Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63776
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

המחקר של ריפוי פצעים הקשורים לפגיעה בשרירים-שלד דורש לעתים קרובות הערכה של אינטראקציות במבחנה בין תאי שוואן (SCs), קרטינוציטים ופיברובלסטים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, התרבות והאפיון של תאים ראשוניים אלה מהעורלה האנושית.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטות בידוד, תנאי גידול ואפיון של תאים ראשוניים אנושיים בעלי תפוקה גבוהה וכדאיות באמצעות דיסוציאציה אנזימטית מהירה של העור. קרטינוציטים ראשוניים, פיברובלסטים ותאי שוואן נקטפים כולם מעורלת היילוד האנושית, הזמינה בהתאם להליכי הטיפול הסטנדרטיים. העור שהוסר מחוטא, והשומן והשרירים התת עוריים מוסרים באמצעות אזמל. השיטה מורכבת מהפרדה אנזימטית ומכנית של שכבות אפידרמיס ודרמליות, ואחריה עיכול אנזימטי נוסף לקבלת תרחיפים חד-תאיים מכל אחת משכבות העור הללו. לבסוף, תאים בודדים גדלים במדיה מתאימה של תרביות תאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים של תרביות תאים כדי לשמור על גדילה וכדאיות במשך שבועות. יחד, פרוטוקול פשוט זה מאפשר בידוד, התרבות ואפיון של כל שלושת סוגי התאים מפיסת עור אחת לצורך הערכה חוץ גופית של מודלים של עור-עצבים. בנוסף, ניתן להשתמש בתאים אלה יחד בתרביות משותפות כדי לאמוד את השפעתם זה על זה ואת תגובותיהם לטראומה במבחנה בצורה של שריטות המבוצעות באופן רובוטי בתרבית הקשורה לריפוי פצעים.

Introduction

תאים ראשוניים שמקורם ברקמות חיות ובתרבית בתנאי מבחנה דומים מאוד למצב הפיזיולוגי1, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. העור מכיל סוגי תאים מרובים, כולל קרטינוציטים, פיברובלסטים, סבוציטים, מלנוציטים ותאי שוואן (SCs), אותם ניתן לבודד ולתרבת אותם לניסויים במבחנה . שיטות לבידוד ותרבית קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs, מפיסת עור אחת, לא תוארו. מטרתו של פרוטוקול זה היא כפולה: 1) לבסס שיטה אמינה וניתנת לשחזור לבידוד וגידול של מעגלים עוריים ו-2) להשתמש בשיטה יעילה וחזקה לבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים ו-SCs מעורלה אנושית אחת.

כיום, ישנם פרוטוקולים מבוססים לבידוד קרטינוציטים בעור 2,3,4 ופיברובלסטים 5,6. מחקרים אלה מתארים את הבידוד של קרטינוציטים, פיברובלסטים או שניהם מהעור, אך אין פרוטוקול המתייחס לאופן שבו ניתן ליצור תרביות של SCs ראשוניים מעור האדם. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-SCs עצביים מווסתים תהליכים תאיים של קרטינוציטים ופיברובלסטים ומווסתים תפקודים פיזיולוגיים תקינים בעור7. לפיכך, SCs הם קריטיים להומאוסטזיס של העור ותורמים באופן משמעותי לפיזיולוגיה של הוויסות המשפיעה על התנהגותם של סוגי תאי עור שכנים הנמצאים8. לכן, פרוטוקול המאפשר בידוד של כל אחד מסוגי התאים הללו הוא אידיאלי לניסויים במבחנה הכוללים תקשורת בין תאים לתאים או לשיחה צולבת בין סוגי תאים.

פרוטוקול זה מתאר את הקמתן של תרביות תאים בודדות של תאים ראשוניים מפיסת עור אחת. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כאשר כמות הרקמה הזמינה מוגבלת. יתר על כן, בידוד של כל שלושת סוגי התאים מתורם יחיד מאפשר השוואות חזקות בין סוגי תאים או ניסויים בתרבית משותפת תוך הפחתת השפעת הגנטיקה במהלך הניסוי הרצוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רכישה ושימוש ברקמת עורלה אנושית לא מזוהה למטרות מחקר נבדקה וקיבלה את הקביעה של "מחקר לא אנושי" על ידי מועצת הביקורת המוסדית של המכללה לרפואה של פן סטייט (IRB #17574).

