Summary
Studien av sårläkning i samband med muskuloskeletal skada kräver ofta bedömning av in vitro-interaktioner mellan Schwann-celler (SC), keratinocyter och fibroblaster. Detta protokoll beskriver isolering, odling och karakterisering av dessa primära celler från den mänskliga förhuden.
Abstract
Detta protokoll beskriver isoleringsmetoder, odlingsförhållanden och karakterisering av humana primära celler med högt utbyte och livskraft med hjälp av snabb enzymatisk dissociation av huden. Primära keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler skördas alla från den mänskliga nyfödda förhuden, som är tillgänglig enligt standardvårdsprocedurer. Den borttagna huden desinficeras och det subkutana fettet och muskeln avlägsnas med en skalpell. Metoden består av enzymatisk och mekanisk separation av epidermala och dermala lager, följt av ytterligare enzymatisk matsmältning för att erhålla encellssuspensioner från vart och ett av dessa hudskikt. Slutligen odlas enstaka celler i lämpliga cellodlingsmedier enligt standardcellodlingsprotokoll för att upprätthålla tillväxt och livskraft under veckor. Tillsammans möjliggör detta enkla protokoll isolering, odling och karakterisering av alla tre celltyperna från en enda hudbit för in vitro-utvärdering av hudnervmodeller. Dessutom kan dessa celler användas tillsammans i samkulturer för att mäta deras effekter på varandra och deras svar på in vitro-trauma i form av repor som utförs robotiskt i kulturen i samband med sårläkning.
Introduction
Primära celler som härrör från levande vävnad och odlas under in vitro-förhållanden liknar det fysiologiska tillståndet1, vilket gör dem till en idealisk modell för att undersöka fysiologiska och patofysiologiska processer. Huden innehåller flera celltyper, inklusive keratinocyter, fibroblaster, sebocyter, melanocyter och Schwann-celler (SC), som kan isoleras och odlas för in vitro-experiment . Metoder för att isolera och odla keratinocyter, fibroblaster och SC, från en enda hudbit, har inte beskrivits. Målet med detta protokoll är tvåfaldigt: 1) att upprätta en tillförlitlig och reproducerbar metod för isolering och odling av dermala SC och 2) att använda en effektiv, robust metod för isolering av keratinocyter, fibroblaster och SC från en enda human förhud.
För närvarande finns det etablerade protokoll för att isolera hud keratinocyter 2,3,4 och fibroblaster 5,6. Dessa studier beskriver isoleringen av antingen keratinocyter, fibroblaster eller båda från huden, men inget protokoll behandlar hur man etablerar kulturer av primära SC från mänsklig hud. Nya studier tyder på att neuronala SC modulerar keratinocyt- och fibroblastcellulära processer och reglerar normala hudfysiologiska funktioner7. SCs är således kritiska för hudhomeostas och bidrar väsentligt till regleringsfysiologin som påverkar beteendet hos närliggande hudcelltyper närvarande8. Därför är ett protokoll som möjliggör isolering av var och en av dessa celltyper idealiskt för in vitro-experiment som involverar cell-cellkommunikation eller korsprat mellan celltyper.
Detta protokoll beskriver upprättandet av enskilda cellkulturer av primära celler från en enda hudbit. Detta protokoll är särskilt användbart när mängden tillgänglig vävnad är begränsad. Dessutom möjliggör isolering av alla tre celltyperna från en enda givare robusta jämförelser mellan celltyper eller samodlingsexperiment samtidigt som man mildrar genetikens inflytande under det önskade experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förvärv och användning av avidentifierad mänsklig förhudsvävnad för forskningsändamål granskades och fick bestämningen av "inte mänsklig forskning" av Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
OBS: Genom att följa protokollet nedan erhålls 2,4 x 106 keratinocyter, 4,4 x 106 fibroblaster och 1,1 x 106 SC från en enda förhud. I allmänhet kan dessa primära celler användas för 3 passager, beroende på experimentella förhållanden.
1. Isolering av primära celler och odlingsförhållanden
- Epidermis och dermis separationsförfarande
- Skaffa neonatal förhud enligt standardvårdsprocedurer av en läkare enligt godkända sjukhusreglerande protokoll. Läkaren bestämmer tidpunkten för omskärelse efter födseln och mängden hud som tas bort.
- Placera den utskurna förhuden i ett mikrocentrifugrör som innehåller 8-10 ml iskallt Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) basalmedium och transportera omedelbart förhuden till cellodlingslaboratoriet för cellisolering. Skölj huden två gånger med 20-25 ml 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) som innehåller 1x antibiotikum/antimykotisk.
OBS: För maximal cellviabilitet bör den utskurna förhuden placeras vid 4 °C tills den bearbetas, och cellerna ska skördas inom 24 timmar. - Efter sköljning i DPBS/antibiotika, blötlägg förhuden i 25-30 ml iskallt DMEM-basalmedium i 10-15 min i en 10 cm vävnadsodlingsskål. Utför alla bearbetningssteg i en vävnadsodlingshuv med steril teknik.
- Skär försiktigt upp förhuden med en skalpell och exponera dermis och subkutan fettvävnad.
- Ta bort den subkutana fettvävnaden med pincett, skalpellblad och sax efter behov. Kassera fettvävnaden. Skär den rengjorda förhuden i tre till fem mindre bitar.
- Överför hudbitar till ett sterilt koniskt rör som innehåller 16-20 ml dispas-I/DMEM-medium (4 mg/ml i DMEM-basalt medium).
- Blanda hudbitarna i det koniska röret genom inversion, intermittent, under de första 30 minuterna av inkubation med dispase-I. Placera sedan det koniska röret vid 4 °C i 16-18 timmar, med tanke på att nedsänka hudbitarna i dispase-I/media.
OBS: Dispase-I-lösningen ska beredas strax före tillsats med kallt DMEM-basalmedium, filtreras med en 0,22 μm sil och hållas vid 4 °C. - Efter matsmältning över natten med dispase-I, ta bort hudbitarna och lägg dem på en torr, steril kulturskål. Rulla ut varje hudbit så att det yttre epidermala lagret vidrör odlingsskålen.
- Använd två uppsättningar pincett, separera försiktigt epidermis från dermis. Börja på kanten av vävnaden och skala epidermis bort från dermis.
OBS: Om epidermisskiktet är svårt att skilja från dermis, var dispase-I-matsmältningen inte tillräcklig. Felsökningsalternativ: 1) återför hudbitar till dispase-I/DMEM-lösning och inkubera ytterligare 2-3 timmar vid 4 °C; 2) placera hudbitar i färsk dispas-I/DMEM och inkubera vid 4 °C i 2-3 timmar till. - Använd den separerade epidermis och dermis för att isolera keratinocyter (epidermis) och fibroblaster och Schwann-celler (dermis).
OBS: Följ stegen nedan för specifika celltyper isolering och odlingsförhållanden.
- Keratinocytisolering från epidermis
- Tillsätt 5 ml HEPES-buffertsaltlösning (HBS) till en 10 cm odlingsskål och tillsätt de separerade epidermisfragmenten. Inkubera vid rumstemperatur (RT) i 10 min.
- Efter HBS-inkubation, samla HBS-lösningen i ett 50 ml koniskt rör. Tillsätt 5 ml trypsinneutraliseringsbuffert (TNB) (materialtabell) i ett 50 ml koniskt rör och lägg åt sidan.
- Tillsätt 3 ml trypsinlösning till de epidermala fragmenten. Inkubera vid 37 °C i 10 min.
- Agitera försiktigt de epidermala fragmenten med pincett tills trypsinlösningen blir grumlig.
- Tillsätt trypsinlösningen/keratinocyterna till hbs- och TNB-innehållande röret i steg 1.2.2.
- För eventuella återstående epidermala fragment som inte har lösts upp i den initiala trypsinuppslutningen, tillsätt 3 ml 0,25% trypsin/ etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Inkubera vid 37 °C i 10 minuter och upprepa steg 1.2.4 och 1.2.5.
- Tillsätt 2 ml fetalt bovint serum (FBS) till trypsin/EDTA-lösningen som innehåller HBS- och TNB-lösningsrör.
- Centrifugera uppsamlingsröret som innehåller HBS/TNB/trypsin och keratinocyter vid 870 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 3 ml keratinocyt komplett tillväxtmedium (materialtabell).
- Filtrera cellsuspensionen med ett sterilt 100 μM filter i ett sterilt 50 ml koniskt rör för att avlägsna skräp.
- Kvantifiera cellantalet och cellviabiliteten.
OBS: Här användes en specialiserad cellprovtagnings- och färgningsanordning (materialtabell) för att kvantifiera cellantalet och livskraften enligt tillverkarens instruktioner. - Fröodlingsplattor efter behov för experiment. Den rekommenderade såddtätheten är ~ 45 000 celler / cm2.
- Placera odlingsplattorna i en inkubator vid 37 °C i 5 %CO2 i 2 dagar så att keratinocyterna fäster vid skålen.
- Efter 2 dagar, aspirera alla icke-vidhäftade celler. Uppdatera cellodlingsmediet varannan dag tills keratinocyter når önskad sammanflöde för passaging eller nedströms experiment (50% -80% sammanflöde).
- Isolering av Schwann-celler (SC) och fibroblaster från dermis
- Förbelägg T25-kolvar med poly-L-lysin (PLL, 0,01 μg/μL) med användning av 5 ml 1x DPBS. Placera de förbelagda kolvarna vid 37 °C i 3 timmar. Tvätta PLL-beläggningsmatrisen två gånger med 1x DPBS (5 ml).
OBS: T25-kolvar kan beredas i förväg. - Skölj de isolerade bitarna av dermis med 5 ml DMEM basalmedium.
- Hacka dermis i små bitar med sax eller en skalpell.
- Smält den malet dermis med 5 ml kollagenas (2 mg/ml i DMEM-basmedium) vid 37 °C i 2,5 timmar. Triturera försiktigt den malet dermis med en pipettspets var 30: e minut tills dermis helt dissocierar.
- Filtrera cellsuspensionen med en 70 μM cellsil. Det är nödvändigt att applicera mekanisk kraft med en 1 ml spruta för att helt filtrera suspensionen.
- Späd den filtrerade cellsuspensionen med 5 ml komplett DMEM-medium (DMEM basalmedium + 5% FBS + 1x antibiotikum) för att stoppa den enzymatiska aktiviteten hos kollagenas.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 870 x g i 5 min vid RT för att pelletera cellerna.
- Från denna cellpellets kommer både fibroblaster och SC att erhållas. Resuspendera cellpelleten i 2 ml DMEM komplett medium för att dela cellerna (1 ml cellsuspension / rör) och centrifugera vid 870 x g i 5 minuter vid RT.
- För SCs-kultur, följ stegen 1.3.10-1.3.17 och för fibroblastkultur, följ stegen 1.3.18-1.3.22.
- Från steg 1.3.8, aspirera supernatanten. Resuspendera cellpelleten i 5 ml färskt DMEM komplett medium.
- Kvantifiera cellnummer och livskraft.
OBS: Här användes en specialiserad cellprovtagnings- och färgningsanordning (materialtabell) för att kvantifiera cellantalet och livskraften enligt tillverkarens instruktioner. - Frö de förbelagda T25-kolvarna med 5 ml återsuspenderade celler med en densitet på 4,0 x 103 celler/ml. Inkubera kolven vid 37 °C i närvaro av 5 %CO2 över natten (~12–16 timmars inkubation).
- Efter 16 timmar, bekräfta celladhesionen genom mikroskopi (materialtabell) vid 10x förstoring.
- Ta bort de icke-vidhäftande cellerna och tvätta kolven 3x med 5 ml 1x DPBS.
- Tillsätt 5 ml 10 μM cytosinarginasiosid (antimitotiskt medel, dödar fibroblaster) i DMEM komplett medium. Inkubera kolven vid 37 °C i närvaro av 5 %CO2 i 24 timmar.
- Aspirera cytosinardinarinosidan som innehåller medium från kolven. Skölj kolven 3x med 5 ml 1x DPBS.
- Fyll på odlingskolven med 5 ml SCs kompletta odlingsmedium (materialtabell) och inkubera vid 37 °C i närvaro av 5 %CO2 i 48 timmar. Uppdatera SC komplett odlingsmedium varannan dag tills SC når 80% sammanflöde.
- Aspirera supernatanten från det dissocierade dermala skiktet (steg 1.3.8) och återsuspendera cellpelleten med 5 ml fibroblast komplett medium (fibroblast basal medium + 5% FBS + 1x antibiotikum).
- Kvantifiera cellnummer och cellviabilitet.
OBS: Här användes en specialiserad cellprovtagnings- och färgningsanordning (materialtabell) för att kvantifiera cellantalet och livskraften enligt tillverkarens instruktioner. - Platta fibroblasterna med en celltäthet på 4,0 x 103 celler/ml i T25-odlingskolvar (ej förbelagda) med 5 ml fullt fibroblastmedium. Inkubera vid 37 °C i närvaro av 5 %CO2 över natten (~12–16 timmar inkubation).
- Efter 16-24 timmar, bekräfta celladhesionen genom mikroskopi (materialtabell) vid 10x förstoring. Aspirera icke-vidhäftande celler från kolven och tvätta kolven två gånger med 5 ml 1x DPBS.
- Tillsätt 5 ml färskt fibroblast komplett medium och inkubera vid 37 °C i närvaro av 5 %CO2 i 48 timmar. Uppdatera odlingsmediet varannan dag tills fibroblaster når önskad sammanflöde för passaging eller nedströms analyser (50% -80% sammanflöde).
- Förbelägg T25-kolvar med poly-L-lysin (PLL, 0,01 μg/μL) med användning av 5 ml 1x DPBS. Placera de förbelagda kolvarna vid 37 °C i 3 timmar. Tvätta PLL-beläggningsmatrisen två gånger med 1x DPBS (5 ml).
2. Verifiering av epidermala keratinocyter, dermala SC och fibroblaster proteinmarkör genom immunofluorescens
- Dag 1- Täckkammarglasglas och lossar celler
- Förbelägga 4-brunnskammarglasglas med kollagen-I för keratinocyter, eller PLL för SC eller endast 1x DPBS för fibroblaster (0,5 ml vardera brunn). Se till att belägga hela ytan. Inkubera kammaren glider vid 37 °C i 2 timmar. Förbered cellerna under inkubation.
- När odlade celler når 50% -80% sammanflöde, tvätta kolvarna med 1x DPBS 3x (1 ml för varje brunn).
- Lossa de vidhäftade cellerna med 5 ml 0,25% trypsin-EDTA (TE) lösning genom att inkubera vid 37 °C i närvaro av 5% CO2 i 2 min tills cellerna börjar bli runda. Visualisera cellavlossning med mikroskopi (materialtabell) vid 10x förstoring.
- Efter inkubation, överför TE-lösning som innehåller celler till ett koniskt rör med 5 ml fetalt bovint serum (FBS).
- Tillsätt 5 ml trypsinneutraliseringsbuffert (TNB) till odlingskolven och överför sedan innehållet till ovannämnda centrifugrör (celler med TE och FBS). Visualisera cellavlossning med mikroskopi (materialtabell) vid 10x förstoring.
OBS: TNB eller FBS eller båda kan användas för att neutralisera trypsinaktivitet. - Centrifugera det koniska röret som innehåller celler/TE/TNB vid 870 x g i 5 min. Överför supernatanten till ett annat rör och återsuspendera cellpelleten i motsvarande fullständiga odlingsmedium. Mät cellviabiliteten enligt beskrivningen i steg 1.2.11.
- Skölj de förbelagda kammarglasglasskivorna (steg 2.1.1) med 1x DPBS (1 ml för varje brunn) 3x.
- Halvtorka objektglasen inuti vävnadsodlingshuven och frökeratinocyter, SC eller fibroblaster med lämplig densitet (30 000 celler/0,5 ml/kammare) i ett lämpligt komplett cellodlingsmedium.
- Inkubera kammarens glidbanor vid 37 °C över natten så att cellerna kan vidhäfta.
- Dag 2- Blockering av kammarens glasglas med bovint serumalbumin (BSA) och inkubation av primära antikroppar
- Aspirera cellmediet från kammarglasen och tvätta 3x med 1 ml 1x DPBS.
- Fixera de vidhäftade cellerna med 4% paraformaldehyd i 1x DPBS (1 ml för varje brunn) och inkubera i 15 minuter vid RT inuti vävnadsodlingshuven.
- Aspirera 4% paraformaldehyd från kammarglasen och tvätta kammarglasen 3x med 1x DPBS (1 ml för varje brunn).
- Permeabilisera cellmembranen med 1% TritonX-100 i 1x DPBS (1 ml för varje brunn) och inkubera i 15 minuter vid RT.
- Aspirera blockeringslösningen från kammarglasen, tvätta 3x med 1x DPBS (1 ml för varje brunn) i 30 s och aspirera sedan 1x DPBS från brunnen.
- Blockera kammarglasen med 5% BSA (0,5 ml för varje brunn) och inkubera i 45 minuter vid RT.
- Aspirera blockeringslösningen från kammarglasen, tvätta 3x med 1x DPBS (1 ml för varje brunn) i 30 s vardera och aspirera sedan 1x DPBS från brunnen.
- Späd de primära antikropparna med 5% BSA (0,2 ml för varje brunn) (Primära antikroppsutspädningar: Keratinocyter: muscytokeratin 14 antikropp (1:100) och cytokeratin 10 antikropp (1:100); Schwann-celler: mus S100-antikropp (1:200) och kaninnervtillväxtfaktorreceptor (p75-NTR) antikropp (1:500); Fibroblaster: kaninvimentinantikropp (1:200) och mus alfa-glattmuskelaktin (α-SMA) antikropp (1:200)).
- Tillsätt de primära antikropparna till motsvarande celler på kammarens glasglasglasglas och inkubera i ca 15-16 timmar (över natten) vid 4 °C i en fuktad kammare.
- Aspirera de primära antikropparna från kammarglasen, tvätta 3 gånger med 1x DPBS (1 ml för varje brunn) i 30 s vardera och aspirera sedan 1x DPBS från brunnen.
- Späd de sekundära antikropparna (Goat anti-rabbit IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 488 (1:500) och Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 594 (1:500)) med 0,5% BSA. Tillsätt lämplig sekundär antikropp till varje brunn (0,2 ml för varje brunn). Inkubera i 45 min vid RT.
- Aspirera den sekundära antikroppen från kammarglas, tvätta 3x med 1x DPBS (1 ml för varje brunn) i 30 s vardera och aspirera sedan 1x DBPS från brunnen.
- Ta bort packningen på 4-brunnskammarglidningen med packningsborttagare. Försök att inte lämna något lim på bilden eftersom det stör appliceringen av täckglas. Tillsätt en droppe monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Alternativt kan du motbespara brunnarna med DAPI och använda ett icke-etikettinnehållande monteringsmedium.
- Placera försiktigt täckglaset på glasskivan genom att undvika luftbubblor och försegla änden av täckglaset med lim. Observera immunofluorescensfärgningsmönster genom mikroskopi (materialtabell) vid 10x och / eller 20x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normal neonatal förhud användes för isolering av primära epidermala keratinocyter och dermala SC och fibroblaster. De isolerade primära cellerna odlades i respektive cellodlingsmedium innehållande tillväxtfaktorer. Efter sådd av SC och fibroblast i odlingskolvar fastnade de flesta cellerna på botten av kolven inom 2 timmar. När det gäller keratinocyter vidhäftade de flesta keratinocyter med 24 timmar. Isolerade epidermala primära keratinocyter nådde 85% sammanflöde vid dag 7 och uppvisade karakteristisk cellmorfologi (kullerstensform) (figur 1A). SC nådde 95% sammanflöde vid dag 5 och verkade bipolära eller tripolära i form (figur 1B). Fibroblastkulturer nådde 95% sammanflöde vid dag 4 och de flesta cellerna uppvisade en spindelformmorfologi (Figur 1C). Celltypsspecifikt proteinuttryck bekräftades i dessa kulturer genom immunofluorescensfärgning. Keratinocyter var positiva för K10 (differentieringsmarkör) och K14 (proliferationsmarkör) proteiner (figur 2A); På samma sätt var SC positiva för S100 och p75-NTR (figur 2C). Fibroblaster uttryckte positivt vimentin, men uttryckte inte myofibroblastmarkören, alfa glattmuskelaktin (α-SMA) (Figur 2E).
De sammanslagna bilderna av keratinimmunfluorescens och DAPI-kärnfärgning (figur 2A) indikerade att 97,8% av cellerna i kulturerna var keratinocyter (figur 2B). Dubbla S100- och p75-NTR-positiva Schwann-celler föreslår renhet på 95,2% SC i odling enligt protokollet (figur 2C, D). På liknande sätt uttryckte 97,2% av cellerna i fibroblastkulturer positivt vimentin (figur 2E,F). Således finns karakteristiskt proteinuttryck i respektive celltyper, och protokollet möjliggör isolering av relativt rena populationer av celler.
Figur 1: Isolering av humana förhudshärledda primära keratinocyter, Schwann-celler och fibroblaster. (A) Keratinocyter, (B) Schwann-celler och (C) Fibroblaster under faskontrastmikroskop; skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av humana förhuds-härledda primära keratinocyter, Schwann-celler och fibroblaster. skalstång = 100 μm. (B) Statistisk analys av renhet hos odlade keratinocyter med användning av immunofluorescenser dubbelfärgade celler. (C) Schwann-celler identifierades med hjälp av S100 och p75-NTR (nervtillväxtfaktorreceptor); skalstreck = 100 μm. (D) Statistisk analys av renhet hos odlade SC med användning av immunofluorescenser dubbelfärgade celler. (E) Fibroblaster identifierades med hjälp av vimentin (fibroblast) och α-glattmuskelaktin (fibroblastdifferentiering, myofibroblast); skalstreck = 100 μm. (F) Statistisk analys av renheten hos odlade fibroblaster med användning av immunofluorescenser vimentinfärgade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera tre distinkta cellpopulationer från en enda bit av förhuden, nämligen keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler. Det finns några isoleringsprotokoll tillgängliga för att isolera keratinocyter och fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortsett från de viktigaste strukturella cellerna i hud, keratinocyter och fibroblaster, är huden också mycket innerverad av sensoriska afferenta strukturer och autonoma efferenter. Sensoriska afferenter spelar en viktig roll vid överföring av lätt beröring, vibrationer, smärta, klåda och varma och kalla känslor. Autonoma efferenter innerverar svettkörtlar och arrector pili muskler9. Varje nervaxon värms upp av en SC, glialcellerna i det perifera nervsystemet. Forskning och kliniska intressen i SCs har ökat avsevärt eftersom SCs stöder axonal regenerering10,11. Hudnerver är viktiga regulatorer för hudfysiologi och sjukdomspatologi genom kommunikationssignaler (neuromodulatorer / neuromediatorer) till icke-neurala celler 12,13,14.
Trots den breda fördelningen av nerv-SC i huden finns det begränsad information om SC: s specifika roll i hudfysiologi. Hur interagerar SC i huden med andra icke-neuronala celler i huden? Att svara på denna fråga har hindrats av bristen på tillförlitliga in vitro-cellodlingsmodeller . Således, med detta protokoll, kan analysen av varje enskild cell och deras interaktioner med celler från samma vävnad exakt avslöja de karakteristiska egenskaperna hos Schwann-cellernas roller i hudhomeostas och patofysiologi.
En av de viktigaste fördelarna med detta protokoll är ett enkelt, billigt experimentellt förfarande för att etablera tre primära celler (SC, keratinocyter och fibroblast) från en enda mänsklig förhud. Det har också fördelen att alla tre celltyperna isoleras från samma vävnad, vilket minskar genetiska skillnader i celljämförelser och optimerar cellisoleringar när vävnad är i begränsad tillgång. Detta protokoll tar 2 dagar att utföra och förenklar isoleringsproceduren för tre primära celler från hudvävnad och odlingsförhållanden. Detta protokoll ger tillförlitligt ett stort antal livskraftiga celler, och initiala passager av dessa celler nådde ~ 90% sammanflöde med 4-7 dagar efter initial plätering. Vi har använt keratinocyter i minst 3 passager (~ 21 dagar) och fibroblast- och Schwann-celler kan användas för 5-6 passager (~ 40 dagar i odling).
Detta protokoll är inte utan tekniska utmaningar. Tillräckligt avlägsnande av den underliggande fettvävnaden och effektiv epidermal / dermal separation före enzymatisk matsmältning är nyckeln till att erhålla relativt rena populationer av celler från varje hudskikt. Dermala SC är svårare att isolera från huden på grund av deras relativt låga prevalens i huden jämfört med de mer talrika fibroblasterna. Varje överföring av fibroblaster i SC-kulturer kommer snabbt att växa ur SC15. För att förbättra SC-vidhäftningen valde vi att förbelägga vävnadsodlingsvaror med PLL eftersom detta ökar vidhäftningen av SC16. För att ytterligare mildra fibroblastkontaminering tillsattes cytosinardinosid (antimitotiskt medel) efter att celler hade fastnat under en kort tidsperiod för att avlägsna de snabbt delande fibroblasterna från SC-kulturer. Men längre exponering för cytosin arabinosid kan också vara skadligt för SC.
Att anta det ovan beskrivna protokollet gör det möjligt att isolera enskilda hud-SC, keratinocyter och fibroblastkulturer för in vitro-experiment . Dessa distinkta cellpopulationer kan användas för att undersöka SC, keratinocyter och fibroblaster individuellt eller i kombination under normal hudfysiologi, sårläkning eller under förhållanden som efterliknar en sjukdomsinställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla andra författare förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Fadia Kamal och Dr. Reyad Elbarbary för att vi fick använda labbinstrument och teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från NIH (K08 AR060164-01A) och DOD (W81XWH-16-1-0725) till J. C. E. förutom institutionellt stöd från Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
