Summary
Detta protokoll beskriver hur ett tredimensionellt cellodlingssystem kan användas för att modellera, behandla och analysera kromatinmodifieringar i ett nästan fysiologiskt tillstånd.
Abstract
Platta kulturer av däggdjursceller är en allmänt använd in vitro-metod för att förstå cellfysiologi, men detta system är begränsat vid modellering av fasta vävnader på grund av onaturligt snabb cellreplikation. Detta är särskilt utmanande vid modellering av moget kromatin, eftersom snabbreplikerande celler ofta är involverade i DNA-replikation och har en heterogen polyploid population. Nedan presenteras ett arbetsflöde för modellering, behandling och analys av vilande kromatinmodifieringar med hjälp av ett tredimensionellt (3D) cellodlingssystem. Med hjälp av detta protokoll odlas hepatocellulära karcinomcellinjer som reproducerbara 3D-sfäroider i en inkubator som ger aktiv näringsdiffusion och låga skjuvkrafter. Behandling med natriumsmörjat och natriumsuccinat inducerade en ökning av histonacetylering respektive bärnstensbehandling. Ökningar av nivåer av histonacetylering och succinylering är förknippade med ett mer öppet kromatintillstånd. Sfäroider samlas sedan in för isolering av cellkärnor, från vilka histonproteiner extraheras för analys av deras post-translationella modifieringar. Histonanalys utförs via vätskekromatografi kopplad online med tandemmasspektrometri, följt av en intern beräkningspipeline. Slutligen visas exempel på datarepresentation för att undersöka frekvensen och förekomsten av kombinatoriska histonmärken.
Introduction
Sedan slutet av 1800-talet har cellodlingssystem använts som en modell för att studera tillväxt och utveckling av celler utanför människokroppen 1,2. Deras användning har också utvidgats till att studera hur vävnader och organ fungerar i både friska och sjuka sammanhang 1,3. Suspensionsceller (t.ex. blodceller) växer i petriskålar eller kolvar sömlöst och omväxlande eftersom de inte monteras i tredimensionella (3D) strukturer in vivo. Celler som härrör från fasta organ kan växa i antingen tvådimensionella (2D) eller 3D-odlingssystem. I 2D-odling odlas celler i ett monolager som fäster vid en plan yta 2,4. 2D-cellodlingssystem kännetecknas av exponentiell tillväxt och en snabb fördubblingstid, vanligtvis 24 timmar till några dagar5. Celler i 3D-system växer för att bilda invecklade cell-cellinteraktioner som modellerar vävnadsliknande konglomerat närmare, och de kännetecknas av deras förmåga att nå en dynamisk jämvikt där deras fördubblingstid kan nå 1 månad eller längre5.
Presenteras i denna uppsats är en innovativ metod för att odla 3D-sfäroider i roterande cellodlingssystem som simulerar minskad gravitation6. Detta är ett förenklat derivat av ett cellodlingssystem som introducerades av NASA på 1990-talet7. Detta tillvägagångssätt minimerar skjuvkrafterna, som förekommer i befintliga metoder som spinnkolvar, och ökar sfäroidreproducerbarheten6. Dessutom ökar den roterande bioreaktorn aktiv näringsdiffusion, vilket minimerar nekrotisk bildning som uppstår i system som hängande droppcellkultur där medieutbytet är opraktiskt6. På detta sätt växer cellerna mestadels ostörda, vilket möjliggör bildandet av strukturella och fysiologiska egenskaper associerade med celler som växer i vävnad. C3A-hepatocyter (HepG2 / C3A) odlade på detta sätt hade inte bara ultrastrukturella organeller utan producerade också mängder ATP, adenylatkinas, urea och kolesterol jämförbara med nivåer som observerats in vivo 1,2. Dessutom uppvisar celler som odlas i 2D vs.3D cellodlingssystem olika genuttrycksmönster8. Genuttrycksanalys av C3A-hepatocyter odlade som 3D-sfäroider visade att dessa celler uttryckte ett brett spektrum av leverspecifika proteiner, liksom gener som är involverade i viktiga vägar som reglerar leverfunktionen8. Tidigare publikationer visade skillnaderna mellan proteom hos exponentiellt växande celler i 2D-odling jämfört med celler vid dynamisk jämvikt i 3D-sfäroidkulturer5. Dessa skillnader inkluderar cellulär metabolism, vilket i sin tur påverkar cellens struktur, funktion och fysiologi5. Proteomet hos celler som odlades i 2D-odling var mer berikat i proteiner som var involverade i cellreplikation, medan proteomet av 3D-sfäroider var mer berikat ileverfunktionalitet 5.
