लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल के लिए त्रि-आयामी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली
Summary
वयस्क लैक्रिमल ग्रंथि (एलजी) स्टेम कोशिकाओं के लिए त्रि-आयामी, सीरम मुक्त संस्कृति विधि एलजी ऑर्गेनोइड गठन के प्रेरण और एसीनार या डक्टल जैसी कोशिकाओं में भेदभाव के लिए अच्छी तरह से स्थापित है।
Abstract
लैक्रिमल ग्रंथि (एलजी) स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा लैक्रिमल ग्रंथि रोगों के लिए एक आशाजनक रणनीति है। हालांकि, पर्याप्त संख्या में एलजी स्टेम सेल (एलजीएससी) प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय, सीरम मुक्त संस्कृति विधि की कमी आगे के शोध और अनुप्रयोग के लिए एक बाधा है। वयस्क माउस एलजीएससी के लिए त्रि-आयामी (3 डी), सीरम मुक्त संस्कृति विधि अच्छी तरह से स्थापित है और यहां दिखाया गया है। एलजीएससी को लगातार पारित किया जा सकता है और एसीनार या डक्टल जैसी कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।
एलजीएससी प्राथमिक संस्कृति के लिए, 6-8 सप्ताह के चूहों के एलजी को डिसपेज, कोलेजनेज आई और ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ पचाया गया था। कुल 1 × 104 एकल कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल-लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल माध्यम (एलजीएससीएम) मैट्रिक्स के 80 μL में 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में वरीयता दी गई थी, मैट्रिक्स जेल-एलजीएससीएम मैट्रिक्स के 20 μL के साथ प्रीकोटेड किया गया था। मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के बाद जम गया था, और एलजीएससीएम के 600 μL जोड़ा गया था।
एलजीएससी रखरखाव के लिए, 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत एलजीएससी को डिसपेज और ट्रिप्सिन-ईडीटीए द्वारा एकल कोशिकाओं में अलग किया गया था। एकल कोशिकाओं को एलजीएससी प्राथमिक संस्कृति में उपयोग की जाने वाली विधि के अनुसार प्रत्यारोपित और सुसंस्कृत किया गया था। एलजीएससी को 40 से अधिक बार पारित किया जा सकता है और लगातार स्टेम / पूर्वज सेल मार्कर केआरटी 14, केआरटी 5, पी 63 और नेस्टिन को व्यक्त किया जा सकता है। एलजीएससीएम में सुसंस्कृत एलजीएससी में आत्म-नवीकरण क्षमता होती है और इन विट्रो और विवो में एसीनार या डक्टल जैसी कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं।
Introduction
लैक्रिमल ग्रंथि स्टेम सेल (एलजीएससी) लैक्रिमल ग्रंथि (एलजी) सेल नवीकरण बनाए रखते हैं और एसीनार और डक्टल कोशिकाओं का स्रोत होते हैं। इसलिए, एलजीएससी प्रत्यारोपण को गंभीर भड़काऊ क्षति और जलीय-कमी वाले शुष्क आंख रोग (एडीडी) 1,2,3 के इलाज के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण माना जाता है। एलजीएससी को समृद्ध करने के लिए कई संस्कृति विधियों को लागू किया गया है तिवारी एट अल कोलेजन आई और मैट्रिक्स जेल का उपयोग करके अलग और सुसंस्कृत प्राथमिक एलजी कोशिकाओं को कई विकास कारकों के साथ पूरक किया गया है; हालाँकि, एलजी कोशिकाओं को लगातार सुसंस्कृत नहीं किया जा सका4. द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृति का उपयोग करते हुए, माउस एलजी-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं को यू एट अल 5 और एकरमैन एट अल द्वारा अलग किया गया था। पूर्वज सेल मार्कर जीन, अक्टूबर 4, सोक्स 2, नैनोग और नेस्टिन को व्यक्त करने के लिए पाया गया, और उपसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, कोई स्पष्ट संकेत नहीं है कि ये कोशिकाएं एसिनार या डक्टल कोशिकाओं में अंतर कर सकती हैं, और विवो में भेदभाव क्षमता को सत्यापित करने के लिए कोई प्रत्यारोपण प्रयोग नहीं है।
हाल ही में, सी-किट + मंद / ईपीसीएएम +/ एससीए 1–/ सीडी 34–/ सीडी 45– कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा माउस एलजी से अलग किया गया था, जो एलजी पूर्वज सेल मार्करों, जैसे पैक्स 6 और रनक्स 1 को व्यक्त करने के लिए पाया गया था, और इन विट्रो में नलिकाओं और एसिनी में विभेदित किया गया था। जोड़ा के साथ चूहों में, इन कोशिकाओं के साथ ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन क्षतिग्रस्त एलजी की मरम्मत और एलजी2 के स्रावी समारोह को बहाल कर सकता है। हालांकि, इस पद्धति द्वारा पृथक स्टेम कोशिकाओं की संख्या छोटी थी, और पृथक एलजीएससी के विस्तार के लिए कोई उपयुक्त संस्कृति की स्थिति नहीं है। संक्षेप में, एडीजेड के उपचार में एलजीएससी के अध्ययन के लिए स्थिर और निरंतर विस्तार के साथ वयस्क एलजीएससी को प्रभावी ढंग से अलग करने और संस्कृति करने के लिए एक उपयुक्त संस्कृति प्रणाली स्थापित करने की आवश्यकता है।
स्टेम कोशिकाओं या प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त ऑर्गेनोइड कोशिकाओं का एक समूह है जो हिस्टोलॉजिकल रूप से संबंधित अंगों के समान हैं और अपने स्वयं के नवीकरण को बनाए रख सकते हैं। 20097 में, अन्य अंगों से ऑर्गेनोइड को सातो की संस्कृति प्रणाली के आधार पर उत्तराधिकार में सुसंस्कृत किया गया था, जैसे पित्ताशय की थैली8, यकृत9, अग्न्याशय10, पेट11, स्तन12, फेफड़े13, प्रोस्टेट14, और लार ग्रंथि15 . ऑर्गेनोइड संस्कृति में सेल भेदभाव से पहले वयस्क स्टेम कोशिकाओं के उच्च अनुपात के कारण, तीन आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड संस्कृति विधि को एलजी के वयस्क स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए इष्टतम माना जाता है।
3 डी, सीरम मुक्त संस्कृति विधि का अनुकूलन करके वर्तमान अध्ययन में एक वयस्क माउस एलजीएससी संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई थी। यह साबित हुआ है कि सामान्य और अतिरिक्त चूहों दोनों से सुसंस्कृत एलजीएससी ने आत्म-नवीकरण और प्रसार की स्थिर क्षमता दिखाई। जोड़े गए माउस एलजी में प्रत्यारोपण के बाद, एलजीएससी ने बिगड़ा हुआ एलजी का उपनिवेश किया और आंसू उत्पादन में सुधार किया। इसके अलावा, लाल फ्लोरोसेंट एलजीएससी को आरओएसए 26एमटी / एमजी चूहों से अलग किया गया और सुसंस्कृत किया गया। यह काम जोड़ा चिकित्सा के लिए नैदानिक अनुप्रयोग में इन विट्रो और एलजीएससी ऑटोग्राफ्ट में एलजीएससी संवर्धन के लिए एक विश्वसनीय संदर्भ प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लैक्रिमल स्टेम सेल संस्कृति और एलजी चोट की मरम्मत के लिए लैक्रिमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और इन विट्रो संस्कृति के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं। शतोस एट अल .17 और एकरमैनएट अल। <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 31871413) और गुआंग्डोंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी के दो कार्यक्रमों (2017 बी 020230002 और 2016 बी 030231001) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम वास्तव में उन शोधकर्ताओं के आभारी हैं जिन्होंने अध्ययन के दौरान हमारी मदद की है और पशु देखभाल में उनके समर्थन के लिए पशु केंद्र में काम करने वाले कर्मचारियों के सदस्यों के लिए।
Materials
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | – | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | – | |
| Yeast Extract | OXID | – | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
References
- Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
- Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
- Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
- Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
- You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
- Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
- Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
- Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
- Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
- Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
- Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
- Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).
