Summary

Tredimensjonalt, serumfritt kultursystem for stamceller med lacrimal kjertel

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

Den tredimensjonale, serumfrie kulturmetoden for voksne lacrimal kjertel (LG) stamceller er godt etablert for induksjon av LG organoiddannelse og differensiering i acinar eller ductal-lignende celler.

Abstract

Lacrimal kjertel (LG) stamcellebasert terapi er en lovende strategi for lacrimal kjertelsykdommer. Mangelen på en pålitelig, serumfri kulturmetode for å oppnå et tilstrekkelig antall LG stamceller (LGSCs) er imidlertid et hinder for videre forskning og anvendelse. Den tredimensjonale (3D), serumfrie kulturmetoden for voksenmus LGSC-er er godt etablert og vist her. LGSC-ene kan kontinuerlig overføres og induseres for å skille mellom acinar- eller kanallignende celler.

For LGSC primærkultur ble LGs fra 6-8 uker gamle mus fordøyd med dispase, kollagenaliser I og trypsin-EDTA. Totalt 1 × 104 enkeltceller ble sådd i 80 μL matrise gel-lacrimal kjertel stamcelle medium (LGSCM) matrise i hver brønn av en 24-brønns plate, forhåndslakkert med 20 μL matrise gel-LGSCM matrise. Blandingen ble størknet etter inkubasjon i 20 min ved 37 °C, og 600 μL LGSCM tilsatt.

For LGSC-vedlikehold ble LGSC-er dyrket i 7 dager disaggregatert i enkeltceller ved dispase og trypsin-EDTA. Enkeltcellene ble implantert og dyrket i henhold til metoden som ble brukt i LGSC primærkulturen. LGSCer kan passeres over 40 ganger og kontinuerlig uttrykke stamcellemarkører Krt14, Krt5, P63 og nestin. LGSCer dyrket i LGSCM har selvfornyelseskapasitet og kan skille seg ut i acinar eller kanallignende celler in vitro og in vivo.

Introduction

Lacrimal kjertel stamceller (LGSCs) opprettholde lacrimal kjertel (LG) celle fornyelse og er kilden til acinar og ductal celler. Derfor anses LGSC-transplantasjon som en alternativ tilnærming for behandling av alvorlig inflammatorisk skade og vandig mangelfull tørrøyesykdom (ADDED)1,2,3. Flere kulturmetoder har blitt brukt for å berike LGSCs. Tiwari et al. separerte og kultiverte primære LG-celler ved hjelp av kollagen I og matrisegel supplert med flere vekstfaktorer; LG-cellene kunne imidlertid ikke kontinuerlig dyrkes4. Ved hjelp av todimensjonal (2D) kultur ble mus LG-avledede stamceller isolert av You et al.5 og Ackermann et al. 6, funnet å uttrykke stamcellemarkørgenene, Oct4, Sox2, Nanog og nestin, og kan subkultureres. Det er imidlertid ingen klar indikasjon på at disse cellene kan skille seg ut i acinar- eller kanalceller, og det er ikke noe transplantasjonseksperiment for å verifisere differensieringspotensialet in vivo.

Nylig ble c-kit + dim / EpCAM + / Sca1 / CD34 / CD45 celler isolert fra musen LGs ved flow cytometri, funnet å uttrykke LG stamcellemarkører, for eksempel Pax6 og Runx1, og differensiert i kanaler og acini in vitro. Hos mus med ADDED kan ortotopisk injeksjon med disse cellene reparere skadede LG-er og gjenopprette sekretorisk funksjon av LG2. Imidlertid var antall stamceller isolert av denne metoden liten, og det er ingen egnede kulturforhold for å utvide de isolerte LGSCene. Oppsummert må det etableres et passende kultursystem for effektivt å isolere og dyrke voksne LGSC-er med stabil og kontinuerlig utvidelse for studiet av LGSCer i behandlingen av ADDED.

Organoider avledet fra stamceller eller pluripotente stamceller er en gruppe celler som er histologisk lik de relaterte organene og kan opprettholde sin egen fornyelse. Etter at musens tarmorganoid ble vellykket dyrket av Sato et al. i 20097, ble organoider fra andre organer dyrket etter hverandre, basert på Satos kultursystem, som galleblæren8,leveren 9, bukspyttkjertelen10, mage11, bryst12, lunge13, prostata14 og spyttkjertel15 . På grunn av den høye andelen voksne stamceller før celledifferensiering i organoidkultur, anses den tredimensjonale (3D) organoidkulturmetoden som optimal for isolasjon og kultur av voksne stamceller i LG.

En voksen mus LGSC kultursystem ble etablert i den nåværende studien ved å optimalisere 3D, serumfri kulturmetode. Det er bevist at LGSC-ene dyrket fra både normale og ekstra mus viste en stabil kapasitet til selvfornyelse og spredning. Etter transplantasjon i ekstra muse-LG-ene koloniserte LGSCene de svekkede LG-ene og forbedret tåreproduksjon. I tillegg ble røde fluorescerende LGSCer isolert fra ROSA26mT / mG-mus og dyrket. Dette arbeidet gir en pålitelig referanse for LGSC berikelse in vitro og LGSC autograft i klinisk søknad om ADDED terapi.

Protocol

Alle eksperimentene i denne protokollen fulgte retningslinjene for dyrepleie i Den etiske komitéen for dyreforsøk ved Sun Yat-sen University. Alle cellerelaterte operasjoner skal utføres på den ultraclean arbeidsbenken i celleoperasjonsrommet. Alle operasjoner med xylen skal utføres i avtrekkshetter. 1. LGSC primærkultur LG-isolasjon Få en 6-8 uker gammel BALB / c mannlig mus, og kutt huden bak øret for å eksponere LG og bindevevet rundt den. Skrell …

Representative Results

Etablere 3D, serumfritt kultursystemI denne studien ble LGSCM som inneholder EGF, Wnt3A, FGF10 og Y-27632 for mus LGSC-er utviklet, og LGSC-er ble vellykket isolert og dyrket av en 3D-kulturmetode (figur 1A). Et vellykket 3D-, serumfritt kultursystem av LGSCer fra C57BL/6-mus, NOD/ShiLtJ-mus, BALB/c-mus og ROSA26mT/mG-mus er etablert ved hjelp av denne metoden16. For en mannlig mus ble 1,5-2 × 106 celler oppnådd fra to LG-e…

Discussion

Det finnes veletablerte metoder for isolasjon og in vitro kultur av lacrimal stamceller for lacrimal stamcelle kultur og LG skade reparasjon. Shatos et al.17 og Ackermannet al. 6 vellykket kultivert og subkulturert lacrimal stamceller av rotter og mus ved henholdsvis 2D-kulturmetoder, noe som gjør det mulig å transplantere lacrimal stamceller for behandling av ADDED. Studier på stamceller18 og mesenchymale stamceller<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) og to programmer for Guangdong Science and Technology (2017B020230002 og 2016B030231001). Vi er virkelig takknemlige for forskerne som har hjulpet oss under studien og til de ansatte som jobber i dyresenteret for deres støtte til dyrepleie.

Materials

Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID
Yeast Extract OXID
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC
Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG
Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC
Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC
Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT
Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA
Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT
Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC
Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren’s syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Play Video

Cite This Article
Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

View Video