Summary

Tredimensionelt, serumfrit kultursystem til stamceller fra lacrimalkirtlen

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

Den tredimensionelle, serumfri dyrkningsmetode til voksne lacrimal kirtel (LG) stamceller er veletableret til induktion af LG organoiddannelse og differentiering i acinar eller duktallignende celler.

Abstract

Lacrimal kirtel (LG) stamcellebaseret terapi er en lovende strategi for lacrimal kirtel sygdomme. Manglen på en pålidelig, serumfri dyrkningsmetode til opnåelse af et tilstrækkeligt antal LG-stamceller (LGSC’er) er imidlertid en hindring for yderligere forskning og anvendelse. Den tredimensionelle (3D), serumfri dyrkningsmetode til lgsc’er med voksne mus er veletableret og vist her. LGSC’erne kunne kontinuerligt passeres og induceres til at differentiere til acinar eller duktallignende celler.

For LGSC primærkulturen blev LP’erne fra 6-8 uger gamle mus fordøjet med dispase, collagenase I og trypsin-EDTA. I alt 1 × 104 enkeltceller blev podet i 80 μL matrix gel-lacrimal kirtel stamcelle medium (LGSCM) matrix i hver brønd af en 24-brønd plade, forbelagt med 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Blandingen blev størknet efter inkubation i 20 minutter ved 37 °C, og der blev tilsat 600 μL LGSCM.

Til LGSC-vedligeholdelse blev LGSC’er dyrket i 7 dage opdelt i enkeltceller ved dispase og trypsin-EDTA. Enkeltcellerne blev implanteret og dyrket i henhold til den metode, der blev anvendt i LGSC primærkulturen. LGSC’er kunne passeres over 40 gange og kontinuerligt udtrykke stam- / stamcellemarkører Krt14, Krt5, P63 og nestin. LGSC’er dyrket i LGSCM har selvfornyelseskapacitet og kan differentiere sig til acinar- eller duktallignende celler in vitro og in vivo.

Introduction

Lacrimal kirtel stamceller (LGSC’er) opretholde lacrimal kirtel (LG) cellefornyelse og er kilden til acinar og duktal celler. Derfor betragtes LGSC-transplantation som en alternativ tilgang til behandling af alvorlig inflammatorisk skade og vandig-mangelfuld tør øjensygdom (TILFØJET)1,2,3. Tiwari et al. adskilte og dyrkede primære LG-celler ved hjælp af kollagen I og matrixgel suppleret med flere vækstfaktorer; LG-cellerne kunne dog ikke kontinuerligt dyrkes4. Ved hjælp af todimensionel (2D) kultur blev mus LG-afledte stamceller isoleret af You et al.5 og Ackermann et al. 6, fundet at udtrykke stam-/stamcellemarkørgenerne, Oct4, Sox2, Nanog og nestin, og kunne subkultureres. Der er imidlertid ingen klar indikation af, at disse celler kan differentiere sig til acinar- eller duktale celler, og der er ikke noget transplantationseksperiment for at verificere differentieringspotentialet in vivo.

For nylig blev c-kit + dim / EpCAM + / Sca1/ CD34/ CD45-celler isoleret fra muse-LP’er ved flowcytometri, fundet at udtrykke LG-stamcellemarkører, såsom Pax6 og Runx1, og differentieret i kanaler og acini in vitro. Hos mus med ADDED kan ortopisk injektion med disse celler reparere beskadigede LC’er og genoprette SEK’ernes sekretoriskefunktion. Antallet af stamceller isoleret ved denne metode var imidlertid lille, og der er ingen egnede kulturbetingelser for udvidelse af de isolerede LGSC’er. Sammenfattende skal der etableres et passende kultursystem til effektivt at isolere og dyrke voksne LGSC’er med stabil og kontinuerlig ekspansion til undersøgelse af LGSC’er i behandlingen af ADDED.

Organoider afledt af stamceller eller pluripotente stamceller er en gruppe celler, der histologisk ligner de beslægtede organer og kan opretholde deres egen fornyelse. Efter at musens tarmorganoid med succes blev dyrket af Sato et al. i 20097, blev organoider fra andre organer dyrket efter hinanden baseret på Satos kultursystem, såsom galdeblære8, lever9, bugspytkirtel10, mave11, bryst12, lunge13, prostata14 og spytkirtel15 . På grund af den høje andel af voksne stamceller før celledifferentiering i organoidkultur betragtes den tredimensionelle (3D) organoidkulturmetode som optimal til isolering og dyrkning af voksne stamceller fra LG.

Et LGSC-dyrkningssystem for voksne mus blev etableret i denne undersøgelse ved at optimere 3D, serumfri dyrkningsmetode. Det er bevist, at LGSC’erne dyrket fra både normale og TILFØJEDE mus viste en stabil kapacitet til selvfornyelse og spredning. Efter transplantation i ADDED-muse-LP’erne koloniserede LGSC’er de svækkede LC’er og forbedrede tåreproduktionen. Derudover blev røde fluorescerende LGSC’er isoleret fra ROSA26mT / mG mus og dyrket. Dette arbejde giver en pålidelig reference for LGSC berigelse in vitro og LGSC autograft i klinisk anvendelse til ADDED terapi.

Protocol

Alle eksperimenterne i denne protokol fulgte retningslinjerne for dyrepleje fra Den Etiske Komité for Dyreforsøg ved Sun Yat-sen University. Alle cellerelaterede operationer skal udføres på det ultrarengørende arbejdsbord i celleoperationsrummet. Alle operationer med xylen skal udføres i røghætter. 1. LGSC primær kultur LG isolation Få en 6-8 uger gammel BALB/c hanmus, og skær huden bag øret for at udsætte LG og bindevævet omkring det. Skræl bi…

Representative Results

Etabler 3D, serumfrit kultursystemI denne undersøgelse blev LGSCM indeholdende EGF, Wnt3A, FGF10 og Y-27632 til LGSC’er til mus udviklet, og LGSC’er blev med succes isoleret og dyrket ved en 3D-dyrkningsmetode (figur 1A). Et vellykket 3D, serumfrit dyrkningssystem af LGSC’er fra C57BL/6-mus, NOD/ShiLtJ-mus, BALB/c-mus og ROSA26mT/mG-mus er blevet etableret ved hjælp af denne metode16. For en hanmus blev 1,5-2 × 106 celler …

Discussion

Der er veletablerede metoder til isolering og in vitro-dyrkning af lacrimal stamceller til lacrimal stamcellekultur og LG skade reparation. Shatos et al.17 og Ackermannet al. 6 succesfuldt dyrkede og subkulturerede lacrimale stamceller fra henholdsvis rotter og mus ved hjælp af henholdsvis 2D-dyrkningsmetoder, hvilket gør det muligt at transplantere lacrimale stamceller til behandling af ADDED. Undersøgelser af stamceller18 og me…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) og to programmer for Guangdong Science and Technology (2017B020230002 og 2016B030231001). Vi er virkelig taknemmelige for de forskere, der har hjulpet os under undersøgelsen og for de medarbejdere, der arbejder i dyrecentret for deres støtte i dyrepleje.

Materials

Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID
Yeast Extract OXID
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC
Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG
Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC
Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC
Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT
Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA
Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT
Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC
Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Play Video

Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

View Video