаптирован с разрешения из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Ультраструктура коллагена в исцеленных эмбриональных роговицах. (A) Сканирование лица полностью исцеленной роговицы мощностью 10 dpw и контрольная группа с использованием гармонической визуализации второго поколения (SGH). Глубина сканирования колеблется от 2 до 66 мкм от передней поверхности роговицы (0 мкм является самой передней стромой) и указана слева от соответствующих изображений. Вставки для каждого изображения соответствуют анализу преобразования Быстрого Фурье центральной области раны для этой конкретной глубины сканирования. (B) Вручную сегментированные стеки двумерного анализа быстрых преобразований Фурье, представляющие организацию коллагена в раненой и согласованной стадии контрольной роговице. Шкала бара = 50 мкм. Рисунок адаптирован с разрешения из ссылки9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цыпленок является идеальной модельной системой для изучения заживления ран роговицы плода без шрамов. В отличие от млекопитающих, птенец легко доступен на протяжении всего развития, используя стратегии ovo8 или ex ovo 24. Эмбриональная роговица цыпленка намного больше, чем роговица грызунов, причем почти 50% черепного объема посвящено глазу25, что делает его очень восприимчивым к физическим манипуляциям, таким как ранение. Кроме того, куриные яйца легко доступны круглый год, часто с местных ферм, и экономически эффективны, требуя только гумифицированного инкубатора для поддержки развития.
Этот протокол сообщает о серии процедур, которые позволяют ранить роговицу эмбрионального цыпленка. Раны, нанесенные эмбриональной роговице цыпленка, полностью регенерируют, что позволяет полностью рекапитулять нативную структуру роговицы без обнаружения рубцов. Этот метод сделал эмбрионального птенца жизненно важной животной моделью для выяснения молекулярных и клеточных факторов, координирующих заживление ран роговицы без шрамов.
Несмотря на четкую перспективу, присущую описанной здесь модели заживления ран плода, стоит отметить, что существуют четкие различия между заживлением ран роговицы плода и взрослого человека. Эмбриональная роговица экспрессирует факторы роста и морфогенетические сигналы, которые заглушаются или отсутствуют во взрослых тканях26. Кроме того, травмированные ткани роговицы взрослых людей проявляют фиброз и образуют рубцовую ткань, вероятно, из-за повышенной воспалительной реакции, опосредованной цитокинами и факторами роста27, которые затухают или еще не установлены на эмбриональных стадиях. Такие возрастные различия в ткани роговицы могут осложнить усилия по полному восстановлению взрослой раненой ткани. Тем не менее, определение ключевых молекулярных факторов и матричных белков, которые регулируют заживление ран плода без рубцов, проложит путь для терапии, которая способствует более восстановительному процессу заживления с меньшим количеством рубцов и лучшей рекапитуляцией нормальной тканевой архитектуры.
Описанный здесь метод ранирования основан на методе, впервые разработанном Spurlin et al.11 для получения доступа in ovo к эмбрионам цыплят поздней стадии (например, >E6). Окончив яйцеклетку и рассекая внеэмбриональные мембраны вдали от черепной области, эмбриональный глаз доступен для стадий вплоть до E7. Как мы уже сообщали ранее, удаление и смещение амниохорионной и хориоаллантоической мембран соответственно не влияют на эмбриональное развитие11. Обнаженные эмбрионы жизнеспособны и легко поддаются физическим манипуляциям. На этом этапе роговица имеет три отдельных слоя (эпителий, строма и эндотелий), что делает ее пригодной для исследований заживления ран после линейного разреза в передней строме. Следует отметить, что из-за увеличения роста аллантоиса с течением времени доступ к глазу в конечном итоге блокируется при E8. Чтобы обойти эту проблему, если доступ к более поздним стадиям глаз для ранения желателен, мы обнаружили, что доступ к глазу может поддерживаться через E9 путем проведения ежедневных манипуляций с внеэмбриональными мембранами (например, при E7, E8 и т. Д.), При этом аллантоис осторожно перемещается в сторону от черепной области, чтобы гарантировать, что его рост происходит направленно в сторону от эмбриона. Это позволяет ранить роговицу на этих более поздних стадиях (например, после иннервации).
В целом, жизнеспособность и выживаемость эмбрионов в этом методе зависят от нескольких факторов, таких как обеспечение поддержания стерильной и гидратированной среды яйцеклеток при одновременной осторожности, чтобы не нанести ущерб эмбриональным кровеносным сосудам или аллантоису. Вся поверхность яйца должна быть стерилизована этанолом перед окном для поддержания стерильности. Это связано с тем, что небольшие фрагменты яичной скорлупы, которые часто нагружены микробами, обычно попадают в яйцо во время процедуры окна. Аналогичным образом, все инструменты, участвующие в окне, рассечении мембраны и изготовлении разреза роговицы, должны быть тщательно промыты этанолом и высушены или стерилизованы пламенем перед их использованием. Кроме того, антибиотики должны быть добавлены в яйцеклетку каждый раз, когда эмбрион подвергается воздействию внешней среды. Кроме того, крайне важно, чтобы эмбрион сохранял надлежащую гидратацию после окна. Необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы убедиться, что окно полностью запечатано скотчем и чтобы не осталось воздушных зазоров. Учитывая важность того, чтобы лента оставалась полностью прикрепленной к поверхности яичной скорлупы и полностью герметизировала отверстие, поверхность яичной скорлупы, окружающую отверстие, необходимо очистить и высушить перед нанесением ленты. Наконец, крайне важно, чтобы кровеносные сосуды не были непреднамеренно разрезаны и чтобы аллантоис, который хранит жидкие отходы от эмбриона, не повреждался во время рассечения внеэмбриональных мембран, поскольку любой из них смертелен для эмбриона. Следует отметить, что жизнеспособность эмбриона выше, когда делаются меньшие разрывы хориона и амниона, хотя разрыв должен быть достаточно большим, чтобы расположить внеэмбриональные мембраны вдали от черепной области. Если эти осторожные шаги будут предприняты во время вскрытия и удаления мембран из высококачественных яйцеклеток, можно ожидать, что почти все эмбрионы переживут процедуру окна (~ 99%), в то время как ~ 40% подвергшихся воздействию эмбрионов выживают до E9 и ~ 30% до E1211. По нашему опыту, ранение роговицы рассеченных эмбрионов мембраны E7-E9 мало влияет на жизнеспособность эмбриона, и достаточное количество эмбрионов остается жизнеспособным через E18, после чего рана роговицы полностью заживает.
Достижение ран, которые пересекают эпителий роговицы и проникают в переднюю строму, имеет важное значение для получения надежных и воспроизводимых результатов. Высококачественный нож для микропарирования необходим для того, чтобы приложить очень небольшое давление. Использование пары изогнутых щипцов радужной оболочки может быть полезно для мягкой подтяжки головы, так как рваная рана производится другой рукой. Таким образом, изогнутые щипцы радужной оболочки служат опорой, так что роговица остается неподвижной во время ранения. Проникновение раны в строму варьируется, особенно при обучении, но становится более воспроизводимым, когда исследователь узнает ощущение и внешний вид разрушения эпителия роговицы. По мере обучения может быть полезно просматривать раненые роговицы в поперечном сечении, чтобы можно было оценить глубину проникновения раны в строму роговицы (см. Рисунок 3B для примера поперечного сечения роговицы, показывающей идеальную глубину ранирования сразу после разрыва роговицы).
В сочетании с классическими методами биологии развития, такими как пересадка тканей и имплантация бусин, или современными подходами к генным манипуляциям, такими как электропорация ДНК и ретровирусная инфекция, эта животная модель регенерации роговицы обещает выявить молекулярные факторы и клеточные механизмы, необходимые для достижения полного восстановления ткани роговицы после повреждения. Кроме того, эта модель на животных может быть использована для проверки потенциальной полезности экзогенных терапевтических соединений для увеличения регенерации роговицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов в отношении информации, представленной в этой рукописи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом на художественное и научное развитие через Иллинойский Уэслианский университет TS и частично финансировалась NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
