Summary

涙腺幹細胞のための3次元、無血清培養システム

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

成体涙腺(LG)幹細胞の三次元無血清培養法は、LGオルガノイドの形成および腺房または腺管様細胞への分化の誘導のために十分に確立されている。

Abstract

涙腺(LG)幹細胞ベースの治療は、涙腺疾患のための有望な戦略です。しかしながら、十分な数のLG幹細胞(LGSC)を得るための信頼性の高い無血清培養方法の欠如は、さらなる研究および応用のための1つの障害である。成体マウスLGSCsの三次元(3D)無血清培養法は十分に確立されており、ここに示されている。LGSCsを連続的に継代し、腺房または乳管様細胞に分化誘導することができた。

LGSC初代培養のために、6〜8週齢のマウスからのLGsを、ディスパーゼ、コラゲナーゼI、およびトリプシン−EDTAで消化した。合計1個×104個の単一細胞を、24 ウェルプレートの各ウェル中のマトリックスゲル涙腺幹細胞培地(LGSCM)マトリックス80μLに播種し、20μLのマトリックスゲルLGSCMマトリックスでプレコートした。この混合物を37°Cで20分間インキュベートした後に固化し、LGSCMを600μL添加した。

LGSC維持のために、7日間培養したLGSCsを、ディスパーゼおよびトリプシン−EDTAによって単一細胞に脱凝集させた。この単一細胞を移植し、LGSC初代培養に用いた方法に従って培養した。LGSCは40回以上継代することができ、ステム/前駆細胞マーカーKrt14、Krt5、P63、およびネスチンを連続的に発現することができる。LGSCMで培養されたLGSCCは自己複製能を有し、インビトロおよびインビボ腺房または乳管様細胞に分化し得る。

Introduction

涙腺幹細胞(LGSC)は、涙腺(LG)細胞の再生を維持し、腺房および乳管細胞の供給源である。したがって、LGSC移植は、重篤な炎症性損傷および水性欠損ドライアイ疾患(ADDED)123を治療するための代替的アプローチと考えられている。Tiwariらは、コラーゲンIおよびいくつかの成長因子を添加したマトリックスゲルを用いて初代LG細胞を分離および 培養した。しかしながら、LG細胞を連続的に培養することができなかった4。二次元(2D)培養を用いて、マウスLG由来幹細胞を、Youら5 およびAckermannらによって単離した図6から、幹/前駆細胞マーカー遺伝子、 Oct4Sox2Nanog、および ネスチンを発現することが見出され、継代培養することができた。しかしながら、これらの細胞が腺房細胞や乳管細胞に分化しうるという明確な兆候はなく、 生体内での分化能を検証する移植実験もない。

最近、c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34/CD45細胞をフローサイトメトリーによりマウスLGから単離し、Pax6やRunx1などのLG前駆細胞マーカーを発現することが判明し、インビトロでダクトやアチーニに分化した。ADDのマウスでは、これらの細胞による同所性注射は、損傷したLGを修復し、LGs2の分泌機能を回復させることができる。しかしながら、この方法により単離された幹細胞の数は少なく、単離されたLGSCsを増殖させるのに好適な培養条件はなかった。要約すると、ADDEDの治療におけるLGSCsの研究のために、安定的かつ継続的な拡大を伴う成人LGSCを効果的に単離および培養するために、適切な培養システムを確立する必要がある。

幹細胞または多能性幹細胞に由来するオルガノイドは、関連する器官に組織学的に類似しており、それら自身の再生を維持することができる細胞群である。2009年に佐藤らによってマウス腸オルガノイドの培養に成功した後7、佐藤の培養系に基づいて他の臓器由来のオルガノイドを連続して培養し、例えば胆嚢8、肝臓9、膵臓10、胃11、乳房12、肺13、前立腺14、及び唾液腺15.オルガノイド培養における細胞分化前の成体幹細胞の割合が高いため、三次元(3D)オルガノイド培養法はLGの成体幹細胞の単離および培養に最適と考えられる。

本研究では、3D無血清培養法を最適化することにより、成体マウスLGSC培養系を確立した。正常マウスとADDマウスの両方から培養したLGSCsは、自己複製および増殖の安定した能力を示したことが証明されている。ADDマウスLGsへの移植後、LGSCsは障害のあるLGsに定着し、涙液産生を改善した。また、ROSA26mT/mG マウスから赤色蛍光LGSCsを単離し、培養した。この研究は、イン ビトロでの LGSC濃縮およびADD療法の臨床応用におけるLGSC自家移植片の信頼できる参照を提供する。

Protocol

このプロトコルのすべての実験は、Sun Yat-sen Universityの動物実験に関する倫理委員会の動物ケアガイドラインに従っていました。すべてのセル関連操作は、セル操作室の超クリーンワークベンチで実行されます。キシレンを使用するすべての操作は、ヒュームフード内で行われるべきである。 1. LGSCの初代文化 LG電子絶縁 生後6〜8週のBALB/cオスマ?…

Representative Results

3D無血清培養システムの確立本研究では、マウスLGSCs用のEGF、Wnt3A、FGF10、Y-27632を含むLGSCMを開発し、3D培養法によるLGSCCsの単離・培養に成功しました(図1A)。この方法を用いて、C57BL/6マウス、NOD/ShiLtJマウス、BALB/cマウス、およびROSA26mT/mG マウスからのLGSCの3D無血清培養系が成功裏に確立されました16。雄マウスの場合、解離によ?…

Discussion

涙腺幹細胞培養およびLG傷害修復のための涙腺幹細胞の単離および体外培養のための十分に確立された方法がある。Shatos et al.17 および Ackermannet al.6ラット及びマウスの涙道幹細胞をそれぞれ2D培養法により培養及び継代培養することに成功し、ADDの治療のために涙道幹細胞を移植することが可能となった。2Dで培養されたLGsの幹細胞<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(第31871413号)と広東省科学技術の2つのプログラム(2017B020230002と2016B030231001)からの助成金によって支援されました。研究中に私たちを助けてくれた研究者と、動物ケアのサポートのために動物センターで働くスタッフに本当に感謝しています。

Materials

Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID
Yeast Extract OXID
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC
Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG
Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC
Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC
Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT
Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA
Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT
Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC
Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

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Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

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