Summary
Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt Isolationsmethoden, Kultivierungsbedingungen und Charakterisierung menschlicher Primärzellen mit hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit unter Verwendung einer schnellen enzymatischen Dissoziation der Haut. Primäre Keratinozyten, Fibroblasten und Schwann-Zellen werden alle aus der menschlichen neugeborenen Vorhaut gewonnen, die nach Standardbehandlungen verfügbar ist. Die entfernte Haut wird desinfiziert und das Unterhautfett und der Muskel werden mit einem Skalpell entfernt. Die Methode besteht aus einer enzymatischen und mechanischen Trennung von epidermalen und dermalen Schichten, gefolgt von einer zusätzlichen enzymatischen Verdauung, um Einzelzellsuspensionen aus jeder dieser Hautschichten zu erhalten. Schließlich werden einzelne Zellen in geeigneten Zellkulturmedien nach Standard-Zellkulturprotokollen gezüchtet, um das Wachstum und die Lebensfähigkeit über Wochen aufrechtzuerhalten. Zusammen ermöglicht dieses einfache Protokoll die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung aller drei Zelltypen aus einem einzigen Stück Haut für die In-vitro-Bewertung von Haut-Nerven-Modellen. Darüber hinaus können diese Zellen zusammen in Kokulturen verwendet werden, um ihre Auswirkungen aufeinander und ihre Reaktionen auf In-vitro-Traumata in Form von Kratzern, die roboterhaft in der mit der Wundheilung verbundenen Kultur durchgeführt werden, zu messen.
Introduction
Primärzellen, die aus lebendem Gewebe gewonnen und unter In-vitro-Bedingungen kultiviert werden, ähneln stark dem physiologischen Zustand 1 und sind damit ein ideales Modell für die Untersuchung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse. Die Haut enthält mehrere Zelltypen, darunter Keratinozyten, Fibroblasten, Sebozyten, Melanozyten und Schwann-Zellen (SCs), die für In-vitro-Experimente isoliert und kultiviert werden können. Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Keratinozyten, Fibroblasten und SCs aus einem einzigen Stück Haut wurden nicht beschrieben. Das Ziel dieses Protokolls ist zweifach: 1) eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Isolierung und Kultivierung von dermalen SCs zu etablieren und 2) eine effiziente, robuste Methode zur Isolierung von Keratinozyten, Fibroblasten und SCs aus einer einzigen menschlichen Vorhaut zu verwenden.
Derzeit gibt es etablierte Protokolle zur Isolierung der Hautkeratinozyten 2,3,4 und der Fibroblasten 5,6. Diese Studien beschreiben die Isolierung von Keratinozyten, Fibroblasten oder beiden aus der Haut, aber kein Protokoll befasst sich mit der Etablierung von Kulturen primärer SCs aus der menschlichen Haut. Neuere Studien deuten darauf hin, dass neuronale SCs Keratinozyten- und Fibroblastenzellprozesse modulieren und normale physiologische Hautfunktionen regulieren7. SCs sind daher entscheidend für die Hauthomöostase und tragen wesentlich zur regulierenden Physiologie bei, die das Verhalten benachbarter Hautzelltypen beeinflusst8. Daher ist ein Protokoll, das die Isolierung jedes dieser Zelltypen ermöglicht, ideal für In-vitro-Experimente mit Zell-Zell-Kommunikation oder Cross-Talk zwischen Zelltypen.
Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung einzelner Zellkulturen von Primärzellen aus einem einzigen Stück Haut. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn die Menge an verfügbarem Gewebe begrenzt ist. Darüber hinaus ermöglicht die Isolierung aller drei Zelltypen von einem einzigen Spender robuste Vergleiche zwischen Zelltypen oder Kokulturexperimenten und mildert gleichzeitig den Einfluss der Genetik während des gewünschten Experiments.
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Protocol
Der Erwerb und die Verwendung von de-identifiziertem menschlichem Vorhautgewebe für Forschungszwecke wurde überprüft und vom Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574) als "nicht menschliche Forschung" eingestuft.
HINWEIS: Durch Befolgen des folgenden Protokolls werden 2,4 x 10 6 Keratinozyten, 4,4 x 10 6 Fibroblasten und 1,1 x 106 SCs aus einer einzigen Vorhaut gewonnen. Im Allgemeinen können diese Primärzellen für 3 Passagen verwendet werden, abhängig von den experimentellen Bedingungen.
1. Isolierung von Primärzellen und Kulturbedingungen
- Epidermis- und Dermis-Trennverfahren
- Erwerben Sie neonatale Vorhaut nach Standardbehandlungsverfahren durch einen Arzt gemäß den genehmigten Zulassungsprotokollen des Krankenhauses. Der Arzt bestimmt den Zeitpunkt der Beschneidung nach der Geburt und die Menge der entfernten Haut.
- Legen Sie die ausgeschnittene Vorhaut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 8-10 ml eiskaltes Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Basalmedium enthält, und transportieren Sie die Vorhaut sofort zur Zellkulturisolierung in das Zellkulturlabor. Spülen Sie die Haut zweimal mit 20-25 ml 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), die 1x Antibiotikum / Antimykotikum enthält.
HINWEIS: Für eine maximale Zelllebensfähigkeit sollte die ausgeschnittene Vorhaut bis zur Verarbeitung bei 4 °C platziert und die Zellen innerhalb von 24 h geerntet werden. - Nach dem Spülen in DPBS/Antibiotika die Vorhaut in 25-30 ml eiskaltem DMEM-Basalmedium für 10-15 min in einer 10 cm großen Gewebekulturschale einweichen. Führen Sie alle Verarbeitungsschritte in einer Gewebekulturhaube mit steriler Technik durch.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell die Vorhaut vorsichtig auf und legen Sie die Dermis und das Unterhautfettgewebe frei.
- Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe bei Bedarf mit einer Pinzette, einer Skalpellklinge und einer Schere. Entsorgen Sie das Fettgewebe. Schneiden Sie die gereinigte Vorhaut in drei bis fünf kleinere Stücke.
- Hautstücke in ein steriles konisches Röhrchen mit 16-20 ml Dispase-I/DMEM-Medium (4 mg/ml in DMEM-Basalmedium) überführen.
- Mischen Sie die Hautstücke im konischen Schlauch durch Inversion intermittierend während der ersten 30 Minuten der Inkubation mit Dispase-I. Legen Sie dann die konische Röhre für 16-18 h auf 4 ° C und achten Sie darauf, die Hautstücke in dispase-I / Medien zu tauchen.
HINWEIS: Die Dispase-I-Lösung sollte kurz vor der Zugabe mit kaltem DMEM-Basalmedium hergestellt, mit einem 0,22 μm-Sieb filtriert und bei 4 °C gehalten werden. - Nach der Verdauung über Nacht mit Dispase-I die Hautstücke entfernen und auf eine trockene, sterile Kulturschale legen. Rollen Sie jedes Stück Haut aus, so dass die äußere epidermale Schicht die Kulturschale berührt.
- Verwenden Sie zwei Sätze von Pinzetten, trennen Sie vorsichtig die Epidermis von der Dermis. Beginnen Sie am Rand des Gewebes und schälen Sie die Epidermis von der Dermis weg.
HINWEIS: Wenn die Epidermisschicht schwer von der Dermis zu trennen ist, war die Dispase-I-Verdauung nicht ausreichend. Fehlerbehebungsoptionen: 1) Bringen Sie die Hautstücke in die Dispase-I/DMEM-Lösung zurück und inkubieren Sie für weitere 2-3 h bei 4 °C; 2) Hautstücke in frisches dispase-I/DMEM geben und bei 4 °C für 2-3 h mehr inkubieren. - Verwenden Sie die getrennte Epidermis und Dermis, um Keratinozyten (Epidermis) und Fibroblasten und Schwann-Zellen (Dermis) zu isolieren.
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte für die Isolierung und die Kulturbedingungen für bestimmte Zelltypen aus.
- Keratinozyten-Isolierung aus der Epidermis
- Fügen Sie 5 ml HEPES-Pufferkochsalzlösung (HBS) zu einer 10 cm großen Kulturschale hinzu und fügen Sie die getrennten Epidermisfragmente hinzu. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Nach der HBS-Inkubation sammeln Sie die HBS-Lösung in einem 50 ml konischen Röhrchen. 5 ml Trypsin-Neutralisationspuffer (TNB) (Materialtabelle) in ein 50 ml konisches Rohr geben und beiseite stellen.
- Fügen Sie den epidermalen Fragmenten 3 ml Trypsinlösung hinzu. 10 min bei 37 °C inkubieren.
- Rühren Sie die epidermalen Fragmente vorsichtig mit einer Pinzette auf, bis die Trypsinlösung trüb wird.
- Die Trypsinlösung/Keratinozyten werden dem HBS- und TNB-haltigen Röhrchen in Schritt 1.2.2 zugegeben.
- Für alle verbleibenden epidermalen Fragmente, die sich bei der anfänglichen Trypsin-Verdauung nicht aufgelöst haben, fügen Sie 3 ml 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu. 10 min bei 37 °C inkubieren und die Schritte 1.2.4 und 1.2.5 wiederholen.
- Fügen Sie 2 ml fetales Rinderserum (FBS) zu der Trypsin/EDTA-Lösung hinzu, die HBS- und TNB-Lösungsröhrchen enthält.
- Das Auffangröhrchen mit HBS/TNB/Trypsin und Keratinozyten bei 870 x g zentrifugieren für 5 min bei 4 °C.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml Keratinozyten-Vollwachstumsmedium (Materialtabelle).
- Filtern Sie die Zellsuspension mit einem sterilen 100 μM-Filter in ein steriles konisches 50-ml-Rohr, um Ablagerungen zu entfernen.
- Quantifizieren Sie die Zellzahl und die Zelllebensfähigkeit.
HINWEIS: Hier wurde ein spezielles Zellprobenahme- und Färbegerät (Table of Materials) verwendet, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren. - Samenkulturplatten nach Bedarf für Experimente. Die empfohlene Aussaatdichte beträgt ~45.000 Zellen/cm2.
- Legen Sie die Kulturplatten 2 Tage lang in einen Inkubator bei 37 °C in 5% CO2, damit Keratinozyten an der Schale haften können.
- Nach 2 Tagen aspirieren Sie alle nicht anhaftenden Zellen. Aktualisieren Sie die Zellkulturmedien jeden zweiten Tag, bis die Keratinozyten den gewünschten Zusammenfluss für das Passieren oder nachgelagerte Experimente erreichen (50% -80% Konfluenz).
- Isolierung von Schwann-Zellen (SCs) und Fibroblasten aus der Dermis
- T25-Flaschen mit Poly-L-Lysin (PLL, 0,01 μg/μL) mit 5 ml 1x DPBS vorbeschichten. Stellen Sie die vorbeschichteten Kolben 3 h lang bei 37 °C auf. Waschen Sie die PLL-Beschichtungsmatrix zweimal mit 1x DPBS (5 ml).
HINWEIS: T25-Flaschen können im Voraus vorbereitet werden. - Spülen Sie die isolierten Stücke der Dermis mit 5 ml DMEM-Basalmedium.
- Zerkleinern Sie die Dermis mit einer Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke.
- Die gehackte Dermis wird mit 5 ml Kollagenase (2 mg/ml in DMEM-Basalmedium) bei 37 °C für 2,5 h aufgeschlossen. Tribrieren Sie die gehackte Dermis vorsichtig alle 30 Minuten mit einer Pipettenspitze, bis sich die Dermis vollständig dissoziiert.
- Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 70 μM Zellsieb. Es ist notwendig, mechanische Kraft mit einer 1-ml-Spritze anzuwenden, um die Aufhängung vollständig zu filtern.
- Verdünnen Sie die filtrierte Zellsuspension mit 5 ml vollständigem DMEM-Medium (DMEM-Basalmedium + 5% FBS + 1x Antibiotikum), um die enzymatische Aktivität der Kollagenase zu stoppen.
- Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 870 x g für 5 min bei RT, um die Zellen zu pelletieren.
- Aus diesem Zellpellet werden sowohl Fibroblasten als auch SCs gewonnen. Resuspendiert das Zellpellet in 2 ml DMEM-Vollmedium, um die Zellen (1 ml Zellsuspension/Röhrchen) zu teilen und bei 870 x g für 5 min bei RT zentrifugieren.
- Führen Sie für die SCs-Kultur die Schritte 1.3.10-1.3.17 und für die Fibroblastenkultur die Schritte 1.3.18-1.3.22 aus.
- Ab Schritt 1.3.8 aspirieren Sie den Überstand. Resuspendiert das Zellpellet in 5 ml frischem DMEM-Vollmedium.
- Quantifizieren Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit.
HINWEIS: Hier wurde ein spezielles Zellprobenahme- und Färbegerät (Table of Materials) verwendet, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren. - Säen Sie die vorbeschichteten T25-Kolben mit 5 ml resuspendierten Zellen bei einer Dichte von 4,0 x 103 Zellen / ml. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C in Gegenwart von 5% CO2 über Nacht (~12-16 h Inkubation).
- Nach 16 h die Zelladhäsion durch Mikroskopie (Table of Materials) bei 10-facher Vergrößerung bestätigen.
- Entfernen Sie die nicht adhärenten Zellen und waschen Sie den Kolben 3x mit 5 ml 1x DPBS.
- 5 ml 10 μM Cytosin-Arabinosid (Antimitotikum, tötet Fibroblasten) in DMEM-Vollmedium geben. Der Kolben wird bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 für 24 h inkubiert.
- Aspirieren Sie das Cytosin-Arabinosid-haltige Medium aus dem Kolben. Spülen Sie den Kolben 3x mit 5 ml von 1x DPBS.
- Füllen Sie den Kulturkolben mit 5 ml vollständigem Nährmedium (Table of Materials) und inkubieren Sie bei 37 °C in Gegenwart von 5% CO2 für 48 h. Aktualisieren Sie das komplette SC-Kulturmedium jeden zweiten Tag, bis die SCs einen Zusammenfluss von 80% erreichen.
- Aspirieren Sie den Überstand aus der dissoziierten Hautschicht (Schritt 1.3.8) und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 5 ml Fibroblasten-Vollmedium (Fibroblasten-Basalmedium + 5% FBS + 1x Antibiotikum).
- Quantifizieren Sie die Zellanzahl und die Zelllebensfähigkeit.
HINWEIS: Hier wurde ein spezielles Zellprobenahme- und Färbegerät (Table of Materials) verwendet, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren. - Die Fibroblasten werden mit einer Zelldichte von 4,0 x 103 Zellen/ml in T25-Kulturflaschen (nicht vorbeschichtet) mit 5 ml Fibroblasten-Vollmedium beschichtet. Inkubation bei 37 °C in Gegenwart von 5% CO2 über Nacht (~12-16 h Inkubation).
- Nach 16-24 h die Zelladhäsion durch Mikroskopie (Table of Materials) bei 10-facher Vergrößerung bestätigen. Saugen Sie nicht adhärente Zellen aus dem Kolben und waschen Sie den Kolben zweimal mit 5 ml 1x DPBS.
- 5 ml frisches Fibroblasten-Vollmedium zugeben und bei 37 °C in Gegenwart von 5% CO2 für 48 h inkubieren. Erfrischen Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag, bis die Fibroblasten den gewünschten Zusammenfluss für Passaging- oder Downstream-Assays erreichen (50%-80% Konfluenz).
- T25-Flaschen mit Poly-L-Lysin (PLL, 0,01 μg/μL) mit 5 ml 1x DPBS vorbeschichten. Stellen Sie die vorbeschichteten Kolben 3 h lang bei 37 °C auf. Waschen Sie die PLL-Beschichtungsmatrix zweimal mit 1x DPBS (5 ml).
2. Nachweis von epidermalen Keratinozyten, dermalen SCs und Fibroblastenproteinmarkern durch Immunfluoreszenz
- Tag 1 - Deckelkammer-Glasobjektträger und Ablösezellen
- Beschichten Sie 4-Well-Kammer-Glasobjektträger mit Kollagen-I für Keratinozyten oder PLL für SCs oder nur 1x DPBS für Fibroblasten (0,5 ml pro Well). Stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Oberfläche beschichten. Inkubationskammerobjektträger bei 37 °C für 2 h. Bereiten Sie während der Inkubation die Zellen vor.
- Nachdem die kultivierten Zellen einen Zusammenfluss von 50% -80% erreicht haben, waschen Sie die Kolben mit 1x DPBS 3x (1 ml für jede Vertiefung).
- Lösen Sie die anhaftenden Zellen mit 5 ml 0,25%iger Trypsin-EDTA (TE)-Lösung, indem Sie bei 37 °C in Gegenwart von 5% CO 2 für 2 min inkubieren, bis die Zellen anfangen, rund zu werden. Visualisieren Sie die Zellablösung mit Mikroskopie (Table of Materials) bei 10-facher Vergrößerung.
- Nach der Inkubation werden TE-Lösung, die Zellen enthält, in einen konischen Schlauch mit 5 ml fetalem Rinderserum (FBS) übertragen.
- 5 ml Trypsin-Neutralisationspuffer (TNB) in den Kulturkolben geben und dann den Inhalt in das oben genannte Zentrifugenröhrchen (Zellen mit TE und FBS) überführen. Visualisieren Sie die Zellablösung mit Mikroskopie (Table of Materials) bei 10-facher Vergrößerung.
HINWEIS: TNB oder FBS oder beides kann verwendet werden, um die Trypsin-Aktivität zu neutralisieren. - Zentrifen Sie das konische Röhrchen mit Zellen/TE/TNB bei 870 x g für 5 min. Übertragen Sie den Überstand auf ein anderes Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet im entsprechenden vollständigen Kulturmedium. Messen Sie die Zelllebensfähigkeit, wie in Schritt 1.2.11 erwähnt.
- Spülen Sie die vorbeschichteten Kammerglasobjektträger (Schritt 2.1.1) mit 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) 3x ab.
- Halbtrocknen Sie die Objektträger in der Gewebekulturhaube und Samenkeratinozyten, SCs oder Fibroblasten bei einer geeigneten Dichte (30.000 Zellen / 0,5 ml / Kammer) in einem geeigneten vollständigen Zellkulturmedium.
- Inkubieren Sie die Kammergleiter bei 37 °C über Nacht, damit die Zellen haften können.
- Tag 2- Blockieren des Kammerglasobjektträgers mit Rinderserumalbumin (BSA) und primärer Antikörperinkubation
- Die Zellmedien aus den Kammerschienen absaugen und 3x mit 1 ml 1x DPBS waschen.
- Fixieren Sie die anhaftenden Zellen mit 4% Paraformaldehyd in 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) und inkubieren Sie für 15 min bei RT in der Gewebekulturhaube.
- 4% Paraformaldehyd aus den Kammerobjektträgern absaugen und die Kammerobjektträger 3x mit 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) waschen.
- Permeabilisieren Sie die Zellmembranen mit 1% TritonX-100 in 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) und inkubieren Sie für 15 min bei RT.
- Saugen Sie die Blockierlösung aus den Kammerschienen ab, waschen Sie 3x mit 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) für 30 s und saugen Sie dann 1x DPBS aus dem Brunnen ab.
- Blockieren Sie die Kammerschienen mit 5% BSA (0,5 ml für jedes Well) und inkubieren Sie für 45 min bei RT.
- Die Sperrlösung aus den Kammerschienen absaugen, 3x mit 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) für jeweils 30 s waschen und dann 1x DPBS aus dem Brunnen abpumpen.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper mit 5% BSA (0,2 ml für jede Vertiefung) (Verdünnung der primären Antikörper: Keratinozyten: Maus-Cytokeratin-14-Antikörper (1:100) und Cytokeratin-10-Antikörper (1:100); Schwann-Zellen: Maus-S100-Antikörper (1:200) und Kaninchen-Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor (p75-NTR) Antikörper (1:500); Fibroblasten: Kaninchen-Vimentin-Antikörper (1:200) und Maus-Alpha-Glattmuskel-Aktin-Antikörper (α-SMA) (1:200)).
- Die primären Antikörper zu den entsprechenden Zellen auf dem Kammerglasobjektträger geben und für ca. 15-16 h (über Nacht) bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
- Die primären Antikörper aus den Kammerobjektträgern absaugen, 3 mal mit 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) für jeweils 30 s waschen und dann 1x DPBS aus dem Bohrloch absaugen.
- Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (Goat anti-rabbit IgG Secondary antibody-Alexa Fluor 488 (1:500) und Goat anti-Mouse IgG Secondary antibody-Alexa Fluor 594 (1:500)) mit 0,5% BSA. Fügen Sie jedem Bohrloch einen geeigneten sekundären Antikörper hinzu (0,2 ml für jedes Bohrloch). Inkubiere für 45 min bei RT.
- Saugen Sie den sekundären Antikörper aus Kammerobjektträgern ab, waschen Sie 3x mit 1x DPBS (1 ml für jede Vertiefung) für jeweils 30 s und saugen Sie dann 1x DBPS aus dem Bohrloch ab.
- Entfernen Sie die Dichtung auf dem 4-Well-Kammerobjektträger mit einem Dichtungsentferner. Versuchen Sie, keinen Klebstoff auf dem Objektträger zu belassen, da dies das Auftragen von Deckgläsern beeinträchtigt. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu. Alternativ können Sie die Vertiefungen mit DAPI gegenfärben und ein nicht etikettenhaltiges Montagemedium verwenden.
- Legen Sie das Deckglas vorsichtig auf den Glasschieber, indem Sie Luftblasen vermeiden und das Ende des Deckglases mit Klebstoff versiegeln. Beobachten Sie Immunfluoreszenz-Färbemuster durch Mikroskopie (Tabelle der Materialien) bei 10-facher und/oder 20-facher Vergrößerung.
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Representative Results
Normale neonatale Vorhaut wurde zur Isolierung von primären epidermalen Keratinozyten und dermalen SCs und Fibroblasten verwendet. Die isolierten Primärzellen wurden in entsprechenden Zellkulturmedien kultiviert, die Wachstumsfaktoren enthielten. Nach der Aussaat von SCs und Fibroblasten in Kulturflaschen haften die meisten Zellen innerhalb von 2 Stunden am Boden des Kolbens. Im Falle von Keratinozyten haften die meisten Keratinozyten bei 24 h. Isolierte epidermale primäre Keratinozyten erreichten am Tag 7 einen Zusammenfluss von 85% und zeigten eine charakteristische Zellmorphologie (Kopfsteinpflasterform) (Abbildung 1A). Die SCs erreichten bis Tag 5 einen Zusammenfluss von 95% und schienen bipolar oder tripolar geformt zu sein (Abbildung 1B). Fibroblastenkulturen erreichten am Tag 4 einen Zusammenfluss von 95% und die meisten Zellen zeigten eine Spindelformmorphologie (Abbildung 1C). Die zelltypspezifische Proteinexpression wurde in diesen Kulturen durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Keratinozyten waren positiv für K10 (Differenzierungsmarker) und K14 (Proliferationsmarker) Proteine (Abbildung 2A); In ähnlicher Weise waren SCs positiv für S100 und p75-NTR (Abbildung 2C). Fibroblasten exprimierten positiv Vimentin, exprimierten aber nicht den Myofibroblastenmarker, Alpha-glattes Muskelaktin (α-SMA) (Abbildung 2E).
Die zusammengeführten Bilder der Keratin-Immunfluoreszenz und der DAPI-Kernfärbung (Abbildung 2A) zeigten, dass 97,8% der Zellen in den Kulturen Keratinozyten waren (Abbildung 2B). Doppelte S100- und p75-NTR-positive Schwann-Zellen deuten auf eine Reinheit von 95,2% SCs in Kultur nach dem Protokoll hin (Abbildung 2C,D). In ähnlicher Weise exprimierten 97,2% der Zellen in Fibroblastenkulturen Vimentin positiv (Abbildung 2E, F). So findet sich die charakteristische Proteinexpression in den jeweiligen Zelltypen, und das Protokoll ermöglicht die Isolierung von relativ reinen Zellpopulationen.
Abbildung 1: Isolierung von primären Keratinozyten, Schwann-Zellen und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut. (A) Keratinozyten, (B) Schwann-Zellen und (C) Fibroblasten unter Phasenkontrastmikroskop; Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Charakterisierung von primären Keratinozyten, Schwann-Zellen und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut. (A) Keratinozyten wurden unter Verwendung von Keratin 14 (K14, proliferative Keratinozyten) und K10 (Keratin 10, Keratinozyten-Differenzierungsmarker) identifiziert; Maßstab bar = 100 μm. (B) Statistische Analyse der Reinheit kultivierten Keratinozyten unter Verwendung von Immunfluoreszenzen doppelt gefärbten Zellen. (C) Schwann-Zellen wurden unter Verwendung von S100 und p75-NTR (Nervenwachstumsfaktorrezeptor) identifiziert; Maßstabsstab = 100 μm. (D) Statistische Analyse der Reinheit von kultivierten SCs unter Verwendung von Immunfluoreszenzen doppelt gefärbten Zellen. (E) Fibroblasten wurden unter Verwendung von Vimentin (Fibroblast) und α-glattem Muskelaktin (Fibroblastendifferenzierung, Myofibroblasten) identifiziert. Skalenstab = 100 μm. (F) Statistische Analyse der Reinheit kultivierter Fibroblasten unter Verwendung von Immunfluoreszenzen Vimentin gefärbten Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um drei verschiedene Zellpopulationen aus einem einzigen Stück der Vorhaut zu isolieren, nämlich Keratinozyten, Fibroblasten und Schwann-Zellen. Es gibt einige Isolationsprotokolle, um Keratinozyten und Fibroblasten 2,3,5,6 zu isolieren, aber keines beschreibt die SC-Isolierung. Abgesehen von den wichtigsten Strukturzellen in Haut, Keratinozyten und Fibroblasten wird die Haut auch stark von sensorisch afferenten Strukturen und autonomen Efferenten innerviert. Sensorische Afferenten spielen eine bedeutende Rolle bei der Übertragung von leichten Berührungen, Vibrationen, Schmerzen, Juckreiz sowie heißen und kalten Empfindungen. Autonome Efferents innervieren Schweißdrüsen und Arrector-Pili-Muskeln9. Jedes Nervenaxon wird von einem SC, den Gliazellen des peripheren Nervensystems, umhüllt. Forschung und klinisches Interesse an SCs haben erheblich zugenommen, da SCs die axonale Regeneration unterstützen10,11. Hautnerven sind wichtige Regulatoren der Hautphysiologie und Krankheitspathologie durch Kommunikationssignale (Neuromodulatoren / Neuromediatoren) zu nicht-neuralen Zellen12,13,14.
Trotz der weiten Verteilung von Nerven-SCs in der Haut gibt es nur begrenzte Informationen über die spezifische Rolle von SCs in der Hautphysiologie. Wie interagieren SCs in der Haut mit anderen nicht-neuronalen Zellen in der Haut? Die Beantwortung dieser Frage wurde durch den Mangel an zuverlässigen In-vitro-Zellkulturmodellen behindert. Mit diesem Protokoll kann die Analyse jeder einzelnen Zelle und ihrer Interaktionen mit Zellen aus demselben Gewebe genau die charakteristischen Merkmale der Rolle von Schwann-Zellen in der Hauthomöostase und Pathophysiologie aufdecken.
Einer der Hauptvorteile dieses Protokolls ist ein einfaches, kostengünstiges experimentelles Verfahren zum Nachweis von drei Primärzellen (SCs, Keratinozyten und Fibroblasten) aus einer einzigen menschlichen Vorhaut. Es hat auch den Vorteil, dass alle drei Zelltypen aus demselben Gewebe isoliert werden, wodurch genetische Unterschiede bei Zellvergleichen gemildert und Zellisolationen optimiert werden, wenn Gewebe nur begrenzt verfügbar ist. Dieses Protokoll dauert 2 Tage und vereinfacht das Isolationsverfahren für drei Primärzellen aus Hautgewebe und Kultivierungsbedingungen. Dieses Protokoll liefert zuverlässig eine hohe Anzahl lebensfähiger Zellen, und die ersten Passagen dieser Zellen erreichten 4-7 Tage nach der ersten Beschichtung ~ 90% Konfluenz. Wir haben Keratinozyten für mindestens 3 Passagen (~ 21 Tage) verwendet und Fibroblasten- und Schwann-Zellen können für 5-6 Passagen (~ 40 Tage in Kultur) verwendet werden.
Dieses Protokoll ist nicht ohne technische Herausforderungen. Eine ausreichende Entfernung des darunter liegenden Fettgewebes und eine effiziente epidermale / dermale Trennung vor der enzymatischen Verdauung sind der Schlüssel, um relativ reine Zellpopulationen aus jeder Hautschicht zu erhalten. Dermale SCs sind aufgrund ihrer relativ geringen Prävalenz in der Haut im Vergleich zu den zahlreicheren Fibroblasten schwieriger von der Haut zu isolieren. Jede Verschleppung von Fibroblasten in SC-Kulturen wird schnell über SCs15 hinauswachsen. Um die SC-Adhärenz zu verbessern, haben wir uns für die Vorbeschichtung von Gewebekulturgeschirr mit PLL entschieden, da dies die Haftung von SCs16 erhöht. Um die Fibroblastenkontamination weiter zu mildern, wurde Cytosin-Arabinosid (Antimitotikum) hinzugefügt, nachdem Zellen für kurze Zeit haftet hatten, um die sich schnell teilenden Fibroblasten aus SC-Kulturen zu entfernen. Eine längere Exposition gegenüber Cytosin-Arabinosid kann jedoch auch schädlich für SCs sein.
Die Anwendung des oben beschriebenen Protokolls ermöglicht es, einzelne Haut-SCs, Keratinozyten und Fibroblastenkulturen für In-vitro-Experimente zu isolieren. Diese unterschiedlichen Zellpopulationen können verwendet werden, um SCs, Keratinozyten und Fibroblasten einzeln oder in Kombination während normaler Hautphysiologie, Wundheilung oder unter Bedingungen, die eine Krankheitseinstellung nachahmen, zu untersuchen.
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Disclosures
Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir möchten uns bei Dr. Fadia Kamal und Dr. Reyad Elbarbary dafür bedanken, dass sie uns den Einsatz von Laborinstrumenten und technischem Support ermöglicht haben. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH (K08 AR060164-01A) und des DOD (W81XWH-16-1-0725) an J. C. E. sowie durch institutionelle Unterstützung des Pennsylvania State University Hershey Medical Center unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
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- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
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