Summary
O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.
Abstract
Este protocolo descreve métodos de isolamento, condições de cultivo e caracterização de células primárias humanas com alto rendimento e viabilidade usando rápida dissociação enzimática da pele. Queratinócitos primários, fibroblastos e células Schwann são todos colhidos do prepúcio de recém-nascido humano, que está disponível seguindo o padrão de procedimentos de cuidado. A pele removida é desinfetada, e a gordura subcutânea e músculo são removidos usando um bisturi. O método consiste na separação enzimática e mecânica de camadas epidérmicas e dérmicas, seguida de digestão enzimática adicional para obter suspensões unicelulares de cada uma dessas camadas de pele. Finalmente, as células únicas são cultivadas em meios de cultura celular apropriados seguindo protocolos padrão de cultura celular para manter o crescimento e a viabilidade ao longo de semanas. Em conjunto, este protocolo simples permite o isolamento, acultura e a caracterização dos três tipos de células a partir de um único pedaço de pele para avaliação in vitro de modelos de nervo da pele. Além disso, essas células podem ser usadas juntas em co-culturas para medir seus efeitos uns sobre os outros e suas respostas ao trauma in vitro na forma de arranhões realizados roboticamente na cultura associada à cicatrização de feridas.
Introduction
As células primárias derivadas do tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro se assemelham muito ao estado fisiológico1, tornando-as um modelo ideal para investigar processos fisiológicos e fisiofósicos. A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos, sebocítos, melanócitos e células schwann (SCs), que podem ser isoladas e cultivadas para experimentos in vitro . Não foram descritos métodos para isolar e cultivar queratinócitos, fibroblastos e SCs, de um único pedaço de pele. O objetivo deste protocolo é duplo: 1) estabelecer um método confiável e reprodutível para o isolamento e cultivo de SCs dérmicas e 2) para utilizar um método eficiente e robusto para o isolamento de queratinócitos, fibroblastos e SCs de um único prepúcio humano.
Atualmente, existem protocolos estabelecidos para isolar os queratinócitosda pele 2,3,4 e os fibroblastos 5,6. Esses estudos descrevem o isolamento de queratinócitos, fibroblastos ou ambos da pele, mas nenhum protocolo aborda como estabelecer culturas de SCs primários da pele humana. Estudos recentes sugerem que as SCs neuronais modulam os processos celulares querat e fibroblasto e regulam as funções fisiológicas normais da pele7. As SCs são, portanto, críticas à homeostase da pele e contribuem substancialmente para a fisiologia regular que influencia o comportamento dos tipos de células da pele vizinhas presentes8. Portanto, um protocolo que permite o isolamento de cada um desses tipos de células é ideal para experimentos in vitro envolvendo comunicação celular-célula ou conversa cruzada entre tipos de células.
Este protocolo descreve o estabelecimento de culturas celulares individuais de células primárias a partir de um único pedaço de pele. Este protocolo é particularmente útil quando a quantidade de tecido disponível é limitada. Além disso, o isolamento de todos os três tipos de células de um único doador permite comparações robustas entre tipos de células ou experimentos de co-cultura, ao mesmo tempo em que mitiga a influência da genética durante o experimento desejado.
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Protocol
A aquisição e o uso de tecido foreskin humano desidentificado para fins de pesquisa foram revisados e receberam a determinação de "não pesquisa humana" pelo Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574).
NOTA: Seguindo o protocolo abaixo, 2,4 x 106 queratinócitos, 4,4 x 106 fibroblastos e 1,1 x 106 SCs são obtidos de um único prepúcio. Em geral, essas células primárias podem ser usadas para 3 passagens, dependendo das condições experimentais.
1. Isolamento das células primárias e condições culturais
- Procedimento de separação de epiderme e derme
- Adquirir prepúcio neonatal seguindo o padrão de procedimentos de cuidado por um médico sob protocolos de regulação hospitalar aprovados. O médico determina o tempo de circuncisão após o nascimento e a quantidade de pele removida.
- Coloque o prepúcio excisado em um tubo de microcentrifuuge contendo 8-10 mL de meio basal de Dulbecco modificado (DMEM) e transporte imediatamente o prepúcio para o laboratório de cultura celular para isolamento de células. Enxágüe a pele duas vezes com 20-25 mL de 1x linha salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo 1x antibiótico/antimíctico.
NOTA: Para viabilidade celular máxima, o prepúcio excisado deve ser colocado a 4 °C até o processamento, e as células devem ser colhidas dentro de 24h. - Depois de enxaguar em DPBS/antibióticos, mergulhe o prepúcio em 25-30 mL de meio basal DMEM gelado por 10-15 min em um prato de cultura de tecido de 10 cm. Realize todas as etapas de processamento em uma capa de cultura de tecido usando técnica estéril.
- Usando um bisturi, corte cuidadosamente o prepúcio aberto e exponha a dermis e o tecido adiposo subcutâneo.
- Remova o tecido adiposo subcutâneo usando fórceps, lâmina de bisturi e tesoura, conforme necessário. Descarte o tecido adiposo. Corte o prepúcio limpo em três a cinco pedaços menores.
- Transfira peças de pele para um tubo cônico estéril contendo 16-20 mL de meio dispase-I/DMEM (4 mg/mL em meio basal DMEM).
- Misture as peças da pele no tubo cônico por inversão, intermitentemente, durante os primeiros 30 minutos de incubação com dispase-I. Em seguida, coloque o tubo cônico a 4 °C por 16-18 h, tendo em mente a imersão das peças da pele em dispase-I/media.
NOTA: A solução despase-I deve ser preparada pouco antes da adição utilizando meio basal DMEM frio, filtrado com um coador de 0,22 μm e mantido a 4 °C. - Após a digestão durante a noite com dispase-I, remova os pedaços da pele e coloque-os em um prato seco, estéril, cultura. Desenrolar cada pedaço de pele para que a camada epidérmica externa esteja tocando o prato da cultura.
- Usando dois conjuntos de fórceps, separe cuidadosamente a epiderme da derme. Comece na borda do tecido e retire a epiderme da derme.
NOTA: Se a camada de epiderme é difícil de separar da derme, a digestão dispase-I não foi suficiente. Opções de solução de problemas: 1) devolver peças de pele à solução despase-I/DMEM e incubar por mais 2-3 h a 4 °C; 2) coloque as peças da pele em despase fresca-I/DMEM e incubar a 4 °C por mais 2-3 h. - Use a epiderme e a derme separadas para isolar queratinócitos (epiderme) e fibroblastos e células schwann (derme).
NOTA: Siga os passos abaixo para obter condições específicas de isolamento e cultura de tipos celulares.
- Isolamento de queratinócitos da epiderme
- Adicione 5 mL de soro fisiológico hepes tampão (HBS) a um prato de cultura de 10 cm e adicione os fragmentos separados de epiderme. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 10 minutos.
- Após a incubação do HBS, colete a solução HBS em um tubo cônico de 50 mL. Adicione 5 mL de tampão de neutralização de trippsina (TNB) (Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL e reserve.
- Adicione 3 mL de solução de trippsina aos fragmentos epidérmicos. Incubar a 37 °C por 10 min.
- Agitar suavemente os fragmentos epidérmicos usando fórceps até que a solução de trypsin se torne turva.
- Adicione a solução de trippsina/queratinócitos ao HBS e TNB contendo tubo na etapa 1.2.2.
- Para quaisquer fragmentos epidérmicos remanescentes que não tenham dissolvido na digestão inicial da trippsina, adicione 3 mL de 0,25% de trippsina/ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA). Incubar a 37 °C por 10 min e repetir as etapas 1.2.4 e 1.2.5.
- Adicione 2 mL de soro bovino fetal (FBS) à solução trypsin/EDTA contendo tubos de solução HBS e TNB.
- Centrifugar o tubo de coleta contendo HBS/TNB/trypsin e queratinócitos a 870 x g por 5 min a 4 °C.
- Aspire o supernasal e resuspenha a pelota celular em 3 mL de meio de crescimento completo de queratinócitos (Tabela de Materiais).
- Filtre a suspensão celular com um filtro estéril de 100 μM em um tubo cônico estéril de 50 mL para remover detritos.
- Quantifique o número do celular e a viabilidade celular.
NOTA: Aqui, foi utilizado um dispositivo especializado de amostragem e coloração celular (Tabela de Materiais) para quantificar o número do celular e a viabilidade seguindo as instruções do fabricante. - Placas de cultura de sementes conforme necessário para experimentos. A densidade de semeadura recomendada é de ~45.000 células/cm2.
- Coloque as placas de cultura em uma incubadora a 37 °C em 5% de CO2 por 2 dias para permitir que os queratinócitos aderam ao prato.
- Após 2 dias, aspire qualquer célula não aderida. Refrescar a mídia da cultura celular a cada dois dias até que os queratinócitos alcancem a confluência desejada para experiências de passagem ou a jusante (50%-80% de confluência).
- Isolamento de células schwann (SCs) e fibroblastos da derme
- Frascos T25 pré-revestimento com poli-L-lysine (PLL, 0,01 μg/μL) utilizando 5 mL de 1x DPBS. Coloque os frascos pré-revestidos a 37 °C por 3h. Lave a matriz de revestimento PLL duas vezes usando 1x DPBS (5 mL).
NOTA: Os frascos T25 podem ser preparados com antecedência. - Enxágüe as peças isoladas da dermes com 5 mL de meio basal DMEM.
- Pique a derme em pequenos pedaços com tesoura ou bisturi.
- Digerir a dermis picada com 5 mL de colagenase (2 mg/mL em meio basal DMEM) a 37 °C por 2,5 h. Triturar suavemente a dermis picada com uma ponta de pipeta a cada 30 minutos até que a dermis dissocia completamente.
- Filtre a suspensão da célula com um coador de células de 70 μM. É necessário aplicar força mecânica usando uma seringa de 1 mL para filtrar totalmente a suspensão.
- Diluir a suspensão celular filtrada com 5 mL de meio DMEM completo (meio basal DMEM + 5% FBS + 1x de antibiótico) para parar a atividade enzimática da colagemnase.
- Centrifugar a suspensão celular a 870 x g por 5 min em RT para pelotar as células.
- A partir desta pelota celular, tanto os fibroblastos quanto os SCs serão obtidos. Resuspenda a pelota celular em 2 mL de MEM médio completo para dividir as células (suspensão/tubo celular de 1 mL) e centrífuga a 870 x g por 5 min no RT.
- Para a cultura das SCs, siga os passos 1.3.10-1.3.17 e para a cultura do fibroblasto, siga os passos 1.3.18-1.3.22.
- A partir do passo 1.3.8, aspire o supernatante. Resuspenda a pelota de célula em 5 mL de meio completo DMEM fresco.
- Quantifique o número do celular e a viabilidade.
NOTA: Aqui, foi utilizado um dispositivo especializado de amostragem e coloração celular (Tabela de Materiais) para quantificar o número do celular e a viabilidade seguindo as instruções do fabricante. - Semente os frascos T25 pré-revestidos com 5 mL de células resuspended a uma densidade de 4,0 x 103 células/mL. Incubar o frasco a 37 °C na presença de 5% de CO2 durante a noite (~12-16 h de incubação).
- Após 16 h, confirme a adesão celular por microscopia (Tabela de Materiais) a 10x de ampliação.
- Remova as células não aderentes e lave o frasco 3x com 5 mL de 1x DPBS.
- Adicione 5 mL de 10 μM arabinoside (agente antimitótico, mata fibroblastos) em meio completo DMEM. Incubar o frasco a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 24 h.
- Aspire o arabinoside citosine contendo meio do frasco. Enxágüe o frasco 3x com 5 mL de 1x DPBS.
- Rechee o frasco de cultura com 5 mL de SCs meio de cultura completa (Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 48 h. Atualizar SC completo meio de cultura a cada dois dias até que os SCs atinjam 80% de confluência.
- Aspire o supernasciante da camada dérmica dissociada (passo 1.3.8) e resuspense a pelota celular com 5 mL de fibroblasto meio completo (fibroblasto meio basal + 5% FBS + 1x antibiótico).
- Quantifique o número celular e a viabilidade celular.
NOTA: Aqui, foi utilizado um dispositivo especializado de amostragem e coloração celular (Tabela de Materiais) para quantificar o número do celular e a viabilidade seguindo as instruções do fabricante. - Plaque os fibroblastos a uma densidade celular de 4,0 x 103 células/mL em frascos de cultura T25 (não pré-revestidos) usando 5 mL de fibroblasto meio completo. Incubar a 37 °C na presença de 5% de CO2 durante a noite (~12-16 h de incubação).
- Após 16-24 h, confirme a adesão celular por microscopia (Tabela de Materiais) à ampliação de 10x. Aspirar células não aderentes do frasco e lavar o frasco duas vezes com 5 mL de 1x DPBS.
- Adicione 5 mL de fibroblasto fresco médio completo e incubar a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 48 h. Refrescar o meio de cultura a cada dois dias até que os fibroblastos atinjam a confluência desejada para ensaios de passagem ou a jusante (50%-80% de confluência).
- Frascos T25 pré-revestimento com poli-L-lysine (PLL, 0,01 μg/μL) utilizando 5 mL de 1x DPBS. Coloque os frascos pré-revestidos a 37 °C por 3h. Lave a matriz de revestimento PLL duas vezes usando 1x DPBS (5 mL).
2. Verificação de queratinócitos epidérmicos, SCs dérmicos e marcadores proteicos de fibroblastos por imunofluorescência
- Dia 1- Reveste lâminas de vidro de câmara e células desprendimento
- Slides de vidro de câmara de 4 poços pré-casaco com colágeno-I para queratinócitos, ou PLL para SCs ou, apenas 1x DPBS para fibroblastos (0,5 mL cada poço). Certifique-se de revestir toda a superfície. Incubar lâminas de câmara a 37 °C por 2 h. Durante a incubação, prepare as células.
- Após as células cultivadas atingirem 50%-80% de confluência, lave os frascos com 1x DPBS 3x (1 mL para cada poço).
- Despeente as células aderidas com 5 mL de 0,25% de solução trypsin-EDTA (TE) incubando a 37 °C na presença de 5% de CO2 por 2 min, até que as células comecem a se tornar redondas. Visualize o descolamento celular com microscopia (Tabela de Materiais) em ampliação de 10x.
- Após a incubação, transfira a solução TE contendo células para um tubo cônico com soro bovino fetal de 5 mL (FBS).
- Adicione 5 mL de tampão de neutralização de trippsina (TNB) ao frasco de cultura e, em seguida, transfira o conteúdo para o tubo de centrífuga acima mencionado (células com TE e FBS). Visualize o descolamento celular com microscopia (Tabela de Materiais) em ampliação de 10x.
NOTA: TNB ou FBS ou ambos podem ser usados para neutralizar a atividade de trippsina. - Centrifugar o tubo cônico contendo células/TE/TNB a 870 x g por 5 min. Transfira o supernatante para outro tubo e resuspense a pelota celular no meio de cultura completa correspondente. Meça a viabilidade celular mencionada na etapa 1.2.11.
- Enxágüe os slides de vidro de câmara pré-revestidos (passo 2.1.1) com 1x DPBS (1 mL para cada poço) 3x.
- Seque semi-seque as lâminas dentro da capa da cultura tecidual e queratinócitos de sementes, SCs ou fibroblastos a uma densidade apropriada (30.000 células/0,5 mL/câmara) em um meio de cultura celular completa apropriado.
- Incubar os slides da câmara a 37 °C durante a noite para permitir que as células aderam.
- Dia 2- Bloqueando o deslizamento de vidro da câmara com o Bovine Serum Albumin (BSA) e a incubação de anticorpos primários
- Aspire a mídia celular dos slides da câmara e lave 3x com 1 mL de 1x DPBS.
- Fixar as células aderidas com 4% de paraformaldeído em 1x DPBS (1 mL para cada poço) e incubar por 15 min em RT dentro da capa de cultura tecidual.
- Aspirar 4% de paraformaldeído dos slides da câmara e lavar os slides da câmara 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço).
- Permeabilize as membranas celulares com 1% TritonX-100 em 1x DPBS (1 mL para cada poço) e incubar por 15 min na RT.
- Aspire a solução de bloqueio dos slides da câmara, lave 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s e depois aspire 1x DPBS do poço.
- Bloqueie os slides da câmara com 5% de BSA (0,5 mL para cada poço) e incubar por 45 min no RT.
- Aspire a solução de bloqueio dos slides da câmara, lave 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s cada e, em seguida, aspire 1x DPBS do poço.
- Diluir os anticorpos primários com 5% de BSA (0,2 mL para cada poço) (Diluições de anticorpos primários: Queratinítos: citokeratin do rato 14 anticorpos (1:100) e, anticorpo citokeratin 10 (1:100); Células schwann: anticorpo S100 do rato (1:200) e anticorpo do fator de crescimento do nervo do coelho (p75-NTR) (1:500); Fibroblastos: anticorpo de vimentina de coelho (1:200) e anticorpo de músculo alfa-liso do rato (α-SMA) anticorpo (1:200)).
- Adicione os anticorpos primários às células correspondentes no deslizamento de vidro da câmara e incubar por cerca de 15-16 h (durante a noite) a 4 °C em uma câmara umidificada.
- Aspire os anticorpos primários dos slides da câmara, lave 3 vezes com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s cada e, em seguida, aspire 1x DPBS do poço.
- Diluir os anticorpos secundários (Anti-coelho de cabra IgG Anticorpo Secundário-Alexa Fluor 488 (1:500) e Anti-Rato de Cabra IgG Anticorpo Secundário-Alexa Fluor 594 (1:500)) com 0,5% BSA. Adicione anticorpo secundário adequado a cada poço (0,2 mL para cada poço). Incubar por 45 min na RT.
- Aspire o anticorpo secundário dos slides de câmara, lave 3x com 1x DPBS (1 mL para cada poço) para 30 s cada e, em seguida, aspire 1x DBPS do poço.
- Remova a junta no slide da câmara de 4 poços usando removedor de junta. Tente não deixar nenhum adesivo no slide, pois isso interfere com a aplicação do deslizamento de tampas. Adicione uma gota de meio de montagem com 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI). Alternativamente, contra-colorindo os poços com DAPI e use um meio de montagem que não contenha rótulos.
- Coloque cuidadosamente a mancha de cobertura no deslizamento de vidro evitando bolhas de ar e sele a extremidade da tampa com cola. Observe padrões de coloração de imunofluorescência por microscopia (Tabela de Materiais) a 10x e/ou 20x de ampliação.
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Representative Results
O prepúcio neonatal normal foi utilizado para o isolamento de queratinócitos epidérmicos primários e SCs e fibroblastos dérmicos. As células primárias isoladas foram cultivadas em suas respectivas mídias de cultura celular contendo fatores de crescimento. Após a semeadura de SCs e fibroblasto em frascos de cultura, a maioria das células aderiu ao fundo do frasco dentro de 2 h. No caso dos queratinócitos, a maioria dos queratinócitos aderiu por 24h. Os queratinócitos primários epidérmicos isolados atingiram 85% de confluência até o dia 7 e apresentaram morfologia celular característica (forma de paralelepípedos) (Figura 1A). Os SCs atingiram 95% de confluência no dia 5 e apareceram em forma bipolar ou tripolar (Figura 1B). As culturas do fibroblasto atingiram 95% de confluência até o dia 4 e a maioria das células exibiu uma morfologia em forma de fuso (Figura 1C). A expressão proteica específica do tipo celular foi confirmada nessas culturas por coloração de imunofluorescência. Os queratinócitos foram positivos para as proteínas K10 (marcador de diferenciação) e K14 (marcador de proliferação) (Figura 2A); da mesma forma, os SCs foram positivos para S100 e p75-NTR (Figura 2C). Os fibroblastos expressaram positivamente a vimentina, mas não expressaram o marcador myofibroblast, o músculo alfa smooth actin (α-SMA) (Figura 2E).
As imagens mescladas de imunofluorescência de queratina e coloração nuclear da DAPI (Figura 2A) indicaram que 97,8% das células nas culturas eram queratinócitos (Figura 2B). Células Schwann positivas do S100 duplo e p75-NTR sugerem pureza de 95,2% de SCs na cultura seguindo o protocolo (Figura 2C,D). Da mesma forma, 97,2% das células em culturas de fibroblasto expressaram positivamente a vimentina (Figura 2E,F). Assim, a expressão proteica característica é encontrada nos respectivos tipos de células, e o protocolo permite o isolamento de populações relativamente puras de células.
Figura 1: Isolamento de queratinócitos primários derivados do prepúcio humano, células schwann e fibroblastos. (A) Keratinócitos, (B) Células schwann e (C) fibroblastos sob microscópio de contraste de fase; barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização de queratinócitos primários derivados do prepúcio humano, células schwann e fibroblastos. (A) Os queratinócitos foram identificados utilizando queratina 14 (K14, queratinócitos proliferativos) e K10 (queratina 10, marcador de diferenciação de queratinato); barra de escala = 100 μm. (B) Análise estatística da pureza dos queratinócitos cultivados usando imunofluorescências duplas células manchadas. (C) As células schwann foram identificadas utilizando S100 e p75-NTR (receptor do fator de crescimento nervoso); barra de escala = 100 μm. (D) Análise estatística da pureza das SCs cultivadas usando imunofluorescências duplas células manchadas. (E) Os fibroblastos foram identificados utilizando vimentina (fibroblasto) e actina muscular α lisa (diferenciação de fibroblasto, miofibroblast); barra de escala = 100 μm. (F) Análise estatística da pureza dos fibroblastos cultivados usando imunofluorescências vimentinas manchadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um método para isolar três populações de células distintas de um único pedaço do prepúcio, ou seja, queratinócitos, fibroblastos e células Schwann. Existem alguns protocolos de isolamento disponíveis para isolar queratinócitos e fibroblastos 2,3,5,6, mas nenhum descreve o isolamento de SC. Além das principais células estruturais da pele, queratinócitos e fibroblastos, a pele também é altamente inervatada por estruturas sensoriais e eferentes autônomos. Os aferentes sensoriais desempenham um papel significativo na transmissão de toque de luz, vibração, dor, coceira e sensações quentes e frias. Efferents autônomos inervam glândulas sudoríparas e músculos pili9. Cada axônio nervoso é envolto por um SC, as células gliais do sistema nervoso periférico. A pesquisa e os interesses clínicos em SCs aumentaram consideravelmente à medida que as SCs apoiam a regeneração axonal10,11. Os nervos da pele são importantes reguladores da fisiologia da pele e da patologia da doença através de sinais de comunicação (neuromoduladores/neuromediadores) para células não neurais 12,13,14.
Apesar da ampla distribuição de SCs nervosos na pele, existem informações limitadas sobre as SCs papel específico na fisiologia da pele. Como as SCs na pele interagem com outras células não neuronais na pele? Responder a essa pergunta tem sido dificultado pela falta de modelos confiáveis de cultura celular in vitro . Assim, com este protocolo, a análise de cada célula individual e suas interações com células do mesmo tecido podem revelar precisamente as características características dos papéis das células schwann na homeostase da pele e na fisiopatologia.
Uma das principais vantagens deste protocolo é um procedimento experimental simples e barato para estabelecer três células primárias (SCs, queratinócitos e fibroblastos) a partir de um único prepúcio humano. Também tem a vantagem de todos os três tipos de células serem isolados do mesmo tecido, mitigando assim as diferenças genéticas nas comparações celulares e otimizando isolamentos celulares quando o tecido está em oferta limitada. Este protocolo leva 2 dias para ser realizado e simplifica o procedimento de isolamento para três células primárias a partir de tecido da pele e condições de cultivo. Este protocolo produz de forma confiável um alto número de células viáveis, e as passagens iniciais dessas células atingiram ~90% de confluência por 4-7 dias após o revestimento inicial. Usamos queratinócitos por pelo menos 3 passagens (~21 dias) e as células fibroblasto e schwann podem ser usadas para passagens de 5 a 6 (~40 dias na cultura).
Este protocolo não é sem desafios técnicos. A remoção suficiente do tecido adiposo subjacente e a separação epidérmica/dérmica eficiente antes da digestão enzimática são fundamentais para obter populações relativamente puras de células de cada camada de pele. As SCs dérmicas são mais difíceis de isolar da pele devido à sua prevalência relativamente baixa na pele em comparação com os mais numerosos fibroblastos. Qualquer transferência de fibroblastos nas culturas de SC irá rapidamente superar os SCs15. Para aumentar a adesão à SC, optamos por pré-revestir a cultura do tecido com PLL, pois isso aumenta a adesão dos SCs16. Para mitigar ainda mais a contaminação do fibroblasto, a citosina arabinoside (agente antimitotético) foi adicionada após as células terem aderido por um curto período de tempo para remover os fibroblastos que se dividem rapidamente das culturas das SCs. No entanto, a exposição mais longa ao arabinoside citosina também pode ser prejudicial para as SCs.
A adoção do protocolo descrito acima permite isolar as culturas individuais de SCs de pele, queratinócitos e fibroblastos para experimentos in vitro . Essas populações celulares distintas podem ser usadas para investigar SCs, queratinócitos e fibroblastos individualmente ou em combinação durante a fisiologia normal da pele, cicatrização de feridas ou sob condições que imitam um cenário da doença.
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Disclosures
Todos os outros autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Fadia Kamal e ao Dr. Reyad Elbarbary por nos permitir usar instrumentos de laboratório e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH (K08 AR060164-01A) e do DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. além do apoio institucional do Centro Médico Hershey da Universidade Estadual da Pensilvânia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