הערה: על ידי ביצוע הפרוטוקול שלהלן, 2.4 x 106 קרטינוציטים, 4.4 x 106 פיברובלסטים ו 1.1 x 106 SCs מתקבלים מעורלה אחת. באופן כללי, תאים ראשוניים אלה יכולים לשמש עבור 3 מעברים, בהתאם לתנאי הניסוי.

1. בידוד של תאים ראשוניים ותנאי תרבית

  1. הליך ההפרדה של אפידרמיס ודרמיס
    1. לרכוש עורלה יילודית בעקבות נהלי טיפול סטנדרטיים על ידי רופא תחת פרוטוקולים רגולטוריים מאושרים של בית החולים. הרופא קובע את עיתוי ברית המילה לאחר הלידה ואת כמות העור שהוסרה.
    2. מניחים את העורלה הנכרתת בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 8-10 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו קר כקרח, ומיד מעבירים את העורלה למעבדת תרביות התאים לבידוד תאים. שטפו את העור פעמיים עם 20-25 מ"ל של 1x Dulbecco's מלח בחסימת פוספט (DPBS) המכיל 1x אנטיביוטיקה/אנטימיקוטי.
      הערה: עבור הכדאיות המרבית של התא, העורלה שנכרתה צריכה להיות ממוקמת על 4 °C (66 °F) עד לעיבוד, ויש לקצור תאים תוך 24 שעות.
    3. לאחר שטיפה ב-DPBS/אנטיביוטיקה, משרים את העורלה ב-25-30 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM קר כקרח למשך 10-15 דקות בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ. בצע את כל שלבי העיבוד במכסה המנוע של תרבית רקמה בטכניקה סטרילית.
    4. באמצעות אזמל, פורסים בזהירות את העורלה פתוחה וחושפים את הדרמיס ואת רקמת השומן התת עורית.
    5. הסר את רקמת השומן התת עורית באמצעות מלקחיים, להב אזמל ומספריים, לפי הצורך. להשליך את רקמת השומן. חותכים את העורלה המנוקה לשלוש עד חמש חתיכות קטנות יותר.
    6. מעבירים את חתיכות העור לצינור חרוטי סטרילי המכיל 16-20 מ"ל של מדיום Dispase-I/DMEM (4 מ"ג/מ"ל במדיום הבסיסי DMEM).
    7. מערבבים את חתיכות העור בצינור החרוטי על ידי היפוך, לסירוגין, במהלך 30 הדקות הראשונות של הדגירה עם dispase-I. לאחר מכן הניחו את הצינור החרוטי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות, תוך שימת לב לטבילת חתיכות העור ב-dispase-I/media.
      הערה: יש להכין את תמיסת Dispase-I ממש לפני התוספת באמצעות מדיום בסיסי DMEM קר, מסונן עם מסננת 0.22 מיקרומטר, ונשמרת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    8. לאחר עיכול לילה עם dispase-I, להסיר את חתיכות העור ולהניח אותם על צלחת יבשה, סטרילית, תרבית. שחררו כל פיסת עור כך ששכבת האפידרמיס החיצונית תיגע בצלחת התרבות.
    9. באמצעות שתי קבוצות של מלקחיים, מפרידים בזהירות את האפידרמיס מהדרמיס. מתחילים בקצה הרקמה ומקלפים את האפידרמיס הרחק מהדרמיס.
      הערה: אם קשה להפריד את שכבת האפידרמיס מהדרמיס, העיכול של dispase-I לא היה מספיק. אפשרויות לפתרון בעיות: 1) להחזיר חתיכות עור לתמיסת dispase-I/DMEM ולדגום למשך 2-3 שעות נוספות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס; 2) מניחים את פיסות העור בדיסקפוזה טרייה-I/DMEM ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות נוספות.
    10. השתמשו באפידרמיס ובדרמיס המופרדים כדי לבודד קרטינוציטים (אפידרמיס) ופיברובלסטים ותאי שוואן (דרמיס).
