Summary
근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.
Abstract
이 프로토콜은 피부의 신속한 효소 해리를 사용하여 높은 수율과 생존력을 가진 인간 일차 세포의 분리 방법, 배양 조건 및 특성화를 설명합니다. 일차 각질세포, 섬유아세포, 슈완 세포는 모두 인간 신생아 포피로부터 수확되며, 이는 표준 관리 절차에 따라 사용할 수 있습니다. 제거 된 피부는 소독되고 피하 지방과 근육은 메스를 사용하여 제거됩니다. 이 방법은 표피 및 진피 층의 효소 및 기계적 분리로 구성되며, 이어서 추가적인 효소 소화가 이뤄져 이들 피부 층 각각으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는다. 마지막으로, 단일 세포는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 적절한 세포 배양 배지에서 성장하여 수주에 걸쳐 성장 및 생존력을 유지한다. 함께, 이 간단한 프로토콜은 피부-신경 모델의 시험관내 평가를 위해 단일 피부 조각으로부터 세 가지 세포 유형 모두를 분리, 배양 및 특성화할 수 있게 한다. 추가적으로, 이들 세포는 상처 치유와 관련된 배양물에서 로봇적으로 수행되는 스크래치의 형태로 서로에 대한 그들의 영향 및 시험관내 외상에 대한 그들의 반응을 측정하기 위해 공동 배양물에서 함께 사용될 수 있다.
Introduction
생체 조직으로부터 유래되고 시험관내 조건 하에서 배양된 1차 세포는 생리학적 상태1과 매우 유사하여, 이들을 생리학적 및 병리생리학적 과정을 조사하기 위한 이상적인 모델이다. 피부는 각질세포, 섬유아세포, 세포세포, 멜라노사이트 및 슈완 세포(SCs)를 포함하는 다수의 세포 유형을 함유하며, 이는 시험관내 실험을 위해 단리되고 배양될 수 있다. 피부의 단일 조각으로부터 각질세포, 섬유아세포 및 SCs를 분리하고 배양하는 방법은 기술되지 않았다. 이 프로토콜의 목표는 두 가지입니다 : 1) 진피 SC의 분리 및 배양을위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 확립하고 2) 단일 인간 포피에서 각질 세포, 섬유 아세포 및 SC를 분리하기위한 효율적이고 강력한 방법을 사용하는 것입니다.
현재, 피부 각질세포 2,3,4 및 섬유아세포 5,6을 분리하기 위한 확립된 프로토콜이 있다. 이 연구는 피부로부터 각질세포, 섬유아세포 또는 둘 다의 분리를 기술하지만, 인간 피부로부터 일차 SC의 배양을 확립하는 방법을 다루는 프로토콜은 없다. 최근 연구에 따르면 뉴런 SC는 각질세포 및 섬유아세포 세포 과정을 조절하고 정상적인 피부 생리적 기능을 조절한다7. 따라서 SCs는 피부 항상성에 매우 중요하며, 존재하는 이웃 피부 세포 유형의 거동에 영향을 미치는 생리학을 조절하는데 실질적으로 기여한다8. 따라서, 이들 세포 유형 각각의 단리를 허용하는 프로토콜은 세포-세포 유형 간의 통신 또는 교차 대화를 포함하는 시험관내 실험에 이상적이다.
이 프로토콜은 피부의 단일 조각으로부터 일차 세포의 개별 세포 배양의 확립을 기술한다. 이러한 프로토콜은 사용 가능한 조직의 양이 제한될 때 특히 유용하다. 또한, 단일 공여체로부터 세 가지 세포 유형을 모두 분리하면 원하는 실험 중에 유전학의 영향을 완화하면서 세포 유형 또는 공동 배양 실험 간의 강력한 비교가 가능합니다.
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Protocol
연구 목적으로 비확인 된 인간 포피 조직의 획득 및 사용은 Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574)에 의해 "인간이 아닌 연구"의 결정을 검토하고 받았다.
참고: 아래의 프로토콜에 따라, 2.4 x 10 6 각질세포, 4.4 x 10 6 섬유아세포 및 1.1 x 106 SCs가 단일 포피로부터 수득된다. 일반적으로, 이들 일차 세포는 실험 조건에 따라 3계대 동안 사용될 수 있다.
1. 1차 세포 및 배양 조건의 분리
- 표피와 진피 분리 절차
- 승인 된 병원 규제 프로토콜에 따라 의사의 치료 절차 표준에 따라 신생아 포피를 습득하십시오. 의사는 출생 후 할례의시기와 제거 된 피부의 양을 결정합니다.
- 적출된 포피를 빙냉 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 기본 배지 8-10 mL가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 포피를 즉시 세포 배양 실험실로 운반하여 세포를 분리합니다. 1x 항생제/항균제가 들어있는 둘베코의 인산완충식염수(DPBS) 20-25mL로 피부를 두 번 헹구십시오.
참고: 세포 생존력을 극대화하기 위해, 적출된 포피는 처리될 때까지 4°C에 두어야 하며, 세포는 24시간 이내에 수확되어야 한다. - DPBS/항생제로 헹구어 낸 후, 포피를 얼음처럼 차가운 DMEM 기본 배지 25-30 mL에 담가 10-15분 동안 10cm 조직 배양 접시에 담그십시오. 멸균 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 처리 단계를 수행하십시오.
- 메스를 사용하여 포피를 조심스럽게 얇게 썰어 진피와 피하 지방 조직을 노출시킵니다.
- 필요에 따라 포셉, 메스 블레이드 및 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하십시오. 지방 조직을 버리십시오. 청소 된 포피를 세 개에서 다섯 개의 작은 조각으로 자릅니다.
- 피부 조각을 16-20mL의 dispase-I/DMEM 배지(DMEM 기본 배지 중 4mg/mL)가 들어있는 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- dispase-I로 인큐베이션의 처음 30 분 동안 간헐적으로 역전시킴으로써 원뿔형 튜브의 피부 조각을 혼합하십시오. 그런 다음 원뿔형 튜브를 4 °C에서 16-18 시간 동안 놓고 피부 조각을 dispase-I / 미디어에 담그십시오.
참고: Dispase-I 용액은 차가운 DMEM 기초 배지를 사용하여 첨가 직전에 제조되어야 하고, 0.22 μm 스트레이너로 여과하고, 4°C에서 유지되어야 한다. - dispase-I로 밤새 소화 한 후 피부 조각을 제거하고 건조하고 멸균 된 배양 접시에 놓습니다. 외부 표피층이 배양 접시에 닿도록 피부의 각 조각을 풉니다.
- 두 세트의 포셉을 사용하여 표피를 진피에서 조심스럽게 분리하십시오. 조직의 가장자리에서 시작하여 표피를 진피에서 벗겨냅니다.
참고: 표피층이 진피로부터 분리되기 어려운 경우, 디스파제-I 소화가 충분하지 않았다. 트러블슈팅 옵션: 1) 피부 조각을 디스파제-I/DMEM 용액으로 복귀시키고 4°C에서 추가로 2-3시간 동안 인큐베이션한다; 2) 피부 조각을 신선한 디스파제-I/DMEM에 넣고 4°C에서 2-3시간 더 배양한다. - 분리된 표피 및 진피를 사용하여 각질세포(표피)와 섬유아세포 및 슈완 세포(진피)를 분리한다.
참고: 특정 세포 유형의 분리 및 배양 조건에 대해서는 아래 단계를 따르십시오.
- 표피로부터의 각질세포 분리
- HEPES 완충 식염수(HBS) 5 mL를 10 cm 배양 접시에 첨가하고, 분리된 표피 단편을 첨가한다. 실온(RT)에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- HBS 인큐베이션 후, HBS 용액을 50 mL 코니컬 튜브에 수집한다. 50 mL 원뿔형 튜브에 트립신 중화 완충액 (TNB) (표 자료)을 첨가하고 따로 두십시오.
- 표피 절편에 트립신 용액 3 mL를 첨가한다. 37°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 트립신 용액이 탁해질 때까지 포셉을 사용하여 표피 단편을 부드럽게 교반하십시오.
- 트립신 용액/각질세포를 1.2.2단계에서 HBS 및 TNB 함유 튜브에 첨가한다.
- 초기 트립신 소화에 용해되지 않은 나머지 표피 단편의 경우 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 mL를 첨가하십시오. 37°C에서 10분 동안 인큐베이션하고 단계 1.2.4 및 1.2.5를 반복한다.
- 2mL의 소 태아 혈청(FBS)을 HBS 및 TNB 용액 튜브가 포함된 트립신/EDTA 용액에 첨가합니다.
- HBS/TNB/트립신 및 각질세포를 함유하는 수집 튜브를 870 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 3 mL의 각질세포 완전 성장 배지에 재현탁시킨다(표 자료).
- 세포 현탁액을 멸균된 100 μM 필터로 여과하여 멸균된 50 mL 원뿔형 튜브에 넣어 이물질을 제거하였다.
- 세포 수 및 세포 생존율을 정량화한다.
참고 : 여기에서는 전문 세포 샘플링 및 염색 장치 (물질 표)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 수와 생존력을 정량화했습니다. - 실험에 필요한 종자 배양 플레이트. 권장 시드 밀도는 ~ 45,000 셀 /cm2입니다.
- 배양 플레이트를 2일 동안 5%CO2 의 37°C의 인큐베이터에 두어 각질세포가 접시에 부착되도록 한다.
- 2 일 후, 부착되지 않은 세포를 흡인하십시오. 각질세포가 계통과 또는 하류 실험(50%-80% 합류)을 위해 원하는 합류에 도달할 때까지 격일로 세포 배양 배지를 새로 고칩니다.
- 진피로부터 슈완 세포 (SCs) 및 섬유아세포의 분리
- 5 mL의 1x DPBS를 사용하여 폴리-L-라이신(PLL, 0.01 μg/μL)으로 T25 플라스크를 프리코트하였다. 예비코팅된 플라스크를 3시간 동안 37°C에서 놓는다. PLL 코팅 매트릭스를 1x DPBS (5 mL)를 사용하여 두 번 세척한다.
참고 : T25 플라스크는 미리 준비 할 수 있습니다. - 진피의 단리된 조각을 5 mL의 DMEM 기본 배지로 헹구십시오.
- 진피를 가위 또는 메스로 작은 조각으로 다듬으십시오.
- 다진 진피를 5 mL의 콜라게나제 (DMEM 기본 배지에서 2 mg / mL)로 37 °C에서 2.5 시간 동안 소화하십시오. 진피가 완전히 해리 될 때까지 30 분마다 피펫 팁으로 다진 진피를 부드럽게 삼중시킵니다.
- 세포 현탁액을 70 μM 세포 스트레이너로 여과한다. 현탁액을 완전히 여과하기 위해 1 mL 주사기를 사용하여 기계적 힘을 가할 필요가 있습니다.
- 여과된 세포 현탁액을 5 mL의 완전한 DMEM 배지 (DMEM 기본 배지 + 5% FBS + 1x 항생제)로 희석하여 콜라게나제의 효소 활성을 정지시킨다.
- 세포 현탁액을 RT에서 5분 동안 870 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다.
- 이러한 세포 펠릿으로부터, 섬유아세포 및 SCs 둘 모두가 수득될 것이다. 세포 펠릿을 DMEM 완전 배지 2mL에 재현탁시켜 세포를 분열시키고(1 mL 세포 현탁액/튜브) RT에서 5분 동안 870 x g 에서 원심분리한다.
- SC 배양의 경우, 단계 1.3.10-1.3.17을 따르고, 섬유아세포 배양을 위해, 단계 1.3.18-1.3.22를 따른다.
- 단계 1.3.8로부터, 상청액을 흡인한다. 세포 펠릿을 5 mL의 신선한 DMEM 완전 배지에 재현탁시킨다.
- 세포 수와 생존력을 정량화하십시오.
참고 : 여기에서는 전문 세포 샘플링 및 염색 장치 (물질 표)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 수와 생존력을 정량화했습니다. - 미리 코팅된 T25 플라스크에 5mL의 재현탁된 세포를 밀도 4.0 x 103 cells/mL로 시드합니다. 플라스크를 5% CO2의 존재 하에 37°C에서 밤새 인큐베이션한다(∼12-16 시간 인큐베이션).
- 16시간 후, 10x 배율에서 현미경(표 자료)으로 세포 부착을 확인하였다.
- 부착되지 않은 세포를 제거하고 3x 플라스크를 5 mL의 1x DPBS로 세척한다.
- DMEM 완전 배지에 10 μM 시토신 아라비노사이드(항균제, 섬유아세포를 죽임) 5 mL를 첨가한다. 플라스크를 5% CO2의 존재 하에 37°C에서24시간 동안 인큐베이션한다.
- 시토신 아라비노사이드 함유 배지를 플라스크로부터 흡인한다. 플라스크를 5mL의 1x DPBS로 3x 헹구십시오.
- 배양 플라스크를 5 mL의 SCs 완전 배양 배지 (표 자료)로 리필하고, 48 시간 동안 5%CO2의 존재 하에 37°C에서 인큐베이션한다. SC가 80% 합류에 도달할 때까지 SC 완전 배양 배지를 격일로 리프레시하십시오.
- 해리된 진피층으로부터 상청액을 흡인하고(단계 1.3.8), 세포 펠릿을 5 mL의 섬유아세포 완전 배지(섬유아세포 기초 배지 + 5% FBS + 1x 항생제)로 재현탁시킨다.
- 세포 수와 세포 생존율을 정량화하십시오.
참고 : 여기에서는 전문 세포 샘플링 및 염색 장치 (물질 표)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 수와 생존력을 정량화했습니다. - 섬유아세포를 5mL의 섬유아세포 완전 배지를 사용하여 T25 배양 플라스크(미리 코팅되지 않음)에 4.0 x 103 cells/mL의 세포 밀도로 플레이트화한다. 5% CO2의 존재 하에 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다(∼12-16 시간 인큐베이션).
- 16-24시간 후, 10x 배율에서 현미경(표 자료)으로 세포 부착을 확인하였다. 플라스크로부터 비부착성 세포를 흡인하고, 플라스크를 5 mL의 1x DPBS로 두 번 세척한다.
- 신선한 섬유아세포 완전 배지 5 mL를 첨가하고, 48시간 동안 5%CO2 의 존재 하에 37°C에서 인큐베이션한다. 섬유아세포가 계류 분석 또는 하류 분석(50%-80% 합류)을 위해 원하는 합류점에 도달할 때까지 격일로 배양 배지를 새로 고칩니다.
- 5 mL의 1x DPBS를 사용하여 폴리-L-라이신(PLL, 0.01 μg/μL)으로 T25 플라스크를 프리코트하였다. 예비코팅된 플라스크를 3시간 동안 37°C에서 놓는다. PLL 코팅 매트릭스를 1x DPBS (5 mL)를 사용하여 두 번 세척한다.
2. 면역형광에 의한 표피 각질세포, 진피 SC 및 섬유아세포 단백질 마커의 검증
- 1 일째 - 코트 챔버 유리 슬라이드 및 분리 셀
- 프리코트 4-웰 챔버 유리 슬라이드는 케라티노사이트용 콜라겐-I, 또는 SCs용 PLL이나, 섬유아세포의 경우 1x DPBS(각 웰당 0.5mL)만 사용할 수 있다. 전체 표면을 코팅하십시오. 챔버 슬라이드를 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 중에 세포를 준비하십시오.
- 배양된 세포가 50%-80% 합류에 도달한 후, 플라스크를 1x DPBS 3x(각 웰당 1 mL)로 세척한다.
- 부착된 세포를 5 mL의 0.25% 트립신-EDTA(TE) 용액으로 분리하고, 세포가 둥글기 시작할 때까지 2분 동안 5%CO2 의 존재 하에 37°C에서 인큐베이션한다. 10x 배율에서 현미경 (재료 표)으로 세포 분리를 시각화하십시오.
- 인큐베이션 후, 세포를 함유하는 TE 용액을 5 mL 소 태아 혈청 (FBS)이 있는 원뿔형 튜브로 옮긴다.
- 5 mL의 트립신 중화 완충액(TNB)을 배양 플라스크에 첨가한 다음, 내용물을 상기 언급된 원심분리 튜브(TE 및 FBS를 갖는 세포)로 옮긴다. 10x 배율에서 현미경 (재료 표)으로 세포 분리를 시각화하십시오.
참고: TNB 또는 FBS 또는 둘 다 트립신 활성을 중화시키는 데 사용할 수 있습니다. - 세포/TE/TNB를 포함하는 원뿔형 튜브를 870 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 다른 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 상응하는 완전한 배양 배지에 재현탁시킨다. 단계 1.2.11에서 언급된 바와 같이 세포 생존율을 측정한다.
- 예비코팅된 챔버 유리 슬라이드(단계 2.1.1)를 1x DPBS(각 웰당 1 mL)로 3배 헹구십시오.
- 조직 배양 후드 내부의 슬라이드를 적절한 완전한 세포 배양 배지에서 적절한 밀도(30,000 세포/0.5 mL/챔버)로 종자 각질세포, SC 또는 섬유아세포에 반건조시킨다.
- 챔버 슬라이드를 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 세포가 부착되도록 한다.
- 제2일-챔버 글라스 슬라이드를 소혈청알부민(BSA) 및 일차 항체로 블로킹하고 인큐베이션한다.
- 챔버 슬라이드로부터 세포 배지를 흡인하고, 1x DPBS의 1 mL로 3x 세척한다.
- 부착된 세포를 1x DPBS (각 웰당 1 mL) 중의 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 조직 배양 후드 내부의 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 챔버 슬라이드로부터 4% 파라포름알데히드를 흡인하고, 챔버 슬라이드를 1x DPBS(각 웰당 1 mL)로 3x 세척한다.
- 세포막을 1x DPBS 중의 1% TritonX-100(각 웰당 1 mL)으로 투과시키고 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 블로킹 용액을 챔버 슬라이드로부터 흡인하고, 30초 동안 1x DPBS(각 웰당 1 mL)로 3x 세척한 다음, 웰로부터 1x DPBS를 흡인한다.
- 챔버 슬라이드를 5% BSA(각 웰당 0.5 mL)로 차단하고 RT에서 45분 동안 인큐베이션한다.
- 블로킹 용액을 챔버 슬라이드로부터 흡인하고, 각각 30초 동안 1x DPBS(각 웰당 1 mL)로 3x 세척한 다음, 웰로부터 1x DPBS를 흡인한다.
- 1차 항체를 5% BSA (각 웰당 0.2 mL)로 희석 (1차 항체 희석물: 케라티노사이트: 마우스 시토케라틴 14 항체 (1:100) 및, 시토케라틴 10 항체 (1:100); 슈완 세포: 마우스 S100 항체 (1:200), 및 토끼 신경 성장 인자 수용체 (p75-NTR) 항체 (1:500); 섬유아세포: 토끼 비멘틴 항체(1:200) 및 마우스 알파-평활근 액틴(α-SMA) 항체(1:200)).
- 일차 항체를 챔버 유리 슬라이드 상의 상응하는 세포에 첨가하고, 가습된 챔버에서 4°C에서 약 15-16 h (밤새) 동안 인큐베이션한다.
- 챔버 슬라이드로부터 일차 항체를 흡인하고, 각각 30초 동안 1x DPBS (각 웰당 1 mL)로 3회 세척한 다음, 웰로부터 1x DPBS를 흡인한다.
- 이차 항체 (염소 항-토끼 IgG 이차 항체-알렉사 플루오르 488 (1:500) 및 염소 항-마우스 IgG 이차 항체-알렉사 플루오르 594 (1:500))를 0.5% BSA로 희석한다. 적절한 2차 항체를 각 웰에 첨가한다 (각 웰당 0.2 mL). RT에서 45분 동안 인큐베이션한다.
- 챔버 슬라이드로부터 이차 항체를 흡인하고, 각각 30초 동안 1x DPBS (각 웰당 1 mL)로 3x 세척한 다음, 웰로부터 1x DBPS를 흡인한다.
- 개스킷 제거제를 사용하여 4웰 챔버 슬라이드의 가스켓을 제거합니다. 이것이 커버슬립 적용을 방해하므로 슬라이드에 접착제를 두지 마십시오. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 또는 DAPI로 웰을 카운터 염색하고 비라벨 함유 장착 매체를 사용하십시오.
- 에어 버블을 피하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 조심스럽게 놓고 커버 슬립의 끝을 접착제로 밀봉하십시오. 10x 및/또는 20x 배율에서 현미경(물질 표)으로 면역형광 염색 패턴을 관찰하십시오.
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Representative Results
정상 신생아 포피는 원발성 표피 각질세포 및 진피 SC 및 섬유아세포의 단리를 위해 사용되었다. 단리된 일차 세포를 성장 인자를 함유하는 각각의 세포 배양 배지에서 배양하였다. 배양 플라스크에서 SCs 및 섬유아세포를 시딩한 후, 대부분의 세포는 2시간 이내에 플라스크의 바닥에 부착되었다. 각질세포의 경우, 대부분의 각질세포는 24 h에 의해 부착되었다. 분리된 표피 일차 각질세포는 7일째까지 85% 합류에 도달하였고, 특징적인 세포 형태학(조약돌 형상)을 나타내었다(도 1A). SC는 5일째까지 95%의 합류율에 도달하였고 양극성 또는 삼극 형상으로 나타났다(그림 1B). 섬유아세포 배양물은 4일째까지 95% 합류에 도달하였고, 대부분의 세포는 스핀들 형상 형태를 나타내었다(도 1C). 이들 배양물에서 세포형 특이적 단백질 발현을 면역형광염색을 통해 확인하였다. 각질세포는 K10(분화 마커) 및 K14(증식 마커) 단백질에 대해 양성이었고(도 2A); 유사하게, SCs는 S100 및 p75-NTR에 대해 양성이었다(도 2C). 섬유아세포는 비멘틴을 긍정적으로 발현하였으나, 근섬유아세포 마커인 알파 평활근 액틴(α-SMA)을 발현하지 않았다(도 2E).
케라틴 면역형광 및 DAPI 핵 염색의 병합된 이미지(도 2A)는 배양물에서 세포의 97.8%가 각질세포였다는 것을 나타내었다(도 2B). 이중 S100 및 p75-NTR 양성 슈완 세포는 프로토콜에 따른 배양물에서 95.2% SCs의 순도를 시사한다(도 2C, D). 유사하게, 섬유아세포 배양물에서 세포의 97.2%는 비멘틴을 긍정적으로 발현시켰다(도 2E,F). 따라서, 특징적인 단백질 발현은 각각의 세포 유형에서 발견되며, 프로토콜은 비교적 순수한 세포 집단의 단리를 허용한다.
도 1: 인간 포피 유래 1차 각질세포, 슈완 세포 및 섬유아세포의 분리. (A) 각질세포, (B) 슈완 세포, 및 (C) 섬유아세포를 위상차 현미경 하에서; 스케일 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 인간 포피 유래 일차 각질세포, 슈완 세포 및 섬유아세포의 특성화. (A) 케라틴 14 (K14, 증식성 각질세포) 및 K10 (케라틴 10, 케라티노사이트 분화 마커)을 사용하여 각질세포를 동정하였다. scale bar = 100 μm. (B) 면역형광 이중 염색된 세포를 이용한 배양된 각질세포의 순도에 대한 통계적 분석. (c) 슈완 세포는 S100 및 p75-NTR (신경 성장 인자 수용체)을 사용하여 확인되었다; 스케일 바 = 100 μm. (D) 면역형광 이중 염색된 세포를 이용한 배양된 SCs의 순도의 통계적 분석. (e) 섬유아세포는 비멘틴(fibroblast) 및 α-평활근 액틴(섬유아세포 분화, 근섬유아세포)을 사용하여 동정하였다; scale bar = 100 μm. (F) 면역형광 비멘틴 염색된 세포를 이용하여 배양된 섬유아세포의 순도에 대한 통계적 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 포피의 단일 조각, 즉 각질세포, 섬유아세포 및 슈완 세포로부터 세 개의 별개의 세포 집단을 분리하는 방법을 기술한다. 각질세포 및 섬유아세포2,3,5,6을 분리하는데 이용가능한 몇 가지 분리 프로토콜이 있지만, SC 단리를 기술하는 것은 없다. 피부, 각질세포 및 섬유아세포의 주요 구조 세포 외에도 피부는 감각적 구심성 구조와 자율 원심에 의해 고도로 신경질화됩니다. 감각 구심증은 가벼운 접촉, 진동, 통증, 가려움 및 뜨겁고 차가운 감각의 전달에 중요한 역할을합니다. 자율 원심성은 땀샘과 arrector pili 근육을 긴장시킵니다9. 각 신경 축삭은 말초 신경계의 신경교 세포인 SC에 의해 포위된다. SC가 축삭 재생10,11을 지원함에 따라 SC에 대한 연구 및 임상 관심이 상당히 증가했습니다. 피부 신경은 비 신경 세포 (12,13,14)에 대한 통신 신호 (신경 조절제 / 신경 매개체)를 통해 피부 생리학 및 질병 병리학의 중요한 조절자입니다.
피부에서 신경 SC의 광범위한 분포에도 불구하고, 피부 생리학에서 SC의 특정 역할에 관한 제한된 정보가 존재한다. 피부의 SC는 피부의 다른 비 신경 세포와 어떻게 상호 작용합니까? 이 질문에 답하는 것은 신뢰할 수있는 시험관 내 세포 배양 모델의 부족으로 인해 방해 받았다. 따라서이 프로토콜을 통해 각 개별 세포의 분석과 동일한 조직의 세포와의 상호 작용을 통해 피부 항상성 및 병리 생리학에서 Schwann 세포의 역할의 특징적인 특징을 정확하게 밝힐 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 단일 인간 포피로부터 세 가지 일차 세포 (SC, 각질 세포 및 섬유 아세포)를 확립하는 간단하고 저렴한 실험 절차입니다. 또한 세 가지 세포 유형 모두가 동일한 조직에서 분리된다는 장점이 있으므로 세포 비교에서 유전 적 차이를 완화하고 조직이 제한된 공급에있을 때 세포 분리를 최적화합니다. 이 프로토콜은 피부 조직 및 배양 조건에서 세 가지 일차 세포에 대한 분리 절차를 수행하고 단순화하는 데 2 일이 걸립니다. 이 프로토콜은 많은 수의 생존 가능한 세포를 안정적으로 산출하며,이 세포의 초기 계대는 초기 도금 후 4-7 일까지 ~ 90 % 합류에 도달했습니다. 우리는 적어도 3 계대 (~ 21 일) 동안 각질 세포를 사용했으며 섬유 아세포와 Schwann 세포는 5-6 계대 (배양에서 ~ 40 일)에 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 기술적 인 문제가 없습니다. 효소 소화 전에 근본적인 지방 조직을 충분히 제거하고 효율적인 표피 / 진피 분리는 각 피부 층에서 비교적 순수한 세포 집단을 얻는 데 중요합니다. 진피 SCs는 더 많은 섬유아세포에 비해 피부에서 상대적으로 낮은 유병률 때문에 피부로부터 분리하기가 더 어렵다. SC 배양물에서 섬유아세포의 임의의 이월은 SCs15를 빠르게 능가할 것이다. SC 순응도를 향상시키기 위해, 우리는 SC16의 접착력을 증가시키기 때문에 PLL로 조직 배양 도자기를 프리 코트하는 것을 선택했습니다. 섬유아세포 오염을 더욱 완화시키기 위해, 시토신 아라비노사이드(antimitotic agent)를 SCs 배양물로부터 빠르게 분열하는 섬유아세포를 제거하기 위해 세포가 단기간 동안 부착된 후에 첨가되었다. 그러나, 시토신 아라비노사이드에 더 오래 노출되면 SCs에 해로울 수도 있다.
전술한 프로토콜을 채택하는 것은 시험관내 실험을 위해 개별 피부 SC, 각질세포, 및 섬유아세포 배양물을 단리하는 것을 가능하게 한다. 이들 별개의 세포 집단은 SC, 각질세포, 및 섬유아세포를 정상 피부 생리학, 상처 치유 동안, 또는 질병 설정을 모방하는 조건 하에서 개별적으로 또는 조합하여 조사하는데 사용될 수 있다.
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Disclosures
다른 모든 저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 Fadia Kamal 박사와 실험실 장비 및 기술 지원을 사용할 수있게 해준 Reyad Elbarbary 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 주립 대학 허쉬 메디컬 센터의 기관 지원 외에도 NIH (K08 AR060164-01A) 및 DOD (W81XWH-16-1-0725)의 보조금으로 J. C. E.에 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
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