Summary
Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC'ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.
Abstract
Bu protokol, cildin hızlı enzimatik ayrışmasını kullanarak izolasyon yöntemlerini, kültürleme koşullarını ve insan birincil hücrelerinin yüksek verim ve canlılığa sahip karakterizasyonunu açıklar. Birincil keratinositler, fibroblastlar ve Schwann hücreleri, standart bakım prosedürlerini takiben mevcut olan insan yenidoğan sünnet derisinden toplanır. Çıkarılan cilt dezenfekte edilir ve deri altı yağ ve kas bir neşter kullanılarak çıkarılır. Yöntem, epidermal ve dermal tabakaların enzimatik ve mekanik olarak ayrılmasından ve ardından bu cilt katmanlarının her birinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ek enzimatik sindirimden oluşur. Son olarak, tek hücreler, haftalar boyunca büyümeyi ve canlılığı korumak için standart hücre kültürü protokollerini izleyerek uygun hücre kültürü ortamında yetiştirilir. Birlikte, bu basit protokol, cilt-sinir modellerinin in vitro değerlendirmesi için üç hücre tipinin de tek bir deri parçasından izolasyonuna, kültürlenmesine ve karakterizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu hücreler birbirleri üzerindeki etkilerini ve in vitro travmaya verdikleri tepkileri, yara iyileşmesi ile ilişkili kültürde robotik olarak gerçekleştirilen çizikler şeklinde ölçmek için ortak kültürlerde birlikte kullanılabilir.
Introduction
Canlı dokudan türetilen ve in vitro koşullar altında kültürlenen birincil hücreler, fizyolojik durum1'e çok benzer, bu da onları fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için ideal bir model haline getirir. Deri, keratinositler, fibroblastlar, sebositler, melanositler ve in vitro deneyler için izole edilebilen ve kültürlenebilen Schwann hücreleri (SC'ler) dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Keratinositleri, fibroblastları ve SC'leri tek bir deri parçasından izole etme ve kültürleme yöntemleri tanımlanmamıştır. Bu protokolün amacı iki yönlüdür: 1) dermal SC'lerin izolasyonu ve kültürlenmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak ve 2) keratinositlerin, fibroblastların ve SC'lerin tek bir insan sünnet derisinden izolasyonu için etkili, sağlam bir yöntem kullanmak.
Şu anda, deri keratinositleri 2,3,4 ve fibroblastları 5,6'yı izole etmek için belirlenmiş protokoller vardır. Bu çalışmalar, keratinositlerin, fibroblastların veya her ikisinin deriden izolasyonunu tanımlamaktadır, ancak hiçbir protokol, birincil SC'lerin kültürlerinin insan derisinden nasıl oluşturulacağını ele almamaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal SC'lerin keratinosit ve fibroblast hücresel süreçlerini modüle ettiğini ve normal cilt fizyolojik fonksiyonlarını düzenlediğini göstermektedir7. SC'ler bu nedenle cilt homeostazı için kritik öneme sahiptir ve mevcut komşu cilt hücresi tiplerinin davranışını etkileyen düzenleyici fizyolojiye önemli ölçüde katkıda bulunur8. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin her birinin izolasyonuna izin veren bir protokol, hücre-hücre iletişimi veya hücre tipleri arasında çapraz konuşmayı içeren in vitro deneyler için idealdir.
Bu protokol, tek bir deri parçasından birincil hücrelerin bireysel hücre kültürlerinin kurulmasını tanımlar. Bu protokol, mevcut doku miktarı sınırlı olduğunda özellikle yararlıdır. Ayrıca, üç hücre tipinin de tek bir donörden izole edilmesi, istenen deney sırasında genetiğin etkisini azaltırken, hücre tipleri veya ko-kültür deneyleri arasında sağlam karşılaştırmalara izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tanımlanmamış insan sünnet derisi dokusunun araştırma amacıyla edinilmesi ve kullanılması gözden geçirilmiş ve Penn State College of Medicine Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #17574) tarafından "insan araştırması değil" tespiti alınmıştır.
NOT: Aşağıdaki protokol izlenerek tek bir sünnet derisinden 2.4 x 10 6 keratinosit, 4.4 x 106 fibroblast ve 1.1 x 106 SC elde edilir. Genel olarak, bu birincil hücreler deneysel koşullara bağlı olarak 3 pasaj için kullanılabilir.