      הערה: בצע את השלבים הבאים עבור סוגי תאים ספציפיים בתנאי בידוד ותרבית.
  2. בידוד קרטינוציטים מהאפידרמיס
    1. הוסיפו 5 מ"ל של מלח חיץ HEPES (HBS) לתבשיל תרבית של 10 ס"מ והוסיפו את שברי האפידרמיס המופרדים. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
    2. לאחר הדגירה של HBS, אספו את תמיסת ה-HBS בצינור חרוטי של 50 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר נטרול טריפסין (TNB) (טבלת חומרים) בצינור חרוטי של 50 מ"ל והניח בצד.
    3. הוסף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין לשברי האפידרמיס. דגירה ב 37 °C (84 °F) למשך 10 דקות.
    4. עצבו בעדינות את שברי האפידרמיס באמצעות מלקחיים עד שתמיסת הטריפסין הופכת עכורה.
    5. הוסיפו את תמיסת הטריפסין/קרטינוציטים לצינור המכיל HBS ו-TNB בשלב 1.2.2.
    6. עבור כל שברי האפידרמיס הנותרים שלא התמוססו בעיכול הטריפסין הראשוני, הוסיפו 3 מ"ל של 0.25% טריפסין/חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA). דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחוזרת על שלבים 1.2.4 ו-1.2.5.
    7. הוסיפו 2 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) לתמיסת טריפסין/EDTA המכילה צינורות תמיסת HBS ו-TNB.
    8. צנטריפוגה צינור האיסוף המכיל HBS / TNB / טריפסין וקרטינוציטים ב 870 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    9. לשאוף את הסופרנטנט ולהחזיר את גלולת התא ב 3 מ"ל של קרטינוציטים להשלים את מדיום הגדילה (טבלת החומרים).
    10. סנן את תרחיף התא עם מסנן סטרילי של 100 μM לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל כדי להסיר פסולת.
    11. לכמת את מספר התא ואת הכדאיות של התא.
      הערה: כאן, מכשיר מיוחד לדגימת תאים וצביעתם (טבלת חומרים) שימש לכימות מספר התא והכדאיות בהתאם להוראות היצרן.
    12. צלחות תרבית זרעים לפי הצורך לניסויים. צפיפות הזריעה המומלצת היא ~ 45,000 תאים / ס"מ2.
    13. הניחו את צלחות התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך יומיים כדי לאפשר לקרטינוציטים להיצמד למנה.
    14. לאחר יומיים, שאפו את כל התאים שאינם דבקים. רענן את המדיה של תרביות התאים כל יומיים עד שהקרטינוציטים יגיעו למפגש הרצוי לניסויים חולפים או במורד הזרם (50%-80% מפגש).
  3. בידוד של תאי שוואן (SCs) ופיברובלסטים מהדרמיס
    1. צלוחיות T25 טרום-ציפוי עם פולי-L-ליזין (PLL, 0.01 מיקרוגרם/מיקרול) באמצעות 5 מ"ל של 1x DPBS. הניחו את הצלוחיות המצופים מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. שטפו את מטריצת ציפוי ה-PLL פעמיים באמצעות 1x DPBS (5 מ"ל).
      הערה: ניתן להכין צלוחיות T25 מראש.
    2. יש לשטוף את החלקים המבודדים של הדרמיס ב-5 מ"ל של מדיום בסיסי DMEM.
    3. לטחון את הדרמיס לחתיכות קטנות עם מספריים או אזמל.
    4. מעכלים את הדרמיס הטחון עם 5 מ"ל של קולגןאז (2 מ"ג/מ"ל במדיום הבסיסי של DMEM) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות. מקצצים בעדינות את הדרמיס הטחון עם קצה פיפטה כל 30 דקות עד שהדרמיס מתנתק לחלוטין.
    5. סנן את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. יש צורך להפעיל כוח מכני באמצעות מזרק 1 מ"ל כדי לסנן באופן מלא את המתלים.
    6. יש לדלל את תרחיף התא המסונן ב-5 מ"ל של מדיום DMEM שלם (מדיום בסיסי DMEM + 5% FBS + פי 1 של אנטיביוטיקה) כדי לעצור את הפעילות האנזימטית של קולגן.
    7. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-870 x g למשך 5 דקות ב-RT כדי להדוף את התאים.
    8. מכדור תא זה יתקבלו גם פיברובלסטים וגם SCs. בצעו החייאה של גלולת התא ב-2 מ"ל של מדיום מלא של DMEM כדי לחלק את התאים (1 mL cell suspension/tube) ואת הצנטריפוגה ב-870 x g למשך 5 דקות ב-RT.
    9. עבור תרבית SCs, בצע את השלבים 1.3.10-1.3.17 ועבור תרבית פיברובלסטים, בצע את השלבים 1.3.18-1.3.22.
    10. משלב 1.3.8, שאפו לסופרנאטנט. בצעו מחדש את גלולת התא ב-5 מ"ל של מדיום DMEM מלא טרי.
    11. לכמת את מספר התא ואת הכדאיות.
      הערה: כאן, מכשיר מיוחד לדגימת תאים וצביעתם (טבלת חומרים) שימש לכימות מספר התא והכדאיות בהתאם להוראות היצרן.
    12. זרעו את צלוחיות T25 המצופים מראש עם 5 מ"ל של תאים שעברו החייאה בצפיפות של 4.0 x 103 תאים/מ"ל. דגירה של הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2 למשך הלילה (כ-12-16 שעות דגירה).
    13. לאחר 16 שעות, אשרו את הידבקות התאים על ידי מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10.
    14. הסר את התאים שאינם דבקים ושטף את הבקבוקון 3x עם 5 מ"ל של 1x DPBS.
    15. הוסף 5 מ"ל של 10 μM ציטוזין ארבינוזיד (חומר אנטי-מיטוטי, הורג פיברובלסטים) במדיום מלא של DMEM. דגירה של הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2 למשך 24 שעות.
    16. לשאוף את הציטוזין ארבינוזיד המכיל מדיום מהבקבוקון. יש לשטוף את הבקבוקון 3x עם 5 מ"ל של 1x DPBS.
    17. מלאו מחדש את בקבוקון התרבית ב-5 מ"ל של מדיום תרבית מלאה של SCs (טבלת חומרים) ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2 למשך 48 שעות. רענן את מדיום התרבות המלאה של SC כל יומיים עד ש-SCs יגיעו ל-80% מפגש.
    18. שאפו את הסופרנטנט משכבת העור המנותקת (שלב 1.3.8) והחזירו את גלולת התא עם 5 מ"ל של מדיום פיברובלסט שלם (מדיום בסיסי פיברובלסט + 5% FBS + 1x אנטיביוטיקה).
    19. לכמת את מספר התא ואת הכדאיות של התא.
      הערה: כאן, מכשיר מיוחד לדגימת תאים וצביעתם (טבלת חומרים) שימש לכימות מספר התא והכדאיות בהתאם להוראות היצרן.
    20. צלחת את הפיברובלסטים בצפיפות תאים של 4.0 x 103 תאים/מ"ל בבקבוקי תרבית T25 (לא מצופים מראש) באמצעות 5 מ"ל של מדיום מלא פיברובלסט. דגירה ב 37 °C בנוכחות 5% CO2 לילה (~ 12-16 שעות דגירה).
    21. לאחר 16-24 שעות, אשרו את הידבקות התאים על ידי מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10. לשאוף לתאים שאינם דבקים מהבקבוקון ולשטוף את הבקבוקון פעמיים עם 5 מ"ל של 1x DPBS.
    22. הוסף 5 מ"ל של פיברובלסט טרי מלא בינוני ודגירה ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2 במשך 48 שעות. רענן את מדיום התרבית אחת ליומיים עד שהפיברובלסטים יגיעו למפגש הרצוי לבדיקות עוברות או במורד הזרם (50%-80% מפגש).

2. אימות של קרטינוציטים אפידרמליים, SCs עוריים וסמן חלבון פיברובלסטים על ידי אימונופלואורסצנציה

  1. יום 1- ציפוי שקופיות זכוכית של תא ותאי ניתוק
    1. ציפוי קדם-ציפוי של 4 שקופיות זכוכית עם קולגן-I לקרטינוציטים, או PLL עבור SCs או, רק 1x DPBS עבור פיברובלסטים (0.5 מ"ל כל באר). הקפידו לצפות את כל המשטח. תא הדגירה מחליק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. במהלך הדגירה, להכין את התאים.
    2. לאחר שהתאים בתרבית מגיעים למפגש של 50%-80%, שטפו את הצלוחיות עם 1x DPBS 3x (1 מ"ל לכל באר).
    3. נתקו את התאים המודבקים עם 5 מ"ל של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA (TE) על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO2 למשך 2 דקות, עד שהתאים מתחילים להיות עגולים. דמיינו את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10.
    4. לאחר הדגירה, העבירו תמיסת TE המכילה תאים לצינור חרוטי עם סרום בקר עוברי של 5 מ"ל (FBS).
    5. הוסף 5 מ"ל של מאגר נטרול טריפסין (TNB) לבקבוק התרבית ולאחר מכן העבר את התוכן לצינור הצנטריפוגה הנ"ל (תאים עם TE ו- FBS). דמיינו את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10.
      הערה: ניתן להשתמש ב- TNB או ב- FBS או בשניהם כדי לנטרל את פעילות הטריפסין.
    6. צנטריפוגה הצינור החרוטי המכיל תאים / TE / TNB ב 870 x g במשך 5 דקות. מעבירים את ה-supernatant לצינור אחר ומחזירים את גלולת התא בתווך התרבית השלם המתאים. מדוד את הכדאיות של התא כאמור בשלב 1.2.11.
    7. שטפו את שקופיות הזכוכית הקאמריות המצופים מראש (שלב 2.1.1) עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) 3x.
    8. יבשו למחצה את המגלשות בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה וזרעים של קרטינוציטים, SCs או פיברובלסטים בצפיפות מתאימה (30,000 תאים/0.5 מ"ל/תא) במדיום תרבית תאים שלם מתאים.
    9. דגירה של שקופיות החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לתאים להידבק.
  2. יום 2- חסימת מגלשת הזכוכית הקאמרית עם אלבומין בסרום בקר (BSA) ודגירה של נוגדנים ראשוניים
    1. שאפו את המדיה התאית מהתא מחליק ושטפו 3x עם 1 מ"ל של 1x DPBS.
    2. קבעו את התאים הדביקים עם 4% פרפורמלדהיד ב-1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) ודגרו במשך 15 דקות ב-RT בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה.
    3. יש לשאוף ל-4% פרפורמלדהיד משקופיות התא ולשטוף את שקופיות התא 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר).
    4. חלחלו את קרומי התאים עם 1% TritonX-100 ב-1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) ודגרו במשך 15 דקות ב-RT.
    5. שאפו את תמיסת החסימה משקופיות התא, שטפו 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות ואז שאפו 1x DPBS מהבאר.
    6. חסום את שקופיות התא עם 5% BSA (0.5 מ"ל לכל באר) ודגירה למשך 45 דקות ב- RT.
    7. שאפו את תמיסת החסימה משקופיות התא, שטפו 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות כל אחת ואז שאפו 1x DPBS מהבאר.
    8. דילול הנוגדנים העיקריים עם 5% BSA (0.2 מ"ל לכל באר) (דילול נוגדנים ראשוניים: קרטינוציטים: עכבר ציטוקראטין 14 נוגדן (1:100) ונוגדן ציטוקראטין 10 (1:100); תאי שוואן: נוגדן עכבר S100 (1:200), ונוגדן קולטן גורם גדילה עצבי ארנב (p75-NTR) (1:500); פיברובלסטים: נוגדן וימנטין ארנב (1:200), ונוגדן אקטין שרירי אלפא-חלק של עכבר (α-SMA) (1:200)).
    9. מוסיפים את הנוגדנים העיקריים לתאים המתאימים על מגלשת הזכוכית של החדר ודגירה במשך כ-15-16 שעות (לילה) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח.
    10. שאפו את הנוגדנים העיקריים מהחלקות התאיות, שטפו 3 פעמים עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות כל אחד ואז שאפו 1x DPBS מהבאר.
    11. דיללו את הנוגדנים המשניים (נוגדן משני IgG נגד ארנב עזים-אלקסה פלואור 488 (1:500) ונוגדן משני IgG נגד עכבר עזים-אלקסה פלואור 594 (1:500)) עם 0.5% BSA. הוסיפו נוגדן משני מתאים לכל באר (0.2 מ"ל לכל באר). דגירה למשך 45 דקות ב- RT.
    12. שאפו את הנוגדן המשני משקופיות התא, שטפו 3x עם 1x DPBS (1 מ"ל לכל באר) במשך 30 שניות כל אחת ואז שאפו 1x DBPS מהבאר.
    13. הסר את האטם בשקופית התא בעלת 4 הבארות באמצעות מסיר אטם. נסו לא להשאיר שום דבק בשקופית מכיוון שהדבר מפריע ליישום הכיסוי. הוסף טיפה של מדיום הרכבה עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI). לחלופין, הכתימו את הבארות ב-DAPI והשתמשו במדיום הרכבה שאינו מכיל תוויות.
    14. הניחו בזהירות את הכיסוי על מגלשת הזכוכית על ידי הימנעות מבועות אוויר ואטמו את קצה הכיסוי בדבק. שימו לב לדפוסי צביעה אימונופלואורסצנטיים על ידי מיקרוסקופיה (טבלת חומרים) בהגדלה של פי 10 ו/או פי 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עורלה יילודית תקינה שימשה לבידוד של קרטינוציטים אפידרמליים ראשוניים ו-SCs עוריים ופיברובלסטים. התאים הראשוניים המבודדים עברו תרבית במדיה המתאימה של תרביות תאים שהכילו גורמי גדילה. לאחר זריעה של SCs ופיברובלסט בצלוחיות תרבית, רוב התאים דבקו בתחתית הבקבוקון תוך 2 שעות. במקרה של קרטינוציטים, רוב הקרטינוציטים דבקו ב -24 שעות. קרטינוציטים ראשוניים אפידרמליים מבודדים הגיעו למפגש של 85% ביום ה-7 והפגינו מורפולוגיה אופיינית של התא (צורת אבן מרוצפת) (איור 1A). ה-SCs הגיעו למפגש של 95% ביום ה-5 ונראו בצורתם דו-קוטבית או תלת-קוטבית (איור 1B). תרביות פיברובלסטים הגיעו למפגש של 95% ביום הרביעי ורוב התאים הציגו מורפולוגיה של צורת ציר (איור 1C). ביטוי חלבון ספציפי לסוג התא אושר בתרביות אלה על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה. קרטינוציטים היו חיוביים לחלבונים K10 (סמן התמיינות) ו-K14 (סמן התפשטות) (איור 2A); באופן דומה, SCs היו חיוביים עבור S100 ו-p75-NTR (איור 2C). פיברובלסטים ביטאו באופן חיובי את הווימנטין, אך לא ביטאו את סמן המיופיברובלסט, אקטין שריר אלפא חלק (α-SMA) (איור 2E).

