פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
לאסטרוציטים יש מידה מדהימה של מורכבות מורפולוגית המאפשרת להם לתקשר כמעט עם כל סוג של תא ומבנה במוח. באמצעות אינטראקציות אלה, אסטרוציטים מווסתים באופן פעיל תפקודי מוח קריטיים רבים, כולל היווצרות סינפסות, העברה עצבית והומאוסטזיס של יונים. במוח המכרסמים, אסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה ויוצרים טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחף את המוח. פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת לניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים באמצעות מקטעי רקמה צפים בחופשיות ממוח העכבר. ראשית, פרוטוקול זה מתאר את השלבים לאיסוף רקמות, קריו-אקטציה ושמירה חיסונית של מקטעי רקמה צפים בחופשיות. שנית, פרוטוקול זה מתאר רכישת תמונות וניתוח של נפח שטח אסטרוציטים ונפח חפיפת שטח, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית. לבסוף, כתב יד זה דן ביתרונות, בשיקולים החשובים, במלכודות הנפוצות ובמגבלות של שיטות אלה. פרוטוקול זה דורש רקמת מוח עם תיוג פלואורסצנטי דליל או פסיפס של אסטרוציטים, והוא מיועד לשימוש עם ציוד מעבדה משותף, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית.
מבוא
אסטרוציטים הם תאים מסועפים בצורה משוכללת המבצעים תפקודים חשובים רבים במוח1. בקליפת המוח של העכבר, תאי גזע גליאליים רדיאליים מעוררים אסטרוציטים בשלב העוברי המאוחר ובשלבים המוקדמים שלאחר הלידה2. במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה, האסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם, ומפתחים אלפי ענפים עדינים המתקשרים ישירות עם סינפסות1. במקביל, אסטרוציטים מקיימים אינטראקציה עם אסטרוציטים שכנים כדי ליצור טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחוץ את המוח3, תוך שמירה על תקשורת באמצעות ערוצי צומת פער4. המורפולוגיה והארגון של אסטרוציטים משתבשים במצבי מחלה רבים ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל העכברים שימשו בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל והמחלקה לרפואה השוואתית (פרוטוקול IACUC מספר 21-116.0). עכברים משני המינים ביום 21 שלאחר הלידה (P21) שימשו לניסויים אלה. עכברי CD1 הושגו באופן מסחרי (טבלת חומרים), ועכברי MADM9 WT:WT:WT ו-MADM9 WT:KO תוארו קודם לכן9.
הערה: פרוטוקול זה דורש מוחות עם ביטוי חלבונים פלואורסצנטי באוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים. ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים יכול להיות מוצג גנטית, ויראלית או על ידי אלקטרופורציה. פרטים על שיטות לתיוג דליל של אסטרוציטים מתוארים במחקרים ובפרוטוקולים שפורסמו בעבר 1,7,8,9,10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג חלוקה סכמטית של השלבים העיקריים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. איור 2 מציג צילומי מסך של שלבים מרכזיים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי ליצור משטח, ליצור כתמים קרובים לפני השטח וליצור גוף קמור. איור 3 מדגים את היישום של טכניקה זו כדי לקבוע חפיפה/ריצוף של טריטוריית אסטרוציטים. באיור 4, תוצאות מייצגות מכתב יד9 שפורסם בעבר מדגימות את היישום של פרוטוקול זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת לניתוח נפח שטח אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים בקליפת המוח של העכבר, המפרט את כל השלבים העיקריים המתחילים בזלוף ומסתיימים בניתוח תמונה. פרוטוקול זה דורש מוחות מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באוכלוסייה דלילה או פסיפס של אסטרוציטים. מחוץ לדרישה זו, ניתן להשתמש בעכברים בכל גיל עבור פרוטוקול זה, עם התאמות קלות בלבד להגדרות הזלוף ונפח המדיה המקפיאה שנוספו לתבנית ההטבעה. בעוד ששיטות אחרות פורסמו לניתוח המורכבות והנפח של הסתעפות אסטרוציטים בקטעי רקמת המוח 7,11<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
מיקרוסקופיה בוצעה בליבת המיקרוסקופיה של UNC Neuroscience (RRID:SCR_019060), הנתמכת בחלקה על ידי מימון ממענק התמיכה של מרכז מדעי המוח NIH-NINDS P30 NS045892 ומענק התמיכה של מרכז המחקר למוגבלויות שכליות והתפתחותיות של NIH-NIH-NICHD U54 HD079124. איור 1 נוצר עם BioRender.com. התמונות והנתונים באיור 4 מודפסים מחדש מפרסום קודם9 באישור המו"ל.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #5 מלקחיים | Roboz | RS-5045 | |
| 1 מ"ל מזרק TB | בקטון דיקינסון (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (תמיסת מלח עם tris-buffered) | 30 גרם Tris, 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, HCl עד pH 7.4, dH2O עד 1 ליטר; אחסן בטמפרטורת החדר (RT) | ||
| צלחת 12 בארות | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 מ"ל 10x TBS + 900 מ"ל dH2O; אחסן ב-RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 מ"ג הפרין + 250 מ"ל 1x TBS; אחסן ב-4 מעלות; C | ||
| צלחת 24 בארות | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% סוכרוז ב-TBS | 15 גרם סוכרוז, 1x TBS עד 50 מ"ל; אחסן ב-4 מעלות; C | ||
| 4% PFA (פרפורמלדהיד) ב-TBS | 40 גרם PFA, 4-6 כדורי NaOH, 100 מ"ל 10x TBS, dH2O עד 1 ליטר; אחסן ב-4 מעלות; C | ||
| Avertin | 0.3125 גרם tri-bromoethanol, 0.625 מ"ל מתילבוטנול, dH2O עד 25 מ"ל; יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C; יש להשליך שבועיים לאחר הכנת | ||
| עיזים חוסם ונוגדנים | 10% ב-TBST; יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C | ||
| CD1 עכברים | צ'ארלס ריבר | 022 | |
| בקבוקון איסוף למוח | פישר סיינטיפיק | 03-337-20 | |
| תוכנת רכישה קונפוקלית | אולימפוס | FV31S-SW | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס | FV3000RS | |
| כיסויים | פישר סיינטיפיק | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat להב | תרמו סיינטיפיק | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| הטמעת עובש | Polysciences | 18646A-1 | |
| הקפאה בינונית | 2:1 30% סוכרוז: OCT; אחסן | ||
| בנוגדנים RT GFP | Aves Labs | GFP1010 | |
| גליצרול | Thermo Scientific | 158920010 | |
| עיזים נגד עוף 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| עיזים נגד ארנב 594 | Invitrogen | A11037 | |
| סרום עיזים | Gibco | 16210064 | |
| הפרין | סיגמא-אולדריץ' | H3149 | |
| חומצה הידרוכלורית | סיגמא-אולדריץ | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N / A | גרסה 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| פח ארוחת צהריים מתכת | AQUARIUS | N / A | מאמזון, "קופסת כיף גדולה DIY" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| מספריים מיקרו ניתוחי | Roboz | RS-5921 | |
| מדיום | הרכבה20 מ"מ טריס pH 8.0, 90% גליצרול, 0.5% N-פרופיל גלאט; יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C; מתאים עד חודשיים | ||
| לק | VWR | 100491-940 | |
| N-פרופיל גלאט | סיגמא-אולדריץ' | 02370-100G | |
| O.C.T. | פישר סיינטיפיק | 23-730-571 | |
| שמן | אולימפוס | IMMOIL-F30CC | ספציפי למיקרוסקופ/מספריים הפעלה אובייקטיביים |
| 6 אינץ' | Roboz | RS-6820 | |
| שייקר פלטפורמה מסלולית | פישר סיינטיפיק | 88861043 | מהירות מינימלית נדרשת: 25 סל"ד |
| מברשת צבע | Bogrinuo | N/A | מאמזון, "מברשות צבע מפורטות - מברשות מיניאטוריות " |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75 ") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9 ")VWR | 14672-380 | ||
| אשלגן כלורי | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| סכין גילוח | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP נוגדן | רוקלנד | 600-401-379 | |
| מדיום | 1:1 גליצרול: 1x TBS; אחסן ב- RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| נתרן כרלואיד | פישר סיינטיפיק | BP358-212 | |
| נתרן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | S5881 | |
| סוכרוז | סיגמא-אולדריץ' | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% טריטון ב-1x TBS; אחסן ב-RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 ( איכות גבוהה) | פישר סיינטיפיק | 50-489-120 | |
| XTsסיריםקמוריםHull | N/A | N/ | A XTension מותאם אישית לספק כחומר משלים |
מקורות
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