Den långsammare replikationshastigheten hos celler som odlas som 3D-sfäroider modellerar mer exakt specifika fenomen associerade med kromatintillstånd och modifieringar (t.ex. histonklippning9). Histonklippning är en irreversibel histon post-translationell modifiering (PTM) som orsakar proteolytisk klyvning av en del av histonens N-terminala svans. Medan dess biologiska funktion fortfarande diskuteras 10,11,12,13, är det uppenbart att dess närvaro i primära celler och levervävnad modelleras av HepG2 / C3A-celler odlade som sfäroider, men inte som platta celler 9. Detta är kritiskt, eftersom kromatintillstånd och modifieringar reglerar DNA-avläsning mestadels genom att modulera tillgängligheten till gener och därmed deras uttryck14. Histon-PTM påverkar antingen kromatintillståndet direkt genom att påverka nettoladdningen av nukleosomerna där histoner monteras, eller indirekt genom att rekrytera kromatinförfattare, läsare och suddgummin14. Hundratals histon-PTM har hittills identifierats15, vilket förstärker hypotesen att kromatin är värd för en "histonkod" som används av cellen för att tolka DNA16. Identifieringen av en myriad av PTM-kombinationer15, och upptäckten att kombinationer av histon-PTM ofta har olika biologiska funktioner från PTM som finns isolerat (t.ex. Fischle, et al.17), belyser dock att mer arbete krävs för att dekryptera "histonkoden".
För närvarande är histon PTM-analys antingen baserad på tekniker som använder antikroppar (t.ex. western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunutfällning följt av sekvensering [ChIP-seq]) eller masspektrometri (MS). Antikroppsbaserade tekniker har hög känslighet och kan ge detaljerad information om genomomfattande lokalisering av histonmärken men är ofta begränsade när det gäller att studera sällsynta PTM eller PTM som finns i kombinationer 18,19,20. MS är mer lämpad för hög genomströmning och opartisk identifiering och kvantifiering av enskilda och samexisterande proteinmodifieringar, särskilt histonproteiner 18,19,20. Av dessa skäl har detta och flera andra laboratorier optimerat MS-pipelinen för analys av histonpeptider (bottom-up MS), intakta histonsvansar (mellanliggande MS) och histonproteiner i full längd (top-down MS)21,22,23.
Nedan beskrivs ett arbetsflöde för odling av HepG2/C3A-sfäroider och förberedelse av dem för histonpeptidanalys (bottom-up MS) via nanovätskekromatografi, kopplad online med tandemmasspektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellodling odlades och cellerna skördades och överfördes till en bioreaktor där de skulle börja bilda sfäroider (Figur 1). Efter 18 dagar i odling behandlades sfäroider med natriumsufyrat eller natriumsuccinat för att öka de relativa överflöden av histonacetylering och succinylering. I synnerhet kan 3D-kulturer behandlas med genotoxiska föreningar lika bra som deras platta kulturekvivalenter; Faktum är att de senaste publikationerna belyser att det toxikologiska svaret hos celler i 3D-odling liknar primära vävnader än de i 2D-platt kultur24,25. Celler samlades sedan in vid angivna tidpunkter och kärnisolering utfördes. Därefter extraherades histoner och derivatiserades med propionsyraanhydrid före och efter trypsinsmältning enligt ett protokoll som först utvecklades av Garcia et al.26. Denna procedur genererar peptider av lämplig storlek för online-separation med omvänd faskromatografi (C18) och detektion med MS. Slutligen identifierades och kvantifierades histonpeptider, och de genererade data representerades på flera sätt för en mer fullständig biologisk tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av buffertar och reagenser
- Celltillväxtmedia (för HepG2/C3A-celler): Tillsätt fetalt bovint serum (FBS) (10% v/v), icke-essentiella aminosyror (1% v/v), L-glutamintillskott (1% v/v) och penicillin/streptomycin (0,5 % v/v) till Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, innehållande 4,5 g/L glukos). Tillväxtmedier lagras vid 4 °C i högst 2 veckor.
- 200 mM natriumbutyrat (NaBut) lösning: För att bereda 10 ml, återsuspendera 220,18 mg NaBut i 10 ml ddH2O. Förvara 1 ml alikvoter vid -20 ° C. Före cellbehandling, filtrera lösningen med ett 0,45 mm sprutfilter och tillsätt 1 ml av den filtrerade lösningen till 9 ml celltillväxtmedier för en arbetskoncentration av 20 mM.
- 100 mM natriumsuccinatlösning (NaSuc): För att bereda 10 ml, återsuspendera 162,05 mg NaSuc i 10 ml ddH2 O. Förvara 1 ml alikvotervid -20 °C. Före cellbehandling, filtrera lösningen med ett 0,45 mm sprutfilter och tillsätt 1 ml av den filtrerade lösningen till 9 ml celltillväxtmedier för en arbetskoncentration på 10 mM.
- Kall 0,2 MH2SO4: För att förbereda 1 L, tillsätt 10 ml koncentreratH2SO4till 990 ml HPLC-vatten. Förvara vid 4 °C.
- Kall aceton + 0,1% saltsyra (HCl): Tillsätt koncentrerad HCl (0,1% v/v) till aceton. Förvara vid 4 °C.
- 100 mMNH4HCO3-lösning, pH 8,0: För att bereda 1 L, återsuspendera 7,91 gNH4HCO3 i 1 liter HPLC-vatten. Förvara 50 ml alikvoter vid -20 °C.
- 0,1 % trifluorättiksyralösning (TFA): Tillsätt koncentrerad TFA (0,1 % v/v) till vatten av HPLC-kvalitet. Förvara vid 4 °C.
- 60 % acetonitril/0,1 % TFA-lösning: Tillsätt acetonitril av HPLC-kvalitet (60 % v/v) till vatten av HPLC-kvalitet. Tillsätt sedan koncentrerad TFA (0,1% v / v) till denna lösning. Förvara vid 4 °C.
