Summary

Isolering, kultur og karakterisering af primære Schwann-celler, keratinocytter og fibroblaster fra human forhud

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Undersøgelsen af sårheling forbundet med muskuloskeletal skade kræver ofte vurdering af in vitro-interaktioner mellem Schwann-celler (SC’er), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokol beskriver isolering, dyrkning og karakterisering af disse primære celler fra den menneskelige forhud.

Abstract

Denne protokol beskriver isolationsmetoder, dyrkningsbetingelser og karakterisering af humane primære celler med højt udbytte og levedygtighed ved hjælp af hurtig enzymatisk dissociation af huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra den menneskelige nyfødte forhud, som er tilgængelig efter standardplejeprocedurer. Den fjernede hud desinficeres, og det subkutane fedt og muskler fjernes ved hjælp af en skalpel. Metoden består af enzymatisk og mekanisk adskillelse af epidermale og dermale lag efterfulgt af yderligere enzymatisk fordøjelse for at opnå enkeltcellesuspensioner fra hvert af disse hudlag. Endelig dyrkes enkeltceller i passende cellekulturmedier efter standard cellekulturprotokoller for at opretholde vækst og levedygtighed over uger. Sammen tillader denne enkle protokol isolering, dyrkning og karakterisering af alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud til in vitro-evaluering af hudnervemodeller. Derudover kan disse celler bruges sammen i co-kulturer til at måle deres virkninger på hinanden og deres reaktioner på in vitro-traumer i form af ridser udført robotisk i kulturen forbundet med sårheling.

Introduction

Primære celler afledt af levende væv og dyrket under in vitro-forhold ligner meget den fysiologiske tilstand1, hvilket gør dem til en ideel model til undersøgelse af fysiologiske og patofysiologiske processer. Huden indeholder flere celletyper, herunder keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SC’er), som kan isoleres og dyrkes til in vitro-eksperimenter . Metoder til at isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SC’er fra et enkelt stykke hud er ikke beskrevet. Målet med denne protokol er todelt: 1) at etablere en pålidelig og reproducerbar metode til isolering og dyrkning af dermaleSC’er og 2) at anvende en effektiv, robust metode til isolering af keratinocytter, fibroblaster og SC’er fra en enkelt menneskelig forhud.

På nuværende tidspunkt er der etablerede protokoller til isolering af hudkeratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse undersøgelser beskriver isoleringen af enten keratinocytter, fibroblaster eller begge dele fra huden, men ingen protokol omhandler, hvordan man etablerer kulturer af primære SC’er fra menneskelig hud. Nylige undersøgelser tyder på, at neuronale SC’er modulerer keratinocyt- og fibroblastcellulære processer og regulerer normale hudfysiologiske funktioner7. SC’er er således kritiske for hudens homeostase og bidrager væsentligt til den regulerende fysiologi, der påvirker adfærden hos de nærliggende hudcelletyper, der er til stede8. Derfor er en protokol, der muliggør isolering af hver af disse celletyper, ideel til in vitro-eksperimenter, der involverer celle-cellekommunikation eller krydstale mellem celletyper.

Denne protokol beskriver etableringen af individuelle cellekulturer af primære celler fra et enkelt stykke hud. Denne protokol er især nyttig, når mængden af tilgængeligt væv er begrænset. Desuden giver isolering af alle tre celletyper fra en enkelt donor mulighed for robuste sammenligninger mellem celletyper eller co-kulturforsøg, samtidig med at genetikkens indflydelse mindskes under det ønskede eksperiment.

Protocol

Erhvervelse og anvendelse af afidentificeret humant forhudsvæv til forskningsformål blev gennemgået og modtaget bestemmelsen af “ikke menneskelig forskning” af Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574). BEMÆRK: Ved at følge nedenstående protokol opnås 2,4 x 106 keratinocytter, 4,4 x 106 fibroblaster og 1,1 x 106 SO’er fra en enkelt forhud. Generelt kan disse primære celler anvendes til 3 passager afhængigt af forsøgsbetin…

Representative Results

Normal neonatal forhud blev anvendt til isolering af primære epidermale keratinocytter og dermale SC’er og fibroblaster. De isolerede primære celler blev dyrket i respektive cellekulturmedier indeholdende vækstfaktorer. Efter såning af SC’er og fibroblast i dyrkningskolber klæbede de fleste celler til bunden af kolben inden for 2 timer. I tilfælde af keratinocytter klæbede de fleste keratinocytter med 24 timer. Isolerede epidermale primære keratinocytter nåede 85% sammenløb på dag 7 og udviste karakteristisk c…

Discussion

Denne protokol beskriver en metode til at isolere tre forskellige cellepopulationer fra et enkelt stykke af forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Der er et par isolationsprotokoller til rådighed for at isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortset fra de vigtigste strukturelle celler i hud, keratinocytter og fibroblaster er…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Dr. Fadia Kamal og Dr. Reyad Elbarbary for at give os mulighed for at bruge laboratorieinstrumenter og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. ud over institutionel støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Materials

0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) MilliporeSigma SLGPR33RS
70 µM cell strainers CELLTREAT 229483
100 µM cell strainers CELLTREAT 229485
1 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) BD Luer-Lok BD309646
10 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD305462
1% TritonX-100 Sigma X100-1L Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution ThermoFisher Scientific J19943.K2 Ready to use and store at 4 °C
5% BSA Sigma A7906-100G Prepared at the time of use
70% ethanol Pharmco 111000200
Antibiotic ScienCell Research 503
Chemometec Vial1-Cassette Fisher Scientific NC1420193
Collagenase Gibco 17018-029
Coverslip Fisherbrand 12544D 22*50-1.5
Dispase I Sigma-Aldrich D46693
DMEM basal medium ScienCell Research 9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes Fisherbrand 02-681-5
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10082147
Fibroblast complete medium ScienCell Research 2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) Lonza CC-5022
Human foreskin De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) Lonza 00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody ThermoFisher Scientific 14-9760-82 Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody Abcam ab7800 Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody ThermoFisher Scientific MA5-12969 Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide) Tab-Tek 154526
NucleoCounter -Via1-Cassette Chemometec 941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL) ScienCell Research 32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI Invitrogen P36935
Rabbit K10 antibody Sigma-Aldrich SAB4501656 Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody Millipore AB1554 Dilution (1:500)
Rabbit vimentin ProteinTech 10366-1-AP Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium ScienCell Research 1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 ROTH LH75.1 Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) Codman 54-6500 Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) Razor blade company 94-0120 Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask Corning 353109
Trypsin neutralization buffer (TNS) Lonza CC-5002
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012
Inverted microscope ZEISS Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope ZEISS Primovert For visulaizing/observing cell attachment or detachment

References

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Play Video

Cite This Article
Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin. J. Vis. Exp. (181), e63776, doi:10.3791/63776 (2022).

View Video