Summary
De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC's), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.
Abstract
Dit protocol beschrijft isolatiemethoden, kweekomstandigheden en karakterisering van menselijke primaire cellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid met behulp van snelle enzymatische dissociatie van de huid. Primaire keratinocyten, fibroblasten en Schwann-cellen worden allemaal geoogst uit de menselijke pasgeboren voorhuid, die beschikbaar is volgens standaardzorgprocedures. De verwijderde huid wordt gedesinfecteerd en het onderhuidse vet en de spieren worden verwijderd met behulp van een scalpel. De methode bestaat uit enzymatische en mechanische scheiding van epidermale en dermale lagen, gevolgd door extra enzymatische spijsvertering om eencellige suspensies te verkrijgen van elk van deze huidlagen. Ten slotte worden afzonderlijke cellen gekweekt in geschikte celkweekmedia volgens standaard celkweekprotocollen om de groei en levensvatbaarheid gedurende weken te behouden. Samen maakt dit eenvoudige protocol isolatie, kweek en karakterisering van alle drie de celtypen uit één stuk huid mogelijk voor in vitro evaluatie van huid-zenuwmodellen. Bovendien kunnen deze cellen samen in coculturen worden gebruikt om hun effecten op elkaar en hun reacties op in vitro trauma te meten in de vorm van krassen die robotisch worden uitgevoerd in de cultuur die verband houdt met wondgenezing.
Introduction
Primaire cellen afgeleid van levend weefsel en gekweekt onder in vitro omstandigheden lijken sterk op de fysiologische toestand1, waardoor ze een ideaal model zijn voor het onderzoeken van fysiologische en pathofysiologische processen. De huid bevat meerdere celtypen, waaronder keratinocyten, fibroblasten, sebocyten, melanocyten en Schwann-cellen (SC's), die kunnen worden geïsoleerd en gekweekt voor in vitro experimenten. Methoden om keratinocyten, fibroblasten en SC's te isoleren en te kweken, uit een enkel stuk huid, zijn niet beschreven. Het doel van dit protocol is tweeledig: 1) het vaststellen van een betrouwbare en reproduceerbare methode voor het isoleren en kweken van dermale SC's en 2) het gebruik van een efficiënte, robuuste methode voor de isolatie van keratinocyten, fibroblasten en SC's van een enkele menselijke voorhuid.
Op dit moment zijn er vastgestelde protocollen om huidkeratocyten 2,3,4 en fibroblasten 5,6 te isoleren. Deze studies beschrijven de isolatie van keratinocyten, fibroblasten of beide van de huid, maar geen protocol gaat in op het vaststellen van culturen van primaire SC's uit de menselijke huid. Recente studies suggereren dat neuronale SC's keratinocyten en fibroblast cellulaire processen moduleren en normale huidfysiologische functies reguleren7. SC's zijn dus van cruciaal belang voor de homeostase van de huid en dragen substantieel bij aan de regulerende fysiologie die het gedrag van naburige huidceltypen beïnvloedt8. Daarom is een protocol dat de isolatie van elk van deze celtypen mogelijk maakt, ideaal voor in vitro experimenten met cel-celcommunicatie of cross-talk tussen celtypen.
Dit protocol beschrijft de vaststelling van individuele celculturen van primaire cellen uit een enkel stuk huid. Dit protocol is vooral handig wanneer de hoeveelheid beschikbaar weefsel beperkt is. Bovendien maakt isolatie van alle drie de celtypen van een enkele donor robuuste vergelijkingen tussen celtypen of co-kweekexperimenten mogelijk, terwijl de invloed van genetica tijdens het gewenste experiment wordt beperkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Acquisitie en gebruik van gedeïdentificeerd menselijk voorhuidweefsel voor onderzoeksdoeleinden werd beoordeeld en ontving de bepaling van "niet menselijk onderzoek" door de Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).
OPMERKING: Door het onderstaande protocol te volgen, worden 2,4 x 106 keratinocyten, 4,4 x 106 fibroblasten en 1,1 x 106 SC's verkregen uit een enkele voorhuid. Over het algemeen kunnen deze primaire cellen worden gebruikt voor 3 passages, afhankelijk van de experimentele omstandigheden.
1. Isolatie van primaire cellen en kweekomstandigheden
- Epidermis- en dermisscheidingsprocedure
- Verkrijg neonatale voorhuid volgens standaardzorgprocedures door een arts volgens goedgekeurde ziekenhuisregelgevingsprotocollen. De arts bepaalt het tijdstip van de besnijdenis na de geboorte en de hoeveelheid verwijderde huid.
- Plaats de weggesneden voorhuid in een microcentrifugebuis met 8-10 ml ijskoud Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) basaal medium en transporteer de voorhuid onmiddellijk naar het celkweeklaboratorium voor celisolatie. Spoel de huid tweemaal met 20-25 ml 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) die 1x antibioticum/antimycotisch bevat.
OPMERKING: Voor maximale levensvatbaarheid van de cel moet de weggesneden voorhuid tot de verwerking bij 4 °C worden geplaatst en moeten de cellen binnen 24 uur worden geoogst. - Na het spoelen in DPBS /antibiotica, week de voorhuid in 25-30 ml ijskoud DMEM basaal medium gedurende 10-15 minuten in een 10 cm weefselkweekschaal. Voer alle verwerkingsstappen in een weefselkweekkap uit met behulp van steriele techniek.
- Snijd met behulp van een scalpel voorzichtig de voorhuid open en leg de dermis en het onderhuidse vetweefsel bloot.
- Verwijder het onderhuidse vetweefsel met een tang, scalpelmes en schaar, indien nodig. Gooi het vetweefsel weg. Snijd de gereinigde voorhuid in drie tot vijf kleinere stukjes.
- Breng huidstukken over in een steriele conische buis met 16-20 ml dispase-I/DMEM-medium (4 mg/ml in DMEM-basaal medium).
- Meng de huidstukken in de conische buis door inversie, met tussenpozen, gedurende de eerste 30 minuten van de incubatie met dispase-I. Plaats vervolgens de conische buis gedurende 16-18 uur op 4 °C, waarbij u er rekening mee houdt dat u de huidstukken onderdompelt in dispase-I/media.
OPMERKING: Dispase-I-oplossing moet vlak voor toevoeging worden bereid met koud DMEM-basaal medium, gefilterd met een zeef van 0,22 μm en bewaard bij 4 °C. - Verwijder na een nachtelijke vertering met dispase-I de huidstukken en plaats ze op een droge, steriele, kweekschaal. Rol elk stukje huid uit zodat de buitenste epidermale laag de kweekschaal raakt.
- Gebruik twee sets tangen om de opperhuid zorgvuldig van de dermis te scheiden. Begin op de rand van het weefsel en pel de opperhuid weg van de dermis.
OPMERKING: Als de epidermislaag moeilijk te scheiden is van de dermis, was de dispase-I-spijsvertering niet voldoende. Opties voor probleemoplossing: 1) breng huidstukken terug naar de dispase-I/DMEM-oplossing en incubeer gedurende nog eens 2-3 uur bij 4 °C; 2) plaats de huidstukjes in verse dispase-I/DMEM en incubeer bij 4 °C gedurende 2-3 uur langer. - Gebruik de gescheiden epidermis en dermis om keratinocyten (epidermis) en fibroblasten en Schwann-cellen (dermis) te isoleren.
OPMERKING: Volg de onderstaande stappen voor specifieke celtypen isolatie en kweekomstandigheden.
- Keratinocytenisolatie van de opperhuid
- Voeg 5 ml HEPES bufferzoutoplossing (HBS) toe aan een kweekschaal van 10 cm en voeg de gescheiden epidermisfragmenten toe. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 min.
- Verzamel na HBS-incubatie de HBS-oplossing in een conische buis van 50 ml. Voeg 5 ml trypsineneutralisatiebuffer (TNB) (materiaaltabel) toe in een conische buis van 50 ml en zet apart.
- Voeg 3 ml trypsine-oplossing toe aan de epidermale fragmenten. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 min.
- Roer de epidermale fragmenten voorzichtig met een tang totdat de trypsine-oplossing troebel wordt.
- Voeg de trypsineoplossing/keratinocyten toe aan de HBS- en TNB-bevattende buis in stap 1.2.2.
- Voeg voor alle resterende epidermale fragmenten die niet zijn opgelost in de initiële trypsinevertering 3 ml 0,25% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten en herhaal de stappen 1.2.4 en 1.2.5.
- Voeg 2 ml foetaal runderserum (FBS) toe aan de trypsine/EDTA-oplossing die HBS- en TNB-oplossingsbuizen bevat.
- Centrifugeer de opvangbuis met HBS/TNB/trypsine en keratinocyten bij 870 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Aspirateer het supernatant en resuspend de celkorrel in 3 ml keratinocyten volledig groeimedium (tabel met materialen).
- Filtreer de celsuspensie met een steriel filter van 100 μM in een steriele conische buis van 50 ml om vuil te verwijderen.
- Kwantificeer het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel.
OPMERKING: Hier werd een gespecialiseerd celbemonsterings- en kleuringsapparaat (Tabel met materialen) gebruikt om het celnummer en de levensvatbaarheid te kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant. - Zaadkweekplaten als dat nodig is voor experimenten. De aanbevolen zaaidichtheid is ~45.000 cellen/cm2.
- Plaats de kweekplaten gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C in 5% CO2 om keratinocyten aan de schaal te laten hechten.
- Na 2 dagen, aspirateer eventuele niet-gehechte cellen. Ververs de celkweekmedia om de andere dag totdat keratinocyten de gewenste confluïtentie bereiken voor passaging of downstream experimenten (50% -80% confluentie).
- Isolatie van Schwann-cellen (SC's) en fibroblasten uit de dermis
- Pre-coat T25 kolven met poly-L-lysine (PLL, 0,01 μg/μL) met 5 ml 1x DPBS. Plaats de voorgecoate kolven gedurende 3 uur bij 37 °C. Was de PLL-coatingmatrix tweemaal met 1x DPBS (5 ml).
OPMERKING: T25-kolven kunnen van tevoren worden voorbereid. - Spoel de geïsoleerde stukken van de dermis af met 5 ml DMEM basaal medium.
- Hak de dermis in kleine stukjes met een schaar of een scalpel.
- Verteer de gehakte dermis met 5 ml collagenase (2 mg/ml in DMEM basaal medium) bij 37 °C gedurende 2,5 uur. Trituraleer de gehakte dermis voorzichtig met een pipetpunt om de 30 minuten totdat de dermis volledig dissociëert.
- Filter de celsuspensie met een celzeef van 70 μM. Het is noodzakelijk om mechanische kracht toe te passen met behulp van een spuit van 1 ml om de suspensie volledig te filteren.
- Verdun de gefilterde celsuspensie met 5 ml volledig DMEM-medium (DMEM-basaal medium + 5% FBS + 1x antibioticum) om de enzymatische activiteit van collagenase te stoppen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 870 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te pelleteren.
- Uit deze celkorrel worden zowel fibroblasten als SC's verkregen. Resuspend de celkorrel in 2 ml DMEM compleet medium om de cellen te delen (1 ml celsuspensie/buis) en centrifugeer bij 870 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Voor SC-cultuur volgt u stap 1.3.10-1.3.17 en voor fibroblastcultuur stap 1.3.18-1.3.22.
- Aspirateer vanaf stap 1.3.8 het supernatant. Resuspend de celkorrel in 5 ml vers DMEM compleet medium.
- Kwantificeer het celnummer en de levensvatbaarheid.
OPMERKING: Hier werd een gespecialiseerd celbemonsterings- en kleuringsapparaat (Tabel met materialen) gebruikt om het celnummer en de levensvatbaarheid te kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant. - Zaai de voorgecoate T25-kolven met 5 ml geresuspendeerde cellen met een dichtheid van 4,0 x 103 cellen/ml. Incubeer de kolf bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 gedurende de nacht (~12-16 h incubatie).
- Bevestig na 16 uur de celhechting door microscopie (Tabel van materialen) bij 10x vergroting.
- Verwijder de niet-hechtende cellen en was de kolf 3x met 5 ml 1x DPBS.
- Voeg 5 ml 10 μM cytosine arabinoside (antimitotisch middel, doodt fibroblasten) toe aan dmem complete medium. Incubeer de kolf bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Zuig het cytosine arabinoside bevattende medium uit de kolf. Spoel de kolf 3x af met 5 ml 1x DPBS.
- Vul de kweekkolf opnieuw met 5 ml SC's volledig kweekmedium (materiaaltabel) en incubeer bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 gedurende 48 uur. Ververs SC complete kweekmedium om de andere dag totdat SC's 80% samenvloeiing bereiken.
- Zuig het supernatant op uit de gedissocieerde dermale laag (stap 1.3.8) en resuspend de celkorrel met 5 ml fibroblast compleet medium (fibroblast basaal medium + 5% FBS + 1x antibioticum).
- Kwantificeer het celnummer en de levensvatbaarheid van de cel.
OPMERKING: Hier werd een gespecialiseerd celbemonsterings- en kleuringsapparaat (Tabel met materialen) gebruikt om het celnummer en de levensvatbaarheid te kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant. - Plaat de fibroblasten bij een celdichtheid van 4,0 x 103 cellen/ml in T25-kweekkolven (niet voorgecoat) met behulp van 5 ml fibroblast compleet medium. Incubeer bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 's nachts (~12-16 h incubatie).
- Bevestig na 16-24 uur de celhechting door microscopie (Tabel van materialen) bij 10x vergroting. Zuig niet-hechtende cellen uit de kolf en was de kolf tweemaal met 5 ml 1x DPBS.
- Voeg 5 ml vers fibroblastenmedium toe en incubeer bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 gedurende 48 uur. Ververs het kweekmedium om de andere dag totdat fibroblasten de gewenste samenvloeiing bereiken voor passaging of downstream assays (50% -80% confluentie).
- Pre-coat T25 kolven met poly-L-lysine (PLL, 0,01 μg/μL) met 5 ml 1x DPBS. Plaats de voorgecoate kolven gedurende 3 uur bij 37 °C. Was de PLL-coatingmatrix tweemaal met 1x DPBS (5 ml).
2. Verificatie van epidermale keratinocyten, dermale SC's en fibroblasten eiwitmarker door immunofluorescentie
- Dag 1- Bedek kamerglasglaasjes en maak cellen los
- Pre-coat 4-well kamer glasglijbanen met collageen-I voor keratinocyten, of PLL voor SC's of, slechts 1x DPBS voor fibroblasten (0,5 ml elk goed). Zorg ervoor dat u het hele oppervlak bedekt. Incubeer kamerglijmen bij 37 °C gedurende 2 uur. Bereid tijdens de incubatie de cellen voor.
- Nadat gekweekte cellen 50% -80% confluentie hebben bereikt, wast u de kolven met 1x DPBS 3x (1 ml voor elke put).
- Maak de aangehechte cellen los met 5 ml 0,25% trypsine-EDTA (TE) oplossing door gedurende 2 minuten te broeden bij 37 °C in aanwezigheid van 5% CO2 , totdat de cellen rond beginnen te worden. Visualiseer celloslating met microscopie (Table of Materials) bij 10x vergroting.
- Breng na incubatie TE-oplossing met cellen over naar een conische buis met 5 ml foetaal runderserum (FBS).
- Voeg 5 ml trypsineneutralisatiebuffer (TNB) toe aan de kweekkolf en breng de inhoud over naar de bovengenoemde centrifugebuis (cellen met TE en FBS). Visualiseer celloslating met microscopie (Table of Materials) bij 10x vergroting.
OPMERKING: TNB of FBS of beide kunnen worden gebruikt om trypsine-activiteit te neutraliseren. - Centrifugeer de conische buis met cellen/TE/TNB bij 870 x g gedurende 5 minuten. Breng het supernatant over in een andere buis en resuspend de celkorrel in het overeenkomstige volledige kweekmedium. Meet de levensvatbaarheid van de cel zoals vermeld in stap 1.2.11.
- Spoel de voorgecoate glasplaten van de kamer (stap 2.1.1) 3x af met 1x DPBS (1 ml voor elke put).
- Semi-droog de dia's in de weefselkweekkap en zaad keratinocyten, SC's of fibroblasten met een geschikte dichtheid (30.000 cellen / 0,5 ml / kamer) in een geschikt volledig celkweekmedium.
- Incubeer de kamerglijbanen bij 37 °C 's nachts om cellen te laten hechten.
- Dag 2- Het blokkeren van de kamerglasplaat met Bovine Serum Albumin (BSA) en primaire antilichamen incubatie
- Zuig de celmedia op uit de kamerglaasjes en was 3x met 1 ml 1x DPBS.
- Fixeer de aangehechte cellen met 4% paraformaldehyde in 1x DPBS (1 ml voor elke put) en incubeer gedurende 15 minuten bij RT in de weefselkweekkap.
- Zuig 4% paraformaldehyde uit de kamerglijbanen en was de kamerglijbanen 3x met 1x DPBS (1 ml voor elke put).
- Permeabiliseer de celmembranen met 1% TritonX-100 in 1x DPBS (1 ml voor elke put) en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
- Zuig de blokkeringsoplossing uit de kamerglijbanen, was 3x met 1x DPBS (1 ml voor elke put) gedurende 30 s en zuig vervolgens 1x DPBS uit de put.
- Blokkeer de kamerglijbanen met 5% BSA (0,5 ml voor elke put) en incubeer gedurende 45 minuten bij RT.
- Zuig de blokkeringsoplossing uit de kamerglijbanen, was 3x met 1x DPBS (1 ml voor elke put) gedurende 30 s elk en zuig vervolgens 1x DPBS uit de put.
- Verdun de primaire antilichamen met 5% BSA (0,2 ml voor elke put) (Primaire antilichamen verdunningen: Keratinocyten: muiscytokeratine 14 antilichaam (1:100) en cytokeratine 10 antilichaam (1:100); Schwann-cellen: muis S100-antilichaam (1:200) en konijnenzenuwgroeifactorreceptor (p75-NTR) antilichaam (1:500); Fibroblasten: konijn vimentine antilichaam (1:200), en muis alfa-gladde spier actine (α-SMA) antilichaam (1:200)).
- Voeg de primaire antilichamen toe aan de overeenkomstige cellen op de glasplaat van de kamer en incubeer gedurende ongeveer 15-16 uur ('s nachts) bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
- Zuig de primaire antilichamen uit de kamerglaasjes, was 3 keer met 1x DPBS (1 ml voor elke put) gedurende 30 s elk en aspirateer vervolgens 1x DPBS uit de put.
- Verdun de secundaire antilichamen (Goat anti-rabbit IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 488 (1:500) en Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody-Alexa Fluor 594 (1:500)) met 0,5% BSA. Voeg het juiste secundaire antilichaam toe aan elke put (0,2 ml voor elke put). Incubateer gedurende 45 minuten bij RT.
- Zuig het secundaire antilichaam uit kamerglaasjes, was 3x met 1x DPBS (1 ml voor elke put) gedurende 30 s elk en zuig vervolgens 1x DBPS uit de put.
- Verwijder de pakking op de 4-puts kamerschuif met behulp van pakkingverwijderaar. Probeer geen lijm op de dia achter te laten, omdat dit het aanbrengen van coverslip verstoort. Voeg een druppel montagemedium toe met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). U kunt ook de putten tegenvlekken met DAPI en een niet-labelbevattend montagemedium gebruiken.
- Plaats de afdekplaat voorzichtig op de glasplaat door luchtbellen te vermijden en sluit het uiteinde van de afdekplaat af met lijm. Observeer immunofluorescentiekleuringspatronen door microscopie (Tabel van Materialen) bij 10x en/of 20x vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Normale neonatale voorhuid werd gebruikt voor de isolatie van primaire epidermale keratinocyten en dermale SC's en fibroblasten. De geïsoleerde primaire cellen werden gekweekt in respectievelijke celkweekmedia die groeifactoren bevatten. Na het zaaien van SC's en fibroblast in kweekkolven kleefden de meeste cellen binnen 2 uur aan de bodem van de kolf. In het geval van keratinocyten hechten de meeste keratinocyten 24 uur. Geïsoleerde epidermale primaire keratinocyten bereikten 85% confluentie op dag 7 en vertoonden karakteristieke celmorfologie (geplaveide vorm) (figuur 1A). De SC's bereikten 95% confluentie op dag 5 en leken bipolair of tripolair van vorm (figuur 1B). Fibroblastculturen bereikten 95% confluentie op dag 4 en de meeste cellen vertoonden een spindelvormige morfologie (figuur 1C). Celtype-specifieke eiwitexpressie werd in deze culturen bevestigd door immunofluorescentiekleuring. Keratinocyten waren positief voor K10 (differentiatiemarker) en K14 (proliferatiemarker) eiwitten (figuur 2A); evenzo waren SC's positief voor S100 en p75-NTR (figuur 2C). Fibroblasten drukten vimentine positief tot expressie, maar drukten niet de myofibroblastmarker, alfa-gladde spier actine (α-SMA) tot expressie (figuur 2E).
De samengevoegde beelden van keratine immunofluorescentie en DAPI nucleaire kleuring (figuur 2A) gaven aan dat 97,8% van de cellen in de culturen keratinocyten waren (figuur 2B). Dubbele S100- en p75-NTR-positieve Schwann-cellen suggereren een zuiverheid van 95,2% SC's in cultuur volgens het protocol (figuur 2C,D). Evenzo bracht 97,2% van de cellen in fibroblastculturen vimentine positief tot expressie (figuur 2E,F). Karakteristieke eiwitexpressie wordt dus gevonden in de respectieve celtypen en het protocol maakt de isolatie van relatief zuivere populaties van cellen mogelijk.
Figuur 1: Isolatie van van menselijke voorhuid afgeleide primaire keratinocyten, Schwann-cellen en fibroblasten. (A) Keratinocyten, (B) Schwann-cellen en (C) Fibroblasten onder fasecontrastmicroscoop; schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van van menselijke voorhuid afgeleide primaire keratinocyten, Schwann-cellen en fibroblasten. (A) Keratinocyten werden geïdentificeerd met behulp van keratine 14 (K14, proliferatieve keratinocyten) en K10 (keratine 10, keratinocytendifferentiatiemarker); schaalbalk = 100 μm. (B) Statistische analyse van de zuiverheid van gekweekte keratinocyten met behulp van immunofluorescenties dubbel gekleurde cellen. (C) Schwann-cellen werden geïdentificeerd met behulp van S100 en p75-NTR (zenuwgroeifactorreceptor); schaalbalk = 100 μm. (D) Statistische analyse van de zuiverheid van gekweekte SC's met behulp van immunofluorescenties dubbel gekleurde cellen. (E) Fibroblasten werden geïdentificeerd met behulp van vimentine (fibroblast) en α-gladde spier actine (fibroblast differentiatie, myofibroblast); schaalbalk = 100 μm. (F) Statistische analyse van de zuiverheid van gekweekte fibroblasten met behulp van immunofluorescenties vimentine gekleurde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode om drie verschillende celpopulaties te isoleren uit een enkel stuk van de voorhuid, namelijk keratinocyten, fibroblasten en Schwann-cellen. Er zijn een paar isolatieprotocollen beschikbaar om keratinocyten en fibroblasten 2,3,5,6 te isoleren, maar geen enkele beschrijft SC-isolatie. Afgezien van de belangrijkste structurele cellen in de huid, keratinocyten en fibroblasten, wordt de huid ook sterk geïnnerveerd door sensorische afferente structuren en autonome efferente stoffen. Sensorische afferente stoffen spelen een belangrijke rol bij de transmissie van lichte aanraking, trillingen, pijn, jeuk en warme en koude sensaties. Autonome efferentes innerveren zweetklieren en arrector pili spieren9. Elk zenuwaxon wordt verwarmd door een SC, de gliacellen van het perifere zenuwstelsel. Onderzoek en klinische interesses in SC's zijn aanzienlijk toegenomen omdat SC's axonale regeneratie ondersteunen10,11. Huidzenuwen zijn belangrijke regulatoren van huidfysiologie en ziektepathologie via communicatiesignalen (neuromodulatoren/neuromediators) naar niet-neurale cellen 12,13,14.
Ondanks de brede verspreiding van zenuw-SC's in de huid, bestaat er beperkte informatie over de specifieke rol van SC's in de huidfysiologie. Hoe interageren SC's in de huid met andere niet-neuronale cellen in de huid? Het beantwoorden van deze vraag werd belemmerd door het gebrek aan betrouwbare in vitro celkweekmodellen. Met dit protocol kan de analyse van elke individuele cel en hun interacties met cellen uit hetzelfde weefsel dus precies de karakteristieke kenmerken van de rol van Schwann-cellen in de homeostase en pathofysiologie van de huid onthullen.
Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is een eenvoudige, goedkope experimentele procedure om drie primaire cellen (SC's, keratinocyten en fibroblast) vast te stellen uit een enkele menselijke voorhuid. Het heeft ook het voordeel dat alle drie de celtypen worden geïsoleerd uit hetzelfde weefsel, waardoor genetische verschillen in celvergelijkingen worden verminderd en celisolatie wordt geoptimaliseerd wanneer weefsel beperkt beschikbaar is. Dit protocol duurt 2 dagen om uit te voeren en vereenvoudigt de isolatieprocedure voor drie primaire cellen uit huidweefsel en kweekomstandigheden. Dit protocol levert op betrouwbare wijze grote aantallen levensvatbare cellen op en de eerste passages van deze cellen bereikten ~ 90% samenvloeiing 4-7 dagen na de eerste plating. We hebben keratinocyten gebruikt voor ten minste 3 passages (~ 21 dagen) en fibroblast- en Schwann-cellen kunnen worden gebruikt voor 5-6 passages (~ 40 dagen in cultuur).
Dit protocol is niet zonder technische uitdagingen. Voldoende verwijdering van het onderliggende vetweefsel en efficiënte epidermale /dermale scheiding vóór enzymatische spijsvertering zijn de sleutel tot het verkrijgen van relatief zuivere populaties van cellen uit elke huidlaag. Dermale SC's zijn moeilijker te isoleren van de huid vanwege hun relatief lage prevalentie in de huid in vergelijking met de meer talrijke fibroblasten. Elke overdracht van fibroblasten in SC-culturen zal SC's snel ontgroeien15. Om de hechting van SC te verbeteren, hebben we ervoor gekozen om weefselkweekwaren voor te coaten met PLL, omdat dit de hechting van SC's16 verhoogt. Om fibroblastbesmetting verder te verminderen, werd cytosine arabinoside (antimitotisch middel) toegevoegd nadat cellen zich gedurende een korte periode hadden gehecht om de snel delende fibroblasten uit SC-culturen te verwijderen. Langere blootstelling aan cytosine arabinoside kan echter ook schadelijk zijn voor SC's.
Het aannemen van het hierboven beschreven protocol maakt het mogelijk om individuele huid-SC's, keratinocyten en fibroblastenculturen te isoleren voor in vitro experimenten. Deze verschillende celpopulaties kunnen worden gebruikt om SC's, keratinocyten en fibroblasten individueel of in combinatie te onderzoeken tijdens normale huidfysiologie, wondgenezing of onder omstandigheden die een ziekte-instelling nabootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle andere auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We willen Dr. Fadia Kamal en Dr. Reyad Elbarbary bedanken voor het feit dat ze ons in staat hebben gesteld om laboratoriuminstrumenten en technische ondersteuning te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (K08 AR060164-01A) en DOD (W81XWH-16-1-0725) aan J. C. E. naast institutionele ondersteuning van het Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
