Den tredimensjonale, serumfrie kulturmetoden for voksne lacrimal kjertel (LG) stamceller er godt etablert for induksjon av LG organoiddannelse og differensiering i acinar eller ductal-lignende celler.
Lacrimal kjertel (LG) stamcellebasert terapi er en lovende strategi for lacrimal kjertelsykdommer. Mangelen på en pålitelig, serumfri kulturmetode for å oppnå et tilstrekkelig antall LG stamceller (LGSCs) er imidlertid et hinder for videre forskning og anvendelse. Den tredimensjonale (3D), serumfrie kulturmetoden for voksenmus LGSC-er er godt etablert og vist her. LGSC-ene kan kontinuerlig overføres og induseres for å skille mellom acinar- eller kanallignende celler.
For LGSC primærkultur ble LGs fra 6-8 uker gamle mus fordøyd med dispase, kollagenaliser I og trypsin-EDTA. Totalt 1 × 104 enkeltceller ble sådd i 80 μL matrise gel-lacrimal kjertel stamcelle medium (LGSCM) matrise i hver brønn av en 24-brønns plate, forhåndslakkert med 20 μL matrise gel-LGSCM matrise. Blandingen ble størknet etter inkubasjon i 20 min ved 37 °C, og 600 μL LGSCM tilsatt.
For LGSC-vedlikehold ble LGSC-er dyrket i 7 dager disaggregatert i enkeltceller ved dispase og trypsin-EDTA. Enkeltcellene ble implantert og dyrket i henhold til metoden som ble brukt i LGSC primærkulturen. LGSCer kan passeres over 40 ganger og kontinuerlig uttrykke stamcellemarkører Krt14, Krt5, P63 og nestin. LGSCer dyrket i LGSCM har selvfornyelseskapasitet og kan skille seg ut i acinar eller kanallignende celler in vitro og in vivo.
Lacrimal kjertel stamceller (LGSCs) opprettholde lacrimal kjertel (LG) celle fornyelse og er kilden til acinar og ductal celler. Derfor anses LGSC-transplantasjon som en alternativ tilnærming for behandling av alvorlig inflammatorisk skade og vandig mangelfull tørrøyesykdom (ADDED)1,2,3. Flere kulturmetoder har blitt brukt for å berike LGSCs. Tiwari et al. separerte og kultiverte primære LG-celler ved hjelp av kollagen I og matrisegel supplert med flere vekstfaktorer; LG-cellene kunne imidlertid ikke kontinuerlig dyrkes4. Ved hjelp av todimensjonal (2D) kultur ble mus LG-avledede stamceller isolert av You et al.5 og Ackermann et al. 6, funnet å uttrykke stamcellemarkørgenene, Oct4, Sox2, Nanog og nestin, og kan subkultureres. Det er imidlertid ingen klar indikasjon på at disse cellene kan skille seg ut i acinar- eller kanalceller, og det er ikke noe transplantasjonseksperiment for å verifisere differensieringspotensialet in vivo.
Nylig ble c-kit + dim / EpCAM + / Sca1 – / CD34 – / CD45 – celler isolert fra musen LGs ved flow cytometri, funnet å uttrykke LG stamcellemarkører, for eksempel Pax6 og Runx1, og differensiert i kanaler og acini in vitro. Hos mus med ADDED kan ortotopisk injeksjon med disse cellene reparere skadede LG-er og gjenopprette sekretorisk funksjon av LG2. Imidlertid var antall stamceller isolert av denne metoden liten, og det er ingen egnede kulturforhold for å utvide de isolerte LGSCene. Oppsummert må det etableres et passende kultursystem for effektivt å isolere og dyrke voksne LGSC-er med stabil og kontinuerlig utvidelse for studiet av LGSCer i behandlingen av ADDED.
Organoider avledet fra stamceller eller pluripotente stamceller er en gruppe celler som er histologisk lik de relaterte organene og kan opprettholde sin egen fornyelse. Etter at musens tarmorganoid ble vellykket dyrket av Sato et al. i 20097, ble organoider fra andre organer dyrket etter hverandre, basert på Satos kultursystem, som galleblæren8,leveren 9, bukspyttkjertelen10, mage11, bryst12, lunge13, prostata14 og spyttkjertel15 . På grunn av den høye andelen voksne stamceller før celledifferensiering i organoidkultur, anses den tredimensjonale (3D) organoidkulturmetoden som optimal for isolasjon og kultur av voksne stamceller i LG.
En voksen mus LGSC kultursystem ble etablert i den nåværende studien ved å optimalisere 3D, serumfri kulturmetode. Det er bevist at LGSC-ene dyrket fra både normale og ekstra mus viste en stabil kapasitet til selvfornyelse og spredning. Etter transplantasjon i ekstra muse-LG-ene koloniserte LGSCene de svekkede LG-ene og forbedret tåreproduksjon. I tillegg ble røde fluorescerende LGSCer isolert fra ROSA26mT / mG-mus og dyrket. Dette arbeidet gir en pålitelig referanse for LGSC berikelse in vitro og LGSC autograft i klinisk søknad om ADDED terapi.
Det finnes veletablerte metoder for isolasjon og in vitro kultur av lacrimal stamceller for lacrimal stamcelle kultur og LG skade reparasjon. Shatos et al.17 og Ackermannet al. 6 vellykket kultivert og subkulturert lacrimal stamceller av rotter og mus ved henholdsvis 2D-kulturmetoder, noe som gjør det mulig å transplantere lacrimal stamceller for behandling av ADDED. Studier på stamceller18 og mesenchymale stamceller<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) og to programmer for Guangdong Science and Technology (2017B020230002 og 2016B030231001). Vi er virkelig takknemlige for forskerne som har hjulpet oss under studien og til de ansatte som jobber i dyresenteret for deres støtte til dyrepleie.
Animal(Mouse) | |||
Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
Equipment | |||
Analytical balance | Sartorius | ||
Automatic dehydrator | Thermo | ||
Blood counting chamber | BLAU | ||
Cell Counter | CountStar | ||
CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
Frozen tissue slicer | Lecia | ||
Horizontal centrifuge | CENCE | ||
Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
Inverted microscope | Olympus | ||
Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
Liquid nitrogen container | Thermo | ||
Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
Micropipettor | Gilson | ||
Microwave oven | Panasonic | ||
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
Paraffin slicing machine | Thermo | ||
PCR Amplifier | Eppendorf | ||
pH value tester | Sartorius | ||
4 °C Refrigerator | Haier | ||
Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
-80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
-20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
Ultra pure water purification system | ELGA | ||
Reagent | |||
Animal Experiment | |||
HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
Cell Culture | |||
B27 | Gibco | 17504044 | |
Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
Dispase | BD | 354235 | |
DMEM | Sigma | D6429 | |
DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
NEAA | Gibco | 11140050 | |
N2 | Gibco | 17502048 | |
R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
Trypsin | Sigma | T4799 | |
Y-27632 | Selleck | S1049 | |
HE staining & Immunostaining | |||
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
DAPI | Thermo | 62248 | |
Eosin | BASO | 68115 | |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
RT-PCR & qRT-PCR | |||
Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
TRIzol | Magen | R4801-02 | |
Vector Construction & Cell Transfection | |||
Agar | OXID | – | |
Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
Trytone | OXID | – | |
Yeast Extract | OXID | – | |
Primers and Sequence | Company | ||
Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
Vector | |||
pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |