Summary
Detta protokoll beskriver metoder för sektionering, färgning och avbildning av fritt flytande vävnadssektioner i mushjärnan, följt av en detaljerad beskrivning av analysen av astrocytrevirvolym och astrocytreviröverlappning eller kakel.
Abstract
Astrocyter har en häpnadsväckande grad av morfologisk komplexitet som gör det möjligt för dem att interagera med nästan alla typer av celler och strukturer i hjärnan. Genom dessa interaktioner reglerar astrocyter aktivt många kritiska hjärnfunktioner, inklusive synapsbildning, neurotransmission och jonhomeostas. I gnagarhjärnan växer astrocyter i storlek och komplexitet under de första tre postnatala veckorna och etablerar distinkta, icke-överlappande territorier för att kakla hjärnan. Detta protokoll tillhandahåller en etablerad metod för att analysera astrocytrevirvolym och astrocytplattor med hjälp av fritt flytande vävnadssektioner från mushjärnan. För det första beskriver detta protokoll stegen för vävnadsuppsamling, kryosektion och immunfärgning av fritt flytande vävnadssektioner. För det andra beskriver detta protokoll bildförvärv och analys av astrocytterritoriumvolym och områdesöverlappningsvolym med hjälp av kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara. Slutligen diskuterar detta manuskript fördelarna, viktiga överväganden, vanliga fallgropar och begränsningar med dessa metoder. Detta protokoll kräver hjärnvävnad med gles eller mosaik fluorescerande märkning av astrocyter och är utformad för att användas med vanlig laboratorieutrustning, konfokalmikroskopi och kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara.
Introduction
Astrocyter är utstuderat grenade celler som utför många viktiga funktioner i hjärnan1. I musbarken ger radiella glialstamceller upphov till astrocyter under de sena embryonala och tidiga postnatala stadierna2. Under de första tre postnatala veckorna växer astrocyter i storlek och komplexitet och utvecklar tusentals fina grenar som direkt interagerar med synapser1. Samtidigt interagerar astrocyter med angränsande astrocyter för att etablera diskreta, icke-överlappande territorier för att kakla hjärnan3, samtidigt som kommunikationen upprätthålls via gapkorsningskanaler4. Astrocytmorfologi och organisation störs i många sjukdomstillstånd efter förolämpning eller skada5, vilket indikerar vikten av dessa processer för korrekt hjärnfunktion. Analys av astrocytmorfologiska egenskaper under normal utveckling, åldrande och sjukdom kan ge värdefulla insikter i astrocytbiologi och fysiologi. Vidare är analys av astrocytmorfologi efter genetisk manipulation ett värdefullt verktyg för att urskilja de cellulära och molekylära mekanismer som styr etableringen och upprätthållandet av astrocytmorfologisk komplexitet.
Analys av astrocytmorfologi i mushjärnan kompliceras av både astrocytförgreningskomplexitet och astrocytplattor. Antikroppsfärgning med det mellanliggande filamentet glialfibrillärt surt protein (GFAP) som en astrocytspecifik markör fångar endast de viktigaste grenarna och underskattar kraftigt astrocytmorfologisk komplexitet1. Andra cellspecifika markörer som glutamattransportör 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminsyntetas eller S100β gör ett bättre jobb med att märka astrocytgrenar6, men introducerar ett nytt problem. Astrocytområden är till stor del icke-överlappande, men en liten grad av överlappning finns vid de perifera kanterna. På grund av komplexiteten i förgrening, när angränsande astrocyter är märkta i samma färg, är det omöjligt att skilja var en astrocyt slutar och den andra börjar. Gles eller mosaikmärkning av astrocyter med endogena fluorescerande proteiner löser båda problemen: den fluorescerande markören fyller cellen för att fånga alla grenar och möjliggör avbildning av enskilda astrocyter som kan särskiljas från sina grannar. Flera olika strategier har använts för att uppnå gles fluorescerande märkning av astrocyter, med eller utan genetisk manipulation, inklusive viral injektion, plasmidelektroporering eller transgena muslinjer. Detaljer om genomförandet av dessa strategier beskrivs i tidigare publicerade studier och protokoll 1,7,8,9,10,11,12,13.
Denna artikel beskriver en metod för att mäta astrocytrevirvolym från mushjärnor med fluorescerande märkning i en gles population av astrocyter (Figur 1). Eftersom medeldiametern för en astrocyt i musbarken är cirka 60 μm används 100 μm tjocka sektioner för att förbättra effektiviteten vid infångning av enskilda astrocyter i sin helhet. Immunfärgning krävs inte men rekommenderas för att förbättra den endogena fluorescerande signalen för konfokal avbildning och analys. Immunfärgning kan också möjliggöra bättre detektion av fina astrocytgrenar och minska fotoblekning av endogena proteiner under bildförvärv. För att förbättra antikroppspenetrationen i de tjocka sektionerna och för att bevara vävnadsvolymen från sektionering genom avbildning används fritt flytande vävnadssektioner. Analys av astrocytrevirvolym utförs med hjälp av kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara. Dessutom beskriver detta protokoll en metod för analys av astrocytplattor i vävnadssektioner med mosaikmärkning, där angränsande astrocyter uttrycker olika fluorescerande etiketter. Detta protokoll har använts framgångsrikt i flera nyligen genomförda studier 1,8,9 för att karakterisera astrocyttillväxt under normal hjärnutveckling, liksom effekten av genetisk manipulation på astrocytutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss användes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of North Carolina at Chapel Hill och Division of Comparative Medicine (IACUC-protokollnummer 21-116.0). Möss av båda könen vid postnatal dag 21 (P21) användes för dessa experiment. CD1-möss erhölls kommersiellt (materialtabell), och MADM9 WT: WT och MADM9 WT: KO-möss beskrevs tidigare9.
OBS: Detta protokoll kräver hjärnor med fluorescerande proteinuttryck i en gles population av astrocyter. Fluorescerande proteinuttryck kan införas genetiskt, viralt eller genom elektroporering. Detaljer om metoder för att glesmärka astrocyter beskrivs i tidigare publicerade studier och protokoll 1,7,8,9,10,11,12,13.
1. Insamling och beredning av vävnader
VARNING: Paraformaldehyd (PFA) är en farlig kemikalie. Utför alla steg med PFA i en kemisk dragskåpa.
- Bedöva möss med ett injicerbart bedövningsmedel (t.ex. avertin; 0,8 mg /kg) och säkerställa anestesidjup med en tånypa. Använd en peristaltisk pump för att utföra intrakardiell perfusion med iskall Tris-buffrad saltlösning (TBS) + heparin med en hastighet av ~ 3 ml / min tills levern är klar (vanligtvis 3-5 min), följt av iskall 4% PFA i TBS med en hastighet av ~ 3 ml / min i 5 minuter.
OBS: Flödeshastighet och tider är optimerade för möss efter dag 21 (P21). Justeringar av flödeshastighet och perfusionstid kan behövas för möss i olika åldrar. - Efter perfusion, använd en sax för att lossa huvudet och ta bort huden för att exponera skallen. Använd sedan en mikrodissekerande sax för att ta bort toppen av skallen för att exponera hjärnan. Använd ett par pincett eller en liten spatel för att ta bort hjärnan och överföra den till ett rör som innehåller iskallt 4% PFA och inkubera över natten vid 4 °C.
OBS: Var noga med att använda ett rör med en platt botten, till exempel en 7 ml scintillationsflaska, så att hjärnan inte blir kilad i rörets botten, vilket kan komprimera vävnaden och ändra astrocytvolymen. - Följande dag, häll ut PFA från röret. Tillsätt 5 ml 1x TBS i röret för att skölja hjärnan och ta bort kvarvarande PFA. Häll ut TBS och upprepa denna process ytterligare två gånger för totalt tre sköljningar.
- Tillsätt 4-5 ml 30% sackaros i TBS och inkubera hjärnan vid 4 °C i 1-2 dagar, eller tills hjärnan sjunker till botten av röret.
OBS: Hjärnor är redo att frysas när de har sjunkit men kan förvaras i sackaroslösning vid 4 °C i flera veckor. - Förbered frysmediet i ett 50 ml rör genom att blanda 15 ml 100% optimal skärtemperatur (OCT) förening med 30 ml 30% sackaros i TBS. Blanda på en mutterator eller en orbitalskakare i minst 1 timme för att säkerställa att lösningen är helt blandad. Håll röret upprätt i ytterligare en timme så att eventuella bubblor kan stiga till ytan.
OBS: Frysmediet kan förberedas i förväg och förvaras vid rumstemperatur i flera veckor. - Använd en serologisk pipett för att lägga till frysmedium till en fyrkantig inbäddningsform (materialtabell). Var noga med att undvika att införa bubblor i mediet. För en P21-mushjärna räcker det med 3 ml. Justera volymen efter behov för olika åldrar så att hjärnan är helt nedsänkt.
- Lägg till hjärnan i mediet och använd ett par #5 tångar för att ta bort alla hjärnstammar som kan hindra hjärnan från att sitta platt i formen. Ställ upp framsidan av hjärnan med ena kanten av formen.
- Överför formen till en plan yta kyld med torris. En lunchburk i metall fylld med torris fungerar bra för detta ändamål. Omge formen med torrispellets för att säkerställa långsam och jämn frysning.
- När frysmediet är helt vitt och fast, förvara formen vid -80 °C.
OBS: Hjärnor kan förvaras vid -80 °C i flera år.
2. Cyrosectioning
OBS: Denna sektionsmetod är avsedd att fungera med många olika kommersiellt tillgängliga kryostater. Med kryostaten som används här (materialtabell) är den optimala skärtemperaturen för provhuvudet -23 °C, med en omgivande kammartemperatur mellan -23 °C och -25 °C.
VARNING: Kryostatbladet är extremt skarpt. Var försiktig när du manipulerar bladet och använder kryostaten.
- Förbered sektioneringsmediet genom att blanda 25 ml 1x TBS och 25 ml glycerol i ett 50 ml rör. Det är lättast att tillsätta glycerolen genom att hälla den direkt i röret och använda markörerna på röret för mätning. Skaka/virvla röret som ska blandas. Denna lösning kan förvaras vid rumstemperatur i flera veckor.
- Förbered dig på att samla vävnadssektioner genom att tillsätta 2 ml sektionsmedium per brunn till en 12-brunnsplatta. Märk plattans övre och nedre del med provinformation. Placera plattan, tillsammans med andra förnödenheter (kryostatblad, rakblad, chuckar och penslar), direkt i kryostaten och låt dem acklimatisera sig till temperaturen i ~ 5 minuter.
- Flytta hjärnorna in i kryostatkammaren och låt dem acklimatisera sig till temperaturen tillsammans med förnödenheterna.
- Ta bort det frysta vävnadsblocket från formen genom att skära två hörn av formen med ett rakblad och skala bort formen från vävnaden. Orientera blocket så att hjärnans framsida är vänd uppåt.
- Tillsätt OCT till chucken så att ~ 2/3 av chucken är täckt med OCT och placera omedelbart vävnadsblocket på chucken och behåll den orientering som beskrivs ovan. Tryck ner blocket i OCT så att det är plant på chuckens yta.
- När OCT är helt frusen och vävnadsblocket är ordentligt på plats, kläm fast chucken på provhuvudet. Sätt i kryostatbladet och för bladet nära provet.
- Trimma genom hjärnan med 100 μm intervall tills strax innan hjärnregionen av intresse nås. För att minska mängden OCT som löses upp i sektionsmediet, använd ett rakblad för att trimma överflödigt frysmedium från sidorna av vävnadsblocket.
- När intresseområdet har uppnåtts börjar du samla 100 μm tjocka sektioner. Samla sektioner med antingen krängningsplattan eller genom att långsamt föra kryostaten framåt med ena handen medan du använder en pensel i den andra handen för att styra sektionen från blocket när den möter bladet. Om kryostatmodellen har en pedal, använd sedan pedalen för att föra kryostaten framåt så att båda händerna kan användas för att styra sektionen från blocket.
- Överför sektionerna till 12-brunnsplattan med en pensel eller pincett. Varje brunn kan rymma minst 10-12 sektioner. När du lägger till sektionen i mediet är det vanligtvis tillräckligt att röra vid sektionens nedre kant till sektionsmediet och låta sektionen smälta in i mediet utan att få borsten eller tången våt. Om borsten rör vid mediet, var noga med att torka den med en pappershandduk eller vävnad, eftersom en alltför våt borste gör det svårt att överföra vävnadssektioner.
- Säkra plattan genom att förpacka den med folie eller paraffinfilm. Se till att märka den tydligt och förvara den sedan vid -20 °C.
OBS: För de flesta färgningsprotokoll kan sektioner lagras vid -20 °C i minst 1-2 år utan betydande signalförlust.
3. Immunfärgning
OBS: Utför alla tvättar och inkubationer på en orbitalplattformsskakare inställd på cirka 100 rpm. Alla steg utförs vid rumstemperatur, utom den primära antikroppsinkubationen, som utförs vid 4 °C. Förbered monteringsmedia i förväg genom att kombinera ingredienserna i ett 50 ml rör och blanda på en mutter över natten. Skydda mot ljus och förvara vid 4 °C i upp till 2 månader. Om den endogena fluorescerande signalen är tillräcklig för avbildning och analys utan behov av immunfärgning kan steg 3.1-3.9 hoppas över. Om du hoppar över immunfärgning, utför tre 10 minuters tvättar i TBS och fortsätt till steg 3.10.
- Förbered en ny lösning av TBST (0,2% Triton i TBS) genom att tillsätta 1 ml 10% Triton-X till ett 50 ml rör och fylla röret till 50 ml med 1x TBS. Förbered 2 ml blockerande och antikroppslösningar (10% getserum i TBST) för varje hjärna.
OBS: För bästa resultat, gör färsk TBST för varje nytt färgningsexperiment och använd en högkvalitativ källa på 10% vattenhaltig Triton-X (materialtabell). - Märk en 24-brunnsplatta enligt schemat (figur 1). Placera olika prover i olika rader och olika lösningar i olika kolumner. Tillsätt 1 ml TBST i de tre första kolumnerna ("Tvätt 1", "Tvätt 2" och "Tvätt 3"). Tillsätt 1 ml blockeringslösning till den fjärde kolumnen.
- Förbered en glasplockning genom att smälta änden av en 5,75 i Pasteur-pipett i en liten krok med en Bunsen-brännare. Använd detta val för att överföra vävnadssektioner från 12-brunnsplattan till tvätt 1-kolonnen på 24-brunnsplattan.
OBS: För bästa resultat, skärma sektionerna innan du börjar färga. För att skärma sektioner, överför sektionerna en efter en till en petriskål fylld med 1x TBS och undersök sektionerna med ett fluorescerande mikroskop med ett 5x eller 10x mål för att säkerställa att ett tillräckligt antal fluorescerande märkta celler är närvarande. Färgning av fyra till sex sektioner per brunn rekommenderas, men upp till åtta per brunn kan färgas vid behov. - Tvätta sektionerna i 10 minuter vardera i tvätt 1, 2 och 3 brunnar, följt av inkubering av sektionerna i 1 timme i blockeringslösningen. Använd glasplockningen för att överföra sektionerna från en brunn till en annan. Plockningen kan användas för att överföra flera hjärnsektioner samtidigt.
- Bered 1 ml primär antikroppslösning för varje prov (t.ex. Rabbit RFP 1:2000 eller Chicken GFP 1:2000). Tillsätt antikroppen till antikroppslösningen, virveln en kort stund, och centrifugera sedan i 5 minuter vid ≥ 4 000 x g vid 4 °C. Inkubera sektionerna i primär antikropp i två till tre nätter vid 4 °C medan du skakar.
- Efter primär antikroppsinkubering, aspirera dag 1 TBST från tvättbrunnarna, tillsätt 1 ml ny TBST till varje tvättbrunn och flytta sektionerna till den första tvättbrunnen. Tvätta sektionerna 3x i 10 min vardera.
OBS: För aspiration, använd en 9 i Pasteur-pipett ansluten med slang till en vakuumkolv. Husvakuumledningar eller en elektrisk vakuumpump kan användas som vakuumkälla. - Medan sektionerna tvättas, förbered sekundära antikroppslösningar i en koncentration av 1:200 genom att tillsätta antikroppar mot antikroppslösningen (t.ex. get-anti-kanin 594 eller get-anti-kyckling 488). Vortex kort och snurra sedan i 5 min vid ≥ 4 000 x g vid 4 °C.
- Inkubera sektioner i sekundär antikropp i 3 timmar vid rumstemperatur. Skydda sektionerna från ljus under detta steg och alla följande steg för att mildra blekning av sekundära antikroppar.
- Efter sekundär antikroppsinkution, aspirera dag 2 TBST från tvättbrunnarna, tillsätt 1 ml ny TBST till varje tvättbrunn och flytta sektionerna till den första tvättbrunnen. Tvätta sektionerna 3x i TBST i 10 min vardera.
- Under den sista tvätten, ta ut monteringsmediet från 4 °C och låt det värmas till rumstemperatur. Förbered en 2: 1 blandning av 1x TBS: dH2O och tillsätt detta till en petriskål. Förbered ett mikroskopglas genom att tillsätta 800 μL 2: 1 TBS: dH2O till ytan.
OBS: Användning av icke-härdande monteringsmedia rekommenderas starkt. Härdningsmedier kan förändra vävnadens volym vilket kan förvirra analysen av astrocytrevirvolymen. Ett recept på ett enkelt och billigt hemlagat monteringsmedium finns i materialtabellen. - Använd en fin pensel och överför sektionerna en i taget från Wash 3-brunnen till petriskålen. Detta steg tar bort triton och hjälper sektionerna att platta ut. Överför sedan sektionerna från petriskålen till vätskan på bilden.
- Använd en pensel för att ordna sektionerna så att de är plana på bilden. Ta försiktigt bort överflödig vätska från bilden med en P1000-pipett, följt av vakuumsugning.
OBS: Lägg till en P200-pipettspets i slutet av Pasteur-pipetten för finare kontroll av vakuumsugning. - När all överflödig vätska har tagits bort från bilden, använd en överföringspipett för att omedelbart lägga till en droppe monteringsmedia i varje sektion och lägg försiktigt ett täckglas över bilden. Låt monteringsmedia spridas i några minuter och ta sedan bort överflödiga monteringsmedier som kommer ut under täckglaset genom vakuumsugning.
OBS: Låt inte sektionerna torka innan du lägger till monteringsmediet. Om sektionerna börjar torka innan monteringsmedia läggs till kan detta påverka vävnadsvolymen och hindra korrekt datainsamling. - Försegla alla fyra kanterna på täckglaset med klart nagellack. Låt diabilderna torka i 30 minuter vid rumstemperatur och förvara dem sedan planta vid 4 °C. Vänta minst 2 timmar innan du avbildar eller bild följande dag.
OBS: Sektioner färgade med antikroppar mot GFP och RFP kan förvaras i upp till 2 veckor före avbildning, förutsatt att de är helt förseglade med nagellack.
4. Konfokal avbildning
OBS: Detta protokoll ger allmänna riktlinjer för bildförvärv som är allmänt tillämpliga på olika konfokala mikroskop, snarare än specifika detaljer för ett visst konfokal- och programvarugränssnitt.
- Använd ett 10x-mål för att lokalisera enskilda celler för avbildning, notera den specifika hjärnregionen eller underregionen (t.ex. lager 5 i den visuella cortexen) som är relevant för experimentet. Använd fokusvredet för att försöka avgöra om hela astrocyten finns i avsnittet.
- Byt till ett oljemål med högre förstoring (t.ex. 40x, 60x eller 63x) och sätt cellen i fokus. När du tittar genom okularet använder du fokusvredet för att flytta från toppen till botten av cellen.
- Inspektera cellen visuellt för att säkerställa att hela cellen finns i sektionen. Om cellen plötsligt går ur fokus och skärs av vid kanten av sektionen, uteslut den här cellen och hitta en annan.
- Använd konfokalmikroskopets tillhörande förvärvsprogramvara och justera förvärvsparametrarna för att få ett lämpligt signal-brusförhållande och detaljnivå (512 x 512 upplösning ger tillräckligt med detaljer för områdesanalys och minskar bildförvärvstiden). Använd 2x zoom om du använder ett 40x-mål och ingen zoom om du använder ett 60x- eller 63x-mål.
- Ställ in de övre och nedre gränserna för z-stacken. För att säkerställa att hela astrocyten fångas bör de första och sista bilderna av z-stacken inte innehålla någon fluorescerande märkning av cellen. För adekvat provtagning, använd en stegstorlek på 0,5 μm.
5. Bildanalys
OBS: Detta protokoll beskriver stegen för att utföra bildanalys med hjälp av kommersiellt tillgänglig bildanalysprogramvara (dvs. Imaris; se materialtabell). Andra versioner av denna programvara kan användas med mindre ändringar av arbetsflödet. Detta protokoll kräver också att MATLAB kör filen Convex Hull XTension (Supplemental File).
- Innan du börjar analysera installerar du Convex Hull XTension-filen XTSpotsConvexHull.m genom att klistra in filen i rtmatlab-undermappen i XT-mappen.
- Använd Imaris File Converter för att konvertera bilder till '.ims' format. Öppna en bildfil i bildanalysprogrammet och visa bilden i 3D-visningsläge genom att välja knappen 3D-vy .
- Innan du analyserar, inspektera cellen för att säkerställa att den uppfyller inklusionskriterierna.
- Se till att hela cellen finns i bilden (dvs. ingen del av cellen ska klippas ut ur bilden). Rotera bilden för att inspektera fram- och bakkanterna.
- Se till att cellen bara har en cellkropp. Klicka på knappen Segment , dra markören till vänster på skärmen för att gå igenom z-stacken och kontrollera att den märkta cellen bara innehåller en cellkropp.
- Se till att det finns en individuell astrocyt som kan särskiljas från alla angränsande astrocyter som är märkta med samma färg.
- Skapa en yta
- Med 3D-visningsknappen vald igen skapar du en ny yta genom att klicka på den blå ikonen Lägg till nya ytor .
- På fliken Skapa som visas längst ned till vänster i programvarufönstret kontrollerar du att endast rutorna Segmentera endast ett intresseområde och Objekt-objektstatistik är markerade för Algoritminställningar och att rutan Starta skapande med utsnittsvy för Skapa inställningar är avmarkerad. Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
OBS: Ett område av intresse kanske inte behövs om det inte finns någon ytterligare fluorescerande signal i bilden utanför cellen av intresse. I det här fallet lämnar du segment endast ett intresseområde avmarkerat och fortsätter till steg 5.4.3.
- På fliken Skapa som visas längst ned till vänster i programvarufönstret kontrollerar du att endast rutorna Segmentera endast ett intresseområde och Objekt-objektstatistik är markerade för Algoritminställningar och att rutan Starta skapande med utsnittsvy för Skapa inställningar är avmarkerad. Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
- Skapa ett område av intresse runt cellen genom att ange dimensioner i rutorna under Storlek på verktyget Skapa yta eller dra i kanterna på den gula rutan (bild 2A). Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
- Välj rätt källkanal i listrutan för analys (t.ex. kanal 1 eller kanalen som innehåller den fluorescerande cellfyllningen). Värdet i rutan Ytdetaljer bestäms av programvaran och baseras på bildinsamlingsparametrar. Se till att det här värdet förblir konstant för alla exempel i experimentet. Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
- Justera tröskelvärdet (absolut intensitet) genom att dra det gula fältet eller genom att mata in värden i rutan så att den grå ytan fyller så mycket av cellens signal som möjligt utan att gå utanför cellens gräns. En liten mängd fluorescerande signal kommer att synas vid kanterna på ytan (figur 2B). Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
- Den sista panelen i verktyget Surface Creation anger det lägsta kvalitetsvärdet, vilket är programvarans standardvärde för lägre tröskelvärde . I listrutan ser du till att Antal Voxels Img=1 är markerat. Kontrollera att endast den vänstra strömbrytaren för Nedre tröskeln är grön (aktiv); höger strömbrytare ska vara röd (inaktiv). Programvaran är som standard värdet lägre tröskelvärde 10. Lämna detta oförändrat och klicka på den gröna pilen för att avsluta genereringen av ytan.
- Kontrollera noggrant den nygenererade ytan. Ta bort alla ytbitar som inte ingår i cellen genom att markera dem, klicka på pennans redigeringsverktyg och klicka på alternativet Ta bort .
- Förena de återstående ytbitarna genom att klicka på trattfilterikonen för att välja alla, klicka på pennan Redigera ikonen och klicka på alternativet Förena (figur 2C).
OBS: Med en stor bildfil kan programvaran ibland krascha under de efterföljande stegen i detta protokoll. Det är en bra idé att spara filen just nu.
- Med 3D-visningsknappen vald igen skapar du en ny yta genom att klicka på den blå ikonen Lägg till nya ytor .
- Generera fläckar nära ytan
- Klicka på den orange ikonen Lägg till nya fläckar . När de nya platserna (t.ex. "Fläckar 1") är markerade, på fliken Skapa , ser du till att endast rutan Objekt-objektstatistik är markerad för Algoritminställningar och att rutan Starta skapande med utsnitt för Skapa inställningar är avmarkerad. Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
- Välj rätt källkanal i listrutan (t.ex. kanal 1) och mata sedan in ett uppskattat XY-diametervärde på 0,400 μm i rutan. Se till att endast rutan Bakgrunds subtraktion är markerad. Klicka på den blå pilen för att fortsätta.
OBS: 0,400 μm är lämpligt för 1024 x 1024 eller 512 x 512 bilder med 63x, 60x eller 40x mål. För andra avbildningsförhållanden måste diametern bestämmas på grundval av avbildningsförhållandena och förbli konstant under hela analysen. Lämpligt värde skapar tillräckligt med fläckar för att täcka all positiv signal men lägger inte till fläckar på bakgrundssignalen. - Den sista panelen i verktyget Spots Creation anger det lägsta kvalitetsvärdet, vilket är programvarans standardvärde för lägre tröskelvärde . se till att detta värde förblir oförändrat såvida det inte finns en märkbar skillnad i placeringen / fördelningen av fläckarna (t.ex. på grund av en färgning av sämre kvalitet). Klicka på den gröna pilen för att avsluta skapandet av fläckarna.
- Om du vill visa fläckarna bättre ändrar du ytans genomskinlighet genom att välja Surface och klicka på verktyget Flerfärgad färg. Under Material väljer du det material som gör ytan tillräckligt transparent för att visa fläckar i hela cellen (det fjärde till sista materialet i listan) (figur 2D,E).
- Välj fläckar igen, klicka på filterikonen och välj Kortaste avstånd till ytor Ytor = Ytor X, där 'Ytor X' är ytan som analyseras (t.ex. Ytor 1), från listrutan. Se till att både nedre tröskel och övre tröskelknappar är gröna (aktiva).
- Ange ett minsta avstånd på -1,0 μm (fläckarnas avstånd från ytans insida) i rutan Nedre tröskel och ett maximalt avstånd på 0,1 μm (avstånd från utsidan) i rutan Övre tröskel . Klicka på knappen Duplicera markering till nya fläckar för att avsluta genereringen av fläckar nära ytan.
OBS: Minimi- och maximiavståndsvärdena kan variera med olika bildinhämtningsparametrar, såsom mål, zoom och upplösning. Dessa siffror måste bestämmas empiriskt. Den genomskinliga ytan hjälper till att bedöma om värdena fångar alla fläckar som exakt representerar ytans form.
- Ange ett minsta avstånd på -1,0 μm (fläckarnas avstånd från ytans insida) i rutan Nedre tröskel och ett maximalt avstånd på 0,1 μm (avstånd från utsidan) i rutan Övre tröskel . Klicka på knappen Duplicera markering till nya fläckar för att avsluta genereringen av fläckar nära ytan.
- Generera konvext skrov och samla in revirmätning
- Se till att de nyskapade platserna är markerade i den övre vänstra panelen i programvarufönstret (t.ex. "Plats 1-val ['Kortaste avstånd...]"). Klicka på kugghjulets verktygsikon och sedan på Plugin-programmet Convex Hull . Klicka bara på plugin-programmet en gång och vänta tills MATLAB-fönstret visas och försvinner sedan (det kan ta flera sekunder). Ett fast skrov visas i 3D-vyn.
- I den övre vänstra panelen väljer du Konvext skrov av Spots X Selection ['Shortest Distance...], där 'Spots X Selection' är de nyskapade fläckarna (t.ex. Spots 1 Selection) och klickar sedan på skrovet för att välja det (Figur 2F).
- Klicka på ikonen Grafstatistik , välj Fliken Urval , se till att Specifika värden är valda i den övre listrutan och välj sedan Volym från den nedre listrutan. Registrera skrovets volym. Spara filen och fortsätt till nästa bild.
- Mätning av territorium överlappar volymen för angränsande celler med olika fluorescerande etiketter
OBS: Detta avsnitt av protokollet kan användas om proverna innehåller angränsande astrocyter som uttrycker distinkta fluorescerande etiketter (t.ex. uttrycker Astrocyt 1 endast GFP och Astrocyt 2 uttrycker endast RFP). Denna märkning uppnåddes med hjälp av virala eller genetiska strategier som tidigare beskrivits 9,10 (figur 3A).- Använd stegen som beskrivs i steg 5.4-5.6 och skapa ytan, fläckarna nära ytan och det konvexa skrovet för varje astrocyt (figur 3B).
- Med Konvext skrov av spots 1 Selection... valt, klicka på penna Redigera ikonen och klicka på Maskval. I fönstret Maskera kanal kontrollerar du att kanal 1 (eller kanalen som representerar astrocyt 1) är markerad och ser till att rutan bredvid dubblettkanalen innan du använder maskalternativet är markerad. Klicka på OK för att skapa kanalen Masked CH1.
- Med konvext skrov av spots 2 Selection ... vald, klicka på pennan Redigera ikonen och klicka på Maskval. I fönstret Maskkanal väljer du Kanal 2 (eller kanalen som representerar astrocyt 2) i rullgardinsmenyn och ser till att rutan bredvid dubblettkanalen innan du använder maskalternativet är markerad. Klicka på OK för att skapa kanalen Masked CH2 (figur 3C).
- Klicka på Coloc-knappen högst upp på skärmen och använd Coloc-verktyget för att skapa en samlokaliseringskanal för de två maskerade kanalerna. Ställ in kanal A på kanal 3 - maskerad CH1 och kanal B på kanal 4 - maskerad CH2 (bild 3D).
- Dra det gula histogramfältet åt vänster för båda kanalerna. Använd segmentvyn nedan för att observera samlokaliseringssignalen, som visas i grått. Observera att eftersom de fluorescerande signalerna från de två cellerna faktiskt inte är samlokaliserade, måste tröskeln flyttas till vänster så att falska samlokaliseringar börjar dyka upp vid cell-cellkontaktpunkter.
- Klicka på Build Coloc Channel på höger sida för att slutföra processen. Klicka på 3D-vyn för att återgå till standard 3D-vyn. En kanal för samlokaliseringsresultat visas nu i grått och visas i rutan för visningsjustering.
- Skapa ytan, fläckarna nära ytan och det konvexa skrovet på samlokaliseringsresultatkanalen med hjälp av stegen som beskrivs i 5.4-5.7 (figur 3E,F).
- Registrera volymen på det konvexa skrovet. Detta är områdets överlappningsvolym. Dela detta nummer med territoriumvolymen för en av astrocyterna för att beräkna procentandelen av territoriumöverlappning. Välj kontroll eller vildtyp astrocyt om en av astrocyterna är genetiskt manipulerad med avseende på den andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I bild 1 visas en schematisk översikt över de viktigaste stegen och arbetsflödet för det här protokollet. Figur 2 visar skärmdumpar av viktiga steg med hjälp av bildanalysprogramvaran för att generera en yta, generera fläckar nära ytan och generera ett konvext skrov. Figur 3 visar tillämpningen av denna teknik för att bestämma astrocytreviröverlappning/plattsättning. I figur 4 visar representativa resultat från ett tidigare publicerat manuskript9 tillämpningen av detta protokoll. I figur 4A och figur 4B minskar knockdown av den astrocytberikade celladhesionsmolekylen hepaCAM signifikant astrocytrevirvolymen. I figur 4C och figur 4D användes mosaikanalys med dubbla markörer (MADM) för att införa gles mosaikmärkning och samtidig genetisk modifiering i musbarken. Med MADM genererades möss där astrocyter av vild typ uttrycker ett rött fluorescerande protein (RFP) och Hepacam knockout-astrocyter uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP). Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan beräknades procentandelen territoriumöverlappning mellan angränsande RFP- och GFP-astrocytpar (WT: KO). Som en kontroll jämfördes detta med närliggande RFP- och GFP-astrocytpar hos möss utan genetisk modifiering av Hepacam (WT: WT). WT:KO-astrocytpar visade en signifikant ökad andel av reviröverlappningsvolymen jämfört med WT:WT-astrocytpar. Sammantaget visar dessa resultat att hepaCAM krävs för normal astrocytrevirvolym och astrocytplattor.
Figur 1: Översikt över arbetsflödet för analys av astrocytrevirvolym. (B) Musen perfuseras och sedan resekteras, bearbetas och fryses hjärnan. (C) Den frusna hjärnan sektioneras med hjälp av en kryostat och (D) de fritt flytande vävnadssektionerna samlas in. (E) Efter sektionering färgas de flytande vävnadssektionerna av immunohistokemi och monteras sedan (F) på glidbanor. (G) Astrocyter i de monterade vävnadssektionerna avbildas med hjälp av konfokalmikroskopi. (H) Slutligen kvantifieras de avbildade cellernas revirvolymer med hjälp av bildanalysprogramvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Viktiga steg i bildanalysproceduren för astrocytrevirvolym (A) Vy av cell med region av intresseruta som utesluter annan signal i bilden från analysproceduren. (B) En acceptabel relativ tröskel för ytskapande (grå) med hjälp av signal (röd). (C) Färdig yta med huvudcellen vald (gul). Andra delar av ytan som inte är cellen kommer att raderas (röd). (D) Genomskinlig yta med skapade fläckar. (E) Närbild av den genomskinliga ytan med fläckar som skapats för att visa en acceptabel fördelning av fläckar i förhållande till ytan. (F) Slutligt konvext skrov. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Viktiga steg i astrocytrevir överlappar analysen. (B) Generering av ett konvext skrov för varje astrocyt. (C) Vy över maskerade GFP- och RFP-kanaler, med ursprungliga kanaler borttagna. (D) Exempel på tröskel med hjälp av verktyget "Coloc" för att skapa en "Colocalization Result" -kanal. Den "samlokaliserade" signalen visas i grått. (E) Vy över de två maskerade kanalerna. (F) En roterad vy av det konvexa skrovet på kanalen "Colocalization Result" (grå) som representerar områdets överlappningsvolym. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Framgångsrik tillämpning av protokollet för att mäta astrocytrevirvolym och astrocytrevir överlappar varandra. Astrocytområdet är skisserat i rött. (B) Förlust av hepaCAM minskar avsevärt astrocytrevirets volym. Datapunkter representerar enskilda musmedelvärden. Felstaplar är ± s.e.m. Kapslat t-test. (C) Angränsande astrocyter i musbarken vid postnatal dag 21 som uttrycker GFP (grön) eller RFP (magenta). I MADM9 WT: WT-möss är båda astrocyterna vildtyp. I MADM9 WT: KO-möss är den gröna astrocyten vildtyp och magenta-astrocyten är noll för Hepacam. Volymen för områdesöverlappning visas i blått. (MADM9 WT:WT-genotyp: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO genotyp: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). D) Kvantifiering av den procentuella överlappningen av områdesvolymen. Datapunkter representerar enskilda musmedelvärden. Felstaplar är ± s.e.m. Kapslat t-test. Skalstänger = 20 μm. Panelerna i denna figur är omtryckta från Baldwin et al9 med tillstånd från förlaget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en etablerad metod för att analysera astrocytrevirvolym och astrocytplattor i musbarken, som beskriver alla de viktigaste stegen som börjar med perfusion och slutar med bildanalys. Detta protokoll kräver hjärnor från möss som uttrycker fluorescerande proteiner i en gles eller mosaikpopulation av astrocyter. Utanför detta krav kan möss i alla åldrar användas för detta protokoll, med endast mindre justeringar av perfusionsinställningar och volymen frysmedia som läggs till i inbäddningsformen. Medan andra metoder har publicerats för analys av astrocytförgreningskomplexitet och volym i hjärnvävnadssektioner 7,11, har detta protokoll flera unika fördelar. För det första beskriver detta protokoll en anpassad kod som kan användas för att erhålla astrocytrevirvolym. Astrocytrevirvolym är ett distinkt mått från astrocytcellvolymen, genom att den mäter hela utrymmet som upptas av en astrocyt, oavsett dess förgreningskomplexitet. Dessutom beskriver detta protokoll hur man tillämpar astrocytrevirets volymmätning för att mäta astrocytreviröverlappningsvolym och därmed astrocytplattor. Slutligen ger detta protokoll en detaljerad diskussion om de potentiella variablerna som kan påverka astrocytområdets volym och datainsamling, inklusive monteringsförhållanden, provlagringsförhållanden och inklusions- och uteslutningskriterier för avbildning och analys. Förutom dessa unika egenskaper kan många aspekter av detta protokoll, inklusive perfusion, kryosektion och immunfärgning av fritt flytande sektioner, i stor utsträckning tillämpas på färgning av hjärnvävnadssektioner av olika tjocklekar och med olika antikroppskombinationer. Nedan beskrivs kritiska steg, viktiga överväganden, felsökning och begränsningar i detalj.
Överväganden för provinsamling
Ett mycket viktigt övervägande för experiment som är utformade för att undersöka astrocytmorfologi är att upprätthålla en konsekvent tid på dagen för provinsamling. Växande bevis tyder på att astrocytfunktionella tillstånd är kopplade till dygnsrytm och sömnbeteenden14. För att avlägsna eventuella variationer som kan införas genom att prover samlas in vid olika tidpunkter på dagen, bör perfusioner planeras så att alla prover för ett experiment samlas in vid ungefär samma tid på dagen, inom ett tidsintervall på 2-3 timmar. För konsekventa perfusioner rekommenderas användning av en peristaltisk pump. Tillsatsen av heparin till TBS är till hjälp för att minska bildandet av blodproppar. Även om detta protokoll inte har testats med kortare efterfixeringstider, kanske efter fixering över natten inte krävs, och en kortare efterfixering på 4 timmar kan övervägas.
Felsökningstips för kryosektion
Fryshjärnor i frysmediet 2:1 Sackaros:OCT minskar mängden OCT i uppsamlingsbrunnarna efter sektionering. När det är fryst beter sig frysmediet på samma sätt som OCT självt men är mindre sprött. När du fryser vävnadsblocket till chucken, var noga med att trycka det platt på chucken omedelbart efter att du har tillsatt OCT till chucken. Om vävnadsblocket bryts av från chucken under sektionering, använd ett rakblad för att skära en ny plan yta på botten och frysa in igen till chucken. Att ge chucken tillräckligt med tid att svalna till kryostatkammarens temperatur innan du lägger till OCT och se till att chucken är ren och torr kommer att förbättra vidhäftningen. När du flyttar vävnadssektioner med penseln, rör penseln till hörnkanten på sektionen, så att den rör vid OCT och inte själva vävnaden. Med lite fukt kommer sektionen att hålla fast vid borsten. Placera försiktigt vävnaden i sektionsmediet genom att röra vid den motsatta kanten av sektionen till mediet och låta den dras in i mediet. Om borsten vidrör frysmediet, torka av det på en pappershandduk i kryostaten. En borste som är för våt gör det svårt att överföra sektioner till skålen. OCT ska upplösas när vävnadssektionen har placerats i sektionsmediet. Om det inte gör det kan kryostatkammartemperaturen vara för låg.
Viktiga överväganden för färgning och montering av vävnadssektioner
För att förbättra färgningskvaliteten, förbered TBST färskt före varje experiment. Använd en högkvalitativ 10% vattenhaltig Triton-källa (materialtabell). Välj ett serum som matchar arten där den sekundära antikroppen tillverkades (t.ex. använd getserum för en get-anti-kanin sekundär). Antikroppslösningar centrifugeras före användning för att pelletera och avlägsna eventuella utfällda antikroppar. Var noga med att inte störa pelleten när du överför antikroppslösning från röret till plattan (detta kan innebära att du pipetterar något mindre än 1 ml antikroppslösning per samt att inte vidröra rörets botten med pipettspetsen). Detta steg hjälper till att minska bakgrundsfärgning. När sektioner placeras i TBS: dH2O kommer de flesta att fälla ut / lossa sig själva, men vissa kan förbli vikta eller vridna. När du överför sektioner till bilden med en borste, använd en P200-spets i den andra handen för att hjälpa till att styra vävnadssektionen till rätt plats. Använd borsten för att försiktigt fälla ut eller lossa sektioner så att de ligger platt. Sektioner tenderar att röra sig mot den aspirerande pipetten när vätskan avlägsnas. Använd P200-spetsen för att hålla mobilsektioner på plats medan du aspirerar. Monteringsmedia måste läggas till sektionerna omedelbart efter att all överskottsvätska har tagits bort och innan sektionerna har tid att torka. Att låta sektionerna torka även i några minuter kommer drastiskt att påverka volymen på cellerna i sektionen. När du har lagt till monteringsmediet i bilden, använd en pipett för att ta bort synliga bubblor. När du har lagt till täckglaset, se till att ta bort överflödigt monteringsmedium från sidorna, eftersom detta kommer att störa nagellackets förmåga att torka. Låt nagellacket torka i rumstemperatur. Vänta i minst 2 timmar eller tills nästa dag för att avbilda sektionerna för att säkerställa att monteringsmediet har tillräckligt med tid för att helt tränga igenom de tjocka sektionerna.
Avbildning av kompletta astrocyter
Vid avbildning av astrocyter för revirvolymanalys är det viktigt att bilden fångar hela volymen av astrocyten. Många märkta astrocyter i vävnadssektionen kommer att vara ofullständiga astrocyter. Kompletta astrocyter kommer att finnas helt i vävnadssektionen. För att identifiera fullständiga astrocyter, börja med en kontaktpunkt i mitten av astrocyten. Använd fokusvredet för att flytta till toppen av astrocyten. När astrocyten inte längre är i fokus bör andra funktioner i vävnaden förbli i fokus. Upprepa denna process för botten av astrocyten. Avbilda inte ofullständiga astrocyter. På grund av sektionernas tjocklek är antikroppspenetrationen inte lika robust i mitten av sektionen. Märkning kan vara starkare runt astrocytens ytterkanter och svagare i mitten. Detta observeras ofta och påverkar inte områdesanalysen.
Tips för bildanalys
Det viktigaste övervägandet för bildanalysdelen av protokollet är att se till att det konvexa skrovet endast representerar en astrocyt. Följ inkluderings- och exkluderingskriterierna varje gång. Ibland kommer två astrocyter att ha sina cellkroppar mycket nära varandra. Detta kan vara svårt att identifiera i 3D-vyn, men kan identifieras med segmentvyn. Om det finns andra fluorescerande märkta astrocyter som kommer i kontakt med astrocyten av intresse, kan detta komplicera ytskapande processen. Om en rimligt tydlig gräns är synlig mellan de två cellerna (till exempel ansluter de bara vid en liten grenpunkt) kan klippverktyget användas för att göra ett snitt i ytan, och denna del av ytan kan raderas. När du har skapat ytan roterar du cellen i 3D-vy för att kontrollera om det finns små bitar av ytan som kan gömma sig bakom cellen, men som inte är en del av cellen. Ta bort dessa innan du fortsätter. Om det konvexa skrovet sticker ut drastiskt till en punkt utanför astrocytområdet finns det sannolikt en bit icke-cellyta som inte togs bort. Om programvaran rutinmässigt kraschar när ytan skapas kan ytdetaljantalet minskas. Om den kraschar när fläckar skapas använder du ett område av intresse för att bara skapa fläckar nära ytobjektet.
Protokollets begränsningar
Även om det finns många användningsområden och fördelar med detta protokoll, finns det också flera begränsningar. Detta protokoll kräver möss som redan uttrycker fluorescerande proteiner i en gles population av astrocyter, men beskriver inte metoderna för att införa uttrycket av fluorescerande proteiner i astrocyter. Avbildnings- och analyspipelines är tidskrävande och lämpar sig inte väl för analys med högt dataflöde. Dessutom är de specifikt inriktade på att mäta astrocytrevirvolym och kakel, snarare än att definiera de detaljerade morfologiska egenskaperna hos enskilda astrocyter. Andra kan tycka att det är användbart att kombinera tillvägagångssätt och strategier för detta protokoll med nyligen publicerade protokoll som beskriver metoder för att mäta astrocytmorfologisk komplexitet 7,11. Slutligen är de kommersiella mjukvaruplattformarna som används i detta protokoll (dvs. Imaris och MATLAB) dyra och kräver en licens att använda. Medan stora institutioner ofta köper licenser för dessa programvaruplattformar kan detta vara oöverkomligt för mindre institutioner och enskilda laboratorier. Framsteg inom mikroskopi, programvara för bildanalys med öppen källkod och maskininlärningsalgoritmer kan hjälpa till att göra detta protokoll allmänt tillgängligt för alla laboratorier och kan också förbättra effektiviteten i bildförvärv och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Mikroskopi utfördes vid UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), delvis med stöd av finansiering från NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 och NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Bild 1 skapades med BioRender.com. Bilderna och uppgifterna i figur 4 återges från en tidigare publikation9 med tillstånd från förlaget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
