Summary

Isolatie, kweek en karakterisering van primaire Schwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten uit menselijke voorhuid

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC’s), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.

Abstract

Dit protocol beschrijft isolatiemethoden, kweekomstandigheden en karakterisering van menselijke primaire cellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid met behulp van snelle enzymatische dissociatie van de huid. Primaire keratinocyten, fibroblasten en Schwann-cellen worden allemaal geoogst uit de menselijke pasgeboren voorhuid, die beschikbaar is volgens standaardzorgprocedures. De verwijderde huid wordt gedesinfecteerd en het onderhuidse vet en de spieren worden verwijderd met behulp van een scalpel. De methode bestaat uit enzymatische en mechanische scheiding van epidermale en dermale lagen, gevolgd door extra enzymatische spijsvertering om eencellige suspensies te verkrijgen van elk van deze huidlagen. Ten slotte worden afzonderlijke cellen gekweekt in geschikte celkweekmedia volgens standaard celkweekprotocollen om de groei en levensvatbaarheid gedurende weken te behouden. Samen maakt dit eenvoudige protocol isolatie, kweek en karakterisering van alle drie de celtypen uit één stuk huid mogelijk voor in vitro evaluatie van huid-zenuwmodellen. Bovendien kunnen deze cellen samen in coculturen worden gebruikt om hun effecten op elkaar en hun reacties op in vitro trauma te meten in de vorm van krassen die robotisch worden uitgevoerd in de cultuur die verband houdt met wondgenezing.

Introduction

Primaire cellen afgeleid van levend weefsel en gekweekt onder in vitro omstandigheden lijken sterk op de fysiologische toestand1, waardoor ze een ideaal model zijn voor het onderzoeken van fysiologische en pathofysiologische processen. De huid bevat meerdere celtypen, waaronder keratinocyten, fibroblasten, sebocyten, melanocyten en Schwann-cellen (SC’s), die kunnen worden geïsoleerd en gekweekt voor in vitro experimenten. Methoden om keratinocyten, fibroblasten en SC’s te isoleren en te kweken, uit een enkel stuk huid, zijn niet beschreven. Het doel van dit protocol is tweeledig: 1) het vaststellen van een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het isoleren en kweken van dermale SC’s en 2) het gebruik van een efficiënte, robuuste methode voor de isolatie van keratinocyten, fibroblasten en SC’s van een enkele menselijke voorhuid.

Op dit moment zijn er vastgestelde protocollen om huidkeratocyten 2,3,4 en fibroblasten 5,6 te isoleren. Deze studies beschrijven de isolatie van keratinocyten, fibroblasten of beide van de huid, maar geen protocol gaat in op het vaststellen van culturen van primaire SC’s uit de menselijke huid. Recente studies suggereren dat neuronale SC’s keratinocyten en fibroblast cellulaire processen moduleren en normale huidfysiologische functies reguleren7. SC’s zijn dus van cruciaal belang voor de homeostase van de huid en dragen substantieel bij aan de regulerende fysiologie die het gedrag van naburige huidceltypen beïnvloedt8. Daarom is een protocol dat de isolatie van elk van deze celtypen mogelijk maakt, ideaal voor in vitro experimenten met cel-celcommunicatie of cross-talk tussen celtypen.

Dit protocol beschrijft de vaststelling van individuele celculturen van primaire cellen uit een enkel stuk huid. Dit protocol is vooral handig wanneer de hoeveelheid beschikbaar weefsel beperkt is. Bovendien maakt isolatie van alle drie de celtypen van een enkele donor robuuste vergelijkingen tussen celtypen of co-kweekexperimenten mogelijk, terwijl de invloed van genetica tijdens het gewenste experiment wordt beperkt.

Protocol

Acquisitie en gebruik van gedeïdentificeerd menselijk voorhuidweefsel voor onderzoeksdoeleinden werd beoordeeld en ontving de bepaling van “niet menselijk onderzoek” door de Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574). OPMERKING: Door het onderstaande protocol te volgen, worden 2,4 x 106 keratinocyten, 4,4 x 106 fibroblasten en 1,1 x 106 SC’s verkregen uit een enkele voorhuid. Over het algemeen kunnen deze primaire cellen worden geb…

Representative Results

Normale neonatale voorhuid werd gebruikt voor de isolatie van primaire epidermale keratinocyten en dermale SC’s en fibroblasten. De geïsoleerde primaire cellen werden gekweekt in respectievelijke celkweekmedia die groeifactoren bevatten. Na het zaaien van SC’s en fibroblast in kweekkolven kleefden de meeste cellen binnen 2 uur aan de bodem van de kolf. In het geval van keratinocyten hechten de meeste keratinocyten 24 uur. Geïsoleerde epidermale primaire keratinocyten bereikten 85% confluentie op dag 7 en vertoonden kar…

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode om drie verschillende celpopulaties te isoleren uit een enkel stuk van de voorhuid, namelijk keratinocyten, fibroblasten en Schwann-cellen. Er zijn een paar isolatieprotocollen beschikbaar om keratinocyten en fibroblasten 2,3,5,6 te isoleren, maar geen enkele beschrijft SC-isolatie. Afgezien van de belangrijkste structurele cellen in de huid, keratinocyten en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Dr. Fadia Kamal en Dr. Reyad Elbarbary bedanken voor het feit dat ze ons in staat hebben gesteld om laboratoriuminstrumenten en technische ondersteuning te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (K08 AR060164-01A) en DOD (W81XWH-16-1-0725) aan J. C. E. naast institutionele ondersteuning van het Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Materials

0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) MilliporeSigma SLGPR33RS
70 µM cell strainers CELLTREAT 229483
100 µM cell strainers CELLTREAT 229485
1 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) BD Luer-Lok BD309646
10 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD305462
1% TritonX-100 Sigma X100-1L Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution ThermoFisher Scientific J19943.K2 Ready to use and store at 4 °C
5% BSA Sigma A7906-100G Prepared at the time of use
70% ethanol Pharmco 111000200
Antibiotic ScienCell Research 503
Chemometec Vial1-Cassette Fisher Scientific NC1420193
Collagenase Gibco 17018-029
Coverslip Fisherbrand 12544D 22*50-1.5
Dispase I Sigma-Aldrich D46693
DMEM basal medium ScienCell Research 9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes Fisherbrand 02-681-5
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10082147
Fibroblast complete medium ScienCell Research 2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) Lonza CC-5022
Human foreskin De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) Lonza 00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody ThermoFisher Scientific 14-9760-82 Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody Abcam ab7800 Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody ThermoFisher Scientific MA5-12969 Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide) Tab-Tek 154526
NucleoCounter -Via1-Cassette Chemometec 941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL) ScienCell Research 32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI Invitrogen P36935
Rabbit K10 antibody Sigma-Aldrich SAB4501656 Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody Millipore AB1554 Dilution (1:500)
Rabbit vimentin ProteinTech 10366-1-AP Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium ScienCell Research 1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 ROTH LH75.1 Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) Codman 54-6500 Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) Razor blade company 94-0120 Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask Corning 353109
Trypsin neutralization buffer (TNS) Lonza CC-5002
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012
Inverted microscope ZEISS Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope ZEISS Primovert For visulaizing/observing cell attachment or detachment

References

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

Play Video

Cite This Article
Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin. J. Vis. Exp. (181), e63776, doi:10.3791/63776 (2022).

View Video