Summary
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Schneiden, Färben und Abbilden von frei schwebenden Gewebeabschnitten des Mäusegehirns, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung oder Kachelung des Astrozytenterritoriums.
Abstract
Astrozyten besitzen einen erstaunlichen Grad an morphologischer Komplexität, der es ihnen ermöglicht, mit fast jeder Art von Zelle und Struktur im Gehirn zu interagieren. Durch diese Wechselwirkungen regulieren Astrozyten aktiv viele kritische Gehirnfunktionen, einschließlich Synapsenbildung, Neurotransmission und Ionenhomöostase. Im Nagetiergehirn wachsen Astrozyten in den ersten drei postnatalen Wochen an Größe und Komplexität und bilden verschiedene, nicht überlappende Gebiete, um das Gehirn zu kacheln. Dieses Protokoll bietet eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung unter Verwendung von frei schwebenden Gewebeschnitten aus dem Mäusegehirn. Zunächst beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Gewebeentnahme, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Gewebeschnitten. Zweitens beschreibt dieses Protokoll die Bildaufnahme und Analyse des Astrozytengebietsvolumens und des Gebietsüberlappungsvolumens unter Verwendung kommerziell verfügbarer Bildanalysesoftware. Schließlich diskutiert dieses Manuskript die Vorteile, wichtige Überlegungen, häufige Fallstricke und Einschränkungen dieser Methoden. Dieses Protokoll erfordert Hirngewebe mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten und ist für die Verwendung mit gängigen Laborgeräten, konfokaler Mikroskopie und kommerziell erhältlicher Bildanalysesoftware konzipiert.
Introduction
Astrozyten sind aufwendig verzweigte Zellen, die viele wichtige Funktionen im Gehirn erfüllen1. In der Mausrinde entstehen radiale Gliastammzellen Astrozyten während der späten embryonalen und frühen postnatalen Stadien2. Während der ersten drei postnatalen Wochen wachsen Astrozyten an Größe und Komplexität und entwickeln Tausende von feinen Zweigen, die direkt mit Synapsen interagieren1. Gleichzeitig interagieren Astrozyten mit benachbarten Astrozyten, um diskrete, nicht überlappende Territorien zu schaffen, um das Gehirn zu kacheln3, während die Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle4 aufrechterhalten wird. Astrozytenmorphologie und -organisation sind in vielen Krankheitszuständen nach Beleidigung oder Verletzunggestört 5, was auf die Bedeutung dieser Prozesse für die ordnungsgemäße Gehirnfunktion hinweist. Die Analyse der morphologischen Eigenschaften von Astrozyten während normaler Entwicklung, Alterung und Krankheit kann wertvolle Einblicke in die Biologie und Physiologie der Astrozyten liefern. Darüber hinaus ist die Analyse der Astrozytenmorphologie nach genetischer Manipulation ein wertvolles Werkzeug, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu erkennen, die die Etablierung und Aufrechterhaltung der morphologischen Komplexität der Astrozyten steuern.
Die Analyse der Astrozytenmorphologie im Gehirn der Maus wird sowohl durch die Komplexität der Astrozytenverzweigung als auch durch die Astrozytenkachelung erschwert. Die Antikörperfärbung unter Verwendung des intermediären Filament-Glia-Fibrillensäureproteins (GFAP) als astrozytenspezifischer Marker erfasst nur die Hauptzweige und unterschätzt die morphologische Komplexität der Astrozytenerheblich 1. Andere zellspezifische Marker wie Glutamattransporter 1 (GLT-1; slc1a2), Glutaminsynthetase oder S100β ermöglichen eine bessere Markierung von Astrozytenzweigen6, führen jedoch zu einem neuen Problem. Astrozyten-Territorien sind weitgehend nicht überlappend, aber ein kleiner Grad an Überlappung existiert an den peripheren Kanten. Aufgrund der Komplexität der Verzweigung, wenn benachbarte Astrozyten mit der gleichen Farbe beschriftet werden, ist es unmöglich zu unterscheiden, wo ein Astrozyt endet und der andere beginnt. Die spärliche oder mosaikartige Markierung von Astrozyten mit endogenen fluoreszierenden Proteinen löst beide Probleme: Der fluoreszierende Marker füllt die Zelle, um alle Zweige zu erfassen, und ermöglicht die Abbildung einzelner Astrozyten, die von ihren Nachbarn unterschieden werden können. Verschiedene Strategien wurden verwendet, um eine spärliche fluoreszierende Markierung von Astrozyten mit oder ohne genetische Manipulation zu erreichen, einschließlich viraler Injektion, Plasmidelektroporation oder transgener Mauslinien. Details zur Umsetzung dieser Strategien sind in bereits veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des Astrozytengebietsvolumens von Mäusegehirnen mit fluoreszierender Markierung in einer spärlichen Population von Astrozyten (Abbildung 1). Da der durchschnittliche Durchmesser eines Astrozyten im Mauskortex etwa 60 μm beträgt, werden 100 μm dicke Abschnitte verwendet, um die Effizienz bei der Erfassung einzelner Astrozyten in ihrer Gesamtheit zu verbessern. Eine Immunfärbung ist nicht erforderlich, wird jedoch empfohlen, um das endogene Fluoreszenzsignal für die konfokale Bildgebung und Analyse zu verstärken. Die Immunfärbung kann auch einen besseren Nachweis von feinen Astrozytenzweigen ermöglichen und die Photobleiche von endogenen Proteinen während der Bildaufnahme reduzieren. Um das Eindringen von Antikörpern in die dicken Abschnitte zu verbessern und das Gewebevolumen vom Schneiden durch Bildgebung zu erhalten, werden frei schwebende Gewebeabschnitte verwendet. Die Analyse des Astrozytengebietsvolumens wird mit handelsüblicher Bildanalysesoftware durchgeführt. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Analyse von Astrozytenkacheln in Gewebeabschnitten mit Mosaikmarkierung, bei der benachbarte Astrozyten unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen exprimieren. Dieses Protokoll wurde in mehreren neueren Studien 1,8,9 erfolgreich verwendet, um das Astrozytenwachstum während der normalen Gehirnentwicklung sowie die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die Astrozytenentwicklung zu charakterisieren.
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Protocol
Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill und der Division of Comparative Medicine (IACUC-Protokollnummer 21-116.0) verwendet. Für diese Experimente wurden Mäuse beiderlei Geschlechts am postnatalen Tag 21 (P21) verwendet. CD1-Mäuse wurden kommerziell gewonnen (Table of Materials), und MADM9 WT:WT und MADM9 WT:KO Mäuse wurden zuvor9 beschrieben.
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert Gehirne mit fluoreszierender Proteinexpression in einer spärlichen Population von Astrozyten. Die Expression fluoreszierender Proteine kann genetisch, viral oder durch Elektroporation eingeführt werden. Details zu Methoden zur spärlichen Markierung von Astrozyten sind in zuvor veröffentlichten Studien und Protokollen 1,7,8,9,10,11,12,13 beschrieben.
1. Gewebeentnahme und -aufbereitung
ACHTUNG: Paraformaldehyd (PFA) ist eine gefährliche Chemikalie. Führen Sie alle Schritte mit PFA in einem chemischen Rauch durch.
- Betäuben Sie Mäuse mit einem injizierbaren Anästhetikum (z. B. Avertin; 0,8 mg / kg) und gewährleisten Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehennot. Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um eine intrakardiale Perfusion mit eiskalter Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) + Heparin mit einer Rate von ~ 3 ml / min durchzuführen, bis die Leber klar ist (typischerweise 3-5 min), gefolgt von eiskaltem 4% PFA bei TBS mit einer Rate von ~ 3 ml / min für 5 min.
HINWEIS: Durchflussrate und -zeiten sind für Mäuse am postnatalen Tag 21 (P21) optimiert. Anpassungen der Durchflussrate und der Perfusionszeit können für Mäuse unterschiedlichen Alters erforderlich sein. - Verwenden Sie nach der Perfusion eine Operationsschere, um den Kopf zu lösen und die Haut zu entfernen, um den Schädel freizulegen. Als nächstes verwenden Sie eine Mikro-Sezierschere, um die Oberseite des Schädels zu entfernen, um das Gehirn freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette oder einen kleinen Spatel, um das Gehirn zu entfernen und es in eine Röhre mit eiskaltem 4% PFA zu übertragen und über Nacht bei 4 ° C zu inkubieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, einen Schlauch mit einem flachen Boden zu verwenden, z. B. eine 7-ml-Szintillationsfläschchen, damit sich das Gehirn nicht im Boden der Röhre verkeilt, was das Gewebe komprimieren und das Astrozytenvolumen verändern könnte. - Am nächsten Tag gießen Sie die PFA aus der Röhre aus. Fügen Sie 5 ml 1x TBS in die Röhre hinzu, um das Gehirn zu spülen und die verbleibenden PFA zu entfernen. Gießen Sie die TBS aus und wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male für insgesamt drei Spülungen.
- Fügen Sie 4-5 ml 30% Saccharose in TBS hinzu und inkubieren Sie das Gehirn bei 4 ° C für 1-2 Tage oder bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt.
HINWEIS: Gehirne sind bereit für das Einfrieren, sobald sie gesunken sind, können aber in Saccharoselösung bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. - Bereiten Sie das Gefriermedium in einem 50-ml-Rohr vor, indem Sie 15 ml 100% optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) mit 30 ml 30% Saccharose in TBS mischen. Mischen Sie mindestens 1 Stunde lang auf einem Nutator oder einem Orbitalschüttler, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig gemischt ist. Halten Sie das Rohr für eine weitere Stunde aufrecht, damit Blasen an die Oberfläche steigen können.
HINWEIS: Das Gefriermedium kann im Voraus vorbereitet und mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden. - Verwenden Sie eine serologische Pipette, um Gefriermedium zu einer quadratischen Einbettungsform hinzuzufügen (Tabelle der Materialien). Achten Sie darauf, dass keine Blasen in das Medium eingebracht werden. Für ein P21-Mausgehirn sind 3 ml ausreichend. Stellen Sie die Lautstärke nach Bedarf für verschiedene Altersgruppen ein, so dass das Gehirn vollständig untergetaucht ist.
- Fügen Sie das Gehirn dem Medium hinzu und verwenden Sie ein Paar # 5-Pinzetten, um jeden Hirnstamm zu entfernen, der das Gehirn daran hindert, flach in der Form zu sitzen. Richten Sie die Vorderseite des Gehirns mit einer Kante der Form aus.
- Übertragen Sie die Form auf eine flache Oberfläche, die mit Trockeneis gekühlt wird. Eine mit Trockeneis gefüllte Lunchdose aus Metall eignet sich gut für diesen Zweck. Umgeben Sie die Form mit Trockeneispellets, um ein langsames und gleichmäßiges Einfrieren zu gewährleisten.
- Sobald das Gefriermedium vollständig weiß und fest ist, lagern Sie das Werkzeug bei -80 °C.
HINWEIS: Gehirne können mehrere Jahre bei -80 °C gelagert werden.
2. Cyrosektion
HINWEIS: Diese Schnittmethode soll mit vielen verschiedenen kommerziell erhältlichen Kryostaten arbeiten. Mit dem hier verwendeten Kryostaten (Table of Materials) beträgt die optimale Schnitttemperatur des Probenkopfes -23 °C, mit einer Umgebungstemperatur zwischen -23 °C und -25 °C.
ACHTUNG: Die Kryostatenklinge ist extrem scharf. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Klinge manipulieren und den Kryostaten bedienen.
- Bereiten Sie das Schnittmedium vor, indem Sie 25 ml 1x TBS und 25 ml Glycerin in einem 50 ml Schlauch mischen. Es ist am einfachsten, das Glycerin hinzuzufügen, indem Sie es direkt in das Röhrchen gießen und die Marker auf dem Röhrchen zur Messung verwenden. Schütteln / wirbeln Sie das Rohr zum Mischen. Diese Lösung kann bei Raumtemperatur mehrere Wochen gelagert werden.
- Bereiten Sie sich darauf vor, Gewebeabschnitte zu sammeln, indem Sie 2 ml Schnittmedium pro Vertiefung zu einer 12-Well-Platte hinzufügen. Beschriften Sie die Ober- und Unterseite der Platte mit Probeninformationen. Legen Sie die Platte zusammen mit anderen Vorräten (Kryostatenklinge, Rasierklinge, Spannfutter und Pinsel) direkt in den Kryostaten und lassen Sie sie sich für ~ 5 Minuten an die Temperatur gewöhnen.
- Bewegen Sie die Gehirne in die Kryostatenkammer und erlauben Sie ihnen, sich zusammen mit den Vorräten an die Temperatur zu gewöhnen.
- Entfernen Sie den gefrorenen Gewebeblock aus der Form, indem Sie zwei Ecken der Form mit einer Rasierklinge schneiden und die Form vom Gewebe abziehen. Richten Sie den Block so aus, dass die Vorderseite des Gehirns nach oben zeigt.
- Fügen Sie dem Spannfutter OCT hinzu, so dass ~ 2/3 des Futters mit OCT bedeckt ist, und legen Sie den Gewebeblock sofort auf das Futter, wobei Sie die oben beschriebene Ausrichtung beibehalten. Drücken Sie den Block nach unten in das OAT, so dass er auf der Oberfläche des Futters flach ist.
- Sobald das OCT vollständig eingefroren ist und der Gewebeblock sicher an Ort und Stelle ist, klemmen Sie das Futter an den Probenkopf. Setzen Sie die Kryostatenklinge ein und bringen Sie die Klinge in die Nähe der Probe.
- Schneiden Sie in Abständen von 100 μm durch das Gehirn, bis kurz bevor die interessierende Gehirnregion erreicht ist. Um die Menge an OCT zu reduzieren, die sich in den Schnittmedien auflöst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges Gefriermedium von den Seiten des Gewebeblocks zu entfernen.
- Sobald die Region von Interesse erreicht ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von 100 μm dicken Abschnitten. Sammeln Sie Abschnitte entweder mit der Anti-Roll-Platte oder indem Sie den Kryostaten mit einer Hand langsam vorwärts bewegen, während Sie in der anderen Hand einen Pinsel verwenden, um den Abschnitt vom Block zu führen, wenn er auf die Klinge trifft. Wenn das Kryostat-Modell ein Pedal hat, verwenden Sie das Pedal, um den Kryostaten zu bewegen, so dass beide Hände verwendet werden können, um den Abschnitt vom Block zu führen.
- Übertragen Sie die Abschnitte mit einem Pinsel oder einer Pinzette auf die 12-Well-Platte. Jeder Brunnen kann mindestens 10-12 Abschnitte aufnehmen. Beim Hinzufügen des Abschnitts zum Medium reicht es normalerweise aus, den unteren Rand des Abschnitts mit dem Schnittmedium zu berühren und den Abschnitt in das Medium schmelzen zu lassen, ohne dass die Bürste oder die Pinzette nass werden. Wenn die Bürste das Medium berührt, achten Sie darauf, es mit einem Papiertuch oder Taschentuch zu trocknen, da eine zu nasse Bürste es schwierig macht, Gewebeabschnitte zu übertragen.
- Sichern Sie die Platte, indem Sie sie mit Folie oder Paraffinfolie umwickeln. Achten Sie darauf, es deutlich zu beschriften, und lagern Sie es dann bei -20 ° C.
HINWEIS: Bei den meisten Färbeprotokollen können Abschnitte mindestens 1-2 Jahre lang bei -20 °C gelagert werden, ohne dass ein Signal erheblich verloren geht.
3. Immunfärbung
HINWEIS: Führen Sie alle Waschungen und Inkubationen an einem Orbitalplattformschüttler durch, der auf ca. 100 U / min eingestellt ist. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der primären Antikörperinkubation, die bei 4 °C durchgeführt wird. Bereiten Sie die Montagemedien im Voraus vor, indem Sie die Zutaten in einem 50-ml-Rohr kombinieren und über Nacht auf einem Nutator mischen. Vor Licht schützen und bis zu 2 Monate bei 4 °C lagern. Wenn das endogene Fluoreszenzsignal für die Bildgebung und Analyse ausreicht, ohne dass eine Immunfärbung erforderlich ist, können die Schritte 3.1-3.9 übersprungen werden. Wenn Sie die Immunfärbung überspringen, führen Sie drei 10-minütige Waschungen bei TBS durch und fahren Sie mit Schritt 3.10 fort.
- Bereiten Sie eine frische TBST-Lösung (0,2% Triton in TBS) vor, indem Sie 1 ml 10% Triton-X in ein 50-ml-Röhrchen geben und das Röhrchen auf 50 ml mit 1x TBS füllen. Bereiten Sie 2 ml Blockier- und Antikörperlösungen (10% Ziegenserum in TBST) für jedes Gehirn vor.
HINWEIS: Für beste Ergebnisse machen Sie frische TBST für jedes neue Färbeexperiment und verwenden Sie eine hochwertige Quelle von 10% wässrigem Triton-X (Tabelle der Materialien). - Beschriften Sie eine 24-Well-Platte gemäß dem Schaltplan (Abbildung 1). Platzieren Sie verschiedene Stichproben in verschiedenen Zeilen und unterschiedliche Lösungen in verschiedenen Spalten. Fügen Sie den ersten drei Spalten 1 ml TBST hinzu ("Wash 1", "Wash 2" und "Wash 3"). Fügen Sie der vierten Spalte 1 ml Blockierlösung hinzu.
- Bereiten Sie einen Glaspickel vor, indem Sie das Ende einer 5,75 in Pasteur-Pipette mit einem Bunsenbrenner in einen kleinen Haken schmelzen. Verwenden Sie diesen Pick, um Gewebeabschnitte von der 12-Well-Platte in die Wash 1-Säule der 24-Well-Platte zu übertragen.
HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, überprüfen Sie die Abschnitte, bevor Sie mit dem Färben beginnen. Um Abschnitte zu screenen, übertragen Sie die Abschnitte nacheinander auf eine Petrischale, die mit 1x TBS gefüllt ist, und untersuchen Sie die Abschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 5x oder 10x Objektiv, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von fluoreszierend markierten Zellen vorhanden ist. Es wird empfohlen, vier bis sechs Abschnitte pro Bohrung zu färben, obwohl bei Bedarf bis zu acht Abschnitte pro Bohrung gefärbt werden können. - Waschen Sie die Abschnitte für jeweils 10 Minuten in Wash 1, 2 und 3 Wells, gefolgt von der Inkubation der Abschnitte für 1 h in der Blocklösung. Verwenden Sie den Glaspickel, um die Abschnitte von einem Brunnen zum nächsten zu übertragen. Der Pick kann verwendet werden, um mehrere Gehirnabschnitte gleichzeitig zu übertragen.
- Bereiten Sie 1 ml primäre Antikörperlösung für jede Probe vor (z. B. Rabbit RFP 1:2000 oder Chicken GFP 1:2000). Fügen Sie den Antikörper der Antikörperlösung hinzu, wirbeln Sie ihn kurz vor und zentrifugieren Sie dann für 5 Minuten bei ≥ 4.000 x g bei 4 ° C. Inkubieren Sie die Abschnitte im primären Antikörper für zwei bis drei Nächte bei 4 °C während des Schüttelns.
- Nach der primären Antikörperinkubation aspirieren Sie die TBST vom Tag 1 aus den Waschbrunnen, fügen Sie 1 ml neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Waschen Sie die Abschnitte 3x für jeweils 10 Minuten.
HINWEIS: Verwenden Sie für die Aspiration eine 9-in-Pasteur-Pipette, die mit einem Schlauch an einen Vakuumflakon angeschlossen ist. Hausvakuumleitungen oder eine elektrische Vakuumpumpe können als Vakuumquelle verwendet werden. - Während die Abschnitte gewaschen werden, bereiten Sie sekundäre Antikörperlösungen in einer Konzentration von 1:200 vor, indem Sie der Antikörperlösung Antikörper hinzufügen (z. B. Goat Anti-Rabbit 594 oder Goat Anti-Chicken 488). Kurz vorwirbeln und dann 5 Minuten bei ≥ 4.000 x g bei 4 °C drehen.
- Inkubieren Sie Abschnitte im sekundären Antikörper für 3 h bei Raumtemperatur. Schützen Sie die Abschnitte während dieses Schritts und aller folgenden Schritte vor Licht, um das Ausbleichen der sekundären Antikörper zu mildern.
- Nach der sekundären Antikörperinkubation aspirieren Sie die TBST vom Tag 2 aus den Waschbrunnen, fügen Sie 1 ml neue TBST zu jeder Waschmulde hinzu und bewegen Sie die Abschnitte in die erste Waschquelle. Waschen Sie die Abschnitte 3x in TBST für jeweils 10 Minuten.
- Während der Endwäsche nehmen Sie das Montagemedium von 4 °C heraus und lassen es auf Raumtemperatur erwärmen. Eine 2:1 Mischung aus 1x TBS:dH2O zubereiten und zu einer Petrischale geben. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie der Oberfläche 800 μL 2:1 TBS:dH2O hinzufügen.
HINWEIS: Die Verwendung von nicht aushärtenden Montagemedien wird dringend empfohlen. Das Aushärten von Montagemedien kann das Volumen des Gewebes verändern, was die Analyse des Astrozytengebietsvolumens stören kann. Ein Rezept für ein einfaches und kostengünstiges selbstgebautes Befestigungsmedium finden Sie in der Materialtabelle. - Übertragen Sie die Abschnitte mit einem feinen Pinsel nacheinander vom Wash 3-Brunnen auf die Petrischale. Dieser Schritt entfernt Triton und hilft dabei, die Abschnitte abzuflachen. Als nächstes die Abschnitte aus der Petrischale in die Flüssigkeit auf dem Objektträger geben.
- Verwenden Sie einen Pinsel, um die Abschnitte so anzuordnen, dass sie auf der Folie flach sind. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger mit einer P1000-Pipette, gefolgt von einer Vakuumabsaugung.
HINWEIS: Fügen Sie eine P200-Pipettenspitze am Ende der Pasteur-Pipette hinzu, um die Vakuumabsaugung besser kontrollieren zu können. - Sobald die gesamte überschüssige Flüssigkeit aus dem Objektträger entfernt wurde, verwenden Sie eine Transferpipet, um sofort einen Tropfen Montagemedium zu jedem Abschnitt hinzuzufügen, und legen Sie vorsichtig ein Deckglas über das Objektträger. Lassen Sie die Montagemedien einige Minuten lang ausbreiten, und entfernen Sie dann alle überschüssigen Montagemedien, die durch Vakuumabsaugung unter dem Deckglas hervortreten.
HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte vor dem Hinzufügen des Montagemediums nicht trocknen. Wenn die Abschnitte zu trocknen beginnen, bevor Montagemedien hinzugefügt werden, kann dies das Gewebevolumen beeinträchtigen und eine genaue Datenerfassung behindern. - Verschließen Sie alle vier Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack. Lassen Sie die Dias 30 min bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie dann flach bei 4 °C. Warten Sie mindestens 2 Stunden, bevor Sie die Bildgebung oder das Bild am nächsten Tag durchführen.
HINWEIS: Abschnitte, die mit Antikörpern gegen GFP und RFP angefärbt sind, können vor der Bildgebung bis zu 2 Wochen gelagert werden, sofern sie vollständig mit Nagellack verschlossen sind.
4. Konfokale Bildgebung
HINWEIS: Dieses Protokoll enthält allgemeine Bildaufnahmerichtlinien, die auf verschiedene konfokale Mikroskope anwendbar sind, und nicht spezifische Details für eine bestimmte konfokale und Softwareschnittstelle.
- Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv, um einzelne Zellen für die Bildgebung zu lokalisieren, wobei Sie die spezifische Hirnregion oder Subregion (z. B. Schicht 5 des visuellen Kortex) notieren, wie es für das Experiment relevant ist. Verwenden Sie den Fokusknopf, um festzustellen, ob der gesamte Astrozyt in dem Abschnitt enthalten ist.
- Wechseln Sie zu einem Ölobjektiv mit höherer Vergrößerung (z. B. 40x, 60x oder 63x) und bringen Sie die Zelle in den Fokus. Während Sie durch das Okular schauen, verwenden Sie den Fokusknopf, um sich von oben nach unten in der Zelle zu bewegen.
- Überprüfen Sie die Zelle visuell, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle im Abschnitt enthalten ist. Wenn die Zelle abrupt aus dem Fokus gerät und am Rand des Schnitts abgeschnitten wird, schließen Sie diese Zelle aus und suchen Sie eine andere.
- Passen Sie mit der zugehörigen Erfassungssoftware des konfokalen Mikroskops die Erfassungsparameter an, um ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis und einen angemessenen Detaillierungsgrad zu erhalten (die Auflösung von 512 x 512 liefert genügend Details für die Gebietsanalyse und reduziert die Bildaufnahmezeit). Verwenden Sie den 2-fachen Zoom, wenn Sie ein 40-faches Objektiv verwenden, und keinen Zoom, wenn Sie ein 60-faches oder 63-faches Objektiv verwenden.
- Legen Sie die oberen und unteren Grenzen des Z-Stacks fest. Um sicherzustellen, dass der gesamte Astrozyt eingefangen wird, sollten das erste und das letzte Bild des Z-Stacks keine fluoreszierende Markierung der Zelle enthalten. Für eine adäquate Probenahme verwenden Sie eine Schrittweite von 0,5 μm.
5. Bildanalyse
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Durchführung der Bildanalyse mit handelsüblicher Bildanalysesoftware (z. B. Imaris; siehe Materialverzeichnis). Andere Versionen dieser Software können mit geringfügigen Änderungen am Workflow verwendet werden. Dieses Protokoll erfordert auch, dass MATLAB die Convex Hull XTension-Datei (Supplemental File) ausführt.
- Bevor Sie mit der Analyse beginnen, installieren Sie die Convex Hull XTension-Datei XTSpotsConvexHull.m , indem Sie die Datei in den Unterordner rtmatlab des XT-Ordners einfügen.
- Verwenden Sie den Imaris File Converter, um Bilder in das '.ims'-Format zu konvertieren. Öffnen Sie eine Bilddatei in der Bildanalysesoftware und zeigen Sie das Bild im 3D-Betrachtungsmodus an, indem Sie die Schaltfläche 3D-Ansicht auswählen.
- Überprüfen Sie vor der Analyse die Zelle, um sicherzustellen, dass sie die Einschlusskriterien erfüllt.
- Stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle im Bild vorhanden ist (d. h. kein Teil der Zelle sollte aus dem Bild ausgeschnitten werden). Drehen Sie das Bild, um die vorderen und hinteren Kanten zu inspizieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Zelle nur einen Zellkörper hat. Klicken Sie auf die Schaltfläche Slice, ziehen Sie den Cursor auf der linken Seite des Bildschirms , um sich durch den Z-Stack zu bewegen, und überprüfen Sie, ob die markierte Zelle nur einen Zellkörper enthält.
- Stellen Sie sicher, dass es einen einzelnen Astrozyten gibt, der von benachbarten Astrozyten unterschieden werden kann, die mit der gleichen Farbe gekennzeichnet sind.
- Erstellen einer Oberfläche
- Wenn die Schaltfläche 3D-Ansicht erneut ausgewählt ist, erstellen Sie eine neue Oberfläche, indem Sie auf das blaue Symbol Neue Flächen hinzufügen klicken.
- Stellen Sie auf der Registerkarte Erstellen , die unten links im Softwarefenster angezeigt wird, sicher, dass nur die Kontrollkästchen Nur eine Region von Interesse segmentieren und Objekt-Objekt-Statistik für Algorithmuseinstellungen aktiviert sind und das Kontrollkästchen Erstellung mit Datenschnittansicht starten für Erstellungseinstellungen deaktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
HINWEIS: Eine Region von Interesse ist möglicherweise nicht erforderlich, wenn sich im Bild außerhalb der interessierenden Zelle kein zusätzliches Fluoreszenzsignal befindet. Lassen Sie in diesem Fall Segment nur eine Region von Interesse deaktiviert und fahren Sie mit Schritt 5.4.3 fort.
- Stellen Sie auf der Registerkarte Erstellen , die unten links im Softwarefenster angezeigt wird, sicher, dass nur die Kontrollkästchen Nur eine Region von Interesse segmentieren und Objekt-Objekt-Statistik für Algorithmuseinstellungen aktiviert sind und das Kontrollkästchen Erstellung mit Datenschnittansicht starten für Erstellungseinstellungen deaktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
- Erzeugen Sie einen Bereich von Interesse um die Zelle, indem Sie Bemaßungen in die Felder unter Größe des Flächenerstellungswerkzeugs eingeben oder die Kanten des gelben Felds ziehen (Abbildung 2A). Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
- Wählen Sie den richtigen Quellkanal aus der Dropdown-Liste für die Analyse aus (z. B. Kanal 1 oder der Kanal, der die fluoreszierende Zellfüllung enthält). Der Wert im Feld Oberflächendetails wird von der Software bestimmt und basiert auf Bildaufnahmeparametern. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert für alle Proben im Experiment konstant bleibt. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
- Passen Sie den Schwellenwert (absolute Intensität) an, indem Sie den gelben Balken ziehen oder Werte in das Feld eingeben, so dass die graue Oberfläche so viel wie möglich vom Signal der Zelle ausfüllt, ohne die Grenze der Zelle zu überschreiten. An den Rändern der Oberfläche ist eine kleine Menge Fluoreszenzsignal sichtbar (Abbildung 2B). Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
- Im letzten Bereich des Werkzeugs "Oberflächenerstellung" wird der Mindestqualitätswert festgelegt, der der standardmäßige untere Schwellenwert der Software ist. Stellen Sie in der Dropdown-Liste sicher, dass Anzahl der Voxel Img=1 ausgewählt ist. Stellen Sie sicher, dass nur der linke Netzschalter für Lower Threshold grün (aktiv) ist. Der rechte Netzschalter sollte rot (inaktiv) sein. Die Software legt den unteren Schwellenwert standardmäßig auf 10 fest. Lassen Sie dies unverändert und klicken Sie auf den grünen Pfeil, um die Generierung der Oberfläche abzuschließen.
- Prüfen Sie die neu erzeugte Oberfläche sorgfältig. Löschen Sie alle Oberflächenteile, die nicht Teil der Zelle sind, indem Sie sie auswählen, auf das Stift-Bearbeitungswerkzeug klicken und auf die Option Löschen klicken.
- Vereinheitlichen Sie die verbleibenden Oberflächenteile, indem Sie auf das Trichterfiltersymbol klicken, um alle auszuwählen, auf das Stiftsymbol Bearbeiten klicken und auf die Option Unify klicken (Abbildung 2C).
HINWEIS: Bei einer großen Bilddatei kann die Software während der nachfolgenden Schritte dieses Protokolls gelegentlich abstürzen. Es ist eine gute Idee, die Datei an dieser Stelle zu speichern.
- Wenn die Schaltfläche 3D-Ansicht erneut ausgewählt ist, erstellen Sie eine neue Oberfläche, indem Sie auf das blaue Symbol Neue Flächen hinzufügen klicken.
- Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche
- Klicken Sie auf das orangefarbene Symbol Neue Spots hinzufügen . Wenn Sie die neuen Spots (z. B. " Spots 1") ausgewählt haben, stellen Sie auf der Registerkarte Erstellen sicher, dass nur das Kontrollkästchen Objekt-Objekt-Statistik für Algorithmuseinstellungen aktiviert ist und das Kontrollkästchen Erstellung mit Datenschnittansicht starten für Erstellungseinstellungen deaktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
- Wählen Sie den richtigen Quellkanal aus der Dropdown-Liste aus (z. B. Kanal 1), und geben Sie dann einen geschätzten XY-Durchmesserwert von 0,400 μm in das Feld ein. Stellen Sie sicher, dass nur das Feld Hintergrundsubtraktion aktiviert ist. Klicken Sie auf den blauen Pfeil , um fortzufahren.
HINWEIS: 0,400 μm sind für 1024 x 1024 oder 512 x 512 Bilder mit 63x, 60x oder 40x Objektiv geeignet. Bei anderen bildgebenden Bedingungen muss der Durchmesser anhand der bildgebenden Bedingungen bestimmt werden und während der gesamten Analyse konstant bleiben. Der entsprechende Wert erzeugt genügend Flecken, um alle positiven Signale abzudecken, fügt jedoch keine Flecken auf dem Hintergrundsignal hinzu. - Das letzte Bedienfeld des Spot-Erstellungswerkzeugs legt den Mindestqualitätswert fest, der der standardmäßige untere Schwellenwert der Software ist. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert unverändert bleibt, es sei denn, es gibt einen spürbaren Unterschied in der Platzierung / Verteilung der Spots (z. B. aufgrund einer schlechteren Qualität der Färbung). Klicken Sie auf den grünen Pfeil , um die Erstellung der Spots abzuschließen.
- Um die Flecken besser anzuzeigen, ändern Sie die Transparenz der Fläche, indem Sie die Fläche auswählen und auf das mehrfarbige Farbwerkzeug klicken. Wählen Sie unter Material das Material aus, das die Oberfläche transparent genug macht, um Punkte in der Zelle anzuzeigen (das vorletzte Material in der Liste) (Abbildung 2D,E).
- Wählen Sie die Spots erneut aus, klicken Sie auf das Filtersymbol und wählen Sie Kürzeste Entfernung zu Flächen = Flächen X, wobei "Flächen X" die zu analysierende Fläche ist (z. B. Flächen 1), aus der Dropdown-Liste. Stellen Sie sicher, dass sowohl der untere Schwellenwert als auch der obere Schwellenwert grün (aktiv) sind.
- Geben Sie einen Mindestabstand von -1,0 μm (Abstand der Spots von der Innenseite der Oberfläche) in das Feld Unterer Schwellenwert und einen maximalen Abstand von 0,1 μm (Abstand von außen) in das Feld Oberer Schwellenwert ein . Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl zu neuen Punkten duplizieren, um die Generierung von Punkten in der Nähe der Oberfläche abzuschließen.
HINWEIS: Die minimalen und maximalen Entfernungswerte können mit unterschiedlichen Bildaufnahmeparametern wie Ziel, Zoom und Auflösung variieren. Diese Zahlen müssen empirisch ermittelt werden. Die transparente Oberfläche hilft zu beurteilen, ob die Werte alle Punkte erfassen, die die Form der Oberfläche genau darstellen.
- Geben Sie einen Mindestabstand von -1,0 μm (Abstand der Spots von der Innenseite der Oberfläche) in das Feld Unterer Schwellenwert und einen maximalen Abstand von 0,1 μm (Abstand von außen) in das Feld Oberer Schwellenwert ein . Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswahl zu neuen Punkten duplizieren, um die Generierung von Punkten in der Nähe der Oberfläche abzuschließen.
- Generieren Sie einen konvexen Rumpf und sammeln Sie Gebietsmessungen
- Stellen Sie sicher, dass die neu erstellten Spots im oberen linken Bereich des Softwarefensters ausgewählt sind (z. B. " Spots 1 Selection ['Shortest Distance...]). Klicken Sie auf das Zahnradwerkzeugsymbol und dann auf das Convex Hull-Plugin . Klicken Sie nur einmal auf das Plugin und warten Sie, bis das MATLAB-Fenster erscheint und dann verschwindet (dies kann einige Sekunden dauern). Ein solider Rumpf wird in der 3D-Ansicht angezeigt.
- Wählen Sie im oberen linken Bereich Konvexe Hülle der Spots X Auswahl ['Kürzeste Entfernung...], wobei 'Spots X Selection' die neu erstellten Spots sind (z. B. Spots 1 Selection), und klicken Sie dann auf den Rumpf, um ihn auszuwählen (Abbildung 2F).
- Klicken Sie auf das Diagrammsymbol Statistik , wählen Sie die Registerkarte Auswahl , stellen Sie sicher, dass Bestimmte Werte aus der oberen Dropdown-Liste ausgewählt ist, und wählen Sie dann Volume aus der unteren Dropdown-Liste aus. Notieren Sie das Volumen des Rumpfes. Speichern Sie die Datei und fahren Sie mit dem nächsten Bild fort.
- Messung des Gebietsüberlappungsvolumens für benachbarte Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen
HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls kann verwendet werden, wenn die Proben benachbarte Astrozyten enthalten, die unterschiedliche fluoreszierende Markierungen exprimieren (z. B. Astrozyte 1 exprimiert nur GFP und Astrozyte 2 exprimiert nur RFP). Diese Markierung wurde unter Verwendung viraler oder genetischer Strategien erreicht, wie zuvor beschrieben 9,10 (Abbildung 3A).- Erzeugen Sie mit den in den Schritten 5.4-5.6 beschriebenen Schritten die Oberfläche, die Flecken in der Nähe der Oberfläche und die konvexe Hülle für jeden Astrozyten (Abbildung 3B).
- Wenn Konvexe Wanne der Flecken 1 Auswahl... ausgewählt ist, klicken Sie auf das Stiftsymbol Bearbeiten und klicken Sie auf Maskenauswahl. Stellen Sie im Fenster Maskenkanal sicher, dass Kanal 1 (oder der Kanal, der Astrozyten 1 darstellt) ausgewählt ist, und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben dem doppelten Kanal vor dem Anwenden der Maskenoption aktiviert ist. Klicken Sie auf OK, um den Kanal Masked CH1 zu erstellen.
- Mit konvexem Rumpf von Spots 2 Auswahl... ausgewählt, klicken Sie auf das Stiftsymbol Bearbeiten und klicken Sie auf Maskenauswahl. Wählen Sie im Fenster Maskenkanal die Option Kanal 2 (oder den Kanal, der Astrozyten 2 darstellt) aus dem Dropdown-Menü aus und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen neben dem doppelten Kanal vor dem Anwenden der Maskenoption aktiviert ist. Klicken Sie auf OK, um den Kanal Masked CH2 zu erstellen (Abbildung 3C).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Coloc oben auf dem Bildschirm und verwenden Sie das Coloc-Tool, um einen Co-Lokalisierungskanal der beiden maskierten Kanäle zu erstellen. Stellen Sie Kanal A auf Kanal 3 - Maskierter CH1 und Kanal B auf Kanal 4 - Maskierter CH2 ein (Abbildung 3D).
- Ziehen Sie den gelben Histogrammbalken für beide Kanäle nach links. Verwenden Sie die Segmentansicht unten, um das Co-Lokalisierungssignal zu beobachten, das in Grau sichtbar ist. Beachten Sie, dass, da die fluoreszierenden Signale der beiden Zellen nicht wirklich kolokalisiert sind, der Schwellenwert nach links verschoben werden muss, so dass falsche Kolokalisationen an Punkten des Zell-Zell-Kontakts auftreten.
- Klicken Sie auf der rechten Seite auf Kolokkanal erstellen , um den Vorgang abzuschließen. Klicken Sie auf die 3D-Ansicht, um zur Standard-3D-Ansicht zurückzukehren. Ein Kanal für das Kolokalisierungsergebnis wird nun grau angezeigt und im Anzeigeanpassungsfeld angezeigt.
- Erstellen Sie die Oberfläche, die Punkte in der Nähe der Oberfläche und die konvexe Hülle des Kolokalisierungsergebniskanals mit den in 5.4-5.7 beschriebenen Schritten (Abbildung 3E,F).
- Notieren Sie sich das Volumen des konvexen Rumpfes. Dies ist das Volumen der Gebietsüberlappung. Teilen Sie diese Zahl durch das Gebietsvolumen eines der Astrozyten, um den Prozentsatz der Gebietsüberlappung zu berechnen. Wählen Sie den Kontroll- oder Wildtyp-Astrozyten, wenn einer der Astrozyten in Bezug auf den anderen genetisch manipuliert ist.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte und den Workflow für dieses Protokoll. Abbildung 2 zeigt Screenshots der wichtigsten Schritte mit der Bildanalysesoftware zum Generieren einer Oberfläche, zum Generieren von Punkten in der Nähe der Oberfläche und zum Generieren einer konvexen Hülle. Abbildung 3 zeigt die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung der Überlappung/Kachelung des Astrozytengebiets. In Abbildung 4 zeigen repräsentative Ergebnisse aus einem zuvor veröffentlichten Manuskript9 die Anwendung dieses Protokolls. In Abbildung 4A und Abbildung 4B reduziert der Knockdown des mit Astrozyten angereicherten Zelladhäsionsmoleküls hepaCAM das Astrozytengebietsvolumen signifikant. In Abbildung 4C und Abbildung 4D wurde die Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM) verwendet, um spärliche Mosaikmarkierungen und gleichzeitige genetische Veränderungen in den Mauskortex einzuführen. Mit MADM wurden Mäuse erzeugt, bei denen Wildtyp-Astrozyten ein rot fluoreszierendes Protein (RFP) und Hepacam-Knockout-Astrozyten ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren. Mit dem oben beschriebenen Protokoll wurde der Prozentsatz der Gebietsüberlappung zwischen benachbarten RFP- und GFP-Astrozytenpaaren (WT:KO) berechnet. Als Kontrolle wurde dies mit benachbarten RFP- und GFP-Astrozytenpaaren in Mäusen ohne genetische Veränderung von Hepacam (WT: WT) verglichen. WT:KO-Astrozytenpaare zeigten einen signifikant erhöhten Prozentsatz des Gebietsüberlappungsvolumens im Vergleich zu WT:WT-Astrozytenpaaren. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass hepaCAM für normales Astrozytengebietsvolumen und Astrozytenkachelung erforderlich ist.
Abbildung 1: Überblick über den Workflow zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens . (A) Das Protokoll erfordert eine Maus mit spärlicher oder mosaikfluoreszierender Markierung von Astrozyten. (B) Die Maus wird durchblutet und dann wird das Gehirn reseziert, verarbeitet und eingefroren. (C) Das gefrorene Gehirn wird mit einem Kryostaten geschnitten und (D) die frei schwebenden Gewebeabschnitte werden gesammelt. (E) Nach dem Schneiden werden die schwimmenden Gewebeabschnitte durch Immunhistochemie gefärbt und dann (F) auf Objektträger montiert. (G) Astrozyten innerhalb der montierten Gewebeabschnitte werden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. (H) Schließlich werden die Gebietsvolumina der abgebildeten Zellen mit Hilfe einer Bildanalysesoftware quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wichtige Schritte im Bildanalyseverfahren für das Volumen des Astrozytengebiets . (A) Ansicht der Zelle mit Feld "Region of Interest", das ein anderes Signal im Bild aus dem Analyseverfahren ausschließt. (B) Ein akzeptabler relativer Schwellenwert für die Oberflächenerzeugung (grau) unter Verwendung von Signal (rot). (C) Abgeschlossene Oberfläche mit ausgewählter Hauptzelle (gelb). Andere Teile der Oberfläche, die nicht die Zelle sind, werden gelöscht (rot). (D) Transluzente Oberfläche mit erzeugten Flecken. (E) Nahaufnahme der durchscheinenden Oberfläche mit Punkten, die erstellt wurden, um eine akzeptable Verteilung von Flecken relativ zur Oberfläche zu zeigen. (F) Endgültiger konvexer Rumpf. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wichtige Schritte in der Astrozyten-Gebietsüberlappungsanalyse. (A) Repräsentatives Bild von zwei Astrozyten, die unterschiedliche Fluoreszenzmarker exprimieren, GFP (grün) und RFP (Magenta). (B) Erzeugung einer konvexen Hülle für jeden Astrozyten. (C) Ansicht der maskierten GFP- und RFP-Kanäle, wobei die ursprünglichen Kanäle entfernt wurden. (D) Beispiel für Schwellenwerte mit dem Werkzeug "Coloc" zum Erstellen eines Kanals "Kolokalisierungsergebnis". Das "colokalisierte" Signal ist grau dargestellt. (E) Ansicht der beiden maskierten Kanäle. (F) Eine gedrehte Ansicht der konvexen Hülle des Kanals "Colocalization Result" (grau), der das Volumen der Gebietsüberlappung darstellt. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erfolgreiche Anwendung des Protokolls zur Messung des Astrozytengebietsvolumens und der Überlappung des Astrozytengebiets . (A) Astrozyten im visuellen Kortex von Wildtyp-CD1-Mäusen am postnatalen Tag 21, die mCherry-CAAX (Cyan) und eine Kontroll-shRNA (shScramble) oder eine shRNA exprimieren, die auf hepaCAM (shHepacam) abzielt. Das Astrozytengebiet ist rot umrandet. (B) Der Verlust von hepaCAM reduziert das Volumen des Astrozytengebiets erheblich. Datenpunkte stellen einzelne Mausdurchschnitte dar. Fehlerbalken sind ± s.e.m. Nested t-test. (C) Benachbarte Astrozyten im Mauskortex am postnatalen Tag 21, die GFP (grün) oder RFP (Magenta) exprimieren. Bei MADM9 WT:WT-Mäusen sind beide Astrozyten Wildtypen. Bei MADM9 WT:KO-Mäusen ist der grüne Astrozyt ein Wildtyp und der Magenta-Astrozyt ist null für Hepacam. Das Volumen der Gebietsüberlappung ist blau dargestellt. (MADM9 WT:WT Genotyp: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO Genotyp: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). (D) Quantifizierung des Prozentsatzes der Überschneidung des Gebietsvolumens. Datenpunkte stellen einzelne Mausdurchschnitte dar. Fehlerbalken sind ± s.e.m. Nested t-test. Maßstabsstäbe = 20 μm. Die Tafeln in dieser Abbildung werden von Baldwin et al 9 mit Genehmigung desVerlags nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine etablierte Methode zur Analyse des Astrozytengebietsvolumens und der Astrozytenkachelung im Mauskortex und beschreibt alle wichtigen Schritte, beginnend mit der Perfusion und endend mit der Bildanalyse. Dieses Protokoll erfordert Gehirne von Mäusen, die fluoreszierende Proteine in einer spärlichen oder mosaischen Population von Astrozyten exprimieren. Außerhalb dieser Anforderung können Mäuse jeden Alters für dieses Protokoll verwendet werden, wobei nur geringfügige Anpassungen an den Perfusionseinstellungen und dem Volumen der Gefriermedien vorgenommen werden, die der Einbettungsform hinzugefügt werden. Während andere Methoden zur Analyse der Komplexität und des Volumens von Astrozytenverzweigungen in Hirngewebeabschnitten 7,11 veröffentlicht wurden, hat dieses Protokoll mehrere einzigartige Vorteile. Erstens beschreibt dieses Protokoll einen benutzerdefinierten Code, der verwendet werden kann, um das Volumen des Astrozytengebiets zu erhalten. Das Volumen des Astrozytenterritoriums unterscheidet sich vom Astrozytenzellvolumen, da es den gesamten von einem Astrozyten besetzten Raum misst, unabhängig von seiner verzweigten Komplexität. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll, wie die Messung des Astrozytengebietsvolumens angewendet wird, um das Überlappungsvolumen des Astrozytenterritoriums und damit das Verhalten der Astrozytenkachelung zu messen. Schließlich bietet dieses Protokoll eine detaillierte Diskussion der potenziellen Variablen, die das Astrozytengebietsvolumen und die Datenerfassung beeinflussen können, einschließlich Montagebedingungen, Probenlagerungsbedingungen sowie Einschluss- und Ausschlusskriterien für Bildgebung und Analyse. Zusätzlich zu diesen einzigartigen Merkmalen können viele Aspekte dieses Protokolls, einschließlich der Perfusion, Kryosektion und Immunfärbung von frei schwebenden Abschnitten, allgemein auf die Färbung von Hirngewebeabschnitten unterschiedlicher Dicke und mit verschiedenen Antikörperkombinationen angewendet werden. Im Folgenden werden wichtige Schritte, wichtige Überlegungen, Problembehandlung und Einschränkungen ausführlich erläutert.
Überlegungen zur Beispielsammlung
Eine sehr wichtige Überlegung für Experimente zur Untersuchung der Astrozytenmorphologie ist die Aufrechterhaltung einer konsistenten Tageszeit für die Probenentnahme. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass die funktionellen Zustände der Astrozyten mit dem circadianen Rhythmus und dem Schlafverhalten verbunden sind14. Um jegliche Variabilität zu beseitigen, die durch die Entnahme von Proben zu verschiedenen Tageszeiten verursacht werden kann, sollten Perfusionen so geplant werden, dass alle Proben für ein Experiment ungefähr zur gleichen Tageszeit innerhalb eines Zeitraums von 2-3 Stunden gesammelt werden. Für konsistente Perfusionen wird der Einsatz einer Peristaltikpumpe dringend empfohlen. Die Zugabe von Heparin zur TBS ist hilfreich, um die Bildung von Blutgerinnseln zu reduzieren. Während dieses Protokoll nicht mit kürzeren Nachfixationszeiten getestet wurde, ist eine Nachfixierung über Nacht möglicherweise nicht erforderlich, und eine kürzere Nachfixierung von 4 h kann in Betracht gezogen werden.
Tipps zur Fehlerbehebung bei der Kryosektion
Das Einfrieren von Gehirnen im 2:1 Saccharose:OCT-Gefriermedium reduziert die Menge an OCT in den Entnahmevertiefungen nach dem Schneiden. Im gefrorenen Zustand verhält sich das gefrierende Medium ähnlich wie OCT selbst, ist aber weniger spröde. Wenn Sie den Gewebeblock auf das Spannfutter einfrieren, achten Sie darauf, ihn unmittelbar nach dem Hinzufügen von OCT zum Spannfutter flach auf das Spannfutter zu drücken. Wenn der Gewebeblock während des Schneidens vom Spannfutter abbricht, schneiden Sie mit einer Rasierklinge eine neue ebene Oberfläche auf der Unterseite ab und frieren Sie das Futter wieder ein. Wenn Sie dem Futter genügend Zeit geben, um vor dem Hinzufügen des OCT auf die Kryostatkammertemperatur abzukühlen, und sicherstellen, dass das Futter sauber und trocken ist, wird die Haftung verbessert. Wenn Sie Gewebeabschnitte mit dem Pinsel bewegen, berühren Sie den Pinsel an der Eckkante des Abschnitts, so dass er das OAT und nicht das Gewebe selbst berührt. Mit etwas Feuchtigkeit haftet der Abschnitt an der Bürste. Legen Sie das Gewebe vorsichtig in das Schnittmedium, indem Sie den gegenüberliegenden Rand des Abschnitts zum Medium berühren und es in das Medium ziehen lassen. Wenn der Pinsel das gefrierende Medium berührt, wischen Sie es auf einem Papiertuch im Kryostaten ab. Eine zu nasse Bürste erschwert den Transfer von Abschnitten in die Schale. OCT sollte sich auflösen, sobald der Gewebeschnitt in das Schnittmedium gelegt wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, kann die Kryostatenkammertemperatur zu niedrig sein.
Wichtige Überlegungen zum Färben und Montieren von Gewebeschnitten
Um die Färbequalität zu verbessern, bereiten Sie TBST vor jedem Experiment frisch zu. Verwenden Sie eine hochwertige 10% wässrige Triton-Quelle (Materialverzeichnis). Wählen Sie ein Serum, das zu der Spezies passt, in der der sekundäre Antikörper hergestellt wurde (z. B. verwenden Sie Ziegenserum für ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärsystem). Antikörperlösungen werden vor der Verwendung zentrifugiert, um ausgefällte Antikörper zu pelletieren und zu entfernen. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, wenn Sie Antikörperlösung vom Röhrchen auf die Platte übertragen (dies kann bedeuten, dass etwas weniger als 1 ml Antikörperlösung pro Person pipettiert wird, um den Boden des Röhrchens nicht mit der Pipettenspitze zu berühren). Dieser Schritt hilft, Hintergrundflecken zu reduzieren. Wenn Abschnitte in TBS:dH2O platziert werden, entwirren sich die meisten selbst, aber einige können gefaltet oder verdreht bleiben. Wenn Sie Abschnitte mit einem Pinsel auf den Objektträger übertragen, verwenden Sie eine P200-Spitze in der anderen Hand, um den Gewebeabschnitt an die entsprechende Stelle zu führen. Verwenden Sie den Pinsel, um Abschnitte vorsichtig zu entfalten oder zu entdrehen, so dass sie flach liegen. Abschnitte neigen dazu, sich in Richtung der Ansaugpipet zu bewegen, wenn die Flüssigkeit entfernt wird. Verwenden Sie die P200-Spitze, um mobile Abschnitte während des Ansaugens an Ort und Stelle zu halten. Montagemedien müssen sofort nach dem Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit und bevor die Abschnitte Zeit zum Trocknen haben, zu den Abschnitten hinzugefügt werden. Wenn Sie die Abschnitte auch nur für einige Minuten trocknen lassen, wirkt sich dies drastisch auf das Volumen der Zellen innerhalb des Abschnitts aus. Nachdem Sie das Montagemedium zum Objektträger hinzugefügt haben, verwenden Sie eine Pipette, um alle sichtbaren Blasen zu entfernen. Achten Sie nach dem Hinzufügen des Deckglases darauf, überschüssige Montagemedien von den Seiten zu entfernen, da dies die Fähigkeit des Nagellacks zum Trocknen beeinträchtigt. Lassen Sie den Nagellack bei Raumtemperatur trocknen. Warten Sie mindestens 2 h oder bis zum nächsten Tag, um die Abschnitte abzubilden, um sicherzustellen, dass das Montagemedium genügend Zeit hat, um die dicken Abschnitte vollständig zu durchdringen.
Abbildung kompletter Astrozyten
Bei der Abbildung von Astrozyten für die Analyse des Gebietsvolumens ist es wichtig, dass das Bild das gesamte Volumen des Astrozyten erfasst. Viele markierte Astrozyten im Gewebeabschnitt werden unvollständige Astrozyten sein. Vollständige Astrozyten werden vollständig im Gewebeabschnitt enthalten sein. Um vollständige Astrozyten zu identifizieren, beginnen Sie mit einem Brennpunkt in der Mitte des Astrozyten. Verwenden Sie den Fokusknopf, um sich an die Spitze des Astrozyten zu bewegen. Wenn der Astrozyt nicht mehr fokussiert ist, sollten andere Merkmale des Gewebes im Fokus bleiben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Boden des Astrozyten. Stellen Sie keine unvollständigen Astrozyten ab. Aufgrund der Dicke der Abschnitte ist die Antikörperpenetration in der Mitte des Abschnitts nicht so robust. Die Beschriftung kann an den äußeren Rändern des Astrozyten stärker und in der Mitte schwächer sein. Dies wird häufig beobachtet und hat keinen Einfluss auf die Gebietsanalyse.
Tipps zur Bildanalyse
Die wichtigste Überlegung für den Bildanalyseteil des Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass der konvexe Rumpf nur einen Astrozyten darstellt. Befolgen Sie jedes Mal die Ein- und Ausschlusskriterien. Manchmal haben zwei Astrozyten ihre Zellkörper sehr nahe beieinander. Dies kann in der 3D-Ansicht schwer zu identifizieren sein, ist aber mit der Segmentansicht identifizierbar. Wenn andere fluoreszierend markierte Astrozyten den interessierenden Astrozyten kontaktieren, kann dies den Oberflächenbildungsprozess erschweren. Wenn eine einigermaßen klare Grenze zwischen den beiden Zellen sichtbar ist (z. B. wenn sie nur an einem kleinen Verzweigungspunkt verbunden sind), kann das Clip-Werkzeug verwendet werden, um einen Schnitt in der Oberfläche vorzunehmen, und dieser Teil der Oberfläche kann gelöscht werden. Drehen Sie nach dem Erstellen der Oberfläche die Zelle in der 3D-Ansicht, um nach kleinen Oberflächenteilen zu suchen, die sich möglicherweise hinter der Zelle verbergen, aber nicht Teil der Zelle sind. Löschen Sie diese, bevor Sie fortfahren. Wenn die konvexe Hülle drastisch zu einem Punkt außerhalb des Astrozytenterritoriums herausragt, gibt es wahrscheinlich ein Stück Nicht-Zell-Oberfläche, das nicht entfernt wurde. Wenn die Software während der Oberflächenerstellung routinemäßig abstürzt, kann die Anzahl der Oberflächendetails reduziert werden. Wenn es während der Fleckenerstellung abstürzt, verwenden Sie einen Bereich von Interesse, um Punkte nur in der Nähe des Oberflächenobjekts zu erstellen.
Einschränkungen des Protokolls
Während es viele Anwendungen und Vorteile für dieses Protokoll gibt, gibt es auch einige Einschränkungen. Dieses Protokoll erfordert Mäuse, die bereits fluoreszierende Proteine in einer spärlichen Population von Astrozyten exprimieren, beschreibt jedoch nicht die Methoden zur Einführung der Expression fluoreszierender Proteine in Astrozyten. Die Bildgebungs- und Analysepipelines sind zeitaufwändig und eignen sich nicht gut für Analysen mit hohem Durchsatz. Darüber hinaus sind sie speziell auf die Messung des Volumens und der Kachelung des Astrozytenterritoriums ausgerichtet, anstatt die detaillierten morphologischen Merkmale einzelner Astrozyten zu definieren. Andere mögen es nützlich finden, Ansätze und Strategien dieses Protokolls mit kürzlich veröffentlichten Protokollen zu kombinieren, die Methoden zur Messung der morphologischen Komplexität von Astrozyten detailliert beschreiben 7,11. Schließlich sind die in diesem Protokoll verwendeten kommerziellen Softwareplattformen (d. h. Imaris und MATLAB) teuer und erfordern eine Lizenz zur Nutzung. Während große Institutionen häufig Lizenzen für diese Softwareplattformen erwerben, könnte dies für kleinere Institutionen und einzelne Labore unerschwinglich sein. Fortschritte in der Mikroskopie, Open-Source-Bildanalysesoftware und Algorithmen für maschinelles Lernen können dazu beitragen, dieses Protokoll für alle Labore allgemein zugänglich zu machen und auch die Effizienz der Bilderfassung und -analyse zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Mikroskopie wurde am UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) durchgeführt, teilweise unterstützt durch Mittel aus dem NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 und dem NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Die Bilder und Daten in Abbildung 4 werden mit Genehmigung des Herausgebers aus einer früheren Publikation 9 nachgedruckt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
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