Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63776
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

غالبا ما تتطلب دراسة التئام الجروح المرتبطة بالإصابة العضلية الهيكلية تقييم التفاعلات في المختبر بين خلايا شوان (SCs) والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا الأولية وزراعتها وتوصيف خصائصها من القلفة البشرية.

Abstract

يصف هذا البروتوكول طرق العزل ، وظروف الزراعة ، وتوصيف الخلايا الأولية البشرية ذات العائد العالي والجدوى باستخدام التفكك الأنزيمي السريع للبشرة. يتم حصاد الخلايا الكيراتينية الأولية والخلايا الليفية وخلايا شوان من القلفة البشرية حديثي الولادة، والتي تتوفر وفقا لإجراءات الرعاية القياسية. يتم تطهير الجلد الذي تمت إزالته ، ويتم إزالة الدهون والعضلات تحت الجلد باستخدام مشرط. تتكون الطريقة من الفصل الأنزيمي والميكانيكي لطبقات البشرة والجلد ، يليه هضم إنزيمي إضافي للحصول على معلقات أحادية الخلية من كل طبقة من طبقات الجلد هذه. وأخيرا، تزرع الخلايا المفردة في وسائط زراعة الخلايا المناسبة باتباع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية للحفاظ على النمو والبقاء على مدى أسابيع. معا ، يسمح هذا البروتوكول البسيط بعزل وزراعة وتوصيف جميع أنواع الخلايا الثلاثة من قطعة واحدة من الجلد لتقييم نماذج الجلد والأعصاب في المختبر . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الخلايا معا في الثقافات المشتركة لقياس آثارها على بعضها البعض واستجاباتها للصدمة في المختبر في شكل خدوش يتم إجراؤها آليا في الثقافة المرتبطة بالتئام الجروح.

Introduction

الخلايا الأولية المشتقة من الأنسجة الحية والمستزرعة في ظل ظروف المختبر تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية1 ، مما يجعلها نموذجا مثاليا للتحقيق في العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. يحتوي الجلد على أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية والخلايا الخلوية والخلايا الصباغية وخلايا شوان (SCs) ، والتي يمكن عزلها وزراعتها لإجراء تجارب في المختبر. لم يتم وصف طرق عزل وزراعة الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs ، من قطعة واحدة من الجلد. الهدف من هذا البروتوكول ذو شقين: 1) إنشاء طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل وزراعة SCs الجلدية و 2) لاستخدام طريقة فعالة وقوية لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs من قلفة بشرية واحدة.

في الوقت الحاضر ، هناك بروتوكولات راسخة لعزل الخلايا الكيراتينية الجلدية2،3،4 والخلايا الليفية5،6. تصف هذه الدراسات عزل الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الليفية أو كليهما عن الجلد ، ولكن لا يوجد بروتوكول يتناول كيفية إنشاء ثقافات SCs الأولية من جلد الإنسان. تشير الدراسات الحديثة إلى أن SCs العصبية تعدل العمليات الخلوية الكيراتينية والخلايا الليفية وتنظم الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجلد7. وبالتالي ، فإن SCs ضرورية لتوازن الجلد وتساهم بشكل كبير في تنظيم علم وظائف الأعضاء الذي يؤثر على سلوك أنواع خلايا الجلد المجاورة الموجودة8. لذلك ، فإن البروتوكول الذي يسمح بعزل كل نوع من أنواع الخلايا هذه مثالي للتجارب المختبرية التي تنطوي على اتصال بين الخلايا الخلوية أو التحدث المتبادل بين أنواع الخلايا.

يصف هذا البروتوكول إنشاء مزارع خلايا فردية للخلايا الأولية من قطعة واحدة من الجلد. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص عندما تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة. وعلاوة على ذلك، فإن عزل جميع أنواع الخلايا الثلاثة عن متبرع واحد يسمح بإجراء مقارنات قوية بين أنواع الخلايا أو تجارب الزراعة المشتركة مع التخفيف من تأثير علم الوراثة أثناء التجربة المطلوبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت مراجعة اقتناء واستخدام أنسجة القلفة البشرية غير المحددة لأغراض البحث وتلقى تحديد "البحث غير البشري" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب (IRB # 17574).

ملاحظة: باتباع البروتوكول أدناه، يتم الحصول على 2.4 × 10 6 خلايا كيراتينية، 4.4 × 10 6 خلايا ليفية، و1.1 × 106 SCs من قلفة واحدة. بشكل عام ، يمكن استخدام هذه الخلايا الأولية لمدة 3 مقاطع ، اعتمادا على الظروف التجريبية.

1. عزل الخلايا الأولية وظروف الزراعة

  1. إجراء فصل البشرة والأدمة
    1. الحصول على القلفة الوليدية وفقا لإجراءات الرعاية القياسية من قبل الطبيب بموجب البروتوكولات التنظيمية المعتمدة للمستشفى. يحدد الطبيب توقيت الختان بعد الولادة وكمية الجلد التي تمت إزالتها.
    2. ضع القلفة المستثناة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 8-10 مل من الوسط القاعدي للنسر المعدل (DMEM) من دولبيكو البارد ونقل القلفة على الفور إلى مختبر زراعة الخلايا لعزل الخلايا. شطف الجلد مرتين مع 20-25 مل من 1x دولبيكو العازلة بالفوسفات المالحة (DPBS) التي تحتوي على 1x مضاد حيوي / مضاد للفطريات.
      ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من صلاحية الخلايا، يجب وضع القلفة المستثناة عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة، ويجب حصاد الخلايا في غضون 24 ساعة.
    3. بعد الشطف في DPBS / المضادات الحيوية ، نقع القلفة في 25-30 مل من وسط DMEM القاعدي البارد المثلج لمدة 10-15 دقيقة في طبق زراعة الأنسجة 10 سم. قم بتنفيذ جميع خطوات المعالجة في غطاء محرك السيارة باستخدام تقنية معقمة.
    4. باستخدام مشرط ، قم بتقطيع القلفة بعناية مفتوحة وفضح الأدمة والأنسجة الدهنية تحت الجلد.
    5. قم بإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد باستخدام الملقط وشفرة المشرط والمقص حسب الحاجة. تخلص من الأنسجة الدهنية. قطع القلفة النظيفة إلى ثلاث إلى خمس قطع أصغر.
    6. انقل قطع الجلد إلى أنبوب مخروطي معقم يحتوي على 16-20 مل من وسط dispase-I/DMEM (4 ملغم/مل في الوسط القاعدي DMEM).
    7. اخلطي قطع الجلد في الأنبوب المخروطي عن طريق الانعكاس ، بشكل متقطع ، خلال أول 30 دقيقة من الحضانة مع dispase-I. ثم ضع الأنبوب المخروطي عند 4 درجات مئوية لمدة 16-18 ساعة ، مع مراعاة غمر قطع الجلد في dispase-I / media.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول Dispase-I قبل الإضافة مباشرة باستخدام وسط قاعدي DMEM بارد ، ويتم تصفيته باستخدام مصفاة 0.22 ميكرومتر ، ويتم الاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية.
    8. بعد الهضم بين عشية وضحاها مع dispase-I ، قم بإزالة قطع الجلد ووضعها على طبق جاف ومعقم وثقافي. قم بفتح كل قطعة من الجلد بحيث تلامس طبقة البشرة الخارجية طبق الثقافة.
    9. باستخدام مجموعتين من الملقط ، افصل البشرة بعناية عن الأدمة. ابدأ على حافة الأنسجة وقشر البشرة بعيدا عن الأدمة.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب فصل طبقة البشرة عن الأدمة ، فإن عملية الهضم dispase-I لم تكن كافية. خيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها: 1) إرجاع قطع الجلد إلى محلول dispase-I / DMEM واحتضانها لمدة 2-3 ساعات إضافية عند 4 درجات مئوية ؛ 2) ضع قطع الجلد في dispase-I / DMEM الطازجة واحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 ساعات أكثر.
    10. استخدم البشرة والأدمة المنفصلتين لعزل الخلايا الكيراتينية (البشرة) والخلايا الليفية وخلايا شوان (الأدمة).
      ملاحظة: اتبع الخطوات أدناه لمعرفة حالات عزل وزراعة أنواع معينة من الخلايا.
  2. عزل الخلايا الكيراتينية عن البشرة
    1. أضف 5 مل من محلول ملحي عازل HEPES (HBS) إلى طبق ثقافة 10 سم وأضف شظايا البشرة المنفصلة. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
    2. بعد حضانة HBS ، اجمع محلول HBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لتحييد التربسين (TNB) (جدول المواد) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واتركه جانبا.
    3. أضف 3 مل من محلول التربسين إلى شظايا البشرة. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. حرك شظايا البشرة بلطف باستخدام الملقط حتى يصبح محلول التربسين عكرا.
    5. أضف محلول التربسين/الخلايا الكيراتينية إلى أنبوب HBS وTNB المحتوي في الخطوة 1.2.2.
    6. بالنسبة لأي شظايا بشرة متبقية لم تذوب في عملية هضم التربسين الأولية ، أضف 3 مل من 0.25٪ من التربسين / حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وكرر الخطوتين 1.2.4 و 1.2.5.
    7. أضف 2 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى محلول التربسين / EDTA الذي يحتوي على أنابيب محلول HBS و TNB.
    8. جهاز طرد مركزي لأنبوب التجميع الذي يحتوي على HBS / TNB / trypsin والخلايا الكيراتينية عند 870 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. شفط السوبرناتانت وإعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من وسط النمو الكامل للخلايا الكيراتينية (جدول المواد).
    10. قم بتصفية تعليق الخلية بفلتر معقم 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل لإزالة الحطام.
    11. تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام جهاز متخصص لأخذ عينات الخلايا وتلوينها (جدول المواد) لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    12. لوحات زراعة البذور حسب الحاجة للتجارب. كثافة البذر الموصى بها هي ~ 45000 خلية / سم2.
    13. ضع لوحات الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة يومين للسماح للخلايا الكيراتينية بالالتصاق بالطبق.
    14. بعد 2 أيام ، استنشاق أي خلايا غير ملتزمة. قم بتحديث وسائط زراعة الخلايا كل يومين حتى تصل الخلايا الكيراتينية إلى الالتقاء المطلوب لتجارب المرور أو المصب (50٪ -80٪ التقاء).
  3. عزل خلايا شوان (SCs) والخلايا الليفية من الأدمة
    1. قوارير T25 المغطاة مسبقا ببولي إل-ليسين (PLL، 0.01 ميكروغرام/ميكرولتر) باستخدام 5 مل من 1x DPBS. ضع القوارير المطلية مسبقا على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. اغسل مصفوفة طلاء PLL مرتين باستخدام 1x DPBS (5 مل).
      ملاحظة: يمكن تحضير قوارير T25 في وقت مبكر.
    2. شطف القطع المعزولة من الأدمة مع 5 مل من الوسط القاعدي DMEM.
    3. افرم الأدمة إلى قطع صغيرة بمقص أو مشرط.
    4. هضم الأدمة المفرومة مع 5 مل من الكولاجيناز (2 ملغ / مل في الوسط القاعدي DMEM) عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. قم بتفتيت الأدمة المفروم بلطف باستخدام طرف ماصة كل 30 دقيقة حتى تنفصل الأدمة تماما.
    5. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر. من الضروري تطبيق القوة الميكانيكية باستخدام حقنة 1 مل لتصفية التعليق بالكامل.
    6. قم بتخفيف تعليق الخلية المصفى باستخدام 5 مل من وسط DMEM الكامل (وسط DMEM القاعدي + 5٪ FBS + 1x من المضادات الحيوية) لوقف النشاط الأنزيمي للكولاجيناز.
    7. الطرد المركزي تعليق الخلية في 870 × غرام لمدة 5 دقائق في RT لتكوير الخلايا.
    8. من هذه الكريات الخلوية ، سيتم الحصول على كل من الخلايا الليفية و SCs. أعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من DMEM وسط كامل لتقسيم الخلايا (1 مل تعليق / أنبوب خلوي) وأجهزة الطرد المركزي عند 870 × g لمدة 5 دقائق في RT.
    9. بالنسبة لثقافة SCs، اتبع الخطوات 1.3.10-1.3.17 وبالنسبة لثقافة الخلايا الليفية، اتبع الخطوات 1.3.18-1.3.22.
    10. من الخطوة 1.3.8 ، استنشق السوبرناتانت. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط DMEM الكامل الطازج.
    11. تحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام جهاز متخصص لأخذ عينات الخلايا وتلوينها (جدول المواد) لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    12. زرع قوارير T25 المغلفة مسبقا مع 5 مل من الخلايا المعاد تعليقها بكثافة 4.0 × 103 خلايا / مل. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 بين عشية وضحاها (~ 12-16 ساعة حضانة).
    13. بعد 16 ساعة ، تأكد من التصاق الخلية عن طريق الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x.
    14. قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة واغسل القارورة 3x ب 5 مل من 1x DPBS.
    15. أضف 5 مل من 10 ميكرومتر سيتوزين أرابينوسيد (عامل مضاد للانقسامات ، يقتل الخلايا الليفية) في وسط DMEM كامل. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    16. استنشاق أرابينوسيد السيتوزين الذي يحتوي على وسط من القارورة. شطف قارورة 3x مع 5 مل من 1x DPBS.
    17. أعد ملء قارورة الاستزراع ب 5 مل من SCs وسط الاستزراع الكامل (جدول المواد) واحتضنها عند 37 درجة مئوية بوجود 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة. قم بتحديث وسط الثقافة الكامل في SC كل يومين حتى تصل SCs إلى 80٪ من الالتقاء.
    18. استنشاق السوبرناتانت من الطبقة الجلدية المنفصلة (الخطوة 1.3.8) وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 5 مل من الوسط الكامل للخلايا الليفية (وسط الخلايا القاعدية الليفية + 5٪ FBS + 1x مضاد حيوي).
    19. تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام جهاز متخصص لأخذ عينات الخلايا وتلوينها (جدول المواد) لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    20. قم بلوحة الخلايا الليفية بكثافة خلية تبلغ 4.0 × 103 خلايا / مل في قوارير ثقافة T25 (غير مغلفة مسبقا) باستخدام 5 مل من الوسط الكامل للخلايا الليفية. احتضان عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 بين عشية وضحاها (~ 12-16 ساعة حضانة).
    21. بعد 16-24 ساعة ، تأكد من التصاق الخلية عن طريق الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x. استنشق الخلايا غير الملتصقة من القارورة واغسل القارورة مرتين ب 5 مل من 1x DPBS.
    22. أضف 5 مل من الخلايا الليفية الطازجة متوسطة كاملة واحتضنها عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة. قم بتحديث وسط الثقافة كل يومين حتى تصل الخلايا الليفية إلى الالتقاء المطلوب للمرور أو المقايسات النهائية (50٪ -80٪ التقاء).

2. التحقق من الخلايا الكيراتينية للبشرة ، SCs الجلدية وعلامة بروتين الخلايا الليفية عن طريق التألق المناعي

  1. اليوم 1- طبقة زجاجية لغرفة الشرائح وفصل الخلايا
    1. شرائح زجاجية من 4 غرف قبل التغليف بالكولاجين-I للخلايا الكيراتينية ، أو PLL ل SCs أو 1x DPBS فقط للخلايا الليفية (0.5 مل لكل بئر). تأكد من طلاء السطح بأكمله. احتضن شرائح الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الخلايا.
    2. بعد أن تصل الخلايا المستزرعة إلى التقاء 50٪ -80٪ ، اغسل القوارير ب 1x DPBS 3x (1 مل لكل بئر).
    3. افصل الخلايا الملتصقة بمحلول 5 مل من محلول التريبسين-EDTA (TE) بنسبة 0.25٪ عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة دقيقتين ، حتى تبدأ الخلايا في أن تصبح مستديرة. تصور انفصال الخلايا باستخدام الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x.
    4. بعد الحضانة ، انقل محلول TE الذي يحتوي على خلايا إلى أنبوب مخروطي مع مصل بقري جنيني 5 مل (FBS).
    5. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لتحييد التربسين (TNB) إلى قارورة الزرع ثم انقل المحتويات إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي المذكور أعلاه (الخلايا التي تحتوي على TE و FBS). تصور انفصال الخلايا باستخدام الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x.
      ملاحظة: يمكن استخدام TNB أو FBS أو كليهما لتحييد نشاط التربسين.
    6. جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خلايا / TE / TNB عند 870 × g لمدة 5 دقائق. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب آخر وأعد تعليق حبيبة الخلية في وسط الثقافة الكامل المقابل. قياس صلاحية الخلية كما هو مذكور في الخطوة 1.2.11.
    7. شطف شرائح زجاج الغرفة المطلية مسبقا (الخطوة 2.1.1) مع 1x DPBS (1 مل لكل بئر) 3x.
    8. شبه جافة الشرائح داخل غطاء محرك السيارة والخلايا الكيراتينية البذور ، SCs ، أو الخلايا الليفية بكثافة مناسبة (30000 خلية / 0.5 مل / غرفة) في وسط مناسب كامل لزراعة الخلايا.
    9. احتضان شرائح الغرفة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق.
  2. اليوم 2- منع انزلاق زجاج الغرفة باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA) وحضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. استنشاق وسائط الخلية من شرائح الغرفة واغسل 3x مع 1 مل من 1x DPBS.
    2. إصلاح الخلايا الملتصقة مع 4٪ بارافورمالدهيد في 1x DPBS (1 مل لكل بئر) وحضانة لمدة 15 دقيقة في RT داخل غطاء زراعة الأنسجة.
    3. استنشاق 4٪ بارافورمالدهيد من شرائح الغرفة وغسل شرائح الغرفة 3x مع 1x DPBS (1 مل لكل بئر).
    4. تخلل أغشية الخلايا بنسبة 1٪ TritonX-100 في 1x DPBS (1 مل لكل بئر) وتحضن لمدة 15 دقيقة في RT.
    5. استنشق محلول الحجب من شرائح الغرفة ، واغسل 3x ب 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية ثم استطلع 1x DPBS من البئر.
    6. قم بحظر شرائح الغرفة بنسبة 5٪ BSA (0.5 مل لكل بئر) واحتضنها لمدة 45 دقيقة في RT.
    7. استنشق محلول الحجب من شرائح الغرفة ، واغسل 3x ب 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية لكل منها ثم استنشق 1x DPBS من البئر.