התמונות הממוזגות של אימונופלואורסצנציה של קרטין וצביעה גרעינית של DAPI (איור 2A) הצביעו על כך ש-97.8% מהתאים בתרביות היו קרטינוציטים (איור 2B). תאי Schwann חיוביים כפולים מסוג S100 ו-p75-NTR מצביעים על טוהר של 95.2% SCs בתרבית בעקבות הפרוטוקול (איור 2C,D). באופן דומה, 97.2% מהתאים בתרביות פיברובלסטים ביטאו באופן חיובי וימנטין (איור 2E,F). לפיכך, ביטוי חלבונים אופייני נמצא בסוגי התאים המתאימים, והפרוטוקול מאפשר בידוד של אוכלוסיות טהורות יחסית של תאים.

Figure 1
איור 1: בידוד של קרטינוציטים ראשוניים שמקורם בעורלה אנושית, תאי שוואן ופיברובלסטים. (A) קרטינוציטים, (B) תאי שוואן, ו-(C) פיברובלסטים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה; סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אפיון של קרטינוציטים ראשוניים שמקורם בעורלה אנושית, תאי שוואן ופיברובלסטים. (A) קרטינוציטים זוהו באמצעות קרטין 14 (K14, קרטינוציטים מתרבים) ו-K10 (קרטין 10, סמן התמיינות קרטינוציטים); סרגל קנה מידה = 100 μm. (B) ניתוח סטטיסטי של טוהר של קרטינוציטים בתרבית באמצעות אימונופלואורסצנציות תאים מוכתמים כפולים. (C) תאי שוואן זוהו באמצעות S100 ו-p75-NTR (קולטן גורם גדילה עצבי); סרגל קנה מידה = 100 μm. (D) ניתוח סטטיסטי של טוהר של SCs בתרבית באמצעות תאים מוכתמים כפולים אימונופלואורסצנציות. (E) פיברובלסטים זוהו באמצעות וימנטין (פיברובלסט) ואקטין שרירי α-חלק (התמיינות פיברובלסט, מיופיברובלסט); סרגל קנה מידה = 100 μm. (F) ניתוח סטטיסטי של טוהר של פיברובלסטים בתרבית באמצעות תאים מוכתמים אימונופלואורסצנטיים וימנטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד שלוש אוכלוסיות תאים נפרדות מחתיכה אחת של העורלה, כלומר קרטינוציטים, פיברובלסטים ותאי שוואן. ישנם מספר פרוטוקולי בידוד זמינים לבידוד קרטינוציטים ופיברובלסטים 2,3,5,6, אך אף אחד מהם אינו מתאר בידוד SC. מלבד התאים המבניים המרכזיים בעור, בקרטינוציטים ובפיברובלסטים, העור גם מופנם מאוד על ידי מבנים חושיים חושיים ופרפרנטים אוטונומיים. אפרנטים חושיים ממלאים תפקיד משמעותי בהעברת מגע קל, רטט, כאב, גירוד ותחושות חמות וקרות. efferents אוטונומיים מעצימים את בלוטות הזיעה ואת שרירי פילי ארקטור9. כל אקסון עצבי נבלע על ידי SC, תאי הגלייה של מערכת העצבים ההיקפית. המחקר ותחומי העניין הקליניים ב-SCs גדלו במידה ניכרת מכיוון ש-SCs תומכים בהתחדשות אקסונאלית10,11. עצבי העור הם מווסתים חשובים של הפיזיולוגיה של העור ופתולוגיה של מחלות באמצעות אותות תקשורת (נוירומודולטורים/נוירו-מתווכים) לתאים שאינם עצביים 12,13,14.

למרות התפוצה הרחבה של SCs עצביים בעור, קיים מידע מוגבל לגבי התפקיד הספציפי של SCs בפיזיולוגיה של העור. כיצד SCs בעור מתקשרים עם תאים אחרים שאינם נוירונים בעור? התשובה לשאלה זו הופרעה על ידי היעדר מודלים אמינים של תרביות תאים במבחנה . לפיכך, עם פרוטוקול זה, הניתוח של כל תא בודד והאינטראקציות שלהם עם תאים מאותה רקמה יכול לחשוף במדויק את המאפיינים האופייניים של תפקידם של תאי שוואן בהומאוסטזיס של העור ובפתופיזיולוגיה.

אחד היתרונות המרכזיים של פרוטוקול זה הוא הליך ניסיוני פשוט וזול להקמת שלושה תאים ראשוניים (SCs, קרטינוציטים ופיברובלסט) מעורלה אנושית אחת. יש לו גם יתרון בכך שכל שלושת סוגי התאים מבודדים מאותה רקמה, ובכך מפחיתים את ההבדלים הגנטיים בהשוואות תאים ומייעלים את בידודי התאים כאשר הרקמה נמצאת בהיצע מוגבל. ביצוע פרוטוקול זה לוקח יומיים ומפשט את הליך הבידוד של שלושה תאים ראשוניים מרקמת העור וממצבי התרבות. פרוטוקול זה מניב באופן אמין מספר גבוה של תאים בני קיימא, והמעברים הראשוניים של תאים אלה הגיעו למפגש של כ-90% ב-4-7 ימים לאחר הציפוי הראשוני. השתמשנו בקרטינוציטים במשך לפחות 3 מעברים (~21 יום) ותאי פיברובלסט ושוואן יכולים לשמש ל-5-6 מעברים (כ-40 יום בתרבית).

פרוטוקול זה אינו נטול אתגרים טכניים. הסרה מספקת של רקמת השומן הבסיסית והפרדת אפידרמיס/עור יעילה לפני עיכול אנזימטי הם המפתח להשגת אוכלוסיות טהורות יחסית של תאים מכל שכבת עור. קשה יותר לבודד SCs עוריים מהעור בשל שכיחותם הנמוכה יחסית בעור בהשוואה לפיברובלסטים הרבים יותר. כל נשיאה של פיברובלסטים בתרביות SC תעלה במהירות על SCs15. כדי לשפר את הדבקות ב- SC, בחרנו לצפות מראש כלי תרבית רקמה עם PLL מכיוון שהדבר מגביר את ההידבקות של SCs16. כדי למתן עוד יותר את זיהום הפיברובלסטים, נוסף ציטוזין ארבינוזיד (חומר אנטי-מיטוטי) לאחר שהתאים דבקו במשך פרק זמן קצר כדי להסיר את הפיברובלסטים המתחלקים במהירות מתרביות SCs. עם זאת, חשיפה ארוכה יותר לציטוזין ארבינוסייד עלולה גם היא להזיק ל-SCs.

אימוץ הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר לבודד תאי עור בודדים, קרטינוציטים ותרביות פיברובלסטים לניסויים במבחנה . ניתן להשתמש באוכלוסיות תאים מובחנות אלה כדי לחקור SCs, קרטינוציטים ופיברובלסטים בנפרד או בשילוב במהלך פיזיולוגיה רגילה של העור, ריפוי פצעים או בתנאים המחקים את סביבת המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים האחרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר פאדיה כמאל ולד"ר ריאד אלברברי על שאפשרו לנו להשתמש במכשירי מעבדה ובתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה- NIH (K08 AR060164-01A) ו- DOD (W81XWH-16-1-0725) ל- J. C. E. בנוסף לתמיכה מוסדית מהמרכז הרפואי הרשי של אוניברסיטת פנסילבניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) MilliporeSigma SLGPR33RS
70 µM cell strainers CELLTREAT 229483
100 µM cell strainers CELLTREAT 229485
1 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) BD Luer-Lok BD309646
10 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD305462
1% TritonX-100 Sigma X100-1L Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution ThermoFisher Scientific J19943.K2 Ready to use and store at 4 °C
5% BSA Sigma A7906-100G Prepared at the time of use
70% ethanol Pharmco 111000200
Antibiotic ScienCell Research 503
Chemometec Vial1-Cassette Fisher Scientific NC1420193
Collagenase Gibco 17018-029
Coverslip Fisherbrand 12544D 22*50-1.5
Dispase I Sigma-Aldrich D46693
DMEM basal medium ScienCell Research 9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes Fisherbrand 02-681-5
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10082147
Fibroblast complete medium ScienCell Research 2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) Lonza CC-5022
Human foreskin De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) Lonza 00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody ThermoFisher Scientific 14-9760-82 Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody Abcam ab7800 Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody ThermoFisher Scientific MA5-12969 Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide) Tab-Tek 154526
NucleoCounter -Via1-Cassette Chemometec 941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL) ScienCell Research 32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI Invitrogen P36935
Rabbit K10 antibody Sigma-Aldrich SAB4501656 Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody Millipore AB1554 Dilution (1:500)
Rabbit vimentin ProteinTech 10366-1-AP Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium ScienCell Research 1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 ROTH LH75.1 Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) Codman 54-6500 Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) Razor blade company 94-0120 Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask Corning 353109
Trypsin neutralization buffer (TNS) Lonza CC-5002
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012
Inverted microscope ZEISS Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope ZEISS Primovert For visulaizing/observing cell attachment or detachment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Tags

מדעי המוח גיליון 181
בידוד, תרבית ואפיון של תאי שוואן ראשוניים, קרטינוציטים ופיברובלסטים מעורלה אנושית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, … More

Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin. J. Vis. Exp. (181), e63776, doi:10.3791/63776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter