Summary
Denne protokol beskriver metoder til sektionering, farvning og billeddannelse af fritsvævende vævssektioner i musehjernen efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af analysen af astrocytområdevolumen og astrocytterritoriumoverlapning eller flisebelægning.
Abstract
Astrocytter besidder en forbløffende grad af morfologisk kompleksitet, der gør det muligt for dem at interagere med næsten alle typer celler og strukturer i hjernen. Gennem disse interaktioner regulerer astrocytter aktivt mange kritiske hjernefunktioner, herunder synapsedannelse, neurotransmission og ionhomeostase. I gnaverhjernen vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet i løbet af de første tre postnatale uger og etablerer forskellige, ikke-overlappende territorier for at flise hjernen. Denne protokol giver en etableret metode til analyse af astrocytområdevolumen og astrocytfliser ved hjælp af fritsvævende vævssektioner fra musehjernen. For det første beskriver denne protokol trinene til vævsindsamling, kryosesektion og immunostaining af fritflydende vævssektioner. For det andet beskriver denne protokol billedoptagelse og analyse af astrocytområdevolumen og territoriumoverlapningsvolumen ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware. Endelig diskuterer dette manuskript fordelene, vigtige overvejelser, almindelige faldgruber og begrænsninger ved disse metoder. Denne protokol kræver hjernevæv med sparsom eller mosaik fluorescerende mærkning af astrocytter og er designet til at blive brugt med fælles laboratorieudstyr, konfokal mikroskopi og kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware.
Introduction
Astrocytter er udførligt forgrenede celler, der udfører mange vigtige funktioner i hjernen1. I musebarken giver radiale glialstamceller anledning til astrocytter i de sene embryonale og tidlige postnatale stadier2. I løbet af de første tre postnatale uger vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet og udvikler tusindvis af fine grene, der direkte interagerer med synapser1. Samtidig interagerer astrocytter med tilstødende astrocytter for at etablere diskrete, ikke-overlappende territorier for at flise hjernen3, samtidig med at kommunikationen opretholdes via gap junction kanaler4. Astrocytmorfologi og organisation forstyrres i mange sygdomstilstande efter fornærmelse eller skade5, hvilket indikerer betydningen af disse processer for korrekt hjernefunktion. Analyse af astrocytmorfologiske egenskaber under normal udvikling, aldring og sygdom kan give værdifuld indsigt i astrocytbiologi og fysiologi. Desuden er analyse af astrocytmorfologi efter genetisk manipulation et værdifuldt værktøj til at skelne mellem de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer etablering og vedligeholdelse af astrocytmorfologisk kompleksitet.
Analyse af astrocytmorfologi i musehjernen kompliceres af både astrocytforgreningskompleksitet og astrocytfliser. Antistoffarvning ved hjælp af det mellemliggende filament glial fibrillary acidic protein (GFAP) som en astrocytspecifik markør fanger kun de vigtigste grene og undervurderer i høj grad astrocytmorfologisk kompleksitet1. Andre cellespecifikke markører såsom glutamattransportør 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminsyntetase eller S100β gør et bedre stykke arbejde med at mærke astrocytgrene6, men introducerer et nyt problem. Astrocytområder er stort set ikke overlappende, men der findes en lille grad af overlapning ved de perifere kanter. På grund af kompleksiteten af forgrening, når nærliggende astrocytter er mærket med samme farve, er det umuligt at skelne, hvor den ene astrocyt slutter, og den anden begynder. Sparsom eller mosaikmærkning af astrocytter med endogene fluorescerende proteiner løser begge problemer: den fluorescerende markør fylder cellen for at fange alle grene og giver mulighed for billeddannelse af individuelle astrocytter, der kan skelnes fra deres naboer. Flere forskellige strategier er blevet brugt til at opnå sparsom fluorescerende mærkning af astrocytter, med eller uden genetisk manipulation, herunder viral injektion, plasmidelektroporation eller transgene muselinjer. Detaljer om gennemførelsen af disse strategier er beskrevet i tidligere offentliggjorte undersøgelser og protokoller 1,7,8,9,10,11,12,13.
Denne artikel beskriver en metode til måling af astrocytområdevolumen fra musehjerner med fluorescerende mærkning i en sparsom population af astrocytter (figur 1). Fordi den gennemsnitlige diameter af en astrocyt i musebarken er ca. 60 μm, bruges 100 μm tykke sektioner til at forbedre effektiviteten ved at fange individuelle astrocytter i deres helhed. Immunostaining er ikke påkrævet, men anbefales at forbedre det endogene fluorescerende signal til konfokal billeddannelse og analyse. Immunostaining kan også muliggøre bedre påvisning af fine astrocytgrene og reducere fotobleaching af endogene proteiner under billedoptagelse. For at forbedre antistofindtrængningen i de tykke sektioner og for at bevare vævsvolumen fra sektionering gennem billeddannelse anvendes fritsvævende vævssektioner. Analyse af astrocytområdevolumen udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware. Derudover beskriver denne protokol en metode til analyse af astrocytfliser i vævssektioner med mosaikmærkning, hvor naboaristotter udtrykker forskellige fluorescerende etiketter. Denne protokol er blevet brugt med succes i flere nylige undersøgelser 1,8,9 til at karakterisere astrocytvækst under normal hjerneudvikling samt virkningen af genetisk manipulation på astrocytudvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev brugt i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill og Division of Comparative Medicine (IACUC protokolnummer 21-116.0). Mus af begge køn på postnatal dag 21 (P21) blev brugt til disse forsøg. CD1-mus blev opnået kommercielt (Materialetabel), og MADM9 WT:WT- og MADM9 WT:KO-mus blev beskrevet tidligere9.
BEMÆRK: Denne protokol kræver hjerner med fluorescerende proteinekspression i en sparsom population af astrocytter. Fluorescerende proteinekspression kan introduceres genetisk, viralt eller ved elektroporation. Detaljer om metoder til sparsom mærkning af astrocytter er beskrevet i tidligere offentliggjorte undersøgelser og protokoller 1,7,8,9,10,11,12,13.
1. Vævsindsamling og -forberedelse
FORSIGTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farligt kemikalie. Udfør alle trin med PFA i en kemisk røghætte.
- Bedøv mus med et injicerbart bedøvelsesmiddel (f.eks. Avertin; 0,8 mg / kg) og sørg for anæstesidybde med en tåspids. Brug en peristaltisk pumpe til at udføre intrakardiær perfusion med iskold Tris-bufferet saltvand (TBS) + Heparin med en hastighed på ~ 3 ml / min, indtil leveren er klar (typisk 3-5 minutter), efterfulgt af iskold 4% PFA i TBS med en hastighed på ~ 3 ml / min i 5 minutter.
BEMÆRK: Flowhastighed og tider er optimeret til mus efter fødslen af dag 21 (P21). Justeringer af strømningshastighed og perfusionstid kan være nødvendige for mus i forskellige aldre. - Efter perfusion skal du bruge et par betjeningssaks til at løsne hovedet og fjerne huden for at udsætte kraniet. Brug derefter en mikrodiskeringssaks til at fjerne toppen af kraniet for at udsætte hjernen. Brug en tang eller en lille spatel til at fjerne hjernen og overføre den til et rør, der indeholder iskold 4% PFA og inkuberes natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Sørg for at bruge et rør med en flad bund, såsom et 7 ml hætteglas med scintillation, så hjernen ikke bliver klemt i bunden af røret, hvilket kan komprimere vævet og ændre astrocytvolumen. - Den følgende dag hældes PFA ud af røret. Tilsæt 5 ml 1x TBS til røret for at skylle hjernen og fjerne resterende PFA. Hæld TBS ud og gentag denne proces to gange mere i alt tre skylninger.
- Tilsæt 4-5 ml 30% saccharose i TBS og inkuber hjernen ved 4 ° C i 1-2 dage, eller indtil hjernen synker til bunden af røret.
BEMÆRK: Hjerner er klar til frysning, når de er sunket, men kan opbevares i saccharoseopløsning ved 4 ° C i flere uger. - Frysemedium tilberedes i et 50 ml rør ved at blande 15 ml 100% optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse med 30 ml 30% saccharose i TBS. Bland på en møtrik eller en orbitalryster i mindst 1 time for at sikre, at opløsningen er fuldt blandet. Hold røret oprejst i en ekstra time for at tillade eventuelle bobler at stige til overfladen.
BEMÆRK: Frysemediet kan fremstilles på forhånd og opbevares ved stuetemperatur i flere uger. - Brug et serologisk pipet til at tilføje frysemedium til en firkantet indlejringsform (Materialetabel). Pas på at undgå at indføre bobler i mediet. For en P21 musehjerne er 3 ml tilstrækkelig. Juster lydstyrken efter behov for forskellige aldre, så hjernen er helt nedsænket.
- Tilføj hjernen til mediet og brug et par # 5 tang til at fjerne enhver hjernestamme, der kan forhindre hjernen i at sidde fladt i formen. Stil forsiden af hjernen op med den ene kant af formen.
- Overfør formen til en flad overflade afkølet med tøris. En metal frokostform fyldt med tøris fungerer godt til dette formål. Omgiv formen med tørispiller for at sikre langsom og jævn frysning.
- Når frysemediet er helt hvidt og fast, opbevares formen ved -80 °C.
BEMÆRK: Hjerner kan opbevares ved -80 °C i flere år.
2. Cyrosectioning
BEMÆRK: Denne sektionsmetode er beregnet til at arbejde med mange forskellige kommercielt tilgængelige kryostater. Med den kryostat, der anvendes her (Materialetabel), er den optimale prøvehovedskæringstemperatur -23 ° C med en omgivende kammertemperatur mellem -23 ° C og -25 ° C.
FORSIGTIG: Kryostatbladet er ekstremt skarpt. Vær forsigtig, når du manipulerer bladet og betjener kryostaten.
- Forbered sektionsmedium ved at blande 25 ml 1x TBS og 25 ml glycerol i et 50 ml rør. Det er nemmest at tilføje glycerol ved at hælde det direkte i røret og bruge markørerne på røret til måling. Ryst/hvirvler røret for at blande. Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger.
- Forbered dig på at samle vævssektioner ved at tilføje 2 ml sektioneringsmedium pr. Brønd til en 12-brøndplade. Mærk toppen og bunden af pladen med prøveoplysninger. Placer pladen sammen med andre forsyninger (kryostatblad, barberblad, borepatroner og pensler) direkte i kryostaten, og lad dem akklimatisere sig til temperatur i ~ 5 minutter.
- Flyt hjernerne ind i kryostatkammeret og lad dem akklimatisere sig til temperatur sammen med forsyningerne.
- Fjern den frosne vævsblok fra formen ved at skære to hjørner af formen med et barberblad og skrælle formen væk fra vævet. Orienter blokken, så forsiden af hjernen vender opad.
- Tilsæt OCT til borepatronen, således at ~ 2/3 af borepatronen er dækket af OCT, og placer straks vævsblokken på borepatronen og hold den retning, der er beskrevet ovenfor. Tryk blokken ned i OCT, så den er flad på overfladen af borepatronen.
- Når OCT'en er helt frosset, og vævsblokken er sikkert på plads, klemmes borepatronen fast til prøvehovedet. Indsæt kryostatbladet, og bring bladet tæt på prøven.
- Trim gennem hjernen med 100 μm intervaller indtil lige før hjerneområdet af interesse er nået. For at reducere mængden af OCT, der opløses i sektionsmediet, skal du bruge et barberblad til at trimme overskydende frysemedium fra siderne af vævsblokken.
- Når interesseområdet er nået, skal du begynde at samle 100 μm tykke sektioner. Saml sektioner ved hjælp af enten anti-rullepladen eller ved langsomt at rykke kryostaten frem med den ene hånd, mens du bruger en pensel i den anden hånd til at styre sektionen væk fra blokken, når den møder bladet. Hvis kryostatmodellen har en pedal, skal du bruge pedalen til at fremme kryostaten, så begge hænder kan bruges til at styre sektionen væk fra blokken.
- Overfør sektionerne til 12-brøndpladen ved hjælp af en pensel eller tang. Hver brønd kan rumme mindst 10-12 sektioner. Når du tilføjer sektionen til mediet, er det normalt tilstrækkeligt at røre sektionens nederste kant til sektionsmediet og lade sektionen smelte ind i mediet uden at gøre penslen eller tangen våd. Hvis børsten rører mediet, skal du sørge for at tørre det med et papirhåndklæde eller væv, da en alt for våd børste vil gøre det vanskeligt at overføre vævssektioner.
- Fastgør pladen ved at indpakke den med folie eller paraffinfilm. Sørg for at mærke det tydeligt, og opbevar det derefter ved -20 °C.
BEMÆRK: For de fleste farvningsprotokoller kan sektioner opbevares ved -20 ° C i mindst 1-2 år uden væsentligt tab af signal.
3. Immunostaining
BEMÆRK: Udfør alle vaske og inkubationer på en orbital platform shaker indstillet til ca. 100 o / min. Alle trin udføres ved stuetemperatur, undtagen den primære antistofinkubation, som udføres ved 4 °C. Forbered monteringsmedier på forhånd ved at kombinere ingredienserne i et 50 ml rør og blande på en møtrik natten over. Beskyt mod lys og opbevar ved 4 °C i op til 2 måneder. Hvis det endogene fluorescerende signal er tilstrækkeligt til billeddannelse og analyse uden behov for immunstaining, kan trin 3.1-3.9 springes over. Hvis du springer immunstaining over, skal du udføre tre 10 minutters vask i TBS og fortsætte til trin 3.10.
- Forbered en frisk opløsning af TBST (0,2% Triton i TBS) ved at tilsætte 1 ml 10% Triton-X til et 50 ml rør og fylde røret til 50 ml med 1x TBS. Forbered 2 ml blokerings- og antistofopløsninger (10% gedeserum i TBST) til hver hjerne.
BEMÆRK: For de bedste resultater skal du lave frisk TBST til hvert nyt farvningseksperiment og bruge en kilde af høj kvalitet på 10% vandig Triton-X (materialetabel). - Mærk en 24-brønds plade i henhold til skemaet (figur 1). Placer forskellige prøver i forskellige rækker og forskellige løsninger i forskellige kolonner. Tilføj 1 ml TBST til de første tre kolonner ('Vask 1', 'Vask 2' og 'Vask 3'). Tilsæt 1 ml blokeringsopløsning til den fjerde kolonne.
- Forbered en glaspluk ved at smelte enden af en 5,75 i Pasteur-pipette til en lille krog ved hjælp af en Bunsen-brænder. Brug dette valg til at overføre vævssektioner fra pladen med 12 brønde til wash 1-søjlen på 24-brøndpladen.
BEMÆRK: For de bedste resultater skal du screene sektionerne, inden farvningen påbegyndes. For at screene sektioner skal du overføre sektionerne en efter en til en petriskål fyldt med 1x TBS og undersøge sektionerne ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med et 5x eller 10x mål for at sikre, at der er et tilstrækkeligt antal fluorescerende mærkede celler til stede. Farvning af fire til seks sektioner pr. Brønd anbefales, selvom op til otte pr. Brønd kan farves, hvis det er nødvendigt. - Vask sektionerne i 10 minutter hver i vask 1, 2 og 3 brønde, efterfulgt af inkubation af sektionerne i 1 time i blokeringsopløsningen. Brug glasplukket til at overføre sektionerne fra den ene brønd til den næste. Pluk kan bruges til at overføre flere hjerneafsnit ad gangen.
- Forbered 1 ml primær antistofopløsning for hver prøve (f.eks. Rabbit RFP 1:2000 eller Chicken GFP 1:2000). Antistoffet tilsættes kort til antistofopløsningen, hvirvel, og centrifuger derefter i 5 minutter ved ≥ 4.000 x g ved 4 °C. Sektionerne inkuberes i primært antistof i to til tre nætter ved 4 °C, mens du ryster.
- Efter primær antistofinkubation aspireres dag 1 TBST fra vaskebrøndene, tilsættes 1 ml ny TBST til hver vaskebrønd, og sektionerne flyttes til den første vaskebrønd. Vask sektionerne 3x i 10 minutter hver.
BEMÆRK: Til aspiration skal du bruge en 9 i Pasteur-pipette forbundet med rør til en vakuumkolbe. Husvakuumledninger eller en elektrisk vakuumpumpe kan bruges som vakuumkilde. - Mens sektionerne vaskes, skal du forberede sekundære antistofopløsninger i en koncentration på 1:200 ved at tilsætte antistoffer til antistofopløsningen (f.eks. Gede-anti-kanin 594 eller ged-anti-kylling 488). Vortex kort, og drej derefter i 5 minutter ved ≥ 4.000 x g ved 4 °C.
- Inkuber sektioner i sekundært antistof i 3 timer ved stuetemperatur. Beskyt sektionerne mod lys under dette trin og alle de følgende trin for at afbøde blegning af de sekundære antistoffer.
- Efter sekundær antistofinkubation aspireres dag 2 TBST fra vaskebrøndene, tilsættes 1 ml ny TBST til hver vaskebrønd, og sektionerne flyttes til den første vaskebrønd. Vask sektionerne 3x i TBST i 10 minutter hver.
- Under den sidste vask skal monteringsmediet tages ud fra 4 °C og lade det varme op til stuetemperatur. Forbered en 2:1 blanding af 1x TBS:dH2O og tilsæt denne til en petriskål. Forbered et mikroskopglas ved at tilsætte 800 μL 2: 1 TBS: dH2O til overfladen.
BEMÆRK: Det anbefales kraftigt at bruge ikke-hærdende monteringsmedier. Hærdning af monteringsmedier kan ændre vævets volumen, hvilket kan forvirre analysen af astrocytområdevolumen. En opskrift på et enkelt og billigt hjemmelavet monteringsmedie findes i materialetabellen. - Brug en fin pensel til at overføre sektionerne en ad gangen fra Wash 3-brønden til Petriskålen. Dette trin fjerner triton og hjælper sektionerne med at flade ud. Overfør derefter sektionerne fra petriskålen til væsken på diaset.
- Brug en pensel til at hjælpe med at arrangere sektionerne, så de er flade på diaset. Fjern forsigtigt overskydende væske fra diaset med en P1000-pipette efterfulgt af vakuumaffangning.
BEMÆRK: Tilsæt en P200 pipettespids til enden af Pasteur-pipetten for finere kontrol af vakuum aspiration. - Når al overskydende væske er fjernet fra diaset, skal du bruge et overføringsrør til straks at tilføje en dråbe monteringsmedier til hver sektion og forsigtigt lægge en dækslip over diaset. Lad monteringsmedier sprede sig i et par minutter, og fjern derefter overskydende monteringsmedier, der kommer ud under dækslen ved vakuumsugning.
BEMÆRK: Lad ikke sektionerne tørre, før monteringsmediet er tilføjet. Hvis sektionerne begynder at tørre, før monteringsmedier tilføjes, kan dette påvirke vævsvolumenet og hindre nøjagtig dataindsamling. - Forsegl alle fire kanter af dækslippen med klar neglelak. Lad glider tørre i 30 minutter ved stuetemperatur, og opbevar dem derefter fladt ved 4 °C. Vent mindst 2 timer før billeddannelse eller billede den følgende dag.
BEMÆRK: Sektioner farvet med antistoffer mod GFP og RFP kan opbevares i op til 2 uger før billeddannelse, forudsat at de er fuldstændigt forseglet med neglelak.
4. Konfokal billeddannelse
BEMÆRK: Denne protokol giver generelle retningslinjer for billedoptagelse, der er bredt anvendelige til forskellige konfokale mikroskoper, snarere end specifikke detaljer for en bestemt konfokal og softwaregrænseflade.
- Brug et 10x mål til at lokalisere individuelle celler til billeddannelse, idet du noterer dig den specifikke hjerneregion eller underregion (f.eks. Lag 5 i den visuelle cortex), som det er relevant for eksperimentet. Brug fokusknappen til at prøve at afgøre, om hele astrocyten er indeholdt i sektionen.
- Skift til et højere forstørrelsesoliemål (f.eks. 40x, 60x eller 63x), og bring cellen i fokus. Mens du kigger gennem okularet, skal du bruge fokusknappen til at flytte fra toppen til bunden af cellen.
- Undersøg cellen visuelt for at sikre, at hele cellen er indeholdt i sektionen. Hvis cellen pludselig går ud af fokus og afskæres ved kanten af sektionen, skal du udelade denne celle og finde en anden.
- Ved hjælp af confocalmikroskopets tilhørende anskaffelsessoftware skal du justere anskaffelsesparametrene for at opnå et passende signal-støj-forhold og detaljeringsniveau (512 x 512 opløsning giver tilstrækkelig detaljer til områdeanalyse og reducerer billedoptagelsestiden). Brug 2x zoom, hvis du bruger et 40x mål, og ingen zoom, hvis du bruger et 60x eller 63x mål.
- Indstil de øvre og nedre grænser for z-stakken. For at sikre, at hele astrocyten fanges, bør de første og sidste billeder af z-stakken ikke indeholde nogen fluorescerende mærkning af cellen. For tilstrækkelig prøveudtagning skal du bruge en trinstørrelse på 0,5 μm.
5. Billedanalyse
BEMÆRK: Denne protokol beskriver trinene til udførelse af billedanalyse ved hjælp af kommercielt tilgængelig billedanalysesoftware (dvs. Imaris; se Materialetabel). Andre versioner af denne software kan bruges med mindre ændringer i arbejdsgangen. Denne protokol kræver også MATLAB for at køre convex Hull XTension-filen (supplerende fil).
- Før du begynder analysen, skal du installere convex Hull XTension-filen XTSpotsConvexHull.m ved at indsætte filen i rtmatlab-undermappen i XT-mappen.
- Brug Imaris File Converter til at konvertere billeder til '.ims' format. Åbn en billedfil i billedanalysesoftwaren, og se billedet i 3D-visningstilstand ved at vælge knappen 3D-visning .
- Før analyse skal du inspicere cellen for at sikre, at den opfylder inklusionskriterierne.
- Sørg for, at hele cellen er til stede i billedet (dvs. ingen del af cellen skal skæres ud af billedet). Drej billedet for at inspicere for- og bagkanterne.
- Sørg for, at cellen kun har en cellekrop. Klik på knappen Slice , træk markøren til venstre på skærmen for at bevæge dig gennem z-stakken, og kontroller, at den mærkede celle kun indeholder et cellehus.
- Sørg for, at der er en individuel astrocyt, der kan skelnes fra eventuelle tilstødende astrocytter, der er mærket med samme farve.
- Opret en overflade
- Når knappen 3D-visning er valgt igen, skal du oprette en ny overflade ved at klikke på det blå ikon Tilføj nye overflader .
- På fanen Opret , der vises nederst til venstre i softwarevinduet, skal du sørge for, at kun felterne Segmentér kun et interesseområde og Objektobjektstatistik er markeret for Algoritmeindstillinger, og at feltet Start oprettelse med udsnitsvisning for Oprettelsesindstillinger ikke er markeret. Klik på den blå pil for at fortsætte.
BEMÆRK: Et område af interesse er muligvis ikke nødvendigt, hvis der ikke er noget yderligere fluorescerende signal i billedet uden for cellen af interesse. I dette tilfælde skal du ikke markere Segmentér kun et interesseområde og fortsætte til trin 5.4.3.
- På fanen Opret , der vises nederst til venstre i softwarevinduet, skal du sørge for, at kun felterne Segmentér kun et interesseområde og Objektobjektstatistik er markeret for Algoritmeindstillinger, og at feltet Start oprettelse med udsnitsvisning for Oprettelsesindstillinger ikke er markeret. Klik på den blå pil for at fortsætte.
- Opret et område af interesse omkring cellen ved at indtaste dimensioner i felterne under Størrelse på værktøjet Til oprettelse af overflade eller trække i kanterne på den gule boks (Figur 2A). Klik på den blå pil for at fortsætte.
- Vælg den korrekte kildekanal på rullelisten til analyse (f.eks. Kanal 1 eller den kanal, der indeholder fluorescerende cellefyld). Værdien i feltet Overfladerdetaljer bestemmes af softwaren og er baseret på parametre for billedoptagelse. Sørg for, at denne værdi forbliver konstant for alle prøverne i eksperimentet. Klik på den blå pil for at fortsætte.
- Juster tærsklen (absolut intensitet) ved at trække i den gule bjælke eller ved at indtaste værdier i feltet, så den grå overflade fylder så meget af cellens signal som muligt uden at gå ud over cellens grænse. En lille mængde fluorescerende signal vil være synligt ved overfladens kanter (figur 2B). Klik på den blå pil for at fortsætte.
- Det sidste panel i Surface Creation-værktøjet angiver minimumskvalitetsværdien, som er softwarens standardværdi nedre tærskelværdi. På rullelisten skal du sikre dig, at Antal Voxels Img = 1 er valgt. Kontroller, at kun den venstre tænd / sluk-knap til nedre tærskel er grøn (aktiv); den højre tænd / sluk-knap skal være rød (inaktiv). Softwaren har som standard den nedre tærskelværdi til 10. Lad dette være uændret, og klik på den grønne pil for at afslutte genereringen af overfladen.
- Kontroller omhyggeligt den nyligt genererede overflade. Slet eventuelle overfladestykker, der ikke er en del af cellen, ved at vælge dem, klikke på blyantredigeringsværktøjet og klikke på indstillingen Slet .
- Saml de resterende overfladestykker ved at klikke på tragtfilterikonet for at vælge alle, klikke på blyantredigeringsikonet og klikke på indstillingen Forenify (figur 2C).
BEMÆRK: Med en stor billedfil kan softwaren lejlighedsvis gå ned under de efterfølgende trin i denne protokol. Det er en god ide at gemme filen på dette tidspunkt.
- Når knappen 3D-visning er valgt igen, skal du oprette en ny overflade ved at klikke på det blå ikon Tilføj nye overflader .
- Generer pletter tæt på overfladen
- Klik på det orange ikon Tilføj nye pletter . Når de nye spots (f.eks. "Spots 1") er markeret, skal du på fanen Opret sikre dig, at kun feltet Objekt-objektstatistik er markeret for Algoritmeindstillinger, og at feltet Start oprettelse med udsnitsvisning for Oprettelsesindstillinger ikke er markeret. Klik på den blå pil for at fortsætte.
- Vælg den korrekte kildekanal på rullelisten (f.eks. kanal 1), og indtast derefter en anslået XY-diameterværdi på 0,400 μm i feltet. Sørg for, at kun feltet Baggrundsundertrækning er markeret. Klik på den blå pil for at fortsætte.
BEMÆRK: 0,400 μm er passende for 1024 x 1024 eller 512 x 512 billeder ved hjælp af 63x, 60x eller 40x mål. For andre billeddannelsesbetingelser skal diameteren bestemmes ud fra billeddannelsesbetingelser og forblive konstant under hele analysen. Den passende værdi vil skabe nok pletter til at dække alt positivt signal, men vil ikke tilføje pletter på baggrundssignalet. - Det sidste panel i værktøjet Spots Creation indstiller minimumskvalitetsværdien, som er softwarens standard nedre tærskelværdi ; sørg for, at denne værdi forbliver uændret, medmindre der er en mærkbar forskel i placeringen/fordelingen af pletterne (f.eks. på grund af en farvning af dårligere kvalitet). Klik på den grønne pil for at afslutte oprettelsen af pletterne.
- Hvis du vil have bedre vist pletterne, skal du ændre overfladens gennemsigtighed ved at vælge Surface og klikke på det flerfarvede farveværktøj. Under Materiale skal du markere det materiale, der gør overfladen gennemsigtig nok til at få vist pletter i hele cellen (det fjerdesidste materiale på listen) (figur 2D,E).
- Vælg pletterne igen, klik på filterikonet , og vælg Korteste afstand til overflader overflader = Overflader X, hvor 'Overflader X' er den overflade, der analyseres (f.eks. Overflader 1), fra rullelisten. Sørg for, at både tænd / slukknapperne Nedre tærskel og Øvre tærskel er grønne (aktive).
- Indtast en minimumsafstand på -1,0 μm (afstanden mellem pletterne fra indersiden af overfladen) i feltet Nedre tærskel og en maksimal afstand på 0,1 μm (afstand udefra) i feltet Øvre tærskel . Klik på knappen Dupliker valg til nye pletter for at afslutte generering af pletter tæt på overfladen.
BEMÆRK: Minimums- og maksimumafstandsværdierne kan variere med forskellige billedoptagelsesparametre, såsom mål, zoom og opløsning. Disse tal skal bestemmes empirisk. Den gennemsigtige overflade hjælper med at bedømme, om værdierne fanger alle pletter, der nøjagtigt repræsenterer overfladens form.
- Indtast en minimumsafstand på -1,0 μm (afstanden mellem pletterne fra indersiden af overfladen) i feltet Nedre tærskel og en maksimal afstand på 0,1 μm (afstand udefra) i feltet Øvre tærskel . Klik på knappen Dupliker valg til nye pletter for at afslutte generering af pletter tæt på overfladen.
- Generer konveks skrog og saml territoriummåling
- Sørg for, at de nyoprettede spots er valgt i øverste venstre panel i softwarevinduet (f.eks. "Spots 1 Selection ['Korteste afstand...]"). Klik på tandhjulsikonet og derefter Convex Hull-pluginet . Klik kun på pluginet én gang, og vent på, at MATLAB-vinduet vises, og forsvind derefter (dette kan tage flere sekunder). Et solidt skrog vises i 3D-visningen.
- I øverste venstre panel skal du vælge Konveks skrog af pletter X-valg ['Korteste afstand ...],hvor 'Spots X Selection' er de nyoprettede pletter (f.eks. Spots 1 Selection), og klik derefter på skroget for at vælge det (figur 2F).
- Klik på grafstatistikikonet , vælg fanen Valg , sørg for, at specifikke værdier er valgt fra den øverste rulleliste, og vælg derefter Lydstyrke fra den nederste rulleliste. Optag skrogets volumen. Gem filen og fortsæt til næste billede.
- Måling af områdeoverlapningsvolumen for naboceller med forskellige fluorescerende etiketter
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen kan bruges, hvis prøverne indeholder tilstødende astrocytter, der udtrykker forskellige fluorescerende etiketter (f.eks. Udtrykker Astrocyt 1 kun GFP, og Astrocyt 2 udtrykker kun RFP). Denne mærkning blev opnået ved hjælp af virale eller genetiske strategier som tidligere beskrevet 9,10 (figur 3A).- Ved hjælp af de trin, der er beskrevet i trin 5.4-5.6, skal du oprette overfladen, pletterne tæt på overfladen og det konvekse skrog for hver astrocyt (figur 3B).
- Med konveks skrog af pletter 1 valg... valgt, skal du klikke på blyant rediger ikon og klikke på Maskevalg. I vinduet Maskekanal skal du sikre dig, at Kanal 1 (eller den kanal, der repræsenterer astrocyt 1) er markeret, og sørg for, at feltet ud for duplikatkanalen, før du anvender maskeindstillingen , er markeret. Klik på OK for at oprette kanalen Masked CH1.
- Med konveks skrog af spots 2 udvalg... valgt, klik på blyant rediger ikon og klik på Maskevalg. I vinduet Maskekanal skal du vælge Kanal 2 (eller den kanal, der repræsenterer astrocyt 2) i rullemenuen og sørge for, at feltet ud for duplikatkanalen, før du anvender maskeindstillingen , er markeret. Klik på OK for at oprette kanalen Masked CH2 (Figur 3C).
- Klik på Coloc-knappen øverst på skærmen, og brug Coloc-værktøjet til at oprette en co-lokaliseringskanal for de to maskerede kanaler. Indstil kanal A til kanal 3 - maskeret CH1 og kanal B til kanal 4 - maskeret CH2 (figur 3D).
- Træk den gule histogramlinje til venstre for begge kanaler. Brug udsnitsvisningen nedenfor til at observere samlokaliseringssignalet, som vil være synligt i gråt. Bemærk, at da de fluorescerende signaler fra de to celler faktisk ikke er co-lokaliserede, skal tærsklen flyttes til venstre, så falske co-lokaliseringer begynder at dukke op ved punkter med cellekontakt.
- Klik på Build Coloc Channel i højre side for at afslutte processen. Klik på 3D-visningen for at vende tilbage til standard 3D-visningen. En kanal til koloraliseringsresultat vil nu være synlig i gråt og vises i displayjusteringsboksen.
- Overfladen, pletterne tæt på overfladen og det konvekse skrog af colocalization Result-kanalen oprettes ved hjælp af de trin, der er beskrevet i 5.4-5.7 (figur 3E,F).
- Optag volumenet af det konvekse skrog. Dette er territoriets overlapningsvolumen. Divider dette tal med områdevolumenet for en af astrocytterne for at beregne procentdelen af territoriumoverlapning. Vælg kontrol- eller vildtype-astrocyt, hvis en af astrocytterne er genetisk manipuleret i forhold til den anden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en skematisk oversigt over de vigtigste trin og arbejdsgange for denne protokol. Figur 2 viser skærmbilleder af nøgletrin ved hjælp af billedanalysesoftwaren til at generere en overflade, generere pletter tæt på overfladen og generere et konvekst skrog. Figur 3 viser anvendelsen af denne teknik til at bestemme astrocytområdeoverlapning / flisebelægning. I figur 4 viser repræsentative resultater fra et tidligere offentliggjort manuskript9 anvendelsen af denne protokol. I figur 4A og figur 4B reducerer knockdown af det astrocytberigede celleadhæsionsmolekyle hepaCAM signifikant astrocytområdevolumen. I figur 4C og figur 4D blev Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) brugt til at introducere sparsom mosaikmærkning og samtidig genetisk modifikation i musebarken. Med MADM blev mus genereret, hvor vildtype astrocytter udtrykker et rødt fluorescerende protein (RFP) og Hepacam knockout astrocytter udtrykker et grønt fluorescerende protein (GFP). Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol blev procentdelen af territoriumoverlapning mellem nærliggende RFP- og GFP-astrocytpar (WT: KO) beregnet. Som en kontrol blev dette sammenlignet med nærliggende RFP- og GFP-astrocytpar hos mus uden genetisk modifikation af Hepacam (WT: WT). WT:KO astrocytpar viste en signifikant øget procentdel af territoriumoverlapningsvolumen sammenlignet med WT:WT-astrocytpar. Samlet viser disse resultater, at hepaCAM er påkrævet for normal astrocytområdevolumen og astrocytfliser.
Figur 1: Oversigt over arbejdsgang til analyse af astrocytområdevolumen. (A) Protokollen kræver en mus med sparsom eller mosaik fluorescerende mærkning af astrocytter. (B) Musen perfunderes, og derefter revurderes, behandles og fryses hjernen. (C) Den frosne hjerne sektioneres ved hjælp af en kryostat, og (D) de fritsvævende vævssektioner opsamles. (E) Efter sektionering farves de flydende vævssektioner af immunhistokemi og monteres derefter (F) på dias. (G) Astrocytter i de monterede vævssektioner afbildes ved hjælp af konfokal mikroskopi. (H) Endelig kvantificeres de afbildede cellers områdevolumener ved hjælp af billedanalysesoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nøgletrin i billedanalyseproceduren for astrocytområdevolumen. (A) Visning af celle med interesseområde, der udelukker andet signal i billedet fra analyseproceduren. (B) En acceptabel relativ tærskel for overfladeoprettelse (grå) ved hjælp af signal (rød). (C) Afsluttet overflade med hovedcelle valgt (gul). Andre dele af overfladen, der ikke er cellen, slettes (rød). (D) Gennemskinnelig overflade med skabte pletter. (E) Nærbillede af den gennemskinnelige overflade med pletter skabt for at vise en acceptabel fordeling af pletter i forhold til overfladen. (F) Endeligt konvekst skrog. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Nøgletrin i analyse af astrocytområdeoverlapning. (A) Repræsentativt billede af to astrocytter, der udtrykker forskellige fluorescerende markører, GFP (grøn) og RFP (magenta). (B) Generering af et konvekst skrog for hver astrocyt. (C) Visning af maskerede GFP- og RFP-kanaler med originale kanaler fjernet. (D) Eksempel på tærskelværdi ved hjælp af værktøjet "Coloc" til at oprette en "Colocalization Result" -kanal. Det "colocaliserede" signal vises i gråt. (E) Visning af de to maskerede kanaler. (F) En roteret visning af det konvekse skrog af kanalen "Colocalization Result" (grå), som repræsenterer territoriets overlapningsvolumen. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vellykket anvendelse af protokollen til måling af astrocytterritoriumvolumen og astrocytterritoriumoverlapning. (A) Astrocytter i den visuelle cortex hos vildtype CD1-mus på postnatal dag 21, der udtrykker mCherry-CAAX (cyan) og et kontrol shRNA (shScramble) eller et shRNA rettet mod hepaCAM (shHepacam). Astrocytområdet er skitseret med rødt. (B) Tab af hepaCAM reducerer astrocytområdets volumen betydeligt. Datapunkter repræsenterer individuelle musegennemsnit. Fejllinjer er ± s.e.m. Nested t-test. (C) Naboaristoter i musebarken på postnatal dag 21, der udtrykker GFP (grøn) eller RFP (magenta). I MADM9 WT: WT-mus er begge astrocytter vildtype. I MADM9 WT: KO-mus er den grønne astrocyt vildtype, og magenta-astrocyten er nul for Hepacam. Volumen af territorieoverlapning vises med blåt. (MADM9 WT:WT genotype: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO genotype: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). (D) Kvantificering af procentdelen af overlapning af territoriumvolumen. Datapunkter repræsenterer individuelle musegennemsnit. Fejllinjer er ± s.e.m. Nested t-test. Skalastænger = 20 μm. Panelerne i denne figur er genoptrykt fra Baldwin et al9 med tilladelse fra udgiveren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en etableret metode til analyse af astrocytområdevolumen og astrocytfliser i musebarken, der beskriver alle de vigtigste trin, der begynder med perfusion og slutter med billedanalyse. Denne protokol kræver hjerner fra mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i en sparsom eller mosaikpopulation af astrocytter. Uden for dette krav kan mus i alle aldre anvendes til denne protokol med kun mindre justeringer af perfusionsindstillinger og mængden af frysemedier tilføjet til indlejringsformen. Mens andre metoder er blevet offentliggjort til analyse af astrocytforgreningskompleksitet og volumen i hjernevævsafsnit 7,11, har denne protokol flere unikke fordele. For det første beskriver denne protokol en brugerdefineret kode, der kan bruges til at opnå astrocytområdevolumen. Astrocytområdevolumen er en særskilt måling fra astrocytcellevolumen, idet den måler hele rummet optaget af en astrocyt, uanset dens forgreningskompleksitet. Desuden beskriver denne protokol, hvordan man anvender astrocytområdets volumenmåling til måling af astrocytområdeoverlapningsvolumen og derfor astrocytflisers adfærd. Endelig giver denne protokol en detaljeret diskussion af de potentielle variabler, der kan påvirke astrocytområdets volumen og dataindsamling, herunder monteringsforhold, prøvelagringsbetingelser og inklusions- og eksklusionskriterier for billeddannelse og analyse. Ud over disse unikke egenskaber kan mange aspekter af denne protokol, herunder perfusion, kryosectioning og immunostaining af fritsvævende sektioner, bredt anvendes til farvning af hjernevævssektioner i forskellige tykkelser og med forskellige antistofkombinationer. Nedenfor diskuteres kritiske trin, vigtige overvejelser, fejlfinding og begrænsninger i detaljer.
Overvejelser om prøveindsamling
En meget vigtig overvejelse for eksperimenter designet til at undersøge astrocytmorfologi er at opretholde et ensartet tidspunkt på dagen for prøveindsamling. Voksende beviser tyder på, at astrocytfunktionelle tilstande er knyttet til døgnrytme og søvnadfærd14. For at fjerne enhver variation, der kan opstå ved, at prøver indsamles på forskellige tidspunkter af dagen, bør perfusioner planlægges således, at alle prøver til et forsøg indsamles på omtrent samme tidspunkt af dagen inden for et tidsinterval på 2-3 timer. For konsekvente perfusioner anbefales det stærkt at bruge en peristaltisk pumpe. Tilsætningen af heparin til TBS er nyttig til at reducere dannelsen af blodpropper. Selvom denne protokol ikke er testet med kortere postfikseringstider, er postfiksering natten over muligvis ikke påkrævet, og en kortere efterfiksering på 4 timer kan overvejes.
Tip til fejlfinding af kryosesektion
Frysning af hjerner i 2: 1 Saccharose: OCT-frysemedium reducerer mængden af OCT i opsamlingsbrøndene efter sektionering. Når det er frosset, opfører frysemediet sig på samme måde som OCT selv, men er mindre skørt. Når du fryser vævsblokken til borepatronen, skal du sørge for at trykke den fladt på borepatronen umiddelbart efter at have tilføjet OCT til chucken. Hvis vævsblokken går i stykker fra borepatronen under sektionering, skal du bruge et barberblad til at skære en ny flad overflade på bunden og genfryse til borepatronen. Hvis du giver borepatronen tilstrækkelig tid til at afkøle til kryostatkammerets temperatur, før OCT tilsættes, og sørger for, at borepatronen er ren og tør, forbedres vedhæftningen. Når du flytter vævssektioner med penslen, skal du røre penslen til hjørnekanten af sektionen, så det berører OCT og ikke selve vævet. Med en lille smule fugt klæber sektionen til børsten. Placer forsigtigt vævet i sektionsmediet ved at røre den modsatte kant af sektionen til mediet og lade det trække ind i mediet. Hvis børsten rører frysemediet, skal du tørre det af på et papirhåndklæde i kryostaten. En børste, der er for våd, gør det vanskeligt at overføre sektioner til skålen. OCT skal opløses, når vævssektionen er anbragt i sektionsmediet. Hvis det ikke gør det, kan kryostatkammertemperaturen være for lav.
Vigtige overvejelser i forbindelse med farvning og montering af vævssektioner
For at forbedre farvningskvaliteten skal du forberede TBST frisk før hvert eksperiment. Brug en 10% vandig Triton-kilde af høj kvalitet (materialetabel). Vælg et serum, der matcher den art, hvor det sekundære antistof blev fremstillet (brug f.eks. gedeserum til en gede-anti-kanin sekundær). Antistofopløsninger centrifugeres inden brug for at pelletere og fjerne ethvert udfældet antistof. Pas på ikke at forstyrre pelleten, når du overfører antistofopløsning fra røret til pladen (dette kan betyde pipettering lidt mindre end 1 ml antistofopløsning pr. Brønd samt ikke at røre bunden af røret med pipettespidsen). Dette trin hjælper med at reducere baggrundsfarvning. Når sektioner placeres i TBS: dH2O, vil de fleste udfolde sig / løsne sig selv, men nogle kan forblive foldet eller snoet. Når du overfører sektioner til diaset ved hjælp af en børste, skal du bruge en P200-spids i den anden hånd for at hjælpe med at guide vævssektionen til det rette sted. Brug børsten til forsigtigt at folde sektioner ud eller løsne dem, så de ligger fladt. Sektioner har tendens til at bevæge sig mod det aspirerende pipette, når væsken fjernes. Brug P200-tippet til at holde mobilsektioner på plads, mens du aspirerer. Monteringsmedier skal tilsættes til sektionerne umiddelbart efter, at al overskydende væske er fjernet, og inden sektionerne har tid til at tørre. At lade sektionerne tørre selv i et par minutter vil drastisk påvirke volumenet af cellerne i sektionen. Når du har tilføjet monteringsmediet til diaset, skal du bruge et pipette til at fjerne eventuelle synlige bobler. Når du har tilføjet dækslippen, skal du sørge for at fjerne overskydende monteringsmedier fra siderne, da dette vil forstyrre neglelakens evne til at tørre. Lad neglelakken tørre ved stuetemperatur. Vent i mindst 2 timer eller indtil næste dag for at afbilde sektionerne for at sikre, at monteringsmediet har tid nok til helt at trænge ind i de tykke sektioner.
Billeddannelse af komplette astrocytter
Ved billeddannelse af astrocytter til områdevolumenanalyse er det afgørende, at billedet fanger hele volumenet af astrocyten. Mange mærkede astrocytter i vævsafsnittet vil være ufuldstændige astrocytter. Komplette astrocytter vil være fuldt indeholdt i vævsafsnittet. For at identificere komplette astrocytter skal du begynde med et fokuspunkt inden for midten af astrocyten. Brug fokusknappen til at flytte til toppen af astrocyten. Når astrocyten ikke længere er i fokus, bør andre træk ved vævet forblive i fokus. Gentag denne proces for bunden af astrocyten. Afbild ikke ufuldstændige astrocytter. På grund af sektionernes tykkelse er antistofindtrængning ikke så robust i midten af sektionen. Mærkning kan være stærkere omkring yderkanterne af astrocyten og svagere i midten. Dette er almindeligt observeret og påvirker ikke områdeanalyse.
Tips til billedanalyse
Den vigtigste overvejelse for billedanalysedelen af protokollen er at sikre, at det konvekse skrog kun repræsenterer en astrocyt. Følg inklusions- og eksklusionskriterierne hver gang. Nogle gange vil to astrocytter have deres cellelegemer meget tæt på hinanden. Dette kan være vanskeligt at identificere i 3D-visningen, men kan identificeres ved hjælp af udsnitsvisningen. Hvis der er andre fluorescerende mærkede astrocytter, der kontakter astrocyten af interesse, kan dette komplicere overfladeoprettelsesprocessen. Hvis en rimelig klar grænse er synlig mellem de to celler (for eksempel forbinder de kun ved et lille grenpunkt), kan klipværktøjet bruges til at skære i overfladen, og denne del af overfladen kan slettes. Når du har oprettet overfladen, skal du rotere cellen i 3D-visning for at kontrollere, om der er små stykker overflade, der muligvis gemmer sig bag cellen, men som ikke er en del af cellen. Slet disse, før du fortsætter. Hvis det konvekse skrog stikker drastisk ud til et punkt uden for astrocytområdet, er der sandsynligvis et stykke ikke-celleoverflade, der ikke blev fjernet. Hvis softwaren rutinemæssigt går ned under overfladeoprettelse, kan overfladedetaljerne reduceres. Hvis det går ned under oprettelsen af pletter, skal du bruge et område af interesse til kun at oprette pletter nær overfladeobjektet.
Begrænsninger af protokollen
Selvom der er mange anvendelser og fordele ved denne protokol, er der også flere begrænsninger. Denne protokol kræver mus, der allerede udtrykker fluorescerende proteiner i en sparsom population af astrocytter, men beskriver ikke metoderne til introduktion af ekspression af fluorescerende proteiner i astrocytter. Billedbehandlings- og analysepipelinerne er tidskrævende og er ikke velegnede til analyse med høj kapacitet. Desuden er de rettet specifikt mod måling af astrocytområdevolumen og flisebelægning snarere end at definere de detaljerede morfologiske egenskaber ved individuelle astrocytter. Andre kan finde det nyttigt at kombinere tilgange og strategier i denne protokol med nyligt offentliggjorte protokoller, der beskriver metoder til måling af astrocytmorfologisk kompleksitet 7,11. Endelig er de kommercielle softwareplatforme, der bruges i denne protokol (dvs. Imaris og MATLAB), dyre og kræver en licens til brug. Mens store institutioner ofte køber licenser til disse softwareplatforme, kan dette være omkostningsoverkommeligt for mindre institutioner og individuelle laboratorier. Fremskridt inden for mikroskopi, open source-billedanalysesoftware og maskinlæringsalgoritmer kan hjælpe med at gøre denne protokol bredt tilgængelig for alle laboratorier og kan også forbedre effektiviteten af billedoptagelse og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Mikroskopi blev udført på UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), delvist støttet af finansiering fra NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Billederne og dataene i figur 4 er genoptrykt fra en tidligere publikation9 med tilladelse fra udgiveren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