1. Primer hücrelerin izolasyonu ve kültür koşulları
- Epidermis ve dermis ayırma prosedürü
- Yenidoğan sünnet derisini, onaylanmış hastane düzenleyici protokolleri kapsamında bir doktor tarafından standart bakım prosedürlerini izleyerek edinin. Doğumdan sonra sünnetin zamanlamasını ve çıkarılan deri miktarını hekim belirler.
- Eksize edilen sünnet derisini, 8-10 mL buz gibi soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) bazal ortamını içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve sünnet derisini derhal hücre izolasyonu için hücre kültürü laboratuvarına taşıyın. 1x antibiyotik/antimikotik içeren 20-25 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile cildi iki kez durulayın.
NOT: Maksimum hücre canlılığı için, eksize edilen sünnet derisi işlenene kadar 4 ° C'ye yerleştirilmeli ve hücreler 24 saat içinde toplanmalıdır. - DPBS / antibiyotiklerde duruladıktan sonra, sünnet derisini 10 cm'lik bir doku kültürü kabında 10-15 dakika boyunca 25-30 mL buz gibi soğuk DMEM bazal ortamında ıslatın. Steril teknik kullanarak bir doku kültürü davlumbazındaki tüm işleme adımlarını gerçekleştirin.
- Bir neşter kullanarak, sünnet derisini dikkatlice dilimleyin ve dermis ve deri altı yağ dokusunu açığa çıkarın.
- Deri altı yağ dokusunu forseps, neşter bıçağı ve makas kullanarak gerektiği gibi çıkarın. Yağ dokusunu atın. Temizlenmiş sünnet derisini üç ila beş küçük parçaya bölün.
- Cilt parçalarını 16-20 mL dispase-I/DMEM ortamı (DMEM bazal ortamında 4 mg/mL) içeren steril bir konik tüpe aktarın.
- Konik tüpteki cilt parçalarını, dispase-I ile inkübasyonun ilk 30 dakikası boyunca aralıklı olarak ters çevirerek karıştırın. Daha sonra konik tüpü 16-18 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin, cilt parçalarını dispase-I / media'ya batırmaya dikkat edin.
NOT: Dispase-I çözeltisi, soğuk DMEM bazal ortamı kullanılarak eklemeden hemen önce hazırlanmalı, 0,22 μm süzgeç ile filtrelenmeli ve 4 °C'de tutulmalıdır. - Dispase-I ile gece boyunca sindirimden sonra, cilt parçalarını çıkarın ve kuru, steril, kültür kabına yerleştirin. Dış epidermal tabakanın kültür kabına dokunması için her bir cilt parçasını açın.
- İki forseps seti kullanarak, epidermisi dermisten dikkatlice ayırın. Dokunun kenarından başlayın ve epidermisi dermisten uzaklaştırın.
NOT: Epidermis tabakasının dermisten ayrılması zorsa, dispase-I sindirimi yeterli değildi. Sorun giderme seçenekleri: 1) cilt parçalarını dispase-I / DMEM çözeltisine geri döndürün ve 4 ° C'de 2-3 saat daha inkübe edin; 2) cilt parçalarını taze dispase-I / DMEM'e yerleştirin ve 4 ° C'de 2-3 saat daha inkübe edin. - Keratinositleri (epidermis) ve fibroblastları ve Schwann hücrelerini (dermis) izole etmek için ayrılmış epidermis ve dermisi kullanın.
NOT: Belirli hücre tiplerinin izolasyonu ve kültür koşulları için aşağıdaki adımları izleyin.
- Epidermisten keratinosit izolasyonu
- 10 cm'lik bir kültür kabına 5 mL HEPES tampon salin (HBS) ekleyin ve ayrılmış epidermis parçalarını ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inkübe edin.
- HBS inkübasyonundan sonra, HBS çözeltisini 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. 50 mL'lik bir konik tüpe 5 mL tripsin nötralizasyon tamponu (TNB) (Malzeme Tablosu) ekleyin ve bir kenara koyun.
- Epidermal fragmanlara 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Tripsin çözeltisi bulanıklaşana kadar forseps kullanarak epidermal parçaları nazikçe çalkalayın.
- Tripsin çözeltisini/keratinositleri adım 1.2.2'de HBS ve TNB içeren tüpe ekleyin.
- İlk tripsin sindiriminde çözünmemiş kalan epidermal fragmanlar için, 3 mL% 0.25 tripsin / Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 1.2.4 ve 1.2.5 adımlarını tekrarlayın.
- HBS ve TNB solüsyon tüplerini içeren tripsin/EDTA çözeltisine 2 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
- HBS/TNB/tripsin ve keratinositleri içeren toplama tüpünü 870 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 3 mL keratinosit tam büyüme ortamında yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu).
- Kalıntıları gidermek için hücre süspansiyonunu steril bir 100 μM filtre ile steril 50 mL konik bir tüpe filtreleyin.
- Hücre sayısını ve hücre canlılığını ölçün.
NOT: Burada, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sayısını ve canlılığını ölçmek için özel bir hücre örnekleme ve boyama cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. - Deneyler için gerektiğinde tohum kültürü plakaları. Önerilen tohumlama yoğunluğu ~ 45.000 hücre /cm2'dir.
- Keratinositlerin yemeğe yapışmasını sağlamak için kültür plakalarını 37 ° C'de% 5 CO2'de 2 gün boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
- 2 gün sonra, yapışmamış hücreleri aspire edin. Keratinositler pasaj veya aşağı akış deneyleri için istenen birleşime ulaşana kadar hücre kültürü ortamını her gün yenileyin (% 50 -% 80 birleşme).
- Schwann hücrelerinin (SC'ler) ve fibroblastların dermisten izolasyonu
- 5 mL 1x DPBS kullanarak poli-L-lizin (PLL, 0,01 μg/μL) ile ön kat T25 şişeler. Önceden kaplanmış şişeleri 3 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin. PLL kaplama matrisini 1x DPBS (5 mL) kullanarak iki kez yıkayın.
NOT: T25 şişeler önceden hazırlanabilir. - Dermisin izole edilmiş parçalarını 5 mL DMEM bazal ortamı ile durulayın.
- Dermisi makas veya neşterle küçük parçalara ayırın.
- Kıyılmış dermisi 5 mL kollajenaz (DMEM bazal ortamında 2 mg / mL) ile 37 ° C'de 2.5 saat boyunca sindirin. Kıyılmış dermisi, dermis tamamen ayrışana kadar her 30 dakikada bir pipet ucu ile nazikçe tritüre edin.
- Hücre süspansiyonunu 70 μM hücre süzgeci ile filtreleyin. Süspansiyonu tamamen filtrelemek için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak mekanik kuvvet uygulamak gerekir.
- Kollajenazın enzimatik aktivitesini durdurmak için filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 5 mL tam DMEM ortamı (DMEM bazal ortamı +% 5 FBS + 1x antibiyotik) ile seyreltin.
- Hücreleri peletlemek için RT'de 5 dakika boyunca 870 x g'de hücre süspansiyonunu santrifüj edin.
- Bu hücre peletinden hem fibroblastlar hem de SC'ler elde edilecektir. Hücreleri bölmek için hücre peletini 2 mL DMEM tam ortamında yeniden askıya alın (1 mL hücre süspansiyonu / tüpü) ve RT'de 5 dakika boyunca 870 x g'de santrifüj yapın.
- SC kültürü için 1.3.10-1.3.17 adımlarını izleyin ve fibroblast kültürü için 1.3.18-1.3.22 adımlarını izleyin.
- Adım 1.3.8'den itibaren, süpernatanı aspire edin. Hücre peletini 5 mL taze DMEM tam ortamında yeniden askıya alın.
- Hücre sayısını ve canlılığını ölçün.
NOT: Burada, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sayısını ve canlılığını ölçmek için özel bir hücre örnekleme ve boyama cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. - Önceden kaplanmış T25 şişeleri, 4.0 x 103 hücre/mL yoğunlukta 5 mL yeniden askıya alınmış hücre ile tohumlayın. Şişeyi gece boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin (~ 12-16 saat inkübasyon).
- 16 saat sonra, 10x büyütmede mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile hücre yapışmasını onaylayın.
- Yapışkan olmayan hücreleri çıkarın ve şişeyi 3x, 5 mL 1x DPBS ile yıkayın.
- DMEM tam ortamına 5 mL 10 μM sitozin arabinozid (antimitotik ajan, fibroblastları öldürür) ekleyin. Şişeyi 37 °C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 varlığında inkübe edin.
- Sitozin arabinozid içeren ortamı şişeden aspire edin. Şişeyi 5 mL 1x DPBS ile 3x durulayın.
- Kültür şişesini 5 mL SC komple kültür ortamı (Malzeme Tablosu) ile doldurun ve 48 saat boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin. SC'ler %80 birleşime ulaşana kadar SC komple kültür ortamını her gün yenileyin.
- Süpernatantı ayrışmış dermal tabakadan aspire edin (adım 1.3.8) ve hücre peletini 5 mL fibroblast tam ortamı (fibroblast bazal ortamı +% 5 FBS + 1x antibiyotik) ile yeniden askıya alın.
- Hücre sayısını ve hücre canlılığını ölçün.
NOT: Burada, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sayısını ve canlılığını ölçmek için özel bir hücre örnekleme ve boyama cihazı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. - Fibroblastları, 5 mL fibroblast tam ortamı kullanarak T25 kültür şişelerinde (önceden kaplanmamış) 4.0 x 103 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğunda plakalayın. Gece boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin (~ 12-16 saat inkübasyon).
- 16-24 saat sonra, 10x büyütmede mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile hücre yapışmasını onaylayın. Yapışkan olmayan hücreleri şişeden aspire edin ve şişeyi 5 mL 1x DPBS ile iki kez yıkayın.
- 5 mL taze fibroblast tam ortam ekleyin ve 48 saat boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe edin. Fibroblastlar pasaj veya aşağı akış tahlilleri için istenen birleşime ulaşana kadar kültür ortamını her gün yenileyin (% 50 -% 80 birleşim).
- 5 mL 1x DPBS kullanarak poli-L-lizin (PLL, 0,01 μg/μL) ile ön kat T25 şişeler. Önceden kaplanmış şişeleri 3 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin. PLL kaplama matrisini 1x DPBS (5 mL) kullanarak iki kez yıkayın.
2. Epidermal keratinositlerin, dermal SC'lerin ve fibroblastların protein belirteçlerinin immünofloresan ile doğrulanması
- 1. Gün - Kat hazneli cam kızaklar ve hücreleri ayırın
- Keratinositler için kollajen-I veya SC'ler için PLL veya fibroblastlar için sadece 1x DPBS (her bir kuyucuk için 0,5 mL) ile ön kaplamalı 4 delikli cam slaytlar. Tüm yüzeyi kapladığınızdan emin olun. Kuluçka odası 2 saat boyunca 37 °C'de kayar. Kuluçka sırasında hücreleri hazırlayın.
- Kültürlenmiş hücreler% 50 -% 80 birleşime ulaştıktan sonra, şişeleri 1x DPBS 3x (her kuyucuk için 1 mL) ile yıkayın.
- Yapıştırılan hücreleri, hücreler yuvarlanmaya başlayana kadar, 2 dakika boyunca% 5 CO 2 varlığında 37 ° C'de inkübe ederek%0.25 tripsin-EDTA (TE) çözeltisinin 5 mL'si ile ayırın. Hücre ayrılmasını mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile 10x büyütmede görselleştirin.
- Kuluçkadan sonra, TE çözeltisini içeren hücreleri 5 mL fetal sığır serumu (FBS) içeren konik bir tüpe aktarın.
- Kültür şişesine 5 mL tripsin nötralizasyon tamponu (TNB) ekleyin ve ardından içeriği yukarıda belirtilen santrifüj tüpüne (TE ve FBS'li hücreler) aktarın. Hücre ayrılmasını mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile 10x büyütmede görselleştirin.
NOT: TNB veya FBS veya her ikisi de tripsin aktivitesini nötralize etmek için kullanılabilir. - Hücreler/TE/TNB içeren konik tüpü 870 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı başka bir tüpe aktarın ve hücre peletini karşılık gelen tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Adım 1.2.11'de belirtildiği gibi hücre canlılığını ölçün.
- Önceden kaplanmış hazneli cam kızakları (adım 2.1.1) 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) 3x ile durulayın.
- Doku kültürü davlumbazının içindeki slaytları ve tohum keratinositlerini, SC'leri veya fibroblastları uygun bir yoğunlukta (30.000 hücre / 0.5 mL / oda) uygun bir tam hücre kültürü ortamında yarı kurulayın.
- Hücrelerin yapışmasına izin vermek için oda kızaklarını gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 2. Gün - Sığır Serum Albümini (BSA) ve primer antikor inkübasyonu ile hazneli cam kaydırağın bloke edilmesi
- Hücre ortamını oda kızaklarından aspire edin ve 1 mL 1x DPBS ile 3x'i yıkayın.
- Yapıştırılan hücreleri 1x DPBS'de (her bir kuyucuk için 1 mL) %4 paraformaldehit ile sabitleyin ve doku kültürü başlığının içindeki RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Oda slaytlarından% 4 paraformaldehit aspire edin ve oda slaytlarını 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x yıkayın.
- Hücre zarlarını 1x DPBS'de (her kuyucuk için 1 mL) %1 TritonX-100 ile geçirgenleştirin ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Blokaj çözeltisini hazne kızaklarından aspire edin, 30 s boyunca 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x'i yıkayın ve ardından kuyudan 1x DPBS'yi aspire edin.
- Oda kızaklarını %5 BSA (her kuyucuk için 0,5 mL) ile bloke edin ve RT'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Blokaj çözeltisini hazne kızaklarından aspire edin, her biri 30 s boyunca 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x'i yıkayın ve ardından kuyudan 1x DPB'yi aspire edin.
- Birincil antikorları% 5 BSA (her kuyucuk için 0.2 mL) ile seyreltin (Birincil antikorlar seyreltmeleri: Keratinositler: fare sitokeratin 14 antikoru (1:100) ve sitokeratin 10 antikoru (1:100); Schwann hücreleri: fare S100 antikoru (1:200) ve tavşan sinir büyüme faktörü reseptörü (p75-NTR) antikoru (1:500); Fibroblastlar: tavşan vimentin antikoru (1:200) ve fare alfa-düz kas aktini (α-SMA) antikoru (1:200)).
- Birincil antikorları hazneli cam slayt üzerindeki karşılık gelen hücrelere ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de yaklaşık 15-16 saat (gecelik) inkübe edin.
- Birincil antikorları oda slaytlarından aspire edin, her biri 30 s için 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3 kez yıkayın ve ardından kuyudan 1x DPBS'yi aspire edin.
- İkincil antikorları (Keçi anti-tavşan IgG Sekonder Antikor-Alexa Fluor 488 (1:500) ve Keçi anti-Fare IgG Sekonder Antikoru-Alexa Fluor 594 (1:500)) %0.5 BSA ile seyreltin. Her bir kuyucuğa uygun ikincil antikor ekleyin (her kuyucuk için 0.2 mL). RT'de 45 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
- Sekonder antikoru hazne slaytlarından aspire edin, her biri 30 s boyunca 1x DPBS (her kuyucuk için 1 mL) ile 3x'i yıkayın ve ardından kuyudan 1x DBPS'yi aspire edin.
- Conta sökücüyü kullanarak 4 delikli odacıklı sürgü üzerindeki contayı çıkarın. Slayt üzerinde herhangi bir yapıştırıcı bırakmamaya çalışın, çünkü bu kapak kaydırma uygulamasına müdahale eder. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bir damla montaj ortamı ekleyin. Alternatif olarak, kuyucukları DAPI ile karşı lekeleyin ve etiket içermeyen bir montaj ortamı kullanın.
