Summary
Undersøgelsen af sårheling forbundet med muskuloskeletal skade kræver ofte vurdering af in vitro-interaktioner mellem Schwann-celler (SC'er), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokol beskriver isolering, dyrkning og karakterisering af disse primære celler fra den menneskelige forhud.
Abstract
Denne protokol beskriver isolationsmetoder, dyrkningsbetingelser og karakterisering af humane primære celler med højt udbytte og levedygtighed ved hjælp af hurtig enzymatisk dissociation af huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra den menneskelige nyfødte forhud, som er tilgængelig efter standardplejeprocedurer. Den fjernede hud desinficeres, og det subkutane fedt og muskler fjernes ved hjælp af en skalpel. Metoden består af enzymatisk og mekanisk adskillelse af epidermale og dermale lag efterfulgt af yderligere enzymatisk fordøjelse for at opnå enkeltcellesuspensioner fra hvert af disse hudlag. Endelig dyrkes enkeltceller i passende cellekulturmedier efter standard cellekulturprotokoller for at opretholde vækst og levedygtighed over uger. Sammen tillader denne enkle protokol isolering, dyrkning og karakterisering af alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud til in vitro-evaluering af hudnervemodeller. Derudover kan disse celler bruges sammen i co-kulturer til at måle deres virkninger på hinanden og deres reaktioner på in vitro-traumer i form af ridser udført robotisk i kulturen forbundet med sårheling.
Introduction
Primære celler afledt af levende væv og dyrket under in vitro-forhold ligner meget den fysiologiske tilstand1, hvilket gør dem til en ideel model til undersøgelse af fysiologiske og patofysiologiske processer. Huden indeholder flere celletyper, herunder keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SC'er), som kan isoleres og dyrkes til in vitro-eksperimenter . Metoder til at isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SC'er fra et enkelt stykke hud er ikke beskrevet. Målet med denne protokol er todelt: 1) at etablere en pålidelig og reproducerbar metode til isolering og dyrkning af dermaleSC'er og 2) at anvende en effektiv, robust metode til isolering af keratinocytter, fibroblaster og SC'er fra en enkelt menneskelig forhud.
På nuværende tidspunkt er der etablerede protokoller til isolering af hudkeratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse undersøgelser beskriver isoleringen af enten keratinocytter, fibroblaster eller begge dele fra huden, men ingen protokol omhandler, hvordan man etablerer kulturer af primære SC'er fra menneskelig hud. Nylige undersøgelser tyder på, at neuronale SC'er modulerer keratinocyt- og fibroblastcellulære processer og regulerer normale hudfysiologiske funktioner7. SC'er er således kritiske for hudens homeostase og bidrager væsentligt til den regulerende fysiologi, der påvirker adfærden hos de nærliggende hudcelletyper, der er til stede8. Derfor er en protokol, der muliggør isolering af hver af disse celletyper, ideel til in vitro-eksperimenter, der involverer celle-cellekommunikation eller krydstale mellem celletyper.
Denne protokol beskriver etableringen af individuelle cellekulturer af primære celler fra et enkelt stykke hud. Denne protokol er især nyttig, når mængden af tilgængeligt væv er begrænset. Desuden giver isolering af alle tre celletyper fra en enkelt donor mulighed for robuste sammenligninger mellem celletyper eller co-kulturforsøg, samtidig med at genetikkens indflydelse mindskes under det ønskede eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erhvervelse og anvendelse af afidentificeret humant forhudsvæv til forskningsformål blev gennemgået og modtaget bestemmelsen af "ikke menneskelig forskning" af Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
BEMÆRK: Ved at følge nedenstående protokol opnås 2,4 x 106 keratinocytter, 4,4 x 106 fibroblaster og 1,1 x 106 SO'er fra en enkelt forhud. Generelt kan disse primære celler anvendes til 3 passager afhængigt af forsøgsbetingelserne.
1. Isolering af primære celler og dyrkningsbetingelser
- Proceduren for adskillelse af epidermis og dermis
- Erhverv neonatal forhud efter standardprocedurer for pleje af en læge i henhold til godkendte hospitalsmæssige reguleringsprotokoller. Lægen bestemmer tidspunktet for omskæring efter fødslen og mængden af hud fjernet.
- Anbring den udskårne forhud i et mikrocentrifugerør indeholdende 8-10 ml iskoldt Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) basalmedium, og transporter straks forhuden til cellekulturlaboratoriet for celleisolering. Skyl huden to gange med 20-25 ml 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS), der indeholder 1x antibiotika/antimykotisk.
BEMÆRK: For at opnå maksimal cellelevedygtighed skal den udskårne forhud anbringes ved 4 °C indtil forarbejdningen, og cellerne skal høstes inden for 24 timer. - Efter skylning i DPBS/ antibiotika suges forhuden i 25-30 ml iskoldt DMEM-basalmedium i 10-15 minutter i en 10 cm vævskulturskål. Udfør alle behandlingstrin i en vævskulturhætte ved hjælp af steril teknik.
- Brug en skalpel til forsigtigt at skære forhuden åben og udsætte dermis og subkutan fedtvæv.
- Fjern det subkutane fedtvæv ved hjælp af tang, skalpelblad og saks efter behov. Kassér fedtvævet. Skær den rensede forhud i tre til fem mindre stykker.
- Overfør hudstykker til et sterilt konisk rør indeholdende 16-20 ml dispase-I / DMEM-medium (4 mg / ml i DMEM basalmedium).
- Bland hudstykkerne i det koniske rør ved inversion, intermitterende, i løbet af de første 30 minutters inkubation med dispase-I. Anbring derefter det koniske rør ved 4 ° C i 16-18 timer, og husk at nedsænke hudstykkerne i dispase-I / medier.
BEMÆRK: Dispase-I-opløsning skal fremstilles lige før tilsætning ved hjælp af koldt DMEM-basalmedium, filtreres med en 0,22 μm sil og opbevares ved 4 °C. - Efter fordøjelsen natten over med dispase-I skal du fjerne hudstykkerne og placere dem på en tør, steril kulturskål. Rul hvert stykke hud ud, så det ydre epidermale lag berører kulturskålen.
- Brug to sæt tang til forsigtigt at adskille epidermis fra dermis. Start på kanten af vævet og skræl epidermis væk fra dermis.
BEMÆRK: Hvis epidermislaget er vanskeligt at adskille fra dermis, var dispase-I-fordøjelsen ikke tilstrækkelig. Fejlfindingsmuligheder: 1) returner hudstykker til dispase-I / DMEM-opløsning og inkuber i yderligere 2-3 timer ved 4 ° C; 2) Læg hudstykker i frisk dispase-I/DMEM og inkuber ved 4 °C i 2-3 timer mere. - Brug den adskilte epidermis og dermis til at isolere keratinocytter (epidermis) og fibroblaster og Schwann-celler (dermis).
BEMÆRK: Følg nedenstående trin for specifikke celletyper isolation og dyrkningsbetingelser.
- Keratinocytisolering fra epidermis
- Tilsæt 5 ml HEPES-buffer saltvand (HBS) til en 10 cm kulturskål og tilsæt de adskilte epidermisfragmenter. Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter.
- Efter HBS-inkubation opsamles HBS-opløsningen i et 50 ml konisk rør. Tilsæt 5 ml trypsinneutraliseringsbuffer (TNB) (Materialetabel) i et 50 ml konisk rør og sæt til side.
- Tilsæt 3 ml trypsinopløsning til de epidermale fragmenter. Inkuber ved 37 °C i 10 min.
- Omrør forsigtigt de epidermale fragmenter ved hjælp af tang, indtil trypsinopløsningen bliver uklar.
- Trypsinopløsningen/keratinocytterne tilsættes til HBS- og TNB-røret i trin 1.2.2.
- For eventuelle resterende epidermale fragmenter, der ikke er opløst i den indledende trypsinfordøjelse, tilsættes 3 ml 0,25% trypsin/ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Inkuber ved 37 °C i 10 minutter, og gentag trin 1.2.4 og 1.2.5.
- Der tilsættes 2 ml føtalt kvægserum (FBS) til trypsin/EDTA-opløsningen indeholdende HBS- og TNB-opløsningsrør.
- Opsamlingsrøret, der indeholder HBS/TNB/trypsin og keratinocytter, centrifugeres ved 870 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspend cellepillen i 3 ml keratinocyt komplet vækstmedium (Tabel over materialer).
- Filtrer cellesuspensionen med et sterilt 100 μM filter i et sterilt 50 ml konisk rør for at fjerne snavs.
- Kvantificer cellenummeret og cellelevedygtigheden.
BEMÆRK: Her blev en specialiseret celleprøveudtagnings- og farvningsanordning (Table of Materials) brugt til at kvantificere cellenummeret og levedygtigheden efter producentens anvisninger. - Frøkulturplader efter behov til forsøg. Den anbefalede såtæthed er ~ 45.000 celler /cm2.
- Anbring kulturpladerne i en inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 i 2 dage, så keratinocytter kan klæbe til fadet.
- Efter 2 dage aspirerer eventuelle ikke-klæbede celler. Opdater cellekulturmedierne hver anden dag, indtil keratinocytter når ønsket sammenløb til passaging eller downstream-eksperimenter (50% -80% sammenløb).
- Isolering af Schwann-celler (SC'er) og fibroblaster fra dermis
- Forcoat T25-kolber med poly-L-lysin (PLL, 0,01 μg/μL) ved anvendelse af 5 ml 1x DPBS. De forbelagte kolber anbrings ved 37 °C i 3 timer. Vask PLL-belægningsmatrixen to gange med 1x DPBS (5 ml).
BEMÆRK: T25-kolber kan fremstilles på forhånd. - Skyl de isolerede stykker af dermis med 5 ml DMEM basal medium.
- Hak dermis i små stykker med en saks eller en skalpel.
- Den hakkede dermis fordøjes med 5 ml kollagenase (2 mg/ml i DMEM-basalmedium) ved 37 °C i 2,5 timer. Triturer forsigtigt den hakkede dermis med en pipettespids hvert 30. minut, indtil dermis helt adskiller sig.
- Filtrer cellesuspensionen med en 70 μM cellesil. Det er nødvendigt at anvende mekanisk kraft ved hjælp af en 1 ml sprøjte for fuldt ud at filtrere suspensionen.
- Fortynd den filtrerede cellesuspension med 5 ml komplet DMEM-medium (DMEM basal medium + 5% FBS + 1x antibiotika) for at stoppe den enzymatiske aktivitet af kollagenase.
- Centrifugering af cellesuspensionen ved 870 x g i 5 minutter ved RT for at pelletere cellerne.
- Fra denne cellepille opnås både fibroblaster og VC'er. Resuspend cellepillen i 2 ml DMEM komplet medium for at opdele cellerne (1 ml cellesuspension / rør) og centrifuge ved 870 x g i 5 minutter ved RT.
- For SCs kultur skal du følge trin 1.3.10-1.3.17 og for fibroblastkultur skal du følge trin 1.3.18-1.3.22.
- Fra trin 1.3.8 aspirerer supernatanten. Resuspend cellepillen i 5 ml frisk DMEM komplet medium.
- Kvantificer cellenummeret og levedygtigheden.
BEMÆRK: Her blev en specialiseret celleprøveudtagnings- og farvningsanordning (Table of Materials) brugt til at kvantificere cellenummeret og levedygtigheden efter producentens anvisninger. - Frø de præ-coatede T25-kolber med 5 ml resuspenderede celler med en densitet på 4,0 x 103 celler/ml. Kolben inkuberes ved 37 °C i nærvær af 5 % CO2 natten over (~12-16 timer inkubation).
- Efter 16 timer bekræftes celleadhæsion ved mikroskopi (materialetabel) ved 10x forstørrelse.
- Fjern de ikke-klæbende celler, og kolben vaskes 3x med 5 ml 1x DPBS.
- Tilsæt 5 ml 10 μM cytosin arabinosid (antimitotisk middel, dræber fibroblaster) i DMEM komplet medium. Kolben inkuberes ved 37 °C i nærværelse af 5 % CO2 i 24 timer.
- Aspirat cytosinarabinosid indeholdende medium fra kolben. Kolben skylles 3x med 5 ml 1x DPBS.
- Kulturkolben genopfyldes med 5 ml SCs komplette dyrkningsmedium (materialetabel) og inkuberes ved 37 °C i nærværelse af 5 % CO2 for 48 timer. Opdater SC komplet kulturmedium hver anden dag, indtil SC'er når 80% sammenløb.
- Aspirer supernatanten fra det dissocierede dermale lag (trin 1.3.8) og resuspend cellepillen med 5 ml fibroblast komplet medium (fibroblast basal medium + 5% FBS + 1x antibiotikum).
- Kvantificer celletal og cellelevedygtighed.
BEMÆRK: Her blev en specialiseret celleprøveudtagnings- og farvningsanordning (Table of Materials) brugt til at kvantificere cellenummeret og levedygtigheden efter producentens anvisninger. - Plader fibroblasterne med en celletæthed på 4,0 x 103 celler/ml i T25-dyrkningskolber (ikke forbelagt) ved hjælp af 5 ml fibroblast komplet medium. Inkuber ved 37 °C i nærværelse af 5 % CO2 natten over (~12-16 timer inkubation).
- Efter 16-24 timer bekræftes celleadhæsion ved mikroskopi (table of materials) ved 10x forstørrelse. Aspirer ikke-klæbende celler fra kolben, og kolben vaskes to gange med 5 ml 1x DPBS.
- Tilsæt 5 ml frisk fibroblast komplet medium og inkuber ved 37 ° C i nærvær af 5% CO2 i 48 timer. Opdater kulturmediet hver anden dag, indtil fibroblaster når det ønskede sammenløb til passaging eller nedstrøms assays (50% -80% sammenløb).
- Forcoat T25-kolber med poly-L-lysin (PLL, 0,01 μg/μL) ved anvendelse af 5 ml 1x DPBS. De forbelagte kolber anbrings ved 37 °C i 3 timer. Vask PLL-belægningsmatrixen to gange med 1x DPBS (5 ml).
2. Verifikation af epidermale keratinocytter, dermaleSC'er og fibroblastproteinmarkør ved immunofluorescens
- Dag 1- Frakke kammerglasrutschebaner og løsn celler
- Pre-coat 4-brønds kammerglas dias med kollagen-I til keratinocytter eller PLL til SC'er eller kun 1x DPBS til fibroblaster (0,5 ml hver brønd). Sørg for at belægge hele overfladen. Inkubationskammeret glider ved 37 °C i 2 timer. Under inkubation skal du forberede cellerne.
- Når dyrkede celler når 50% -80% sammenløb, vaskes kolberne med 1x DPBS 3x (1 ml for hver brønd).
- Fjern de klæbende celler med 5 ml 0,25% trypsin-EDTA (TE) opløsning ved at inkubere ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 i 2 minutter, indtil cellerne begynder at blive runde. Visualiser celleløsning med mikroskopi (Table of Materials) ved 10x forstørrelse.
- Efter inkubation overføres TE-opløsning indeholdende celler til et konisk rør med 5 ml føtalt kvægserum (FBS).
- Der tilsættes 5 ml trypsinneutraliseringsbuffer (TNB) til dyrkningskolben, og indholdet overføres derefter til ovennævnte centrifugerør (celler med TE og FBS). Visualiser celleløsning med mikroskopi (Table of Materials) ved 10x forstørrelse.
BEMÆRK: TNB eller FBS eller begge kan bruges til at neutralisere trypsinaktivitet. - Centrifugering af det koniske rør indeholdende celler/TE/TNB ved 870 x g i 5 min. Overfør supernatanten til et andet rør og resuspend cellepillen i det tilsvarende komplette dyrkningsmedium. Cellelevedygtigheden måles som nævnt i trin 1.2.11.
- Skyl de forbelagte kammerglasrutsjebaner (trin 2.1.1) med 1x DPBS (1 ml for hver brønd) 3x.
- Halvtørre gliderne inde i vævskulturhætten og frøkeratinocytter, SC'er eller fibroblaster med en passende densitet (30.000 celler / 0,5 ml / kammer) i et passende komplet cellekulturmedium.
- Inkuber kammeret glider ved 37 ° C natten over for at tillade celler at klæbe.
- Dag 2- Blokering af kammerglasrutsjebanen med Bovin Serum Albumin (BSA) og inkubation af primære antistoffer
- Aspirer cellemediet fra kammeret glider og vask 3x med 1 ml 1x DPBS.
- Fastgør de klæbede celler med 4% paraformaldehyd i 1x DPBS (1 ml for hver brønd) og inkuber i 15 minutter ved RT inde i vævskulturhætten.
- Aspirat 4% paraformaldehyd fra kammeret glider og vask kammeret glider 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønd).
- Permeabilisere cellemembranerne med 1% TritonX-100 i 1x DPBS (1 ml for hver brønd) og inkubere i 15 minutter ved RT.
- Aspirer blokeringsopløsningen fra kammergliderene, vask 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønd) i 30 s og aspirer derefter 1x DPBS fra brønden.
- Bloker kammerglider med 5% BSA (0,5 ml for hver brønd) og inkuber i 45 minutter ved RT.
- Aspirer blokeringsopløsningen fra kammergliderene, vask 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønd) i 30 s hver og aspirer derefter 1x DPBS fra brønden.
- Fortynd de primære antistoffer med 5% BSA (0,2 ml for hver brønd) (Primære antistoffortyndinger: Keratinocytter: musecytokeratin 14-antistof (1:100) og cytokeratin 10-antistof (1:100); Schwann-celler: mus S100-antistof (1:200) og kaninnervevækstfaktorreceptor (p75-NTR) antistof (1:500); Fibroblaster: kanin vimentin antistof (1:200) og mus alfa-glat muskel actin (α-SMA) antistof (1:200)).
- Tilsæt de primære antistoffer til de tilsvarende celler på kammerglasglasglasset og inkuber i ca. 15-16 timer (natten over) ved 4 °C i et befugtet kammer.
- Aspirer de primære antistoffer fra kammeret glider, vask 3 gange med 1x DPBS (1 ml for hver brønd) i 30 s hver og derefter aspirer 1x DPBS fra brønden.
- Fortynd de sekundære antistoffer (Gede-anti-kanin IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 488 (1:500) og Gede-anti-Mus IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 594 (1:500)) med 0,5% BSA. Tilsæt passende sekundært antistof til hver brønd (0,2 ml for hver brønd). Inkuber i 45 minutter ved RT.
- Aspirer det sekundære antistof fra kammerdias, vask 3x med 1x DPBS (1 ml for hver brønd) i 30 s hver og aspirer derefter 1x DBPS fra brønden.
- Fjern pakningen på 4-brønds kammerglideren ved hjælp af pakningsfjerner. Prøv ikke at efterlade noget klæbemiddel på diaset, da dette forstyrrer påføringen af coverslip. Tilsæt en dråbe monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Alternativt kan du modplet brøndene med DAPI og bruge et ikke-etiketholdigt monteringsmedium.
- Placer forsigtigt dækslippet på glasglideren ved at undgå luftbobler og forsegl enden af dæksedlen med lim. Overhold immunofluorescensfarvningsmønstre ved mikroskopi (table of materials) ved 10x og / eller 20x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normal neonatal forhud blev anvendt til isolering af primære epidermale keratinocytter og dermale SC'er og fibroblaster. De isolerede primære celler blev dyrket i respektive cellekulturmedier indeholdende vækstfaktorer. Efter såning af SC'er og fibroblast i dyrkningskolber klæbede de fleste celler til bunden af kolben inden for 2 timer. I tilfælde af keratinocytter klæbede de fleste keratinocytter med 24 timer. Isolerede epidermale primære keratinocytter nåede 85% sammenløb på dag 7 og udviste karakteristisk cellemorfologi (brostensform) (figur 1A). VC'erne nåede 95% sammenløb på dag 5 og syntes bipolære eller tripolære i form (figur 1B). Fibroblastkulturer nåede 95% sammenløb på dag 4, og de fleste af cellerne udviste en spindelformmorfologi (figur 1C). Celletypespecifik proteinekspression blev bekræftet i disse kulturer ved immunofluorescensfarvning. Keratinocytter var positive for K10 (differentieringsmarkør) og K14 (proliferationsmarkør) proteiner (figur 2A); Tilsvarende var SC'erne positive for S100 og p75-NTR (figur 2C). Fibroblaster udtrykte positivt vimentin, men udtrykte ikke myofibroblastmarkøren, alfa glat muskel actin (α-SMA) (figur 2E).
De fusionerede billeder af keratinimmunfluorescens og DAPI-nuklear farvning (figur 2A) viste, at 97,8% af cellerne i kulturerne var keratinocytter (figur 2B). Dobbelt S100- og p75-NTR-positive Schwann-celler antyder renhed på 95,2% SC'er i kultur efter protokollen (figur 2C,D). Tilsvarende udtrykte 97,2% af cellerne i fibroblastkulturer positivt vimentin (figur 2E,F). Således findes karakteristisk proteinekspression i de respektive celletyper, og protokollen muliggør isolering af relativt rene populationer af celler.
Figur 1: Isolering af humane forhudsafledte primære keratinocytter, Schwann-celler og fibroblaster. (A) Keratinocytter, (B) Schwann-celler og (C) Fibroblaster under fasekontrastmikroskop; skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af humane forhudsafledte primære keratinocytter, Schwann-celler og fibroblaster. (A) Keratinocytter blev identificeret ved anvendelse af keratin 14 (K14, proliferative keratinocytter) og K10 (keratin 10, keratinocytdifferentieringsmarkør); skalastang = 100 μm. (B) Statistisk analyse af renheden af dyrkede keratinocytter ved anvendelse af immunofluorescenser dobbeltfarvede celler. (C) Schwann-celler blev identificeret ved anvendelse af S100 og p75-NTR (nervevækstfaktorreceptor); skalastang = 100 μm. (D) Statistisk analyse af renheden af dyrkede SC'er ved anvendelse af immunofluorescenser dobbeltfarvede celler. (E) Fibroblaster blev identificeret ved anvendelse af vimentin (fibroblast) og α-glat muskel actin (fibroblastdifferentiering, myofibroblast); skalastang = 100 μm. (F) Statistisk analyse af renheden af dyrkede fibroblaster ved anvendelse af immunofluorescenser vimentin farvede celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til at isolere tre forskellige cellepopulationer fra et enkelt stykke af forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Der er et par isolationsprotokoller til rådighed for at isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortset fra de vigtigste strukturelle celler i hud, keratinocytter og fibroblaster er huden også stærkt innerveret af sensoriske afferente strukturer og autonome efferenter. Sensoriske afferenter spiller en væsentlig rolle i transmissionen af let berøring, vibrationer, smerte, kløe og varme og kolde fornemmelser. Autonome efferenter inderverer svedkirtler og arrector pili muskler9. Hver nerveaxon er indkapslet af en SC, glialcellerne i det perifere nervesystem. Forskning og kliniske interesser i SC'er er steget betydeligt, da SC'er understøtter aksonal regenerering10,11. Hudnerver er vigtige regulatorer af hudfysiologi og sygdomspatologi gennem kommunikationssignaler (neuromodulatorer / neuromediatorer) til ikke-neurale celler 12,13,14.
På trods af den brede fordeling af nerve-VC'er i huden findes der begrænset information om SCs specifikke rolle i hudens fysiologi. Hvordan interagerer SC'er i huden med andre ikke-neuronale celler i huden? Besvarelsen af dette spørgsmål er blevet forhindret af manglen på pålidelige in vitro-cellekulturmodeller . Med denne protokol kan analysen af hver enkelt celle og deres interaktioner med celler fra det samme væv således præcist afsløre de karakteristiske træk ved Schwann-cellernes roller i hudhomeostase og patofysiologi.
En af de vigtigste fordele ved denne protokol er en enkel, billig eksperimentel procedure til etablering af tre primære celler (VC'er, keratinocytter og fibroblast) fra en enkelt menneskelig forhud. Det har også den fordel, at alle tre celletyper isoleres fra det samme væv, hvilket mindsker genetiske forskelle i cellesammenligninger og optimerer celleisoleringer, når væv er i begrænset forsyning. Denne protokol tager 2 dage at udføre og forenkler isolationsproceduren for tre primære celler fra hudvæv og dyrkningsbetingelser. Denne protokol giver pålideligt et stort antal levedygtige celler, og de første passager af disse celler nåede ~ 90% sammenløb med 4-7 dage efter den første plettering. Vi har brugt keratinocytter i mindst 3 passager (~ 21 dage), og fibroblast- og Schwann-celler kan bruges til 5-6 passager (~ 40 dage i kultur).
Denne protokol er ikke uden tekniske udfordringer. Tilstrækkelig fjernelse af det underliggende fedtvæv og effektiv epidermal/dermal separation før enzymatisk fordøjelse er nøglen til at opnå relativt rene populationer af celler fra hvert hudlag. DermaleSC'er er vanskeligere at isolere fra huden på grund af deres relativt lave forekomst i huden sammenlignet med de mere talrige fibroblaster. Enhver overførsel af fibroblaster i SC-kulturer vil hurtigt vokse ud af SC'er15. For at forbedre SC-adhærensen valgte vi at præ-coate vævskulturvarer med PLL, da dette øger vedhæftningen af SC'er16. For yderligere at afbøde fibroblastforurening blev cytosin arabinosid (antimitotisk middel) tilsat, efter at celler havde klæbet i en kort periode for at fjerne de hurtigt delende fibroblaster fra SCs kulturer. Imidlertid kan længere eksponering for cytosin arabinosid også være skadeligt for SC'er.
Vedtagelse af den ovenfor beskrevne protokol gør det muligt at isolere individuelle hud-SC'er, keratinocytter og fibroblastkulturer til in vitro-eksperimenter . Disse forskellige cellepopulationer kan bruges til at undersøge SC'er, keratinocytter og fibroblaster individuelt eller i kombination under normal hudfysiologi, sårheling eller under forhold, der efterligner en sygdomsindstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle andre forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Fadia Kamal og Dr. Reyad Elbarbary for at give os mulighed for at bruge laboratorieinstrumenter og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. ud over institutionel støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