- 2 % acetonitril av HPLC-kvalitet + 0,1 % myrsyra: Tillsätt acetonitril av HPLC-kvalitet (2 % v/v) i vatten av HPLC-kvalitet. Tillsätt sedan koncentrerad myrsyra (0,1% v / v) till denna lösning.
- 80 % acetonitril av HPLC-kvalitet + 0,1 % myrsyra: Tillsätt acetonitril av HPLC-kvalitet (80 % v/v) i vatten av HPLC-kvalitet. Tillsätt sedan koncentrerad myrsyra (0,1% v / v) till denna lösning.
2. Förberedelse av 3D-odlingssystemet
OBS: Olika celler, primära eller odödliga, har olika odlingsegenskaper, så bildandet av sfäroider kan skilja sig åt mellan celltyper. Detta protokoll har upprättats för HepG2 / C3A-sfäroidbildning med hjälp av bioreaktorer och ett innovativt 3D-cellodlingssystem.
- Använd standardtillväxtmedier, odla celler som ett monolager tills de är 80% sammanflytande.
- Tvätta celler med HBSS (5 ml för en 75 cm2 kolv) och inkubera celler med 5 ml 0,05% trypsin-EDTA utspätt i HBSS (1:2 utspädning) i 5 min vid 37 oC med 5% CO2.
- Kontrollera cellavskiljning under ett mikroskop och neutralisera trypsin genom att tillsätta 3 ml fetalt bovint serum (FBS) eller tillväxtmedier (innehållande 5% -10% FBS).
- Räkna antalet celler och späd cellsuspensionen för att erhålla 1 x 106 celler i en maximal volym av 1,5 ml.
- Balansera en ultralåg fastsättning 24-brunns rund bottenplatta (innehållande flera mikrobrunnar per brunn) genom att tvätta brunnarna med 0,5 ml tillväxtmedier. Centrifugera plattan i 5 min vid 3000 x g för att avlägsna luftbubblor från brunnens yta.
- Överför cellsuspensionen till plattan och centrifugen i 3 minuter vid 120 x g.
- Inkubera plattan i 24 timmar vid 37 oC med 5% CO2 för sfäroidbildning. Under tiden balanserar bioreaktorn genom att fylla fuktighetskammaren med 25 ml sterilt vatten och cellkammaren med 9 ml tillväxtmedier.
- Inkubera bioreaktorn, roterande i klinostatinkubatorn, i 24 timmar vid 37 oC med 5% CO2.
3. Tillväxt av sfäroider i bioreaktorer
OBS: För att bevara strukturen hos sfäroider används breda borrspetsar för hantering av 3D-strukturerna.
- Lossa sfäroider från den ultralåga fästplattan genom att försiktigt pipettera upp och ner med 1 ml breda borrspetsar och överför till en vävnadsodlingsbehandlad skål.
- Tvätta plattan med 0,5 ml förvärmt tillväxtmedie och överför till samma maträtt.
- Utvärdera kvaliteten på sfäroider genom mikroskopi och välj tillräckligt formade sfäroider. Sfäroider av god kvalitet har enhetlig storlek, kompaktitet och rundhet.
- Överför sfäroider till jämviktsbioreaktorer fyllda med 5 ml färska tillväxtmedier. Efter överföring av sfäroiderna fyller du bioreaktorn helt med färska tillväxtmedier.
- Placera bioreaktor i klinostatinkubatorn och justera rotationshastigheten till 10-11 rpm.
- Byt ut tillväxtmedier var 2-3: e dag genom att ta bort 10 ml gamla medier och ersätta det med 10 ml färska medier.
- Justera rotationshastigheten enligt sfäroidtillväxt, öka när sfäroider växer i storlek och antal.
- Efter 18 dagar i odling är sfäroider redo för behandling och / eller insamling
4. Sfäroidbehandling och insamling
OBS: I detta protokoll behandlas HepG2 / C3A-sfäroider med natriumbutyrat (NaBut) och natriumsuccinat (NaSuc) för att utvärdera nivåerna av histonmärken som innehåller acetylering respektive bärnstensering.
- Förbered tillväxtmedier med lämplig arbetskoncentration av föreningen (t.ex. 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc). Byt ut media i bioreaktorn med det behandlade mediet.
OBS: För att fastställa ett kontrolltillstånd, samla antingen tillräckligt med sfäroider för experiment innan du lägger till behandlingen eller utse en bioreaktor för obehandlade sfäroider. - Samla in sfäroider för proteomisk analys efter tillräcklig behandlingstid (t.ex. 48 timmar till 1 vecka för NaSuc-behandling eller 48-72 timmar för NaBut-behandling).
OBS: För histonextraktion med hjälp av detta protokoll samlades sex till åtta sfäroider innehållande cirka 1 x 106 celler.- Ta bort 3-5 ml media från bioreaktorn genom toppporten.
- Öppna den främre porten och använd en 1 ml bred borrspets för att ta bort sfäroider och placera dem i mikrocentrifugrör.
- Centrifugera sfäroiderna vid 100 x g i 5 minuter och kassera media.
OBS: Mediet i bioreaktorn kan ändras och bioreaktorn kan återföras till inkubatorn för ytterligare behandlingstid eller återhämtning. - Tvätta sfäroider med 200 μL HBSS för att ta bort FBS. Centrifugera vid 100 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
OBS: Sfäroider kan lagras vid -80 oC tills bearbetning.
5. Histon extraktion
OBS: De många basiska aminosyraresterna som finns i histoner gör det möjligt för dem att nära interagera med DNA, som har en fosforsyra ryggrad. Eftersom histoner är några av de mest basiska proteinerna i kärnan, när de extraheras med iskall svavelsyra (0,2 MH2SO4) finns det minimal förorening. De icke-histonproteinerna kommer att fällas ut i stark syra. Högkoncentrerad triklorättiksyra (TCA) utspädd till en slutlig koncentration av 33% används efteråt för att fälla ut histonerna från svavelsyran. Förvara alla prover, rör och reagenser på is för hela histonextraktionen.
- Tillsätt fem volymer (~ 100 μL) kall 0,2MH2SO4till cellpelleten (~ 10-20 μL) och pipett upp och ner för att störa pelletsen och släppa histoner.
- Inkubera rör i upp till 4 timmar vid konstant rotation eller skakning vid 4 oC.
OBS: För återsuspenderade prover som har en volym större än 500 μL är en 2 timmars inkubation tillräcklig för att extrahera histoner (längre inkubation kan leda till extraktion av andra basiska kärnproteiner). För återsuspenderade prover med en volym mindre än 200 μL krävs en 4 timmars inkubation för ett bättre utbyte. - Centrifug vid 3 400 x g i 5 min vid 4 °C. Samla supernatant i ett nytt rör och kasta pelletsen senare.
- Tillsätt kall koncentrerad TCA så att den utgör en slutlig 25% -33% v / v (t.ex. 40-60 μL kall TCA: 120 μL supernatant) och blanda genom att invertera röret några gånger.
- Inkubera rör i minst 1 timme vid konstant rotation eller skakning vid 4 oC.
OBS: För mindre startpelletsstorlekar rekommenderas en inkubation över natten. - Centrifug vid 3 400 x g i 5 min vid 4 oC. Kassera supernatant genom pipettering. Aspirera supernatanten försiktigt; Rör inte vid sidorna på röret eller pelletsen.
OBS: Histoner deponeras på båda sidorna och botten av röret. Den vita olösliga pelleten som bildas längst ner i röret innehåller mestadels icke-histonproteiner och andra biomolekyler. - Tvätta röret (väggar och pellets) med kall aceton + 0,1% HCl med en Pasteurpipett i glas (~ 500 μL / rör).
- Centrifug vid 3 400 x g i 5 min vid 4 oC. Kassera supernatant genom att vända röret.
- Tvätta röret (väggar och pellets) med 100% kall aceton med en Pasteurpipett i glas (~ 500 μL / rör). Centrifug vid 3 400 x g i 5 min vid 4 oC.
- Kassera supernatant genom att vända röret och pipetten ut den återstående acetonen. Öppna locket och lufttorka provet på bänken i ~ 20 min.
- Fortsätt till propionylering eller lagra prover i -80 oC tills de används.
6. Första derivatiseringsrundan
OBS: Användningen av trypsin för att smälta histonproteiner leder till alltför små peptider som är svåra att identifiera med traditionella proteomikinställningar. Av denna anledning används propionsyraanhydrid för att kemiskt derivatisera ɛ-aminogrupperna av omodifierade och monometyllysinrester. Detta begränsar trypsinproteolys till C-terminala argininrester. För prover i 96-brunnsplattor rekommenderas användning av flerkanaliga pipetter och reservoarer för reagensupptagning (figur 2A). Derivatisering utförs också efter matsmältning för att märka peptidernas fria N-termini som ökar peptidhydrofobicitet och därmed kromatografisk retention i omvänd fas.
- Resuspendprover i 20 μL av 15%-20% acetonitril i 100 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0). Vortex i 15 s och snurra sedan ner vid 1000 x g i 30 s.
- Om det finns åtta eller fler prover, överför varje återsuspenderat prov till en 96-brunnsplatta.
OBS: Om proverna inte har överförts till en 96-brunnsplatta kan en enkanalspipett användas i steg 6.3-6.7, 7.1-7.5 och 8.1-8.5. - Tillsätt 2 μL propionsyraanhydrid under huven med en flerkanalig pipett. Blanda genom att pipettera upp och ner 5x.
- Tillsätt snabbt 10 μL ammoniumhydroxid med en flerkanalig pipett. Blanda genom att pipettera upp och ner 5x.
OBS: Propionsyra är en produkt av reaktionen mellan propionsyraanhydrid och fria aminer från peptider och kan minska provets pH. pH 8 kan återupprättas genom tillsats av ammoniumhydroxid till provet i förhållandet 1:5 (v/v). - Se till att pH är 8 med pH-testpapper. Om pH < 8, justera genom att tillsätta 1 μL ammoniumhydroxid. Om pH > 8, justera genom att tillsätta 1 μL myrsyra eller ättiksyra. När pH > 10 är märkning av andra aminosyrarester med högre pKa möjlig.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Upprepa steg 6.3–6.6. En dubbel omgång histonpropionylering säkerställer nästan fullständig reaktionseffektivitet.
- Torr platta i hastighetsvakuum tills alla brunnar är helt torkade (~ 9 timmar).
- Fortsätt att trypsin matsmältning eller lagra prover vid -80 oC tills användning.
7. Histon matsmältning
OBS: Histoner smälts till peptider med trypsin, som skär vid karboxylsidan av arginin- och lysinrester. Eftersom propionylering modifierar lysinrester klyvs emellertid endast argininrester (figur 2B).
- Förbered trypsinlösning (25 ng / μL i 50 mMNH4HCO3, pH 8,0). Tillsätt 20 μL trypsin (500 ng) till varje prov.
- För att bereda 50 mM NH4HCO3-lösning , späd 100 mM NH4HCO3-lösning 1:1 v/v med vatten av HPLC-kvalitet.
- Se till att pH är 8 med pH-testpapper. Om pH < 8, justera genom att tillsätta 1 μL ammoniumhydroxid. Om pH > 8, justera genom att tillsätta 1 μL myrsyra eller ättiksyra.
- Smält vid rumstemperatur över natten eller inkubera vid 37 oC i 6-8 timmar.
- Om möjligt, kontrollera pH efter ~ 3 h av matsmältningen, eftersom det kan ha minskat. Om pH < 8, justera genom att tillsätta 1 μL ammoniumhydroxid.
- Tillsätt ytterligare 5 μL 50 ng/μL trypsinlösning (250 ng) och fortsätt matsmältningen.
- Fortsätt till den andra omgången av propionylering eller lagra prover vid -80 oC tills de används.
8. Derivatisering av peptid N-termini
OBS: Propionylering av histonpeptider vid deras N-terminal förbättrar retentionen av de kortaste peptiderna genom omvänd fas vätskekromatografi (t.ex. aminosyror 3-8 av histon H3), eftersom propionylgruppen ökar peptidhydrofobiciteten.
- Under huven tillsätt 2 μL propionsyraanhydrid med hjälp av flerkanalspipetten. Blanda genom att pipettera upp och ner 5x.
- Tillsätt snabbt 10 μL ammoniumhydroxid med hjälp av flerkanalspipetten. Blanda genom att pipettera upp och ner 5x.
OBS: Propionsyra är en produkt av reaktionen mellan propionsyraanhydrid och fria aminer från peptider och kan minska provets pH. pH 8 kan återupprättas genom tillsats av ammoniumhydroxid till provet i förhållandet 1:5 (v/v). - Se till att pH är 8 med pH-testpapper. Om pH < 8, justera genom att tillsätta 1 μL ammoniumhydroxid. Om pH > 8, justera genom att tillsätta 1 μL myrsyra eller ättiksyra. När pH > 10 är märkning av andra aminosyrarester med högre pKa möjlig.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Upprepa steg 8.1–8.4. En dubbel omgång histonpropionylering säkerställer nästan fullständig reaktionseffektivitet.
- Torr platta i hastighetsvakuum tills alla brunnar är helt torkade (~ 9 timmar).
- Fortsätt till avsaltningssteget eller lagra prover vid -80 oC tills de används.
9. Avsaltning och provrensning
OBS: Salter som finns i provet stör masspektrometrianalysen. Salter joniseras också under elektrospray och kan undertrycka signaler från peptider. Salter kan bilda joniska addukter på peptider, vilket gör att den addukterade peptiden har en annan massa. Detta minskar peptidens signalintensitet och förhindrar korrekt identifiering och kvantifiering. Inställningen för avsaltning illustreras i figur 2C.
- Börja blanda HLB-hartset (50 mg / ml i 100% acetonitril) på en magnetisk omrörningsplatta.
- Se till att det finns en 96-brunns uppsamlingsplatta placerad under 96-brunns polypropenfilterplattan för att samla upp genomströmningen.
- Tillsätt 70 μL HLB-suspension per brunn till filterplattan. Slå försiktigt på vakuumet för att förhindra stänk. Kassera genomströmningen.
- Tvätta hartset med 100 μL 0,1% TFA. Slå försiktigt på vakuumet för att förhindra stänk. Kassera genomströmningen.
- Resuspendera varje prov i 100 μL av 0,1% TFA. Kontrollera pH; det ska vara ~ 2-3.
- Ladda varje prov i varje brunn. Slå på vakuumet försiktigt för att förhindra stänk. Kassera genomströmningen.
- Tvätta med 100 μL 0,1% TFA. Slå på vakuumet försiktigt för att förhindra stänk. Kassera genomströmningen.
- Byt ut uppsamlingsplattan mot en ny uppsamlingsplatta med 96 brunnar.
- Tillsätt 60 μL 60 % acetonitril/0,1 % TFA per brunn. Slå på vakuumet försiktigt för att förhindra stänk. Samla genomströmningen och torka i ett hastighetsvakuum.
- Fortsätt till LC-MS / MS eller lagra prover vid -80 oC tills de används.
10. Histonpeptidanalys via vätskekromatografi i kombination med masspektrometri
- Förbered de mobila faserna så att de körs på högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Mobil fas A (MPA): 2% HPLC-klass acetonitril + 0,1% myrsyra. Mobil fas B (MPB): 80% ACETONITRIL AV HPLC-kvalitet + 0,1% myrsyra.
- Programmera HPLC-metoden enligt följande: (1) 4%-34% MPB över 30 min; (2) 34%-90% MPB över 5 min; och (3) isokratisk 90% MPB i 5 min. Använd följande rekommenderade kolonnegenskaper: C18 3 μm förpackningsmaterial, 75 μm inre diameter, 20-25 cm längd. Ställ in flödeshastigheten på 250-300 nL/min för nanokolonner med en inre diameter på 75 μm.
- Om HPLC inte är programmerad för att automatisera kolonnjämvikt före provladdning, inkludera (4) 90% -4% MPB över 1 min och (5) isokratisk 4% MPB över 10 min.
- Programmera MS-förvärvsmetoden.
- Se till att instrumentet utför en fullständig MS-genomsökning i början av varje arbetscykel. Högupplöst instrumentering (t.ex. orbitrap eller time-of-flight-analysatorer) rekommenderas på grund av den massnoggrannhet som kan användas vid signalutvinning. Lågupplöst instrumentering kan dock också användas som tidigare beskrivits27,28.
- Se till att den fullständiga MS-genomsökningen följs av 16 MS/MS-skanningshändelser, var och en med en isoleringsbredd på 50 m/z, som spänner över m/z-intervallet 300–1100. Till exempel bör den första skanningen isolera signaler vid 300-350 m / z, den andra vid 350-400 m / z, etc. Om möjligt, skaffa MS / MS-skanningar i hög upplösning också, men lägre upplösning jämfört med hela MS-skanningen är tillräcklig (på grund av de mindre massorna av fragmentjoner jämfört med intakta joner).
- HPLC-metoden kommer att generera kromatografiska signaler med toppbredder på ~ 3-40 s; För att säkerställa korrekt signalkvantifiering, se till att masspektrometern utför minst 10 arbetscykler per kromatografisk topp (dvs. en arbetscykel på 3 s eller snabbare).
- Om du använder en massanalysator i fångststil (orbitrap, jonfälla), se till att tidsgränsen för joninjektion är inställd på <200 ms; för andra analysatorer (kvadrupol, flygtid) är detta inte ett problem på grund av deras snabbare skanningstid. Ett preliminärt test kan krävas.
OBS: Mer information om MS-metoder för histonpeptidanalys finns i följande referenser 27,28,29.
- Resuspendprov i 10 μL MPA, vilket motsvarar ~ 1 μg / μL smält histonprov. Den exakta lastmängden är inte kritisk (inte heller trivial att bedöma) om alla prover i satsen laddas med liknande utspädningar och volymer.
- Lägg 1 μL prov på HPLC-kolonnen.
- Kör LC-MS/MS-metoden som programmerats i steg 10.1–10.3.
11. Analys av data
- Importera MS rådatafiler till programvara som är utformad för att utföra peak area integration.
OBS:EpiProfile 30,31 används i den aktuella studien och rekommenderas generellt, eftersom den är optimerad för tillförlitlig toppareaextraktion av kända histonpeptider. Annan fritt tillgänglig programvara för extraherad jonkromatografi som Skyline32,33 är dock lämpliga. - Beräkna den relativa förekomsten av en given (o)modifierad peptid som arealen för en enda peptid dividerat med peptidens totala yta i alla dess modifierade former. Programvara som EpiProfile30,31 innehåller redan bibliotek med peptider för signalextraktion. Annars generera ett bibliotek av peptider av intresse antingen manuellt eller via peptididentifiering med hjälp av rutinmässiga proteomikrörledningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll behandlades HepG2/C3A-sfäroider med 20 mM NaBut och 10 mM NaSuc, som båda påverkade globala nivåer av histon-PTM (Figur 3A). Histon PTM identifierades sedan och kvantifierades på nivån av enstaka rester via MS/MS-förvärv (figur 3B).
När prover körs i replikat kan statistisk analys utföras för att bedöma veckförändringsanrikningen av en PTM mellan prover, liksom observationens reproducerbarhet. De visade uppgifterna visar att peptider modifierade med acetyleringar berikas i sfäroider behandlade med NaBut vs. kontroll (figur 3C), medan prover behandlade med NaSuc har ett högre relativt överflöd av histonpeptider modifierade med lysinsuccinylering (Figur 3D). Dessa beräkningar gjordes i ett kalkylprogram som beskrivs i en separat publikation34. En total ökning av en given histonmodifiering kan bättre representeras i radardiagram, där observation av ett högre globalt överflöd av en viss modifiering blir mer intuitivt, även om detaljerad information om de analyserade modifieringsplatserna bibehålls (Figur 3E, F).
Detta protokoll genererar en peptid från histon H3 aminosyrarester 9-17, som inkluderar de ofta modifierade resterna K9, S10 och K14. De visade uppgifterna indikerar att behandling med NaBut ökar nivåerna av H3K14ac, men endast på histoner som modifierats med H3K9me2 och inte H3K9me3 (Figur 4A). Samexistensfrekvensen mellan två modifieringar kan representeras mer intuitivt som ett ringdiagram, där noderna representerar enskilda modifieringar medan tjockleken på anslutningslinjerna representerar samexistensfrekvensen mellan de två PTM: erna (figur 4B). Ibland påverkas inte samexistensfrekvensen, men data som representeras som stapeldiagram kan vara vilseledande. Till exempel indikerar de data som representeras i figur 4A att kombinationen H3K9me2K14ac är rikligare vid NaBut-behandling än vid kontroll. Detta är korrekt, men denna givna kombination är den vanligaste oavsett behandling. Figur 4B visar tydligt att H3K9me2K14ac och H3K9me3K14ac är de vanligaste kombinatoriska mönstren oavsett behandling (linjetjocklek), men att globala nivåer av H3K14ac (nod) är det som verkligen förändras i experimentet.
Detta protokoll genererar en peptid från histon H4-rester 4-17, som inkluderar modifierbara rester vid positionerna K5, K8, K12 och K16 (mestadels genom acetyleringar). Vid jämförelse av kontroll och NaBut-behandling är det möjligt att observera en ökning av kombinationer av acetylationer genom att representera data som till exempel ordmoln (figur 4C). Denna representation belyser tydligt att den omodifierade versionen av histon H4 är vanligast i kontrollprovet, medan sfäroider behandlade med NaBut berikas i dubbelt, trippelt och fyrfaldigt acetylerade histon H4-proteoformer. Ordmoln är dock begränsade när det gäller att visa exakta värden; den relativa överflödet av en histonkod bör de-convoluted av textens storlek, vilket kan uppskattas felaktigt. Därför kan Venn-diagram eller modernare ekvivalenter som UpSetR-representation35 användas för att visa den exakta kvantifieringen av samexisterande histon-PTM (Figur 4D,E). De visade uppgifterna belyser återigen att utvalda kombinationer av acetyleringar på histon H4 är relativt rikligare vid NaBut-behandling jämfört med kontroll.
Figur 1: Arbetsflöde för histonpeptidanalys av 3D-sfäroider. HepG2 / C3A-celler odlas först i 2D-odling tills de når 80% sammanflöde. Cellerna överförs sedan till en jämviktsbioreaktor och placeras i klinostatinkubatorn där de kommer att rotera vid 10-11 rpm för att bilda sfäroider. Efter 18 dagar behandlas sfäroiderna med antingen 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc och skördas efter motsvarande tidpunkter. Kärnor isoleras från cellerna och histonextraktion utförs med 0,2MH2SO4. Histonderivatisering utförs sedan med propionsyraanhydrid före och efter trypsinsmältning för att säkerställa retention av de resulterande korta peptiderna genom vätskekromatografi. Proverna avsaltas och körs sedan med LC-MS/MS-metoden som nämns i steg 10, och de resulterande data analyseras enligt beskrivningen i steg 11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning för propionylering och avsaltningssteg. (A) Propionylering utförs i en draghuv och alla komponenter läggs ut så att stegen kan utföras i snabb följd. (B) Schematisk över första propionyleringsomgången, trypsinsmältningen och andra propionyleringsomgången på histon H3.1-svansen. (C) Avsaltning utförs på bänken med hjälp av ett 96-brunns vakuumgrenrör och en 96-brunns polypropenfilterplatta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representation av enskilda histonmodifieringar. (A) Stapeldiagram som visar det relativa överflödet av vanliga globala histonmodifieringar i kontroll och behandlade (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-sfäroider. (B) Stapeldiagram som visar överflödet av enstaka histon-PTM som förekommer på resthalterna 9–17 av histon H3-peptid (KSTGGKAPR) vid kontroll och behandling (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-sfäroider. (C,D) Vulkandiagram som visar veckförändringen och betydelsen av differentiellt uttryck av histonpeptid PTM efter behandling med 20 mM NaBut (C) eller 10 mM NaSuc (D). Markerade blå och gröna punkter representerar acetylerade respektive bärnstenserade rester. (E,F) Radardiagram som visar överflödet av enstaka histonpeptidacetylering (E) eller bärnstensering (F) efter behandling med 20 mM NaBut respektive 10 mM NaSuc jämfört med kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representation av samexisterande histonmodifieringar. (A) Stapeldiagram som visar överflödet av kombinatoriska histon-PTM som förekommer på rester 9-17 av histon H3 (KSTGGKAPR) i kontroll och behandlade (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-sfäroider. (B) Ringdiagram som visar förhållandet mellan kombinatoriska histon-PTM på resthalterna 9–17 av histon H3 (KSTGGKAPR) vid kontroll och behandlade (20 mM NaBut) HepG2/C3A-sfäroider. Nodfärgens intensitet motsvarar överflödet av en enda PTM inom dess behandlingsgrupp, medan linjetjockleken motsvarar frekvensen av PTM-samförekomst. (C) Ordmoln som visar frekvensen av kombinatoriska histon-PTM på histon H4-rester i kontroll och behandlade (20 mM NaBut) HepG2/C3A-sfäroider. Textens storlek motsvarar överflödet av den angivna kombinatoriska PTM. (D,E) Venndiagram som representerar frekvensen av samexisterande modifieringar på histon H4-peptidrester 4-17 i kontroll och 20 mM NaBut-behandlade prover. Data visas med ShinyApp UpSetR35. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Lista över peptider som detekterats med hjälp av detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen av histon-PTM skiljer sig fundamentalt från den typiska proteomikanalyspipelinen. De flesta histon-PTM har fortfarande gåtfulla biologiska funktioner; Som ett resultat är anteckningar som genontologi eller pathway databaser inte tillgängliga. Det finns flera resurser som associerar histonmodifieringar med enzymet som är ansvarigt för deras katalys eller proteiner som innehåller domäner som binder dessa PTM (t.ex. HISTome36). Det är också möjligt att spekulera i kromatinets övergripande tillstånd när globala nivåer av histon-PTM regleras. Till exempel är en total ökning av histonacetylering eller andra acylationer som bärnstensering normalt associerad med kromatindekondensation37,38.
MS-analys ger mer detaljerad information om dessa modifieringar, såsom deras exakta lokalisering på aminosyrasekvensen. I detta protokoll används MS / MS-förvärv för att identifiera och kvantifiera histon-PTM, vilket kan vara avgörande för biologisk tolkning. Till exempel berikas trimetylering på lysin 4 av histon H3 (H3K4me3) på promotorer av aktivt transkriberade gener39, medan samma modifiering på lysin 9 (H3K9me3) riktmärken konstitutiv heterokromatin40. Histonmodifieringar används för närvarande som biomarkörer vid specifika sjukdomar; som sådan kan histonanalys användas för att studera sjukdomspatologi utöver svaret på behandlingen (t.ex. med epigenetiska läkemedel)41,42.
Det är mer utmanande att visuellt representera interaktioner mellan flera PTM i motsats till enskilda PTM. Medan befintliga diagram som ringdiagram kan visa samexistensfrekvensen för två PTM, kan de inte representera samexistensfrekvensen mellan mer än två PTM åt gången, eftersom detta skulle kräva en tredimensionell representation av nätverket. Av denna anledning kan andra representationer vara lämpligare för att markera förändringar i histonkoder när tre eller flera PTM beaktas. I allmänhet erbjuder diversifiering av datarepresentation högre chanser att observera signifikanta förändringar mellan prover. Detta protokoll presenterar exempel på olika illustrationer för att visa regler för histon-PTM och samexisterande PTM.
Även om detta protokoll genererar relativt små histonpeptider på grund av trypsinsmältning (cirka 4-20 aminosyror), innehåller utvalda peptider flera modifierbara rester. Analysen av dessa peptider möjliggör kvantifiering av samexistensfrekvenser för PTM, vilket kan avslöja viktig information om vilka kombinatoriska histonmärken som regleras i en given dataset. I synnerhet finns det inga steg under provberedningen där kvantifiering av histoner utförs. Det finns fyra orsaker till detta: (1) trypsin har ett brett spektrum av aktiviteter och kan användas vid ett brett spektrum av enzym-till-provförhållanden (1:10-1:200). Även när det experimentella utbytet av extraherade histoner skiljer sig från det förväntade, har problem med matsmältningen inte stött på med hjälp av detta protokoll. (2) Detta protokoll är avsett för små mängder material, där histonkvantifiering kan vara svår att utföra på grund av bristande känslighet. (3) Genom att använda en konstant trypsinkoncentration oavsett mängden histonmaterial kan vi använda tryptiska peptider (som trypsin autolyserar) för att jämföra kromatografiprestanda. Små variationer i provutbytet normaliseras av dataanalysprogramvara (steg 11), som använder alla (o)modifierade signaler för en given peptid som nämnare under normaliseringsprocessen. (4) Slutligen kan en dramatisk underskattning av mängden utgångsmaterial skapa problem med överbelastning av den kromatografiska nanokolonnen. Att utföra avsaltningssteget som anges i detta protokoll förhindrar dock att detta problem äger rum. Vid alltför stora mängder utgångsmaterial (t.ex. >100 μg) överskrids gränsen för avsaltningshartsets kapacitet och eventuellt överskottsprov tvättas bort under lastningssteget.
Det är viktigt att notera att inte alla peptider som detekterats genom denna analys har markerats i figur 3 och figur 4. Dessutom är inte alla histonmodifieringar detekterbara med hjälp av dessa specifika provberednings- och förvärvsmetoder. Kompletterande tabell 1 tillhandahålls för att lista alla peptidsignaler som extraheras med hjälp av den beskrivna rörledningen. Några välkända modifieringar listas inte i tabellen, eftersom det beskrivna provpreparatet inte är lämpligt för deras upptäckt. Anmärkningsvärda exempel är ubiquitinylerade peptider från histon H2A och H2B och fosforylering av histon H2A. X (en allmän markör för DNA-skador). Detta beror på att propionylering av peptiderna associerade med dessa PTM leder till alltför långa peptider, som inte är lämpliga för C18-kromatografi och den beskrivna MS-detektionsmetoden. Andra modifieringar som finns i litteraturen men som inte finns i kompletterande tabell 1 är modifieringar med mycket låg förekomst (för närvarande endast detekterbara med MS efter anrikningsstrategier såsom immunutfällning eller specifik cellbehandling), såsom laktylering43 eller serotonylering44. Histonmodifieringar med oförutsägbara massförskjutningar orsakade av polymerisation eller heterogen kovalent bindning till histonsekvensen beaktas inte heller (t.ex. poly-ADP-ribosylering45 och glykation46). Dessutom använder detta protokoll NaSuc och NaBut för att behandla HepG2 / C3A-sfäroider, men det kan modifieras för användning med andra läkemedel / epigenetiska modifierare och 2D / 3D-cellodlingstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Sidoli-laboratoriet erkänner tacksamt Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck och NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
References
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
- Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
- Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
- Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
- Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
- Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
- Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
- Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
- Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
- Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
- Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
- Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
- Lex, A., et al.
- Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
- Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
- Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
- Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
- Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
- Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
- Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
- Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
- Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
- Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).