- Hava kabarcıklarından kaçınarak kapak kaymasını cam sürgü üzerine dikkatlice yerleştirin ve kapak kaymasının ucunu yapıştırıcı ile kapatın. İmmünofloresan boyama modellerini mikroskopi (Malzeme Tablosu) ile 10x ve / veya 20x büyütmede gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primer epidermal keratinositler ile dermal SC'ler ve fibroblastların izolasyonu için normal yenidoğan sünnet derisi kullanıldı. İzole edilen primer hücreler, büyüme faktörleri içeren ilgili hücre kültürü ortamlarında kültürlendi. Kültür şişelerinde SC'lerin ve fibroblastın tohumlanmasından sonra, hücrelerin çoğu şişenin dibine 2 saat içinde yapışır. Keratinositler söz konusu olduğunda, çoğu keratinosit 24 saat yapışır. İzole epidermal primer keratinositler 7. günde %85 birleşime ulaşmış ve karakteristik hücre morfolojisi (parke taşı şekli) sergilemiştir (Şekil 1A). SC'ler 5. günde %95 birleşime ulaştı ve bi-polar veya tri-polar şeklinde göründü (Şekil 1B). Fibroblast kültürleri 4. günde %95 birleşime ulaştı ve hücrelerin çoğunda iğ şeklinde morfoloji sergilendi (Şekil 1C). Bu kültürlerde hücre tipine özgü protein ekspresyonu immünofloresan boyama ile doğrulandı. Keratinositler K10 (farklılaşma belirteci) ve K14 (proliferasyon belirteci) proteinleri için pozitifti (Şekil 2A); Benzer şekilde, SC'ler S100 ve p75-NTR için pozitifti (Şekil 2C). Fibroblastlar vimentini pozitif olarak eksprese ettiler, ancak miyofibroblast belirtecini, alfa düz kas aktinini (α-SMA) eksprese etmediler (Şekil 2E).
Keratin immünofloresan ve DAPI nükleer boyamasının birleştirilmiş görüntüleri (Şekil 2A), kültürlerdeki hücrelerin% 97.8'inin keratinositler olduğunu göstermiştir (Şekil 2B). Çift S100 ve p75-NTR pozitif Schwann hücreleri, protokolü takiben kültürde% 95.2 SC'lerin saflığını göstermektedir (Şekil 2C, D). Benzer şekilde, fibroblast kültürlerindeki hücrelerin% 97.2'si pozitif vimentin eksprese etti (Şekil 2E, F). Böylece, karakteristik protein ekspresyonu ilgili hücre tiplerinde bulunur ve protokol, nispeten saf hücre popülasyonlarının izolasyonuna izin verir.
Şekil 1: İnsan sünnet derisi kaynaklı primer keratinositlerin, Schwann hücrelerinin ve fibroblastların izolasyonu. (A) Keratinositler, (B) Schwann hücreleri ve (C) Faz kontrast mikroskobu altında fibroblastlar; ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan sünnet derisi kaynaklı primer keratinositlerin, Schwann hücrelerinin ve fibroblastların karakterizasyonu. (A) Keratinositler keratin 14 (K14, proliferatif keratinositler) ve K10 (keratin 10, keratinosit farklılaşma belirteci) kullanılarak tanımlandı; ölçek çubuğu = 100 μm. (B) İmmünofloresanlar çift boyalı hücreler kullanılarak kültürlenmiş keratinositlerin saflığının istatistiksel analizi. (C) Schwann hücreleri S100 ve p75-NTR (sinir büyüme faktörü reseptörü) kullanılarak tanımlandı; ölçek çubuğu = 100 μm. (D) İmmünofloresanlar çift boyalı hücreler kullanılarak kültürlenmiş SC'lerin saflığının istatistiksel analizi. (E) Fibroblastlar vimentin (fibroblast) ve α düz kas aktini (fibroblast farklılaşması, miyofibroblast) kullanılarak tanımlandı; ölçek çubuğu = 100 μm. (F) İmmünofloresanlar vimentin boyalı hücreler kullanılarak kültürlenmiş fibroblastların saflığının istatistiksel analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, üç farklı hücre popülasyonunu sünnet derisinin tek bir parçasından, yani keratinositlerden, fibroblastlardan ve Schwann hücrelerinden izole etmek için bir yöntemi tanımlar. Keratinositleri ve fibroblastları 2,3,5,6 izole etmek için birkaç izolasyon protokolü vardır, ancak hiçbiri SC izolasyonunu tanımlamaz. Derideki anahtar yapısal hücreler, keratinositler ve fibroblastların yanı sıra, cilt ayrıca duyusal afferent yapılar ve otonomik eferentler tarafından da oldukça innerve edilir. Duyusal afferentler, hafif dokunuş, titreşim, ağrı, kaşıntı ve sıcak ve soğuk duyumların iletilmesinde önemli bir rol oynar. Otonom eferentler ter bezlerini ve arrector pili kaslarını innerve eder9. Her sinir aksonu, periferik sinir sisteminin glial hücreleri olan bir SC tarafından kaplanır. SC'lere yönelik araştırma ve klinik ilgiler, SC'ler aksonal rejenerasyonu desteklediği için önemli ölçüde artmıştır10,11. Deri sinirleri, nöral olmayan hücrelere iletişim sinyalleri (nöromodülatörler/nöromediatörler) yoluyla cilt fizyolojisinin ve hastalık patolojisinin önemli düzenleyicileridir12,13,14.
Sinir SC'lerinin derideki geniş dağılımına rağmen, SC'lerin cilt fizyolojisindeki spesifik rolü hakkında sınırlı bilgi bulunmaktadır. Derideki SC'ler ciltteki diğer nöronal olmayan hücrelerle nasıl etkileşime girer? Bu soruyu cevaplamak, güvenilir in vitro hücre kültürü modellerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Bu nedenle, bu protokolle, her bir hücrenin analizi ve aynı dokudan hücrelerle etkileşimleri, Schwann hücrelerinin cilt homeostazı ve patofizyolojisindeki rollerinin karakteristik özelliklerini tam olarak ortaya çıkarabilir.
Bu protokolün en önemli avantajlarından biri, tek bir insan sünnet derisinden üç birincil hücre (SC'ler, keratinositler ve fibroblast) oluşturmak için basit, ucuz bir deneysel prosedürdür. Ayrıca, her üç hücre tipinin de aynı dokudan izole edilmesinin avantajına sahiptir, böylece hücre karşılaştırmalarındaki genetik farklılıkları azaltır ve doku sınırlı miktarda olduğunda hücre izolasyonlarını optimize eder. Bu protokolün uygulanması 2 gün sürer ve cilt dokusundan ve kültürleme koşullarından üç birincil hücre için izolasyon prosedürünü basitleştirir. Bu protokol güvenilir bir şekilde yüksek sayıda canlı hücre verir ve bu hücrelerin ilk geçişleri, ilk kaplamadan 4-7 gün sonra ~% 90 birleşmeye ulaşır. Keratinositleri en az 3 pasaj (~21 gün) kullandık ve fibroblast ve Schwann hücreleri 5-6 pasaj (kültürde ~ 40 gün) için kullanılabilir.
Bu protokol teknik zorluklar olmadan değildir. Altta yatan yağ dokusunun yeterli miktarda çıkarılması ve enzimatik sindirimden önce etkili epidermal/dermal ayrım, her cilt tabakasından nispeten saf hücre popülasyonları elde etmenin anahtarıdır. Dermal SC'lerin, daha fazla sayıda fibroblasta kıyasla derideki nispeten düşük prevalansı nedeniyle deriden izole edilmesi daha zordur. SC kültürlerinde fibroblastların herhangi bir şekilde taşınması, SC'lerin15'ini hızla aşacaktır. SC aderansını arttırmak için, SC16'nın yapışmasını arttırdığı için PLL ile doku kültürü yazılımını ön kaplamayı tercih ettik. Fibroblast kontaminasyonunu daha da azaltmak için, hücreler SC kültürlerinden hızla bölünen fibroblastları çıkarmak için kısa bir süre yapıştıktan sonra sitozin arabinozid (antimitotik ajan) eklendi. Bununla birlikte, sitozin arabinositine daha uzun süre maruz kalmak da SC'lere zararlı olabilir.
Yukarıda tarif edilen protokolün benimsenmesi, in vitro deneyler için bireysel cilt SC'lerini, keratinositleri ve fibroblast kültürlerini izole etmeyi mümkün kılar. Bu farklı hücre popülasyonları, SC'leri, keratinositleri ve fibroblastları ayrı ayrı veya normal cilt fizyolojisi, yara iyileşmesi sırasında veya bir hastalık ortamını taklit eden koşullar altında kombinasyon halinde araştırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Diğer tüm yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Dr. Fadia Kamal ve Dr. Reyad Elbarbary'ye laboratuvar araçlarını ve teknik desteği kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hershey Tıp Merkezi'nden kurumsal desteğe ek olarak, NIH (K08 AR060164-01A) ve DOD'dan (W81XWH-16-1-0725) JC E.'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical - sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