    8. تمييع الأجسام المضادة الأولية مع 5٪ BSA (0.2 مل لكل بئر) (تخفيفات الأجسام المضادة الأولية: خلايا الكيراتين: الجسم المضاد سيتوكيراتين الفأر 14 (1:100) و ، سيتوكيراتين 10 الأجسام المضادة (1:100) ؛ خلايا شوان: الجسم المضاد S100 الفأر (1:200) ، ومستقبلات عامل نمو الأعصاب الأرانب (p75-NTR) الأجسام المضادة (1:500) ؛ الخلايا الليفية: الجسم المضاد للأرنب vimentin (1:200) ، والفأر ألفا العضلات الملساء الأكتين (α-SMA) الجسم المضاد (1:200)).
    9. أضف الأجسام المضادة الأولية إلى الخلايا المقابلة على شريحة زجاج الغرفة واحتضنها لمدة 15-16 ساعة (بين عشية وضحاها) عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    10. استنشاق الأجسام المضادة الأولية من شرائح الغرفة ، واغسلها 3 مرات باستخدام 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية لكل منها ثم استنشق 1x DPBS من البئر.
    11. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للأرانب IgG الأجسام المضادة الثانوية - Alexa Fluor 488 (1:500) والماعز المضاد للفأر IgG الأجسام المضادة الثانوية - Alexa Fluor 594 (1:500)) مع 0.5٪ BSA. أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب إلى كل بئر (0.2 مل لكل بئر). احتضن لمدة 45 دقيقة في RT.
    12. استنشق الجسم المضاد الثانوي من شرائح الغرفة ، واغسل 3x مع 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية لكل منهما ثم استطلع 1x DBPS من البئر.
    13. قم بإزالة الحشية الموجودة على شريحة الغرفة المكونة من 4 آبار باستخدام مزيل الحشية. حاول ألا تترك أي مادة لاصقة على الشريحة لأن هذا يتداخل مع تطبيق الغطاء الزجاجي. أضف قطرة من وسط التركيب مع 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). بدلا من ذلك ، قم بتلطيخ الآبار باستخدام DAPI واستخدام وسيط تركيب غير محتو على الملصقات.
    14. ضع الغطاء بعناية على الشريحة الزجاجية عن طريق تجنب فقاعات الهواء وأغلق نهاية الغطاء بالغراء. راقب أنماط تلطيخ التألق المناعي عن طريق الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x و / أو 20x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام القلفة الطبيعية لحديثي الولادة لعزل الخلايا الكيراتينية الأولية للبشرة و SCs الجلدية والخلايا الليفية. تم استزراع الخلايا الأولية المعزولة في وسائط زراعة الخلايا ذات الصلة التي تحتوي على عوامل النمو. بعد بذر SCs والخلايا الليفية في قوارير الثقافة ، التزمت معظم الخلايا بقاع القارورة في غضون 2 ساعة. في حالة الخلايا الكيراتينية ، التزمت معظم الخلايا الكيراتينية بمقدار 24 ساعة. وصلت الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة للبشرة إلى 85٪ من الالتقاء بحلول اليوم 7 وأظهرت مورفولوجيا خلية مميزة (شكل حصاة) (الشكل 1A). وبلغت نسبة التقاء SCs 95٪ بحلول اليوم 5 وظهرت ثنائية القطب أو ثلاثية الأقطاب في الشكل (الشكل 1B). وصلت مزارع الخلايا الليفية إلى 95٪ من الالتقاء بحلول اليوم 4 وأظهرت معظم الخلايا مورفولوجيا شكل مغزل (الشكل 1C). تم تأكيد تعبير البروتين الخاص بنوع الخلية في هذه الثقافات عن طريق تلطيخ التألق المناعي. كانت الخلايا الكيراتينية إيجابية لبروتينات K10 (علامة التمايز) و K14 (علامة الانتشار) (الشكل 2A) ؛ وبالمثل ، كانت SCs إيجابية ل S100 ، و p75-NTR (الشكل 2C). عبرت الخلايا الليفية بشكل إيجابي عن الفيمنتين ، ولكنها لم تعبر عن علامة myofibroblast ، ألفا الأكتين العضلي الأملس (α-SMA) (الشكل 2E).

أشارت الصور المدمجة للتألق المناعي للكيراتين والتلطيخ النووي DAPI (الشكل 2A) إلى أن 97.8٪ من الخلايا في الثقافات كانت خلايا كيراتينية (الشكل 2B). تشير خلايا شوان الإيجابية المزدوجة S100 و p75-NTR إلى نقاء 95.2٪ SCs في الثقافة باتباع البروتوكول (الشكل 2C ، D). وبالمثل ، فإن 97.2٪ من الخلايا في مزارع الخلايا الليفية عبرت بشكل إيجابي عن vimentin (الشكل 2E ، F). وبالتالي ، تم العثور على تعبير البروتين المميز في أنواع الخلايا المعنية ، ويسمح البروتوكول بعزل مجموعات الخلايا النقية نسبيا.

Figure 1
الشكل 1: عزل الخلايا الكيراتينية الأولية المشتقة من القلفة البشرية وخلايا شوان والخلايا الليفية. (أ) الخلايا الكيراتينية، (ب) خلايا شوان، و (ج) الخلايا الليفية تحت مجهر تباين الطور؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف الخلايا الكيراتينية الأولية المشتقة من القلفة البشرية، وخلايا شوان، والخلايا الليفية. (أ) تم تحديد الخلايا الكيراتينية باستخدام الكيراتين 14 (K14، الخلايا الكيراتينية التكاثرية) و K10 (الكيراتين 10، علامة تمايز الخلايا الكيراتينية)؛ (ب) تم تحديد الخلايا الكيراتينية باستخدام الكيراتين 14 (K14، الخلايا الكيراتينية التكاثرية) و K10 (الكيراتين 10، علامة تمايز الخلايا الكيراتينية)؛ (ب) تم تحديد الخلايا الكيراتينية باستخدام الكيراتين 14 (K14، الخلايا الكيراتينية التكاثرية) و K10 (الكيراتين 10، علامة تمايز الخلايا الكيراتينية)؛ (ج) تم تحديد الخلايا الكيراتينية 14 (K14، الخلايا الكيراتينية التكاثرية) و K10 (الكيراتين 10، علامة تمايز الخلايا الكيراتينية)؛ (ب) تم تحديد الخلايا الكيراتينية الكيراتينية 14 (K14، شريط المقياس = 100 ميكرومتر (ب) التحليل الإحصائي لنقاء الخلايا الكيراتينية المستزرعة باستخدام الفلورة المناعية الخلايا المزدوجة الملطخة. (ج) تم تحديد خلايا شوان باستخدام S100 و p75-NTR (مستقبلات عامل نمو الأعصاب)؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر (D) التحليل الإحصائي لنقاء SCs المستزرعة باستخدام الخلايا المناعية المزدوجة الملطخة. (ه) تم تحديد الخلايا الليفية باستخدام الفيمنتين (الخلايا الليفية) والأكتين العضلي الأملس α (تمايز الخلايا الليفية، الأرومة الليفية العضلية)؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر (F) التحليل الإحصائي لنقاء الخلايا الليفية المستزرعة باستخدام الخلايا الملطخة بالفلور المناعي vimentin. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل ثلاث مجموعات خلايا متميزة من قطعة واحدة من القلفة ، وهي الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية وخلايا شوان. هناك عدد قليل من بروتوكولات العزل المتاحة لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية2،3،5،6 ، ولكن لا شيء يصف عزل SC. بصرف النظر عن الخلايا الهيكلية الرئيسية في الجلد والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية ، فإن الجلد أيضا معصب للغاية من خلال الهياكل الحسية و الفوارة اللاإرادية. تلعب المؤثرات الحسية دورا مهما في نقل اللمس الخفيف والاهتزاز والألم والحكة والأحاسيس الساخنة والباردة. الفوارة اللاإرادي تعصب الغدد العرقية وعضلات بيلي المستقيم9. يتم تغليف كل محور عصبي بواسطة SC ، الخلايا الدبقية للجهاز العصبي المحيطي. زادت الاهتمامات البحثية والسريرية في SCs بشكل كبير حيث تدعم SCs التجديد المحوري10,11. الأعصاب الجلدية هي منظمات مهمة لفسيولوجيا الجلد وأمراض الأمراض من خلال إشارات الاتصال (المعدلات العصبية / الوسطاء العصبيين) إلى الخلايا غير العصبية 12،13،14.

على الرغم من التوزيع الواسع لل SCs العصبية في الجلد ، توجد معلومات محدودة فيما يتعلق بدور SCs المحدد في فسيولوجيا الجلد. كيف تتفاعل SCs في الجلد مع الخلايا غير العصبية الأخرى في الجلد؟ وقد أعيقت الإجابة على هذا السؤال بسبب عدم وجود نماذج موثوقة لزراعة الخلايا في المختبر . وبالتالي ، مع هذا البروتوكول ، يمكن أن يكشف تحليل كل خلية على حدة وتفاعلاتها مع الخلايا من نفس الأنسجة بدقة عن السمات المميزة لأدوار خلايا شوان في توازن الجلد والفيزيولوجيا المرضية.

واحدة من المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هو إجراء تجريبي بسيط وغير مكلف لإنشاء ثلاث خلايا أولية (SCs ، الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية) من قلفة بشرية واحدة. كما أن لديها ميزة عزل جميع أنواع الخلايا الثلاثة من نفس الأنسجة ، وبالتالي تخفيف الاختلافات الجينية في مقارنات الخلايا وتحسين عزل الخلايا عندما تكون الأنسجة محدودة العرض. يستغرق هذا البروتوكول 2 أيام لأداء وتبسيط إجراء العزل لثلاث خلايا أولية من أنسجة الجلد وظروف الزراعة. ينتج عن هذا البروتوكول بشكل موثوق أعداد كبيرة من الخلايا القابلة للحياة ، ووصلت الممرات الأولية لهذه الخلايا إلى التقاء ~ 90٪ بعد 4-7 أيام من الطلاء الأولي. لقد استخدمنا الخلايا الكيراتينية لمدة 3 مقاطع على الأقل (~ 21 يوما) ويمكن استخدام الخلايا الليفية وخلايا شوان لمدة 5-6 مقاطع (~ 40 يوما في الثقافة).

هذا البروتوكول لا يخلو من التحديات التقنية. تعد الإزالة الكافية للأنسجة الدهنية الأساسية والفصل الفعال بين البشرة والجلد قبل الهضم الأنزيمي أمرا أساسيا للحصول على مجموعات نقية نسبيا من الخلايا من كل طبقة من طبقات الجلد. يصعب عزل SCs الجلدية عن الجلد بسبب انتشارها المنخفض نسبيا في الجلد مقارنة بالخلايا الليفية الأكثر عددا. أي ترحيل للخلايا الليفية في ثقافات SC سوف يتجاوز بسرعة SCs15. لتعزيز الالتزام ب SC ، اخترنا استخدام أدوات زراعة الأنسجة قبل الطلاء مع PLL لأن هذا يزيد من التصاق SCs16. ولزيادة التخفيف من التلوث بالخلايا الليفية، تمت إضافة أرابينوسيد السيتوزين (عامل مضاد للانقسام) بعد أن التصقت الخلايا لفترة قصيرة من الزمن لإزالة الخلايا الليفية سريعة الانقسام من مزارع SCs. ومع ذلك ، فإن التعرض لفترة أطول للسيتوزين أرابينوسيد يمكن أن يكون ضارا أيضا ب SCs.

إن اعتماد البروتوكول الموصوف أعلاه يجعل من الممكن عزل مزارع SCs والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية الفردية للجلد لإجراء تجارب في المختبر . يمكن استخدام مجموعات الخلايا المتميزة هذه للتحقيق في SCs والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية بشكل فردي أو مجتمعة أثناء فسيولوجيا الجلد الطبيعية أو التئام الجروح أو في ظل ظروف تحاكي بيئة المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح مالية منافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتورة فادية كمال والدكتور رياض البربري على السماح لنا باستخدام الأدوات المخبرية والدعم الفني. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (K08 AR060164-01A) ووزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0725) إلى J. C. E. بالإضافة إلى الدعم المؤسسي من مركز هيرشي الطبي بجامعة ولاية بنسلفانيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) MilliporeSigma SLGPR33RS
70 µM cell strainers CELLTREAT 229483
100 µM cell strainers CELLTREAT 229485
1 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) BD Luer-Lok BD309646
10 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD305462
1% TritonX-100 Sigma X100-1L Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution ThermoFisher Scientific J19943.K2 Ready to use and store at 4 °C
5% BSA Sigma A7906-100G Prepared at the time of use
70% ethanol Pharmco 111000200
Antibiotic ScienCell Research 503
Chemometec Vial1-Cassette Fisher Scientific NC1420193
Collagenase Gibco 17018-029
Coverslip Fisherbrand 12544D 22*50-1.5
Dispase I Sigma-Aldrich D46693
DMEM basal medium ScienCell Research 9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes Fisherbrand 02-681-5
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10082147
Fibroblast complete medium ScienCell Research 2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) Lonza CC-5022
Human foreskin De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) Lonza 00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody ThermoFisher Scientific 14-9760-82 Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody Abcam ab7800 Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody ThermoFisher Scientific MA5-12969 Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide) Tab-Tek 154526
NucleoCounter -Via1-Cassette Chemometec 941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL) ScienCell Research 32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI Invitrogen P36935
Rabbit K10 antibody Sigma-Aldrich SAB4501656 Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody Millipore AB1554 Dilution (1:500)
Rabbit vimentin ProteinTech 10366-1-AP Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium ScienCell Research 1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 ROTH LH75.1 Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) Codman 54-6500 Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) Razor blade company 94-0120 Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask Corning 353109
Trypsin neutralization buffer (TNS) Lonza CC-5002
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012
Inverted microscope ZEISS Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope ZEISS Primovert For visulaizing/observing cell attachment or detachment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 181 ،
عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, … More

Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin. J. Vis. Exp. (181), e63776, doi:10.3791/63776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter