Summary
Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.
Abstract
Kuiken embryonale hoornvlieswonden vertonen een opmerkelijk vermogen om volledig en snel te regenereren, terwijl volwassen gewonde hoornvliezen een verlies van transparantie ervaren als gevolg van fibrotische littekens. De weefselintegriteit van gewonde embryonale hoornvliezen is intrinsiek hersteld zonder detecteerbare littekenvorming. Gezien de toegankelijkheid en het gemak van manipulatie, is het kuikenembryo een ideaal model voor het bestuderen van littekenloos hoornvlieswondherstel. Dit protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om toegang te krijgen tot het oog. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties naar de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd. Ten derde worden lineaire hoornvlieswonden die de buitenste epitheellaag en het voorste stroma binnendringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure. Studies tot nu toe met behulp van dit model hebben aangetoond dat gewonde embryonale hoornvliezen activering van keratocytendifferentiatie vertonen, gecoördineerde remodellering van ECM-eiwitten ondergaan naar hun oorspronkelijke driedimensionale macrostructuur en adequaat opnieuw worden geïnnerveerd door cornea-sensorische zenuwen. In de toekomst kan de potentiële impact van endogene of exogene factoren op het regeneratieve proces worden geanalyseerd bij het genezen van hoornvliezen met behulp van ontwikkelingsbiologische technieken, zoals weefseltransplantatie, elektroporatie, retrovirale infectie of kraalimplantatie. De huidige strategie identificeert het embryonale kuiken als een cruciaal experimenteel paradigma voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire factoren die de genezing van littekenloze hoornvlieswonden coördineren.
Introduction
Het hoornvlies is het transparante, buitenste weefsel van het oog dat licht doorgeeft en breekt dat bevorderlijk is voor de gezichtsscherpte. In het volwassen hoornvlies leidt schade of infectie aan het corneastroma tot een snelle en robuuste wondgenezingsreactie die wordt gekenmerkt door keratocytenproliferatie, fibrose, verhoogde ontsteking die leidt tot cytokine-geïnduceerde apoptose, generatie van reparatiemyofibroblasten en algehele remodellering van de extracellulaire matrix (ECM)1,2 . Na letsel resulteert een dergelijk herstel van hoornvliesweefsel in ondoorzichtig littekenweefsel dat de transparantie van het hoornvlies vermindert en de doorgang van licht afsluit, waardoor het gezichtsvermogen wordt vervormd en, in de meest ernstige gevallen, leidt tot hoornvliesblindheid3. Er is dus een duidelijke behoefte om betrouwbare diermodellen te ontwikkelen om de complexiteit van wondgenezing aan te pakken en om de cellulaire en moleculaire factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor wondsluiting en weefselregeneratie.
Tot op heden hebben de meeste onderzoeken naar de genezing van hoornvlieswonden postnatale4- of volwassen diermodellengebruikt 1,2,5,6,7. Hoewel deze studies hebben geleid tot een aanzienlijke vooruitgang in het begrip van de cornea wondgenezingsrespons en de mechanismen die ten grondslag liggen aan littekenvorming, slagen de beschadigde corneaweefsels in deze genezingsmodellen er niet in om volledig te regenereren, waardoor hun nut voor het identificeren van de moleculaire factoren en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het volledig recapituleren van corneamorfologie en structuur na letsel wordt beperkt. Foetale wonden die met een mes in het embryonale hoornvlies van het kuiken worden gegenereerd, bezitten daarentegen een intrinsiek vermogen om volledig te genezen op een littekenloze manier8. In het bijzonder vertoont het embryonale hoornvlies van het kuiken nonfibrotische regeneratie met de volledige recapitulatie van de extracellulaire matrixstructuur en innervatiepatronen 8,9.
Het huidige protocol beschrijft een opeenvolging van stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. Ten eerste worden eieren op vroege embryonale leeftijden bekeken om de toegang tot het embryo te vergemakkelijken. Ten tweede wordt een reeks in ovo fysieke manipulaties van de extra-embryonale membranen uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de toegang tot het oog wordt gehandhaafd in latere stadia van ontwikkeling, wat overeenkomt met wanneer de drie cellulaire lagen van het hoornvlies worden gevormd en verwonding gewenst is. Ten derde worden lineaire centrale hoornvliesincisies die door het cornea-epitheel en in het voorste stroma doordringen, gemaakt met behulp van een microchirurgisch mes. Het regeneratieproces of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De stam eieren die in dit protocol werd gebruikt, was White Leghorn en alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Illinois Wesleyan University.
1. Incubatie van kuikeneieren
- Bewaar de eieren op ~ 10 ° C tot 1 week nadat ze zijn gelegd om de ontwikkeling te stoppen. Wanneer u klaar bent om de ontwikkeling van kuikenembryo's te starten, veegt u de hele eierschaal af met pluisvrije doekjes (zie Materiaaltabel) verzadigd met water op kamertemperatuur om vuil en vuil te verwijderen.
- Zorg ervoor dat de eierschaal is ontsmet. Veeg het hele eioppervlak af met pluisvrije doekjes bevochtigd met 70% ethanol. Veeg de ethanol snel af om het ei te drogen en vermijd ethanolabsorptie door de eierschaal naar het embryo.
- Schik de eieren horizontaal op een bakje. Markeer de bovenkant van het ei om de verwachte positie van het embryo aan te geven. Incubeer de eieren horizontaal, met de schommelfunctie geactiveerd, in een bevochtigde incubator van 38 °C.
2. De eieren vensteren om zich voor te bereiden op membraandissectie
- Verwijder eieren uit de couveuse op de derde dag van de embryonale ontwikkeling (E3). Steriliseer de bovenkant van de eieren met pluisvrije doekjes bevochtigd met 70% ethanol. Droog de ethanol van de eierschaaloppervlakken.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de ontwikkeling niet werd vertraagd tijdens de vensterprocedure, werden 6-12 eieren verwijderd en de procedure werd snel uitgevoerd terwijl de resterende eieren in de broedmachine werden achtergelaten. - Plaats een ei horizontaal in een veilige eierhouder (zie Materiaaltabel). Maak met behulp van het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een klein gaatje in de bovenkant van de eierschaal nabij het puntige uiteinde van het ei.
OPMERKING: Dit gat vergemakkelijkt de verwijdering van albumine, wat nodig is om de dooier en het embryo weg te laten vallen van het binnenste eierschaaloppervlak. Voor eierhouders werden papierpulp-eiervullers gebruikt, waarbinnen de eieren worden verzonden. - Steek door het gat (stap 2.2.) een afgeschuinde injectienaald van 18 G. Met de naald naar het onderste binnenoppervlak van het ei geduwd en de schuine kant van de naald naar het puntige uiteinde van het ei gericht (bijvoorbeeld weg van de verwachte locatie van de dooier en het embryo in het midden van het ei), verwijder 2-3 ml albumine uit het kippenei en gooi weg.
OPMERKING: Als iemands naald tijdens deze stap het embryo of de bijbehorende vasculatuur insnijdt, zal dit ertoe leiden dat bloed wordt geaspireerd met het albumine. Dit zal resulteren in embryodood. Verder, als de dooier per ongeluk samen met het albumine tijdens deze stap wordt geaspireerd, zal het embryo niet levensvatbaar zijn. In beide gevallen moet het ei worden weggegooid als het embryo niet onmiddellijk voor andere doeleinden kan worden gebruikt. - Reinig het eierschaaloppervlak rond het gat met pluisvrije doekjes die licht zijn bevochtigd met 70% ethanol en veeg droog. Dicht het gat dat is gemaakt voor het verwijderen van albumine af met doorzichtige tape.
- Maak met het scherpe uiteinde van de ontleedschaar een tweede "venster" -gat in de bovenkant van de eierschaal op de markeringsplaats (stap 1.3.). Zorg ervoor dat de schaar zich niet te ver in de eierschaal uitstrekt om te voorkomen dat het embryo of de embryonale vasculatuur, die vaak in het ei direct onder de plaats van het tweede gat wordt geplaatst, in contact komt en beschadigd raakt.
- Gebruik gebogen iristangen om het "venster" -gat te verbreden tot een diameter van ~ 2-3 cm en dien als een "venster" voor het zich ontwikkelende embryo onder de schaal.
- Steek het ene uiteinde van de tang in het gat en houd het parallel aan en dicht bij de eierschaal. Met het uiteinde van de andere tang buiten de eierschaal, knijp je de twee tanguiteinden voorzichtig samen, zodat ze kunnen breken en kleine stukjes van de eierschaal kunnen verwijderen. Ga door met het breken en verwijderen van eierschaalfragmenten totdat er een venster van 2-3 cm overblijft dat het embryo direct bedekt.
OPMERKING: Eieren waarin embryo's niet direct onder het gat liggen dat in stap 2.6 is gemaakt. mogen niet worden gebruikt omdat de komende membraandissecties een uitdaging zouden zijn om te voltooien. Zelfs met het horizontaal schommelen van de eieren is ongeveer 10% van de eieren onbruikbaar vanwege de slechte positionering van het embryo. Deze embryo's kunnen voor andere doeleinden worden gebruikt.
- Steek het ene uiteinde van de tang in het gat en houd het parallel aan en dicht bij de eierschaal. Met het uiteinde van de andere tang buiten de eierschaal, knijp je de twee tanguiteinden voorzichtig samen, zodat ze kunnen breken en kleine stukjes van de eierschaal kunnen verwijderen. Ga door met het breken en verwijderen van eierschaalfragmenten totdat er een venster van 2-3 cm overblijft dat het embryo direct bedekt.
- Om bacteriële besmetting te beperken, voegt u door het raamgat (bijv. in het ei) ~ 100-200 μL Ringer's oplossing (8 g NaCl, 0,37 g KCl en 0,23 g CaCl2,2H 2 0 per L gedestilleerde H20) toe die Penicilline / Streptomycine-antibiotica bevatten (50 U / ml penicilline en 50 μg / ml streptomycine, zie Materiaaltabel).
- Dicht het raamgat af met doorzichtig plakband. Voer de eierafdichting uit door een hoek van de tape op de lange as van het gat uit te lijnen en de tape op de schaal ~ 1-2 cm van de rand van het gat te drukken.
- Blijf rond de opening afdichten totdat een hangende klep van tape aan één kant is achtergelaten. Druk de twee stukjes tape tegen elkaar, waardoor een koepelvormige vorm over het gat ontstaat en druk de flap van overhangende tape op de schaal om het ei af te sluiten.
OPMERKING: Eieren moeten worden vensterd op E2 of E3. Volgens de ervaring resulteert windowing voorafgaand aan E2 in een lage levensvatbaarheid van het embryo. Bovendien worden door E4 de embryonale en extra-embryonale membranen gehecht aan de eierschaal10, en elke poging om op E4 of later te vensteren, resulteert vaak in embryoschade of scheuren van extra-embryonale bloedvaten, waarbij beide gebeurtenissen leiden tot de uitkomst van embryodood.
- Blijf rond de opening afdichten totdat een hangende klep van tape aan één kant is achtergelaten. Druk de twee stukjes tape tegen elkaar, waardoor een koepelvormige vorm over het gat ontstaat en druk de flap van overhangende tape op de schaal om het ei af te sluiten.
- Breng de "venstervormige" eieren terug naar de broedmachine voor verdere ontwikkeling. Zorg ervoor dat u de eieren horizontaal houdt en schakel de schommelfunctie van de incubator uit.
- Herhaal stap 2.2.-2.9. voor elk ei.
3. Microdissecties van de extra-embryonale membranen
- Verwijder een E5.5-vensterei uit de broedmachine. Leg het embryo bloot door de tape weg te snijden van het raam met een gesteriliseerde ontleedschaar.
- Gebruik een ontleedmicroscoop om het embryo en zijn extra-embryonale membranen door het raam te observeren. Gebruik indien nodig een schaar of een gebogen iristang om het venster te verbreden, zodat het embryo goed onder het raam wordt geplaatst en zorg ervoor dat de embryonale vasculatuur niet wordt beschadigd.
- Voeg twee druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine-antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
- Gebruik een ontleedmicroscoop om ervoor te zorgen dat het embryo zich in het juiste ontwikkelingsstadium bevindt (Hamburger Hamilton stadium 27, ~E5.5)11,12 en lokaliseer de posities van het vruchtwatervlies (ACM) en het chorioallantoïsche membraan (CAM).
OPMERKING: In dit stadium wordt het embryo omringd door de ACM, die bestaat uit het vruchtwatermembraan en het bovenliggende chorionmembraan gefuseerd en gedeeltelijk bedekt door de sterk gevasculariseerde allantois, die zich uitstrekt van het darmgebied van het embryo en fuseert met het overlappende chorion om de CAM11,12 te vormen. De ACM is niet zwaar gevasculariseerd, waardoor men deze membranen kan ontleden om het embryo bloot te stellen zonder de bloedvaten te beschadigen en het embryo te beschadigen. - Voer in dit stadium extra-embryonale membraandissecties uit (E5.5).
OPMERKING: E5.5 is het ideale moment om de extra-embryonale membraandissecties uit te voeren. Het eerder ontleden van de membranen (bijvoorbeeld bij E4) vóór CAM-vorming vermindert de toegankelijkheid van het embryo in latere stadia11. Bovendien wordt het embryo op E5.5 slechts gedeeltelijk bedekt door de sterk gevasculariseerde CAM, maar in de komende 1-2 dagen omhult de CAM snel en sluit verdere toegang tot het embryouit 11,12. Om deze reden is membraandissectie op E6 of later een uitdaging, omdat het risico op scheurende bloedvaten toeneemt.- Gebruik een paar gesteriliseerde fijne tangen om de ACM voorzichtig vast te pakken en weg te trekken van het embryo. Gebruik vervolgens een gesteriliseerde micro-ontleedschaar om een gat in de ACM direct boven de voorpoot te snijden dat zich uitstrekt van het membraan boven de voorpoot tot het membraan boven het hoofd.
OPMERKING: Deze stap ontspant de chorion- en amnionmembranen, waardoor ze gemakkelijker te grijpen zijn en verder te ontleden met een tang in de volgende stappen. Zie figuur 1 voor een nuttig schema van hoe membranen worden ontleed door het eierschaalvenster.
- Gebruik een paar gesteriliseerde fijne tangen om de ACM voorzichtig vast te pakken en weg te trekken van het embryo. Gebruik vervolgens een gesteriliseerde micro-ontleedschaar om een gat in de ACM direct boven de voorpoot te snijden dat zich uitstrekt van het membraan boven de voorpoot tot het membraan boven het hoofd.
- Gebruik twee paar fijne, steriele tangen om het amnion voorzichtig vast te pakken in twee aangrenzende posities tussen de ACM en de CAM (bijvoorbeeld een gebied tussen de snede boven de voorpoot en de dichtstbijzijnde rand van de CAM).
- Beweeg voorzichtig elk paar tangen, beide stevig het vruchtwatermembraan vastpakkend, van elkaar af, waarbij het ene paar dorsaal naar het embryo beweegt en het andere ventraal.
OPMERKING: Deze beweging dient om het amnion verder te scheuren en tegelijkertijd de ACM (die door de ene tang in de dorsale richting ten opzichte van het embryo wordt getrokken) en de CAM (die door de andere tang in de ventrale richting ten opzichte van het embryo wordt getrokken) te scheiden. - Zorg ervoor dat de membranen worden gescheiden wanneer de CAM het embryo niet langer bedekt en de allantoïsche slagader en ader, die afkomstig zijn van de embryonale darm naar de CAM, gemakkelijk zichtbaar zijn.
- Beweeg voorzichtig elk paar tangen, beide stevig het vruchtwatermembraan vastpakkend, van elkaar af, waarbij het ene paar dorsaal naar het embryo beweegt en het andere ventraal.
- Gebruik gesteriliseerde fijne tangen om het resterende amnionmembraan dat het embryo bedekt te ontleden en te verwijderen. Het wordt meestal waargenomen dat het resterende amnion de caudale helft van het embryo gedeeltelijk bedekt.
- Pak met behulp van een gesteriliseerde tang het amnion in de buurt van het midden van de schedel van het embryo en trek het amnion voorzichtig in een caudale richting met betrekking tot het embryo naar de eerder verplaatste CAM. Het embryo zal nu volledig worden blootgesteld en verdere groei van de CAM zal voornamelijk plaatsvinden buiten het zich ontwikkelende embryo.
OPMERKING: Zie figuur 1 voor een nuttig schema over hoe het blootgestelde embryo zal verschijnen na membraandissectie. Raadpleeg ook een eerder gepubliceerd rapport11 voor nuttige schematische diagrammen van stap 3.3.-3.6.
- Pak met behulp van een gesteriliseerde tang het amnion in de buurt van het midden van de schedel van het embryo en trek het amnion voorzichtig in een caudale richting met betrekking tot het embryo naar de eerder verplaatste CAM. Het embryo zal nu volledig worden blootgesteld en verdere groei van de CAM zal voornamelijk plaatsvinden buiten het zich ontwikkelende embryo.
- Voeg een paar druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
- Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape, zoals beschreven in stap 2.8. Breng het ei terug naar de incubator voor verdere ontwikkeling, houd het ei horizontaal en houd de schommelfunctie van de incubator geïnactiveerd.
- Herhaal stap 3.1.-3.8. voor elk ei.
OPMERKING: De hierboven beschreven extra-embryonale membraandissecties op E5.5 maken toegang tot het embryo mogelijk via E7, wanneer wonden kunnen worden uitgevoerd 8,9. Tegen E8 begint de voortdurende groei van het CAM-weefsel het schedelgebied van het embryo te bedekken, waardoor verdere toegang tot het hoornvlies wordt uitgesloten. Als men wonden wil uitvoeren in oudere E8-E9 hoornvliezen, is het mogelijk om de groeiende CAM ventraal te herpositioneren ten opzichte van het embryo (stap 3.10.). Als men op E7 wil verwonden, stap 3.10. is niet nodig om uit te voeren en men kan doorgaan naar stap 4, hoornvlieswonden. - Verwijder een E7-ei uit de couveuse waarvan de extra-embryonale membranen eerder werden ontleed bij E5.5 (stappen 3.1.-3.8.). Pak met gesteriliseerde tang alle beschikbare amnionmembraanweefsels vast die met de CAM zijn gefuseerd en trek het amnionmembraan voorzichtig weg van het schedelgebied van het embryo in een ventrale richting ten opzichte van het embryo.
OPMERKING: Aangezien het amnionische membraan dat van het embryo wordt verplaatst, is gefuseerd met de CAM, zal de groeiende en sterk gevasculariseerde CAM de amnion-grijpende tang volgen en weggaan van het schedelgebied. Herhaal deze stap dagelijks om de CAM voortdurend weg te verplaatsen van het embryo totdat het embryo de gewenste leeftijd heeft om te verwonden.
4. Hoornvlies verwonding
- Verkrijg een ei uit de couveuse voor verwonding op de gewenste embryonale leeftijd, E7-E9. Leg het embryo bloot door de tape weg te snijden van het raam met een gesteriliseerde ontleedschaar. Voeg een paar druppels Ringer's oplossing met penicilline / streptomycine antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
- Gebruik een micro-ontleedmes om een incisie te maken die de omvang van het hoornvlies van het rechteroog overspant (vanwege de manier waarop het embryo in het ei ligt, is het linkeroog niet toegankelijk maar kan het dienen als een niet-gewonde controle), die parallel loopt aan en in overeenstemming is met de koraalspleet (figuur 1). De eerste snede doorkruist het hoornvliesepitheel.
- Gebruik het micro-ontleedmes om het hoornvlies opnieuw te scheuren op dezelfde plek als de eerste incisie 2x meer (bijv. drie sneden in totaal, waarbij snede 2 en snij 3 optreden, samen met dezelfde positie in het hoornvlies als gesneden 1)11. De tweede scheur zal het keldermembraan doorkruisen en de derde zal het voorste stroma binnendringen.
OPMERKING: Als het embryo zich onder de ontleedde CAM heeft gevestigd, kan men gesteriliseerde gebogen iristangen gebruiken om het hoofd voorzichtig onder de CAM vandaan te bewegen. Plaats de gebogen iristang onder het hoofd en maak contact met de linkerkant van het hoofd. Wieg het hele hoofd bovenop de gesloten gebogen iristang en til het hoofd voorzichtig rond en boven de CAM op. Om te helpen bij de levensvatbaarheid, gebruikt u een vergelijkbare techniek met de gebogen iristang om het embryo na de operatie terug onder de CAM te stoppen om een goede groei van de CAM te bevorderen.
- Gebruik het micro-ontleedmes om het hoornvlies opnieuw te scheuren op dezelfde plek als de eerste incisie 2x meer (bijv. drie sneden in totaal, waarbij snede 2 en snij 3 optreden, samen met dezelfde positie in het hoornvlies als gesneden 1)11. De tweede scheur zal het keldermembraan doorkruisen en de derde zal het voorste stroma binnendringen.
- Voeg 3-4 druppels Ringer's oplossing met Penicilline / Streptomycine-antibiotica toe om het embryo te hydrateren en het ei te steriliseren.
- Sluit het raamgat opnieuw met doorzichtige tape en keer terug naar de broedmachine, waarbij het ei horizontaal blijft. Laat het embryo zich ontwikkelen en de hoornvlieswond gedurende een gewenste periode genezen (bijv. 0,5-11 dagen) en euthanaseer het embryo vervolgens op humane wijze door onthoofding.
- Gebruik gebogen iristangen om het oog te oogsten van een geëuthanaseerd embryo dat in een petrischaaltje van Ringer's zoutoplossing zweeft door het oog voorzichtig aan de achterste kant te grijpen, waar het oog en gezichtsweefsel elkaar ontmoeten, en voorzichtig het hele oog weg te tillen en vrij van het gezichtsweefsel.
- Gebruik een fijne tang om een klein gaatje (3-5 cm) in de achterkant van het hele oog te prikken en fixeer het hele oog in 4% paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts met milde agitatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de eerdere dissectie van de ACM en CAM op E5.5 om het schedelgebied van het zich ontwikkelende embryo bloot te leggen, werd een reeks scheuren gemaakt die het centrale hoornvlies van E7 overspanden in ovo (figuur 1). Een ideale wond om de regeneratie van het hoornvlies te bestuderen, vindt plaats na drie scheuren, elk gemaakt op dezelfde locatie van het hoornvlies. De eerste scheur doorkruist het cornea-epitheel, terwijl de tweede en derde scheuren respectievelijk het onderliggende keldermembraan en het voorste stroma binnendringen. Om een ideale wond te bereiken, is het cruciaal om een scherp microdissectiemes te gebruiken (zie Materiaaltabel) en de juiste hoeveelheid druk uit te oefenen terwijl de scheur wordt gemaakt (figuur 2, zie ideale wond). Te weinig druk uitoefenen zal resulteren in een ondiepe wond die het hoornvliesepitheel scheurt zonder voldoende door te dringen in het voorste stroma (figuur 2, zie ondiepe wond). Toch resulteert het toepassen van te veel druk in een volledige wond die het hele stroma binnendringt en de waterige humor blootstelt aan de externe omgeving (figuur 2, zie volledige omvang wond).
Het uitvoeren van de juiste scheurincisies levert een ideale wond op (figuur 2) die in eerste instantie groter wordt (0-3 dagen na het verwonden)8 (figuur 3). Er is gepostuleerd dat de fase van wondvergroting die optreedt door het verwonden van E7 kiphoornvliezen verband houdt met de snelle uitbreiding van de oogomvang in dit embryonale stadium8. Embryonale kippenogen groeien aanzienlijk sneller van E4 tot E10 in vergelijking met de ooggroei van E10 tot uitkomen. Deze vroege snelle fasen van ooggroei worden toegeschreven aan verhoogde intraoculaire druk (IOP)-afhankelijke groei13. Daarom is het waarschijnlijk dat de snelle groeisnelheid van het oog in combinatie met de verhoogde IOP de wondterugtrekking bevordert tijdens de vroege fasen van het genezingsproces (0-3 dagen na het verwonden), wat uniek is voor de embryonale progressie van de wondgenezing van het hoornvlies. Daarna treden re-epithelisatie en nieuwe weefselvorming op (4-9 dagen na het verwonden) om de wond uiteindelijk 11 dagen na verwonding8 op een littekenvrije manier te sluiten (figuur 3A).
Verdere analyse van wonddiepte en regeneratie was mogelijk door doorsneden te kleuren met een laminine-antilichaam dat het lamininerijke keldermembraan markeert en de secties te beitsen met de nucleaire marker DAPI, die de omvang van de wond door het hoornvliesepitheel onthult8. Recent gewonde hoornvliezen (0 dpw) en die vroeg in het regeneratieproces (3 dpw) toonden aan dat de wond de epitheellaag en het keldermembraan binnendrong, zoals blijkt uit de inbraakkleuring van de nucleaire marker DAPI in het cornea-epitheel en de afwezigheid van laminine-antilichaamkleuring, die het lamininerijke keldermembraan tussen het hoornvliesepitheel en het onderliggende stroma8 markeert (figuur 3B ). Doorsneden door 11 dpw cornea's gekleurd met DAPI en laminine-antilichaam onthulden echter een volledig genezen hoornvlies dat opnieuw was geëpitheliseerd en een continu lamininerijk keldermembraan bevatte op de plaats van de geregenereerde wond8 (figuur 3B).
Na de cornea-incisie werd een gedetailleerde karakterisering van het wondgenezingsproces bereikt door immunohistochemie uit te voeren op gesneden, gewonde hoornvliesweefsels. De extracellulaire matrixeiwitten fibronectine en tenascine zijn geassocieerd met epitheliale en keratocytcelmigratie naar genezende volwassen hoornvlieswonden14,15. Spatiotemporale lokalisatie van de extracellulaire matrixeiwitten, fibronectine en tenascine is duidelijk in de genezende wond en bleek verhoogd te zijn op tijdstippen die overeenkomen met cornea-re-epithelisatie (5 dagen na verwonding)8 (figuur 4). Een dergelijke analyse suggereert het belang van fibronectine en tenascine voor wondsluiting en, in het bijzonder, hun betrokkenheid bij epitheelcelmigratie en overleving, consistent met dergelijke functies in volwassen hoornvlieswonden16,17.
Beginnend bij E8-E9, wordt het hoornvlies dicht geïnnerveerd door trigeminus sensorische zenuwvezels die afkomstig zijn van een pericorneale zenuwring en door het voorste stroma lopen terwijl ze naar het centrum van het hoornvlies en het hoornvliesepitheel projecteren door E12 18,19,20. Aangezien hoornvlieswonden in dit model worden gemaakt op E7, kort voor zenuwprojectie in het hoornvlies, onderzoekt dit model verder corneazenuwen terwijl ze een genezend hoornvlies navigeren na belediging. Door gebruik te maken van whole-mount immunohistochemie om corneazenuwen te traceren met anti-β neurale tubuline (Tuj1) antilichamen21, is het duidelijk dat zenuwen tijdelijk worden geremd uit het genezende hoornvliesweefsel dat het gewonde, centrale hoornvlies direct naast elkaar plaatst (5 dagen na verwonding)8 (figuur 5A, B). Ondanks eerdere remming innerveren corneazenuwen uiteindelijk het volledig genezen hoornvliesweefsel (11 dagen na het verwonden) tot vergelijkbare dichtheidsniveaus en in vergelijkbare patronen als stadium-matched, niet-gewonde controles (E18C) (figuur 5C, D).
Opvallend is dat volledig gerepithelialiseerde corneaweefsels die op een nonfibrotische, littekenloze manier zijn genezen, een volledige recapitulatie van de normale collageenweefselarchitectuur vertonen. Zoals blijkt uit harmonische beeldvorming van de tweede generatie22,23, zijn bundels collageenvezels over verschillende diepten van het centrale hoornvlieswondgebied orthogonaal gerangschikt, overeenkomend met de inheemse macrostructuur van niet-gewond centraal hoornvliesweefsel 9 (figuur 6).
Figuur 1: Schematische van in ovo extra-embryonale membraandissecties en hoornvlieswonden. Bij E5.5 wordt het schedelgebied van het embryo blootgelegd door de ACM- en CAM-membranen te ontleden en het amnion en de allantois weg te plaatsen van het zich ontwikkelende oog. Eieren worden verzegeld en geïncubeerd tot E7 wanneer het centrale hoornvlies gewond is, met behulp van gebogen tangen als een wieg voor het embryohoofd, omdat de punt van een microchirurgisch mes een incisie maakt in het centrale hoornvlies. De wond is evenwijdig aan de koraalspleet georiënteerd (asterisk). Om ervoor te zorgen dat de diepte van de incisie het voorste stroma bereikt, moeten drie gelijktijdige sneden worden gemaakt met het mes, elk in dezelfde relatieve positie, de ene over de andere. Schaalbalk = 1 mm. Het cijfer is met toestemming aangepast aan de hand van referenties 8,11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Variaties in wonden gegenereerd in ovo. (A) Na membraandissecties bij E5.5 is het rechteroog toegankelijk in ovo. (B-D) Beelden gemaakt van een in ovo embryo onmiddellijk na scheuren van verschillende gradaties die de omvang van het hoornvlies overspannen en in overeenstemming zijn met de vaatvormige fissuur (cf). (B) Na drie scheuren waarbij zwakke druk werd uitgeoefend, is een ondiepe wond zichtbaar. De pijlpunt markeert een plaats in het hoornvlies waar het epitheel is geschoren, maar het voorste stroma niet is doorgedrongen. Pijlpunten duiden op een klein hoornvliesgebied waar het voorste stroma is doorgedrongen. (C) Na drie scheuren waarbij een ideale hoeveelheid druk werd uitgeoefend, is een ideale wond zichtbaar. Pijlpunten duiden op een wond die de gehele omvang van het hoornvlies beslaat waar het voorste stroma is doorgedrongen. (D) Na drie scheuren waarbij overmatige druk werd uitgeoefend, is een volledige wond zichtbaar en is de waterige humor blootgesteld aan de externe omgeving. Afkortingen: tca, temporal ciliaire slagader; cf, vaatvormige fissuur; CAM, chorioallantoïsch membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Progressie van wondgenezing. (A) Progressie van genezing in gewonde hoornvliezen in vergelijking met stadium-gematchte controles wordt getoond vanaf het moment van verwonding (0 dpw) en 16 h na verwonding (hrpw) tot 3-11 dagen na verwonding (dpw). Pijlpunten bakenen de dorsale en ventrale randen van de wond af, wat wijst op een periode van wondexpansie (0-3 dpw) gevolgd door progressieve wondsluiting (5-11 dpw). (B) Doorsneden DAPI (blauw)- en lamineïne (rood)-gekleurde gewonde hoornvliezen bij 0, 3 en 11 dpw. Haakjes tonen de omvang van het gewonde gebied, wat wondexpansie met 3 dpw en volledig herstel van het opnieuw gepitheliseerde hoornvlies door E11 onthult. Sterretjes geven het genezen gebied van het hoornvlies aan. De schaalbalk is (A) 1 mm, (B) 100 μm. De figuur is met toestemming aangepast van referentie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische analyse van gewonde hoornvliezen. Doorsneden door (A) 3 dpw en (B) 5 dpw. DAPI-gekleurde (blauwe) gewonde hoornvliezen onthullen de lokalisatie van fibronectine (FN, rood) en Tenascin-C (TN-C, groen). Haakjes in (A) en (B) geven het gewonde gebied aan. Schaalbalk: 100 μm. Afkortingen: ep, epithelium; st, stroma; nl, endotheel. De figuur is met toestemming aangepast van referentie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Innervatie van gewonde hoornvliezen. (A-D) Visualisatie van de hoornvlieszenuwen na anti-β neurale tubuline (Tuj1) whole-mount immunostaining in (B) 5 dpw en (D) 11 dpw cornea's, evenals (A) stage-matched E12 (E12C, stage-matched voor 5 dpw) en (C) E18 controles (E18C, stage-matched voor 11 dpw). (B) De gebroken lijn in het hoornvlies van 5 dpw geeft de omvang van de wond aan. Het haakjes geplaatste gebied direct grenzend aan de wond duidt op het hoornvliesgebied dat tijdelijk afstotelijk is voor zenuwen en actief re-epithelisatie ondergaat. (B') Optische scan door het genezende hoornvliesweefsel direct grenzend aan de open wond onthult een zeldzame stromale zenuwbundel die zich uitstrekt tot in het weefsel (pijl) en epitheliale zenuwriemen (pijlpunt). (C,D) Volledig geregenereerde hoornvliezen bij 11 dpw vertonen vergelijkbare innervatiepatronen en vergelijkbare zenuwdichtheden als gefaseerde controles. Afkorting: w, wound. De figuur is met toestemming aangepast van referentie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Collageen ultrastructuur in genezen embryonale hoornvliezen. (A) En gezichtsscan van volledig genezen 10 dpw hoornvliezen en stadium-matched controles met behulp van tweede generatie harmonische beeldvorming (SGH). Scandieptes variëren van 2-66 μm vanaf het voorste oppervlak van het hoornvlies (0 μm is het meest voorste stroma) en worden links van de respectieve afbeeldingen weergegeven. Inzetstukken voor elke afbeelding komen overeen met fast fouriertransformatieanalyse van het centrale wondgebied voor die specifieke scandiepte. (B) Handmatig gesegmenteerde stapels van tweedimensionale Fast Fourier-transformatieanalyse, die de collageenorganisatie binnen het gewonde en op een stadium afgestemde controlehoornvlies vertegenwoordigen. Schaalbalk = 50 μm. De figuur is met toestemming aangepast van referentie9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kuiken is een ideaal modelsysteem voor het bestuderen van foetaal, littekenloos hoornvlieswondherstel. In tegenstelling tot zoogdieren is het kuiken gemakkelijk toegankelijk tijdens de ontwikkeling met behulp van ovo8 of ex ovo strategieën24. Het embryonale hoornvlies van het kuiken is veel groter dan hoornvliezen van knaagdieren, met bijna 50% van het schedelvolume gewijd aan het oog25, waardoor het zeer vatbaar is voor fysieke manipulaties zoals verwonding. Bovendien zijn kippeneieren het hele jaar door gemakkelijk verkrijgbaar, vaak van lokale boerderijen, en kosteneffectief, waarvoor alleen een gebromeerde incubator nodig is om de ontwikkeling te ondersteunen.
Dit protocol rapporteert een reeks procedures die embryonale kuikenhoornvlieswonden mogelijk maken. Wonden gemaakt aan het embryonale kuikenhoornvlies regenereren volledig, waardoor een volledige recapitulatie van de inheemse hoornvliesstructuur mogelijk is zonder detecteerbare littekens. Deze techniek heeft van het embryonale kuiken een vitaal diermodel gemaakt voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire factoren die de genezing van littekenloze hoornvlieswonden coördineren.
Ondanks de duidelijke belofte die inherent is aan het foetale wondgenezingsmodel dat hierin wordt beschreven, is het vermeldenswaard dat er duidelijke verschillen zijn tussen foetale en volwassen hoornvlieswondgenezing. Het embryonale hoornvlies drukt groeifactoren en morfogenetische signalen uit die in volwassen weefsels tot zwijgen worden gebracht of afwezig zijn26. Bovendien vertonen gewonde volwassen hoornvliesweefsels fibrose en vormen ze littekenweefsel, waarschijnlijk als gevolg van een verhoogde ontstekingsreactie gemedieerd door cytokines en groeifactoren27, die gedempt zijn of nog niet zijn vastgesteld in embryonale stadia. Dergelijke leeftijdsgebonden verschillen in het hoornvliesweefsel kunnen de inspanningen om volwassen gewond weefsel volledig te herstellen bemoeilijken. Niettemin zal het bepalen van belangrijke moleculaire factoren en matrixeiwitten die foetale littekenloze wondgenezing reguleren, de weg vrijmaken voor therapieën die een meer herstellend genezingsproces bevorderen met minder littekens en een betere recapitulatie van de normale weefselarchitectuur.
De hier beschreven verwondingsmethode bouwt voort op een techniek die voor het eerst werd ontwikkeld door Spurlin et al.11 om in ovo toegang te krijgen tot kuikenembryo's in een laat stadium (bijv. >E6). Door het ei te raamen en extra-embryonale membranen weg te snijden van het schedelgebied, is het embryonale oog toegankelijk voor stadia tot E7. Zoals we eerder hebben gemeld, hebben de verwijdering en verplaatsing van respectievelijk de amniochorionische en chorioallantoïsche membranen geen invloed op de embryonale ontwikkeling11. Blootgestelde embryo's zijn levensvatbaar en zijn gemakkelijk vatbaar voor fysieke manipulatie. In dit stadium heeft het hoornvlies drie verschillende lagen (epitheel, stroma en endotheel), waardoor het geschikt is voor wondgenezingsstudies na lineaire incisie in het voorste stroma. Opgemerkt moet worden dat, als gevolg van de toenemende groei van allantois in de loop van de tijd, de toegang tot het oog uiteindelijk wordt afgesloten op E8. Om dit probleem te omzeilen, als toegang tot ogen in een later stadium voor verwonding wenselijk is, hebben we ontdekt dat de toegang tot het oog kan worden gehandhaafd via E9 door dagelijkse manipulatie van de extra-embryonale membranen uit te voeren (bijv. Op E7, E8, enz.), Waarbij de allantois zorgvuldig wordt verplaatst weg van het schedelgebied om ervoor te zorgen dat de groei ervan richting het embryo plaatsvindt. Hierdoor kunnen hoornvliezen in deze latere stadia (bijvoorbeeld na innervatie) gewond raken.
Over het algemeen zijn de levensvatbaarheid en overlevingskansen van embryo's in deze techniek afhankelijk van verschillende factoren, zoals ervoor zorgen dat een steriele en gehydrateerde eiomgeving wordt gehandhaafd, terwijl verder voorzichtig wordt om geen schade toe te brengen aan embryonale bloedvaten of de allantois. Het hele eioppervlak moet worden gesteriliseerd met ethanol voordat het wordt geribbeld om de steriliteit te behouden. Dit komt omdat kleine eierschaalfragmenten, die vaak beladen zijn met microben, meestal in het ei vallen tijdens de vensterprocedure. Evenzo moeten alle gereedschappen die betrokken zijn bij vensters, membraandissecties en het maken van de cornea-incisie grondig worden gespoeld in ethanol en gedroogd of vlamsteriliseerd voordat ze worden gebruikt. Bovendien moeten antibiotica aan het ei worden toegevoegd wanneer het embryo wordt blootgesteld aan de externe omgeving. Het is verder van cruciaal belang dat het embryo de juiste hydratatie behoudt na het vensteren. Er moet veel zorg aan worden besteed om ervoor te zorgen dat het raam volledig is afgedicht met tape en dat er geen luchtspleten achterblijven. Gezien het belang van het feit dat de tape volledig aan het eierschaaloppervlak blijft kleven en het gat volledig afsluit, moet het eierschaaloppervlak rond het gat worden gereinigd en gedroogd voordat de tape wordt aangebracht. Ten slotte is het absoluut noodzakelijk dat er geen bloedvaten per ongeluk worden doorgesneden en dat de allantois, die vloeibaar afval van het embryo opslaat, niet wordt beschadigd tijdens de dissectie van de extra-embryonale membranen, omdat beide dodelijk zijn voor het embryo. Opgemerkt moet worden dat de levensvatbaarheid van het embryo hoger is wanneer kleinere scheuren aan het chorion en amnion worden gemaakt, hoewel de scheur voldoende groot moet zijn om de extra-embryonale membranen weg van het schedelgebied te plaatsen. Als deze zorgvuldige stappen worden genomen tijdens het ontleden en verwijderen van membranen uit eieren van hoge kwaliteit, kan men verwachten dat bijna alle embryo's de vensterprocedure (~ 99%) overleven, terwijl ~ 40% van de blootgestelde embryo's overleven tot E9 en ~ 30% tot E1211. In onze ervaring heeft het verwonden van de hoornvliezen van E7-E9 membraan ontlede embryo's weinig invloed op de levensvatbaarheid van embryo's, en voldoende embryo's blijven levensvatbaar via E18, op welk moment de hoornvlieswond volledig is genezen.
Het bereiken van wonden die het cornea-epitheel doorkruisen en het voorste stroma binnendringen, is essentieel om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te produceren. Een hoogwaardig micro-ontleedmes is noodzakelijk zodat er heel weinig druk hoeft te worden uitgeoefend. Het gebruik van een gebogen iristang kan nuttig zijn om het hoofd voorzichtig te wiegen terwijl de scheur met de andere hand wordt gemaakt. Op deze manier dient de gebogen iristang als achtervang zodat het hoornvlies stationair blijft tijdens het verwonden. De penetratie van de wond in het stroma is variabel, vooral tijdens het leren, maar wordt meer reproduceerbaar naarmate de onderzoeker het gevoel en de uitstraling van het breken van het hoornvliesepitheel leert. Zoals men leert, kan het nuttig zijn om gewonde hoornvliezen in dwarsdoorsnede te bekijken, zodat de diepte van wondpenetratie in het hoornvliesstroma kan worden beoordeeld (zie figuur 3B voor een voorbeeld van een doorsnede hoornvlies met ideale verwondingsdiepte onmiddellijk na hoornvliesscheur).
In combinatie met klassieke ontwikkelingsbiologische technieken, zoals weefseltransplantatie en kraalimplantatie, of moderne benaderingen voor genmanipulatie, zoals DNA-elektroporatie en retrovirale infectie, belooft dit diermodel van cornearegeneratie de moleculaire factoren en cellulaire mechanismen te onthullen die nodig zijn om volledig herstel van het hoornvliesweefsel na schade te bereiken. Verder zou dit diermodel kunnen worden gebruikt om het potentiële nut van exogene therapeutische verbindingen te testen om de regeneratie van het hoornvlies te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen met betrekking tot de informatie die in dit manuscript wordt gepresenteerd.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een artistieke en wetenschappelijke ontwikkelingsbeurs via Illinois Wesleyan University aan TS en gedeeltelijk gefinancierd door NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
- Wilson, S. E.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Developmental Biology. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A.
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
