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Neuroscience

मोटी फ्री-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों में एस्ट्रोसाइट क्षेत्र मात्रा और टाइलिंग का विश्लेषण

Published: April 20, 2022 doi: 10.3791/63804
Automatic Translation
1, 1,2
1Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क के सेक्शनिंग, धुंधला और इमेजिंग फ्री-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों के तरीकों का वर्णन करता है, इसके बाद एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट क्षेत्र ओवरलैप या टाइलिंग के विश्लेषण का विस्तृत विवरण होता है।

Abstract

एस्ट्रोसाइट्स में रूपात्मक जटिलता की एक आश्चर्यजनक डिग्री होती है जो उन्हें मस्तिष्क के भीतर लगभग हर प्रकार की कोशिका और संरचना के साथ बातचीत करने में सक्षम बनाती है। इन इंटरैक्शन के माध्यम से, एस्ट्रोसाइट्स सक्रिय रूप से कई महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्यों को विनियमित करते हैं, जिसमें सिनैप्स गठन, न्यूरोट्रांसमिशन और आयन होमोस्टैसिस शामिल हैं। कृंतक मस्तिष्क में, एस्ट्रोसाइट्स पहले तीन प्रसवोत्तर हफ्तों के दौरान आकार और जटिलता में बढ़ते हैं और मस्तिष्क को टाइल करने के लिए अलग-अलग, गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों की स्थापना करते हैं। यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क से मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट टाइलिंग का विश्लेषण करने के लिए एक स्थापित विधि प्रदान करता है। सबसे पहले, यह प्रोटोकॉल ऊतक संग्रह, क्रायोसेक्शनिंग और मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों के इम्यूनोस्टेनिंग के चरणों का वर्णन करता है। दूसरा, यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम की छवि अधिग्रहण और विश्लेषण का वर्णन करता है। अंत में, यह पांडुलिपि इन विधियों के फायदे, महत्वपूर्ण विचार, सामान्य नुकसान और सीमाओं पर चर्चा करती है। इस प्रोटोकॉल को एस्ट्रोसाइट्स के विरल या मोज़ेक फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ मस्तिष्क के ऊतकों की आवश्यकता होती है, और इसे सामान्य प्रयोगशाला उपकरण, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Introduction

एस्ट्रोसाइट्स विस्तृत रूप से शाखित कोशिकाएं हैं जो मस्तिष्क में कई महत्वपूर्ण कार्य करती हैं1. माउस प्रांतस्था में, रेडियल ग्लियाल स्टेम कोशिकाएं देर से भ्रूण और प्रारंभिक प्रसवोत्तर चरणों के दौरान एस्ट्रोसाइट्स को जन्म देतीहैं 2. पहले तीन प्रसवोत्तर हफ्तों के दौरान, एस्ट्रोसाइट्स आकार और जटिलता में बढ़ते हैं, हजारों ठीक शाखाओं को विकसित करते हैं जो सीधे सिनैप्सके साथ बातचीत करते हैं 1. समवर्ती रूप से, एस्ट्रोसाइट्स पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स के साथ मस्तिष्क 3 को टाइल करने के लिए असतत, गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों को स्थापित करने के लिए बातचीत करते हैं, जबकि गैप जंक्शनचैनलों के माध्यम से संचार बनाए रखतेहैं 4. अपमान या चोट5 के बाद कई रोग राज्यों में एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान और संगठन बाधित होते हैं, जो उचित मस्तिष्क समारोह के लिए इन प्रक्रियाओं के महत्व को दर्शाता है। सामान्य विकास, उम्र बढ़ने और बीमारी के दौरान एस्ट्रोसाइट रूपात्मक गुणों का विश्लेषण एस्ट्रोसाइट जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, आनुवंशिक हेरफेर के बाद एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान का विश्लेषण सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है जो एस्ट्रोसाइट रूपात्मक जटिलता की स्थापना और रखरखाव को नियंत्रित करता है।

माउस मस्तिष्क में एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान का विश्लेषण एस्ट्रोसाइट ब्रांचिंग जटिलता और एस्ट्रोसाइट टाइलिंग दोनों द्वारा जटिल है। एक एस्ट्रोसाइट-विशिष्ट मार्कर के रूप में मध्यवर्ती फिलामेंट ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) का उपयोग करके एंटीबॉडी धुंधला केवल प्रमुख शाखाओं को कैप्चर करता है, और एस्ट्रोसाइट रूपात्मक जटिलता को काफी कम करके आंकता है1. अन्य सेल-विशिष्ट मार्कर जैसे ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (जीएलटी -1; एसएलसी 1 ए 2), ग्लूटामाइन सिंथेटेज, या एस 100β एस्ट्रोसाइट शाखाओं6 को लेबल करने का बेहतर काम करते हैं, लेकिन एक नई समस्या पेश करते हैं। एस्ट्रोसाइट क्षेत्र काफी हद तक गैर-अतिव्यापी हैं, लेकिन परिधीय किनारों पर ओवरलैप की एक छोटी डिग्री मौजूद है। ब्रांचिंग की जटिलता के कारण, जब पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स को एक ही रंग का लेबल दिया जाता है, तो यह भेद करना असंभव है कि एक एस्ट्रोसाइट कहां समाप्त होता है और दूसरा शुरू होता है। अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एस्ट्रोसाइट्स की विरल या मोज़ेक लेबलिंग दोनों समस्याओं को हल करती है: फ्लोरोसेंट मार्कर सभी शाखाओं को पकड़ने के लिए सेल को भरता है और व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स की इमेजिंग की अनुमति देता है जिसे उनके पड़ोसियों से अलग किया जा सकता है। वायरल इंजेक्शन, प्लास्मिड इलेक्ट्रोपोरेशन या ट्रांसजेनिक माउस लाइनों सहित आनुवंशिक हेरफेर के साथ या बिना एस्ट्रोसाइट्स के विरल फ्लोरोसेंट लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए कई अलग-अलग रणनीतियों का उपयोग किया गया है। इन रणनीतियों के निष्पादन पर विवरण पहले प्रकाशित अध्ययनों और प्रोटोकॉल 1,7,8,9,10,11,12,13 में वर्णित हैं।

यह लेख एस्ट्रोसाइट्स (चित्रा 1) की विरल आबादी में फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ माउस दिमाग से एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। क्योंकि माउस कॉर्टेक्स में एस्ट्रोसाइट का औसत व्यास लगभग 60 μm है, 100 μm मोटी वर्गों का उपयोग उनकी संपूर्णता में व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स को कैप्चर करने में दक्षता में सुधार करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोस्टेनिंग की आवश्यकता नहीं है, लेकिन कॉन्फोकल इमेजिंग और विश्लेषण के लिए अंतर्जात फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाने की सिफारिश की जाती है। इम्यूनोस्टेनिंग भी ठीक एस्ट्रोसाइट शाखाओं का बेहतर पता लगाने और छवि अधिग्रहण के दौरान अंतर्जात प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग को कम करने में सक्षम हो सकती है। मोटी वर्गों में एंटीबॉडी प्रवेश में सुधार करने के लिए, और इमेजिंग के माध्यम से सेक्शनिंग से ऊतक की मात्रा को संरक्षित करने के लिए, फ्री-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों का उपयोग किया जाता है। एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा का विश्लेषण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल मोज़ेक लेबलिंग के साथ ऊतक वर्गों में एस्ट्रोसाइट टाइलिंग के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जहां पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग सामान्य मस्तिष्क के विकास के दौरान एस्ट्रोसाइट वृद्धि के साथ-साथ एस्ट्रोसाइट विकास पर आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए कई हालिया अध्ययनों 1,8,9 में सफलतापूर्वक किया गया है।

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Protocol

चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) और तुलनात्मक चिकित्सा विभाग (आईएसीयूसी प्रोटोकॉल नंबर 21-116.0) के अनुसार सभी चूहों का उपयोग किया गया था। प्रसवोत्तर दिन 21 (पी 21) में दोनों लिंगों के चूहों का उपयोग इन प्रयोगों के लिए किया गया था। सीडी 1 चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था (सामग्री की तालिका), और एमएडीएम 9 डब्ल्यूटी: डब्ल्यूटी और एमएडीएम 9 डब्ल्यूटी: केओ चूहों को पहले9 वर्णित किया गया था।

नोट: इस प्रोटोकॉल एस्ट्रोसाइट्स की एक विरल आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ दिमाग की आवश्यकता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति को आनुवंशिक रूप से, वायरल रूप से या इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा पेश किया जा सकता है। एस्ट्रोसाइट्स को विरल रूप से लेबल करने के तरीकों का विवरण पहले प्रकाशित अध्ययनों और प्रोटोकॉल 1,7,8,9,10,11,12,13 में वर्णित है।

1. ऊतक संग्रह और तैयारी

चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) एक खतरनाक रसायन है। एक रासायनिक धूआं हुड में पीएफए के साथ सभी चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. एक इंजेक्शन योग्य संवेदनाहारी (जैसे, एवर्टिन; 0.8 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों को संवेदनाहारी करें और पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण की गहराई सुनिश्चित करें। बर्फ-ठंडे ट्रिस-बफर खारा (टीबीएस) + हेपरिन के साथ इंट्राकार्डियक छिड़काव करने के लिए एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें जब तक कि यकृत स्पष्ट न हो (आमतौर पर 3-5 मिनट), इसके बाद बर्फ-ठंडा 4% पीएफए टीबीएस में ~ 3 एमएल /
    नोट: प्रवाह दर और समय प्रसवोत्तर दिन 21 (पी 21) चूहों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। विभिन्न उम्र के चूहों के लिए प्रवाह दर और छिड़काव समय के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
  2. छिड़काव के बाद, सिर को अलग करने और खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को हटाने के लिए ऑपरेटिंग कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। अगला, मस्तिष्क को उजागर करने के लिए खोपड़ी के शीर्ष को हटाने के लिए सूक्ष्म-विदारक कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें। मस्तिष्क को हटाने के लिए संदंश या एक छोटे से स्पैटुला की एक जोड़ी का उपयोग करें और इसे बर्फ-ठंडा 4% पीएफए युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
    नोट: एक फ्लैट तल के साथ एक ट्यूब का उपयोग करना सुनिश्चित करें, जैसे कि 7 एमएल जगमगाहट शीशी, ताकि मस्तिष्क ट्यूब के नीचे न हो, जो ऊतक को संपीड़ित कर सकता है और एस्ट्रोसाइट मात्रा को बदल सकता है।
  3. अगले दिन, ट्यूब से पीएफए डालें। मस्तिष्क को कुल्ला करने और अवशिष्ट पीएफए को हटाने के लिए ट्यूब में 1 एक्स टीबीएस के 5 एमएल जोड़ें। टीबीएस डालें और कुल तीन कुल्ला के लिए इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  4. टीबीएस में 30% सुक्रोज के 4-5 एमएल जोड़ें और मस्तिष्क को 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, या जब तक मस्तिष्क ट्यूब के नीचे डूब नहीं जाता है।
    नोट: मस्तिष्क एक बार डूबने के बाद ठंड के लिए तैयार होते हैं लेकिन कई हफ्तों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सुक्रोज समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. टीबीएस में 30% सुक्रोज के 30 मिलीलीटर के साथ 100% इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक के 15 मिलीलीटर मिश्रण करके 50 एमएल ट्यूब में ठंड माध्यम तैयार करें। समाधान पूरी तरह से मिश्रित होने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए एक नटेटर या कक्षीय शेकर पर मिलाएं। किसी भी बुलबुले को सतह पर बढ़ने की अनुमति देने के लिए ट्यूब को एक अतिरिक्त घंटे के लिए सीधा रखें।
    नोट: ठंड माध्यम को पहले से तैयार किया जा सकता है और कई हफ्तों तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. एक वर्ग एम्बेडिंग मोल्ड (सामग्री की तालिका) में ठंड माध्यम जोड़ने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। माध्यम में बुलबुले पेश करने से बचने के लिए ध्यान रखें। पी 21 माउस मस्तिष्क के लिए, 3 एमएल पर्याप्त है। विभिन्न उम्र के लिए आवश्यकतानुसार मात्रा को समायोजित करें ताकि मस्तिष्क पूरी तरह से जलमग्न हो जाए।
  7. मस्तिष्क को माध्यम में जोड़ें और किसी भी मस्तिष्क स्टेम को हटाने के लिए # 5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें जो मस्तिष्क को मोल्ड में फ्लैट बैठने से रोक सकता है। मोल्ड के एक किनारे के साथ मस्तिष्क के सामने लाइन करें।
  8. मोल्ड को सूखी बर्फ के साथ ठंडा एक सपाट सतह पर स्थानांतरित करें। सूखी बर्फ से भरा एक धातु दोपहर का भोजन टिन इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से काम करता है। धीमी और यहां तक कि ठंड सुनिश्चित करने के लिए सूखी बर्फ छर्रों के साथ मोल्ड को घेरें।
  9. एक बार ठंड माध्यम पूरी तरह से सफेद और ठोस हो जाने के बाद, मोल्ड को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: दिमाग को कई वर्षों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. साइरोसेक्शनिंग

नोट: यह सेक्शनिंग विधि कई अलग-अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रायोस्टैट्स के साथ काम करने का इरादा है। यहां उपयोग किए जाने वाले क्रायोस्टैट (सामग्री की तालिका) के साथ, इष्टतम नमूना सिर काटने का तापमान -23 डिग्री सेल्सियस है, जिसमें -23 डिग्री सेल्सियस और -25 डिग्री सेल्सियस के बीच परिवेश कक्ष तापमान है।

सावधानी: क्रायोस्टैट ब्लेड बेहद तेज है। ब्लेड में हेरफेर करते समय और क्रायोस्टैट का संचालन करते समय सावधानी बरतें।

  1. 50 एमएल ट्यूब में 1एक्स टीबीएस के 25 एमएल और ग्लिसरॉल के 25 एमएल को मिलाकर सेक्शनिंग मीडियम तैयार करें। इसे सीधे ट्यूब में डालकर और माप के लिए ट्यूब पर मार्करों का उपयोग करके ग्लिसरॉल जोड़ना सबसे आसान है। मिश्रण करने के लिए ट्यूब हिलाओ/ इस समाधान को कई हफ्तों तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एक 12 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए अच्छी तरह से प्रति सेक्शनिंग माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़कर ऊतक वर्गों को इकट्ठा करने के लिए तैयार करें। नमूना जानकारी के साथ प्लेट के ऊपर और नीचे लेबल करें। प्लेट को अन्य आपूर्ति (क्रायोस्टैट ब्लेड, रेजर ब्लेड, चक और पेंटब्रश) के साथ सीधे क्रायोस्टैट में रखें, और उन्हें ~ 5 मिनट के लिए तापमान पर पहुंचने की अनुमति दें।
  3. मस्तिष्क को क्रायोस्टैट कक्ष में ले जाएं और उन्हें आपूर्ति के साथ तापमान के अनुकूल होने दें।
  4. एक रेजर ब्लेड के साथ मोल्ड के दो कोनों को काटकर और मोल्ड को ऊतक से दूर छीलकर मोल्ड से जमे हुए ऊतक ब्लॉक को हटा दें। ब्लॉक को उन्मुख करें ताकि मस्तिष्क का सामना ऊपर की ओर हो।
  5. चक में ओसीटी जोड़ें जैसे कि चक का ~ 2/3 ओसीटी के साथ कवर किया गया है और तुरंत ऊपर वर्णित अभिविन्यास को रखते हुए चक पर ऊतक ब्लॉक रखें। ब्लॉक को ओसीटी में दबाएं ताकि यह चक की सतह पर सपाट हो।
  6. एक बार जब ओसीटी पूरी तरह से जमे हुए हो जाता है और ऊतक ब्लॉक सुरक्षित रूप से जगह में होता है, तो चक को नमूना सिर पर क्लैंप करें। क्रायोस्टैट ब्लेड डालें और ब्लेड को नमूने के करीब लाएं।
  7. ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र तक पहुंचने से ठीक पहले 100 μm अंतराल पर मस्तिष्क के माध्यम से ट्रिम करें। सेक्शनिंग मीडिया में घुलने वाले ओसीटी की मात्रा को कम करने के लिए, ऊतक ब्लॉक के किनारों से अतिरिक्त ठंड माध्यम को ट्रिम करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
  8. एक बार ब्याज के क्षेत्र तक पहुँच जाता है, 100 μm मोटी वर्गों इकट्ठा शुरू करते हैं। एंटी-रोल प्लेट का उपयोग करके या धीरे-धीरे एक हाथ से क्रायोस्टैट को आगे बढ़ाकर अनुभागों को इकट्ठा करें, जबकि दूसरे हाथ में पेंटब्रश का उपयोग करके ब्लॉक से अनुभाग का मार्गदर्शन करने के लिए क्योंकि यह ब्लेड से मिलता है। यदि क्रायोस्टैट मॉडल में पेडल है, तो क्रायोस्टैट को आगे बढ़ाने के लिए पेडल का उपयोग करें ताकि दोनों हाथों का उपयोग ब्लॉक से अनुभाग का मार्गदर्शन करने के लिए किया जा सके।
  9. एक पेंटब्रश या संदंश का उपयोग कर 12 अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए वर्गों को स्थानांतरित करें। प्रत्येक कुआं कम से कम 10-12 खंडों को पकड़ सकता है। अनुभाग को माध्यम में जोड़ते समय, यह आमतौर पर अनुभाग के निचले किनारे को सेक्शनिंग माध्यम में छूने के लिए पर्याप्त होता है और ब्रश या संदंश को गीला किए बिना अनुभाग को माध्यम में पिघलने की अनुमति देता है। यदि ब्रश माध्यम को छूता है, तो इसे पेपर तौलिया या ऊतक के साथ सूखना सुनिश्चित करें, क्योंकि अत्यधिक गीला ब्रश ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करना मुश्किल बना देगा।
  10. पन्नी या पैराफिन फिल्म के साथ लपेटकर प्लेट को सुरक्षित करें। इसे स्पष्ट रूप से लेबल करना सुनिश्चित करें, फिर इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: अधिकांश धुंधला प्रोटोकॉल के लिए, वर्गों संकेत के पर्याप्त नुकसान के बिना कम से कम 1-2 साल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. इम्यूनोस्टेनिंग

नोट: लगभग 100 आरपीएम पर सेट एक कक्षीय प्लेटफ़ॉर्म शेकर पर सभी वॉश और ऊष्मायन करें। प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन को छोड़कर सभी चरण कमरे के तापमान पर किए जाते हैं, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है। 50 एमएल ट्यूब में सामग्री के संयोजन और रात भर एक नटेटर पर मिश्रण करके समय से पहले बढ़ते मीडिया तैयार करें। प्रकाश से बचाएं और 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि अंतर्जात फ्लोरोसेंट सिग्नल इम्यूनोस्टेनिंग की आवश्यकता के बिना इमेजिंग और विश्लेषण के लिए पर्याप्त है, तो चरण 3.1-3.9 को छोड़ा जा सकता है। यदि इम्यूनोस्टेनिंग छोड़ रहे हैं, तो टीबीएस में तीन 10 मिनट धोएं और चरण 3.10 पर आगे बढ़ें।

  1. 50 एमएल ट्यूब में 10% ट्राइटन-एक्स के 1 एमएल जोड़कर और 1 एक्स टीबीएस के साथ 50 एमएल में ट्यूब भरकर टीबीएसटी (टीबीएस में 0.2% ट्राइटन) का एक ताजा समाधान तैयार करें।
    नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रत्येक नए धुंधला प्रयोग के लिए ताजा टीबीएसटी बनाएं और 10% जलीय ट्राइटन-एक्स (सामग्री की तालिका) के उच्च गुणवत्ता वाले स्रोत का उपयोग करें।
  2. योजनाबद्ध (चित्रा 1) के अनुसार एक 24 अच्छी तरह से प्लेट लेबल। अलग-अलग पंक्तियों में अलग-अलग नमूने रखें, और विभिन्न कॉलम में अलग-अलग समाधान रखें। पहले तीन कॉलम ('वॉश 1', 'वॉश 2', और 'वॉश 3') में 1 एमएल टीबीएसटी जोड़ें। चौथे कॉलम में अवरुद्ध समाधान का 1 एमएल जोड़ें।
  3. पाश्चर पिपेट में 5.75 के अंत को बनसेन बर्नर का उपयोग करके एक छोटे हुक में पिघलाकर एक ग्लास पिक तैयार करें। 24-अच्छी तरह से प्लेट के वॉश 1 कॉलम में 12-अच्छी तरह से प्लेट से ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए इस पिक का उपयोग करें।
    नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, धुंधला शुरू करने से पहले अनुभागों को स्क्रीन करें। अनुभागों को स्क्रीन करने के लिए, अनुभागों को एक-एक करके 1x टीबीएस से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और पर्याप्त संख्या में फ्लोरोसेंट लेबल वाली कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए 5x या 10x उद्देश्य के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अनुभागों की जांच करें। अच्छी तरह से प्रति चार से छह वर्गों धुंधला करने की सिफारिश की जाती है, हालांकि यदि आवश्यक हो तो प्रति अच्छी तरह से आठ तक दाग दिया जा सकता है।
  4. 1, 2, और 3 कुओं में प्रत्येक 10 मिनट के लिए वर्गों को धो लें, इसके बाद अवरुद्ध समाधान में 1 घंटे के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें। अनुभागों को एक कुएं से दूसरे में स्थानांतरित करने के लिए ग्लास पिक का उपयोग करें। पिक का उपयोग एक समय में कई मस्तिष्क वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान का 1 एमएल तैयार करें (उदाहरण के लिए, खरगोश आरएफपी 1: 2000 या चिकन जीएफपी 1: 2000)। एंटीबॉडी समाधान में एंटीबॉडी जोड़ें, भंवर संक्षेप में, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥ 4,000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर दो से तीन रातों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी में वर्गों सेते हैं।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, धोने के कुओं से दिन 1 टीबीएसटी की आकांक्षा करें, प्रत्येक धोने के लिए 1 मिलीलीटर नई टीबीएसटी जोड़ें, और वर्गों को पहले धोने में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। प्रत्येक 10 मिनट के लिए अनुभागों 3x धो लें।
    नोट: आकांक्षा के लिए, एक वैक्यूम फ्लास्क के लिए ट्यूबिंग से जुड़े पाश्चर पिपेट में 9 का उपयोग करें। हाउस वैक्यूम लाइनों या एक इलेक्ट्रिक वैक्यूम पंप का उपयोग वैक्यूम स्रोत के रूप में किया जा सकता है।
  7. जबकि वर्गों को धोया जा रहा है, एंटीबॉडी समाधान (जैसे, बकरी विरोधी खरगोश 594, या बकरी विरोधी चिकन 488) में एंटीबॉडी जोड़कर 1:200 की एकाग्रता पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। भंवर संक्षेप में, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥ 4,000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए स्पिन।
  8. कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी में वर्गों सेते हैं। इस चरण के दौरान प्रकाश से वर्गों की रक्षा करें और माध्यमिक एंटीबॉडी के विरंजन को कम करने के लिए निम्नलिखित सभी कदम।
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, धोने के कुओं से दिन 2 टीबीएसटी की आकांक्षा करें, प्रत्येक धोने के लिए 1 मिलीलीटर नया टीबीएसटी जोड़ें, और वर्गों को पहले धोने में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। प्रत्येक 10 मिनट के लिए टीबीएसटी में अनुभाग 3x धो लें।
  10. अंतिम धोने के दौरान, बढ़ते मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस से बाहर निकालें और इसे कमरे के तापमान पर गर्म होने दें। 1एक्स टीबीएस: डीएच 2 ओ का2: 1 मिश्रण तैयार करें और इसे पेट्री डिश में जोड़ें। सतह पर 2: 1 टीबीएस: डीएच 2ओ के 800 μL जोड़कर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें।
    नोट: गैर-इलाज बढ़ते मीडिया का उपयोग करना दृढ़ता से अनुशंसित है। सख्त बढ़ते मीडिया ऊतक की मात्रा को बदल सकता है जो एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा के विश्लेषण को भ्रमित कर सकता है। सामग्री की तालिका में एक सरल और सस्ती घर का बना बढ़ते मीडिया के लिए एक नुस्खा प्रदान किया गया है।
  11. एक ठीक पेंटब्रश का उपयोग करके, वॉश 3 से पेट्री डिश में एक समय में अनुभागों को स्थानांतरित करें। यह चरण ट्राइटन को हटा देता है और अनुभागों को समतल करने में मदद करता है। अगला पेट्री डिश से अनुभागों को स्लाइड पर तरल में स्थानांतरित करें।
  12. अनुभागों को व्यवस्थित करने में मदद करने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग करें ताकि वे स्लाइड पर सपाट हों। वैक्यूम आकांक्षा के बाद, पी 1000 पिपेट के साथ स्लाइड से अतिरिक्त तरल को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    नोट: वैक्यूम आकांक्षा के महीन नियंत्रण के लिए पाश्चर पिपेट के अंत में एक पी 200 पिपेट टिप जोड़ें।
  13. एक बार स्लाइड से सभी अतिरिक्त तरल हटा दिए जाने के बाद, प्रत्येक अनुभाग में तुरंत बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें और धीरे-धीरे स्लाइड पर एक कवरस्लिप बिछाएं। बढ़ते मीडिया को कुछ मिनटों के लिए फैलने दें, और फिर वैक्यूम आकांक्षा द्वारा कवरस्लिप के नीचे से बाहर आने वाले किसी भी अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को हटा दें।
    नोट:: बढ़ते मीडिया जोड़ने से पहले अनुभागों को सूखने के लिए किसी भी समय अनुमति न दें। यदि बढ़ते मीडिया को जोड़ने से पहले अनुभाग सूखने लगते हैं, तो यह ऊतक की मात्रा को प्रभावित कर सकता है और सटीक डेटा संग्रह को बाधित कर सकता है।
  14. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के सभी चार किनारों को सील करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्लाइड सूखने दें, और फिर उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्लैट स्टोर करें। इमेजिंग से पहले कम से कम 2 घंटे प्रतीक्षा करें, या, अगले दिन छवि।
    नोट: जीएफपी और आरएफपी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग वाले अनुभागों को इमेजिंग से पहले 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है, बशर्ते वे पूरी तरह से नाखून पॉलिश के साथ सील हों।

4. कॉन्फोकल इमेजिंग

नोट: यह प्रोटोकॉल सामान्य छवि अधिग्रहण दिशानिर्देश देता है जो किसी विशेष कॉन्फोकल और सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस के लिए विशिष्ट विवरण के बजाय विभिन्न कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर व्यापक रूप से लागू होते हैं।

  1. इमेजिंग के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग करें, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र या उप-क्षेत्र (जैसे, दृश्य प्रांतस्था की परत 5) को ध्यान में रखते हुए जैसा कि प्रयोग के लिए प्रासंगिक है। पूरे एस्ट्रोसाइट अनुभाग के भीतर निहित है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें।
  2. एक उच्च आवर्धन तेल उद्देश्य (जैसे, 40x, 60x, या 63x) पर स्विच करें और सेल को फोकस में लाएं। आईपीस के माध्यम से देखते समय, सेल के ऊपर से नीचे तक जाने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें।
    1. नेत्रहीन यह सुनिश्चित करने के लिए सेल का निरीक्षण करें कि संपूर्ण सेल अनुभाग के भीतर निहित है। यदि सेल अचानक फोकस से बाहर हो जाता है और अनुभाग के किनारे पर कट जाता है, तो इस सेल को बाहर करें और दूसरे का पता लगाएं।
  3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के संबंधित अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, उपयुक्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात और विस्तार के स्तर को प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करें (512 x 512 रिज़ॉल्यूशन क्षेत्र विश्लेषण के लिए पर्याप्त विवरण प्रदान करेगा और छवि अधिग्रहण समय को कम करेगा)। 40x उद्देश्य का उपयोग करते समय 2x ज़ूम का उपयोग करें, और 60x या 63x उद्देश्य का उपयोग करते समय कोई ज़ूम नहीं।
  4. जेड-स्टैक की ऊपरी और निचली सीमाएं सेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे एस्ट्रोसाइट पर कब्जा किया जा रहा है, जेड-स्टैक की पहली और आखिरी छवियों में सेल का कोई फ्लोरोसेंट लेबलिंग नहीं होना चाहिए। पर्याप्त नमूने के लिए, 0.5 μm के एक कदम आकार का उपयोग करें।

5. छवि विश्लेषण

नोट: यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण करने के चरणों का वर्णन करता है (यानी, इमारिस; सामग्री की तालिका देखें)। इस सॉफ़्टवेयर के अन्य संस्करणों का उपयोग वर्कफ़्लो में मामूली संशोधनों के साथ किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को उत्तल हल Xtension फ़ाइल (पूरक फ़ाइल) चलाने के लिए MATLAB की भी आवश्यकता होती है।

  1. विश्लेषण प्रारंभ करने से पहले, उत्तल हल Xtension फ़ाइल XTSpotsConvexHull.m XT फ़ोल्डर के rtmatlab सबफ़ोल्डर में फ़ाइल चिपकाकर स्थापित करें।
  2. छवियों को '.IMs' प्रारूप में परिवर्तित करने के लिए इमारिस फ़ाइल कनवर्टर का उपयोग करें। छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में एक छवि फ़ाइल खोलें और 3 डी व्यू बटन का चयन करके छवि को 3 डी व्यूइंग मोड में देखें।
  3. विश्लेषण से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए सेल का निरीक्षण करें कि यह समावेश मानदंडों को पूरा करता है।
    1. सुनिश्चित करें कि संपूर्ण सेल छवि के भीतर मौजूद है (यानी, सेल का कोई भी हिस्सा छवि से बाहर नहीं काटा जाना चाहिए)। सामने और पीछे के किनारों का निरीक्षण करने के लिए छवि को घुमाएं।
    2. सुनिश्चित करें कि कोशिका में केवल एक कोशिका शरीर है। स्लाइस बटन पर क्लिक करें, जेड-स्टैक के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए स्क्रीन के बाईं ओर कर्सर खींचें, और सत्यापित करें कि लेबल किए गए सेल में केवल एक सेल बॉडी है।
    3. सुनिश्चित करें कि एक व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट है जिसे किसी भी पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स से अलग किया जा सकता है जिसे एक ही रंग के साथ लेबल किया जाता है।
  4. एक सतह बनाएँ
    1. फिर से चयनित 3 डी व्यू बटन के साथ, नीले रंग की नई सतहों को जोड़ें आइकन पर क्लिक करके एक नई सतह बनाएं।
      1. सॉफ़्टवेयर विंडो के निचले बाईं ओर प्रकट होने वाले बनाएँ टैब में, सुनिश्चित करें कि केवल सेगमेंट केवल रुचि का क्षेत्र और ऑब्जेक्ट-ऑब्जेक्ट सांख्यिकी बॉक्स एल्गोरिथ्म सेटिंग्स के लिए चेक किए गए हैं, और निर्माण प्राथमिकताओं के लिए स्लाइसर दृश्य के साथ प्रारंभ करें बॉक्स अनियंत्रित है। आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
        नोट: ब्याज के सेल के बाहर छवि में कोई अतिरिक्त फ्लोरोसेंट संकेत नहीं है, तो ब्याज के एक क्षेत्र की आवश्यकता नहीं हो सकती है। इस मामले में, सेगमेंट को केवल ब्याज का एक क्षेत्र अनियंत्रित छोड़ दें और चरण 5.4.3 पर आगे बढ़ें।
    2. सतह निर्माण उपकरण के आकार के तहत बक्से में आयाम दर्ज करके, या पीले बॉक्स (चित्रा 2 ए) के किनारों को खींचकर सेल के चारों ओर रुचि का एक क्षेत्र बनाएं। आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
    3. विश्लेषण के लिए ड्रॉप-डाउन सूची से सही स्रोत चैनल का चयन करें (उदाहरण के लिए, चैनल 1, या वह चैनल जिसमें फ्लोरोसेंट सेल भरण है)। सतहों विवरण बॉक्स में मान सॉफ्टवेयर द्वारा और छवि अधिग्रहण मापदंडों के आधार पर निर्धारित किया जाता है। सुनिश्चित करें कि यह मान प्रयोग में सभी नमूनों के लिए स्थिर रहता है। आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
    4. पीले रंग की पट्टी को खींचकर या बॉक्स में मूल्यों को इनपुट करके थ्रेसहोल्ड (निरपेक्ष तीव्रता) समायोजित करें ताकि ग्रे सतह सेल की सीमा से परे जाने के बिना सेल के सिग्नल को जितना संभव हो उतना भर सके भर सके। फ्लोरोसेंट सिग्नल की एक छोटी राशि सतह के किनारों पर दिखाई देगी (चित्रा 2 बी)। आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
    5. सरफेस क्रिएशन टूल का अंतिम पैनल न्यूनतम गुणवत्ता मान सेट करता है, जो सॉफ़्टवेयर का डिफ़ॉल्ट लोअर थ्रेशोल्ड मान है। ड्रॉप-डाउन सूची में, सुनिश्चित करें कि वोक्सल्स आईएमजी = 1 की संख्या का चयन किया गया है। जांचें कि लोअर थ्रेशोल्ड के लिए केवल बाएं पावर बटन हरे (सक्रिय) हैं; सही पावर बटन लाल (निष्क्रिय) होना चाहिए। सॉफ़्टवेयर निम्न थ्रेशोल्ड मान को 10 पर डिफ़ॉल्ट करता है। इसे अपरिवर्तित छोड़ दें और सतह उत्पन्न करने के लिए हरे तीर पर क्लिक करें।
    6. नई उत्पन्न सतह का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें। किसी भी सतह के टुकड़े को हटाएं जो सेल का हिस्सा नहीं हैं, उन्हें चुनकर, पेंसिल संपादन उपकरण पर क्लिक करके, और हटाएं विकल्प पर क्लिक करके।
    7. सभी का चयन करने के लिए फ़नल फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करके शेष सतह के टुकड़ों को एकजुट करें, पेंसिल संपादित करें आइकन पर क्लिक करें, और एकीकृत विकल्प (चित्रा 2 सी) पर क्लिक करें।
      नोट:: एक बड़ी छवि फ़ाइल के साथ, सॉफ़्टवेयर कभी-कभी इस प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के दौरान क्रैश हो सकता है। इस बिंदु पर फ़ाइल को सहेजना एक अच्छा विचार है।
  5. सतह के करीब स्पॉट उत्पन्न करें
    1. नारंगी नए स्पॉट जोड़ें आइकन पर क्लिक करें। नए स्पॉट (जैसे, "स्पॉट 1") चयनित के साथ, बनाएँ टैब में, सुनिश्चित करें कि एल्गोरिथ्म सेटिंग्स के लिए केवल ऑब्जेक्ट-ऑब्जेक्ट सांख्यिकी बॉक्स चेक किया गया है, और निर्माण प्राथमिकताओं के लिए स्लाइसर दृश्य बॉक्स के साथ प्रारंभ करें बॉक्स अनियंत्रित है। आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
    2. ड्रॉप-डाउन सूची (जैसे, चैनल 1) से सही स्रोत चैनल का चयन करें, और फिर बॉक्स में 0.400 μm का अनुमानित XY व्यास मान इनपुट करें। सुनिश्चित करें कि केवल पृष्ठभूमि घटाव बॉक्स चयनित है। आगे बढ़ने के लिए नीले तीर पर क्लिक करें।
      नोट: 0.400 μm 1024 x 1024 या 512 x 512 छवियों के लिए 63x, 60x, या 40x उद्देश्य का उपयोग कर उपयुक्त है। अन्य इमेजिंग स्थितियों के लिए, व्यास इमेजिंग स्थितियों के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए और सभी विश्लेषणों में स्थिर रहना चाहिए। उपयुक्त मूल्य सभी सकारात्मक संकेतों को कवर करने के लिए पर्याप्त स्पॉट बनाएगा लेकिन पृष्ठभूमि सिग्नल पर स्पॉट नहीं जोड़ेगा।
    3. स्पॉट क्रिएशन टूल का अंतिम पैनल न्यूनतम गुणवत्ता मान सेट करता है, जो सॉफ़्टवेयर का डिफ़ॉल्ट लोअर थ्रेशोल्ड मान है; सुनिश्चित करें कि यह मान अपरिवर्तित रहता है जब तक कि स्पॉट के प्लेसमेंट / वितरण में ध्यान देने योग्य अंतर न हो (उदाहरण के लिए, खराब गुणवत्ता धुंधला होने के कारण)। स्पॉट बनाना समाप्त करने के लिए हरे तीर पर क्लिक करें।
    4. स्पॉट को बेहतर ढंग से देखने के लिए, सतह का चयन करके और बहुरंगी रंग उपकरण पर क्लिक करके सतह की पारदर्शिता बदलें। सामग्री के तहत, उस सामग्री का चयन करें जो सतह को सेल में स्पॉट देखने के लिए पर्याप्त पारदर्शी बनाती है (सूची में चौथी से अंतिम सामग्री) (चित्रा 2 डी, ई)।
    5. स्पॉट का फिर से चयन करें, फ़िल्टर आइकन पर क्लिक करें और सतहों की सतहों = सतहों एक्स के लिए सबसे छोटी दूरी का चयन करें, जहां 'सर्फेस एक्स' ड्रॉप-डाउन सूची से विश्लेषण की जा रही सतह है (उदाहरण के लिए, सतह 1)। सुनिश्चित करें कि लोअर थ्रेशोल्ड और अपर थ्रेशोल्ड पावर बटन दोनों हरे (सक्रिय) हैं।
      1. निचले थ्रेशोल्ड बॉक्स में -1.0 μm (सतह के अंदर से धब्बे की दूरी) की न्यूनतम दूरी और ऊपरी थ्रेशोल्ड बॉक्स में 0.1 μm (बाहर से दूरी) की अधिकतम दूरी इनपुट करें। सतह के करीब स्पॉट उत्पन्न करना समाप्त करने के लिए नए स्पॉट बटन पर डुप्लिकेट चयन पर क्लिक करें।
        नोट: न्यूनतम और अधिकतम दूरी मान विभिन्न छवि अधिग्रहण पैरामीटर, जैसे उद्देश्य, ज़ूम और रिज़ॉल्यूशन के साथ भिन्न हो सकते हैं। इन संख्याओं को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। पारदर्शी सतह यह तय करने में मदद करती है कि क्या मान उन सभी धब्बों को कैप्चर करते हैं जो सतह के आकार का सटीक प्रतिनिधित्व करते हैं।
  6. उत्तल पतवार उत्पन्न करें और क्षेत्र माप एकत्र करें
    1. सुनिश्चित करें कि नए बनाए गए स्पॉट सॉफ़्टवेयर विंडो के ऊपरी बाएं पैनल में चुने गए हैं (उदाहरण के लिए, "स्पॉट 1 चयन ['सबसे छोटी दूरी ...]")। गियर टूल आइकन पर क्लिक करें, और फिर उत्तल हल प्लगइन। प्लगइन पर केवल एक बार क्लिक करें और मैटलैब विंडो के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें और फिर गायब हो जाएं (इसमें कई सेकंड लग सकते हैं)। 3 डी दृश्य में एक ठोस पतवार दिखाई देगी।
    2. ऊपरी बाएं पैनल में, स्पॉट एक्स चयन के उत्तल पतवार का चयन करें ['सबसे छोटी दूरी ...], जहां 'स्पॉट एक्स चयन' नए बनाए गए स्पॉट (जैसे, स्पॉट 1 चयन) है, और फिर इसे चुनने के लिए पतवार पर क्लिक करें (चित्रा 2 एफ)।
    3. ग्राफ़ सांख्यिकी आइकन पर क्लिक करें, चयन टैब चुनें, सुनिश्चित करें कि शीर्ष ड्रॉप-डाउन सूची से विशिष्ट मान चयनित हैं, और फिर नीचे ड्रॉप-डाउन सूची से वॉल्यूम चुनें। पतवार की मात्रा रिकॉर्ड करें। फ़ाइल सहेजें और अगली छवि पर आगे बढ़ें।
  7. विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल के साथ पड़ोसी कोशिकाओं के लिए क्षेत्र ओवरलैप मात्रा को मापना
    नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड का उपयोग किया जा सकता है यदि नमूनों में पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स होते हैं जो अलग-अलग फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त करते हैं (उदाहरण के लिए, एस्ट्रोसाइट 1 केवल जीएफपी व्यक्त करता है और एस्ट्रोसाइट 2 केवल आरएफपी व्यक्त करता है)। यह लेबलिंग वायरल या आनुवंशिक रणनीतियों का उपयोग करके हासिल की गई थी जैसा कि पहले 9,10 (चित्रा 3 ए) वर्णित है।
    1. चरण 5.4-5.6 में विस्तृत चरणों का उपयोग करके, सतह, सतह के करीब स्पॉट और प्रत्येक एस्ट्रोसाइट (चित्रा 3 बी) के लिए उत्तल पतवार बनाएं।
    2. स्पॉट 1 चयन के उत्तल पतवार के साथ ... चयनित, पेंसिल संपादित करें आइकन पर क्लिक करें और मास्क चयन पर क्लिक करें। मास्क चैनल विंडो में, सुनिश्चित करें कि चैनल 1 (या एस्ट्रोसाइट 1 का प्रतिनिधित्व करने वाला चैनल) चयनित है और सुनिश्चित करें कि मास्क विकल्प लागू करने से पहले डुप्लिकेट चैनल के बगल में स्थित बॉक्स चेक किया गया है। चैनल नकाबपोश सीएच 1 बनाने के लिए ओके पर क्लिक करें।
    3. स्पॉट 2 चयन के उत्तल पतवार के साथ ... चयनित, पेंसिल संपादित करें आइकन पर क्लिक करें और मास्क चयन पर क्लिक करें। मास्क चैनल विंडो में, ड्रॉप-डाउन मेनू से चैनल 2 (या एस्ट्रोसाइट 2 का प्रतिनिधित्व करने वाला चैनल) का चयन करें और सुनिश्चित करें कि मास्क विकल्प लागू करने से पहले डुप्लिकेट चैनल के बगल में स्थित बॉक्स चेक किया गया है। चैनल नकाबपोश सीएच 2 (चित्रा 3 सी) बनाने के लिए ठीक पर क्लिक करें।
    4. स्क्रीन के शीर्ष पर कोलोक बटन पर क्लिक करें और दो नकाबपोश चैनलों का सह-स्थानीयकरण चैनल बनाने के लिए कोलोक टूल का उपयोग करें। चैनल ए को चैनल 3 पर सेट करें - नकाबपोश सीएच 1 और चैनल बी चैनल 4 - नकाबपोश सीएच 2 (चित्रा 3 डी)।
    5. दोनों चैनलों के लिए बाईं ओर पीले हिस्टोग्राम बार खींचें। सह-स्थानीयकरण संकेत का निरीक्षण करने के लिए नीचे दिए गए स्लाइस दृश्य का उपयोग करें, जो ग्रे में दिखाई देगा। ध्यान दें कि चूंकि दो कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट सिग्नल वास्तव में सह-स्थानीयकृत नहीं हैं, इसलिए थ्रेसहोल्ड को बाईं ओर ले जाने की आवश्यकता होगी ताकि सेल-सेल संपर्क के बिंदुओं पर झूठे सह-स्थानीयकरण दिखाई देने लगें।
    6. प्रक्रिया को पूरा करने के लिए दाईं ओर बिल्ड कोलोक चैनल पर क्लिक करें। मानक 3 डी दृश्य पर लौटने के लिए 3 डी दृश्य पर क्लिक करें। एक कोलोकलाइज़ेशन परिणाम चैनल अब ग्रे में दिखाई देगा और प्रदर्शन समायोजन बॉक्स में दिखाई देगा।
    7. 5.4-5.7 (चित्रा 3 ई, एफ) में वर्णित चरणों का उपयोग करके सतह, सतह के करीब स्पॉट, और कोलोकलाइजेशन परिणाम चैनल के उत्तल पतवार बनाएं।
    8. उत्तल पतवार की मात्रा रिकॉर्ड करें। यह क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम है। क्षेत्र ओवरलैप के प्रतिशत की गणना करने के लिए इस संख्या को एस्ट्रोसाइट्स में से एक के क्षेत्र की मात्रा से विभाजित करें। नियंत्रण या जंगली प्रकार के एस्ट्रोसाइट चुनें यदि एस्ट्रोसाइट्स में से एक आनुवंशिक रूप से दूसरे के संबंध में हेरफेर किया जाता है।

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Representative Results

चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल के लिए प्रमुख चरणों और वर्कफ़्लो की एक योजनाबद्ध रूपरेखा प्रस्तुत करता है। चित्रा 2 एक सतह उत्पन्न करने, सतह के करीब स्पॉट उत्पन्न करने और उत्तल पतवार उत्पन्न करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके महत्वपूर्ण चरणों के स्क्रीनशॉट दिखाता है। चित्रा 3 एस्ट्रोसाइट क्षेत्र ओवरलैप/टाइलिंग निर्धारित करने के लिए इस तकनीक के अनुप्रयोग को दर्शाता है। चित्रा 4 में, पहले प्रकाशित पांडुलिपि9 से प्रतिनिधि परिणाम इस प्रोटोकॉल के आवेदन का प्रदर्शन करते हैं। चित्रा 4 ए और चित्रा 4 बी में, एस्ट्रोसाइट-समृद्ध सेल आसंजन अणु हेपैकैम का नॉकडाउन एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा को काफी कम कर देता है। चित्रा 4 सी और चित्रा 4 डी में, डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग माउस कॉर्टेक्स में विरल मोज़ेक लेबलिंग और समवर्ती आनुवंशिक संशोधन पेश करने के लिए किया गया था। एमएडीएम के साथ, चूहों को उत्पन्न किया गया था जहां जंगली प्रकार के एस्ट्रोसाइट्स एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) व्यक्त करते हैं और हेपाकैम नॉकआउट एस्ट्रोसाइट्स एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हैं। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, पड़ोसी आरएफपी और जीएफपी एस्ट्रोसाइट जोड़े (डब्ल्यूटी: केओ) के बीच क्षेत्र ओवरलैप का प्रतिशत गणना की गई थी। एक नियंत्रण के रूप में, इसकी तुलना चूहों में पड़ोसी आरएफपी और जीएफपी एस्ट्रोसाइट जोड़े से की गई थी, जिसमें हेपाकैम (डब्ल्यूटी: डब्ल्यूटी) का कोई आनुवंशिक संशोधन नहीं था। डब्ल्यूटी: केओ एस्ट्रोसाइट जोड़े ने डब्ल्यूटी: डब्ल्यूटी एस्ट्रोसाइट जोड़े की तुलना में क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम का काफी बढ़ा हुआ प्रतिशत दिखाया। सामूहिक रूप से, इन परिणामों से पता चलता है कि हेपैकैम सामान्य एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट टाइलिंग के लिए आवश्यक है।

Figure 1
चित्रा 1: एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए वर्कफ़्लो का अवलोकन( ए) प्रोटोकॉल को एस्ट्रोसाइट्स के विरल या मोज़ेक फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ एक माउस की आवश्यकता होती है। (बी) माउस को सुगंधित किया जाता है और फिर मस्तिष्क को विच्छेदित, संसाधित और जमे हुए किया जाता है। (सी) जमे हुए मस्तिष्क को क्रायोस्टैट का उपयोग करके विभाजित किया जाता है और (डी) मुक्त-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों को एकत्र किया जाता है। (ई) सेक्शनिंग के बाद, फ्लोटिंग ऊतक वर्गों को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा दाग दिया जाता है और फिर (एफ) स्लाइड पर घुड़सवार किया जाता है। (जी) घुड़सवार ऊतक वर्गों के भीतर एस्ट्रोसाइट्स को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। (एच) अंत में, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इमेज किए गए कोशिकाओं के क्षेत्र की मात्रा निर्धारित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एस्ट्रोसाइट क्षेत्र मात्रा के लिए छवि विश्लेषण प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम( ए) ब्याज बॉक्स के क्षेत्र के साथ सेल का दृश्य जो विश्लेषण प्रक्रिया से छवि में अन्य सिग्नल को बाहर करता है। (बी) सिग्नल (लाल) का उपयोग करके सतह निर्माण (ग्रे) के लिए एक स्वीकार्य सापेक्ष सीमा। (सी) चयनित मुख्य सेल (पीला) के साथ पूर्ण सतह। सतह के अन्य भाग जो कक्ष नहीं हैं, हटा दिए जाएंगे (लाल)। (डी) बनाए गए धब्बों के साथ पारभासी सतह। (ई) सतह के सापेक्ष धब्बों के स्वीकार्य वितरण को दिखाने के लिए बनाए गए धब्बों के साथ पारभासी सतह का क्लोज-अप। (एफ) अंतिम उत्तल पतवार। स्केल सलाखों = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एस्ट्रोसाइट क्षेत्र ओवरलैप विश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम (ए) विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्करों, जीएफपी (हरा) और आरएफपी (मैजेंटा) को व्यक्त करने वाले दो एस्ट्रोसाइट्स की प्रतिनिधि छवि। (बी) प्रत्येक एस्ट्रोसाइट के लिए एक उत्तल पतवार की पीढ़ी। (सी) मूल चैनलों को हटाने के साथ नकाबपोश जीएफपी और आरएफपी चैनलों का दृश्य। (डी) "कोलोकलाइज़ेशन परिणाम" चैनल बनाने के लिए "कोलोक" टूल का उपयोग करके थ्रेसहोल्डिंग का उदाहरण। "कोलोकलाइज्ड" सिग्नल ग्रे में दिखाया गया है। (ई) दो नकाबपोश चैनलों का दृश्य। (एफ) "कोलोकलाइज़ेशन परिणाम" चैनल (ग्रे) के उत्तल पतवार का एक घुमावदार दृश्य जो क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल सलाखों = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट क्षेत्र ओवरलैप को मापने के लिए प्रोटोकॉल का सफल अनुप्रयोग( ए) प्रसवोत्तर दिन 21 पर जंगली प्रकार के सीडी 1 चूहों के दृश्य प्रांतस्था में एस्ट्रोसाइट्स, एमचेरी-सीएएएक्स (सियान) और एक नियंत्रण एसएचआरएनए (एसएचएसक्रैम्बल) या एक एसएचआरएनए लक्षित हेपैकैम (एसएचएचईपीएकैम) को व्यक्त करते हैं। एस्ट्रोसाइट क्षेत्र को लाल रंग में उल्लिखित किया गया है। (बी) हेपैकैम का नुकसान एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा को काफी कम कर देता है। डेटा बिंदु अलग-अलग माउस औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों को एसईएम नेस्टेड टी-टेस्ट ± जाता है। (सी) जीएफपी (हरा) या आरएफपी (मैजेंटा) व्यक्त प्रसवोत्तर दिन 21 पर माउस प्रांतस्था में पड़ोसी एस्ट्रोसाइट्स। एमएडीएम 9 डब्ल्यूटी: डब्ल्यूटी चूहों में, दोनों एस्ट्रोसाइट्स जंगली प्रकार के होते हैं। एमएडीएम 9 डब्ल्यूटी: केओ चूहों में, हरा एस्ट्रोसाइट जंगली प्रकार का होता है और मैजेंटा एस्ट्रोसाइट हेपाकैम के लिए शून्य होता है। क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम नीले रंग में दिखाया गया है। (एमएडीएम 9 डब्ल्यूटी: डब्ल्यूटी जीनोटाइप: एमएडीएम 9टीजी / ईएमएक्स-क्रेटीजी / हेपाकैम +/+। एमएडीएम 9 डब्ल्यूटी: केओ जीनोटाइप: एमएडीएम 9टीजी / ईएमएक्स-क्रेटीजी / हेपाकैम +/-)। (डी) क्षेत्र मात्रा ओवरलैप के प्रतिशत का परिमाणीकरण। डेटा बिंदु अलग-अलग माउस औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों को एसईएम नेस्टेड टी-टेस्ट ± जाता है। स्केल सलाखों = 20 μm. इस आंकड़े में पैनल प्रकाशक की अनुमति के साथ बाल्डविन एट अल9 से पुनर्मुद्रित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल माउस कॉर्टेक्स में एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और एस्ट्रोसाइट टाइलिंग का विश्लेषण करने के लिए एक स्थापित विधि का वर्णन करता है, छिड़काव के साथ शुरू होने वाले सभी प्रमुख चरणों का विवरण देता है और छवि विश्लेषण के साथ समाप्त होता है। इस प्रोटोकॉल को चूहों से दिमाग की आवश्यकता होती है जो एस्ट्रोसाइट्स की विरल या मोज़ेक आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। इस आवश्यकता के बाहर, किसी भी उम्र के चूहों का उपयोग इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है, छिड़काव सेटिंग्स के लिए केवल मामूली समायोजन और एम्बेडिंग मोल्ड में जोड़े गए ठंड मीडिया की मात्रा के साथ। जबकि मस्तिष्क के ऊतक वर्गों 7,11 में एस्ट्रोसाइट ब्रांचिंग जटिलता और मात्रा के विश्लेषण के लिए अन्य तरीकों को प्रकाशित किया गया है, इस प्रोटोकॉल के कई अनूठे फायदे हैं। सबसे पहले, यह प्रोटोकॉल एक कस्टम कोड का वर्णन करता है जिसका उपयोग एस्ट्रोसाइट क्षेत्र वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा एस्ट्रोसाइट सेल वॉल्यूम से एक अलग माप है, जिसमें यह एक एस्ट्रोसाइट द्वारा कब्जा किए गए पूरे स्थान को मापता है, इसकी शाखाओं की जटिलता की परवाह किए बिना। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एस्ट्रोसाइट क्षेत्र ओवरलैप वॉल्यूम को मापने के लिए एस्ट्रोसाइट क्षेत्र वॉल्यूम माप को कैसे लागू किया जाए, और इसलिए एस्ट्रोसाइट टाइलिंग व्यवहार। अंत में, यह प्रोटोकॉल संभावित चर की एक विस्तृत चर्चा प्रदान करता है जो एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और डेटा संग्रह को प्रभावित कर सकता है, जिसमें बढ़ते स्थितियां, नमूना भंडारण की स्थिति और इमेजिंग और विश्लेषण के लिए समावेश और बहिष्करण मानदंड शामिल हैं। इन अनूठी विशेषताओं के अलावा, इस प्रोटोकॉल के कई पहलुओं, छिड़काव, क्रायोसेक्शनिंग, और मुक्त फ्लोटिंग वर्गों के इम्यूनोस्टेनिंग सहित, मोटे तौर पर विभिन्न मोटाई के धुंधला मस्तिष्क ऊतक वर्गों और विभिन्न एंटीबॉडी संयोजनों के साथ लागू किया जा सकता है। नीचे, महत्वपूर्ण चरणों, महत्वपूर्ण विचारों, समस्या निवारण और सीमाओं पर विस्तार से चर्चा की गई है।

नमूना संग्रह विचार
एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण विचार नमूना संग्रह के लिए दिन का एक सुसंगत समय बनाए रखना है। बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि एस्ट्रोसाइट कार्यात्मक राज्य सर्कैडियन लय और नींद के व्यवहार से जुड़े हुए हैं14. दिन के अलग-अलग समय पर एकत्र किए जा रहे नमूनों द्वारा पेश की जा सकने वाली किसी भी परिवर्तनशीलता को हटाने के लिए, छिड़काव की योजना बनाई जानी चाहिए ताकि एक प्रयोग के लिए सभी नमूने 2-3 घंटे की समय सीमा के भीतर दिन के लगभग एक ही समय में एकत्र किए जाएं। लगातार छिड़काव के लिए, एक पेरिस्टाल्टिक पंप के उपयोग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। टीबीएस में हेपरिन का जोड़ रक्त के थक्कों के गठन को कम करने में सहायक है। हालांकि इस प्रोटोकॉल को छोटे पोस्ट-फिक्सेशन समय के साथ परीक्षण नहीं किया गया है, रात भर पोस्ट-फिक्सेशन की आवश्यकता नहीं हो सकती है, और 4 घंटे के छोटे पोस्ट-फिक्सेशन पर विचार किया जा सकता है।

क्रायोसेक्शनिंग के लिए समस्या निवारण युक्तियाँ
2: 1 सुक्रोज में ठंड दिमाग: ओसीटी ठंड माध्यम सेक्शनिंग के बाद संग्रह कुओं में ओसीटी की मात्रा को कम करता है। जमे हुए होने पर, ठंड माध्यम ओसीटी के समान व्यवहार करता है लेकिन कम भंगुर होता है। चक को ऊतक ब्लॉक को ठंडा करते समय, चक में ओसीटी जोड़ने के तुरंत बाद चक पर इसे फ्लैट दबाना सुनिश्चित करें। यदि सेक्शनिंग के दौरान ऊतक ब्लॉक चक से टूट जाता है, तो नीचे की ओर एक नई सपाट सतह को काटने और चक को फिर से फ्रीज करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। चक को ओसीटी जोड़ने से पहले क्रायोस्टैट चैंबर तापमान को ठंडा करने के लिए पर्याप्त समय देना और यह सुनिश्चित करना कि चक साफ और सूखा है, पालन में सुधार करेगा। पेंटब्रश के साथ ऊतक वर्गों को स्थानांतरित करते समय, पेंटब्रश को अनुभाग के कोने के किनारे पर स्पर्श करें, ताकि यह ओसीटी को छू सके और ऊतक को नहीं। थोड़ी नमी के साथ, अनुभाग ब्रश से चिपक जाएगा। धीरे मीडिया के लिए अनुभाग के विपरीत किनारे को छूने और इसे माध्यम में खींचने की अनुमति देकर अनुभाग माध्यम में ऊतक रखें। यदि ब्रश ठंड माध्यम को छूता है, तो इसे क्रायोस्टैट के भीतर एक पेपर तौलिया पर पोंछ लें। एक ब्रश जो बहुत गीला है, पकवान में वर्गों को स्थानांतरित करना मुश्किल बना देगा। एक बार ऊतक अनुभाग को सेक्शनिंग माध्यम में रखे जाने के बाद ओसीटी को भंग करना चाहिए। यदि ऐसा नहीं होता है, तो क्रायोस्टैट चैंबर का तापमान बहुत कम हो सकता है।

धुंधला और बढ़ते ऊतक वर्गों के लिए महत्वपूर्ण विचार
धुंधला गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, प्रत्येक प्रयोग से पहले टीबीएसटी ताजा तैयार करें। एक उच्च गुणवत्ता वाले 10% जलीय ट्राइटन स्रोत (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें। एक सीरम चुनें जो उन प्रजातियों से मेल खाता है जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी बनाया गया था (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक के लिए बकरी सीरम का उपयोग करें)। एंटीबॉडी समाधान उपयोग करने से पहले सेंट्रीफ्यूज किए जाते हैं, गोली मारने और किसी भी अवक्षेपित एंटीबॉडी को हटाने के लिए। ट्यूब से प्लेट में एंटीबॉडी समाधान स्थानांतरित करते समय गोली को परेशान न करने का ध्यान रखें (इसका मतलब यह हो सकता है कि प्रति एंटीबॉडी समाधान के 1 मिलीलीटर से थोड़ा कम पाइपिंग के साथ-साथ पिपेट टिप के साथ ट्यूब के नीचे स्पर्श न करें)। यह चरण पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने में मदद करता है। जब वर्गों को टीबीएस: डीएच2ओ में रखा जाता है, तो अधिकांश खुद को प्रकट / ब्रश का उपयोग करके स्लाइड में अनुभागों को स्थानांतरित करते समय, ऊतक अनुभाग को उचित स्थान पर मार्गदर्शन करने में मदद करने के लिए दूसरे हाथ में पी 200 टिप का उपयोग करें। ब्रश का उपयोग धीरे-धीरे प्रकट करने या अनुभागों को खोलने के लिए करें ताकि वे सपाट रहें। तरल को हटा दिए जाने के साथ अनुभाग एस्पिरेटिंग पिपेट की ओर बढ़ते हैं। आकांक्षा करते समय मोबाइल अनुभागों को रखने के लिए पी 200 टिप का उपयोग करें। सभी अतिरिक्त तरल को हटाने के तुरंत बाद और अनुभागों को सूखने का समय होने से पहले बढ़ते मीडिया को अनुभागों में जोड़ा जाना चाहिए। अनुभागों को कुछ मिनटों के लिए भी सूखने की अनुमति देना अनुभाग के भीतर कोशिकाओं की मात्रा को काफी प्रभावित करेगा। स्लाइड में बढ़ते मीडिया को जोड़ने के बाद, किसी भी दृश्यमान बुलबुले को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। कवरस्लिप जोड़ने के बाद, पक्षों से अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को हटाना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह नेल पॉलिश की सूखने की क्षमता में हस्तक्षेप करेगा। नेल पॉलिश को कमरे के तापमान पर सूखने दें। अनुभागों को चित्रित करने के लिए कम से कम 2 घंटे या अगले दिन तक प्रतीक्षा करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि बढ़ते मीडिया के पास मोटे वर्गों में पूरी तरह से घुसने के लिए पर्याप्त समय है।

इमेजिंग पूर्ण एस्ट्रोसाइट्स
क्षेत्र मात्रा विश्लेषण के लिए इमेजिंग एस्ट्रोसाइट्स करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि छवि एस्ट्रोसाइट की पूरी मात्रा को कैप्चर करती है। ऊतक अनुभाग में कई लेबल वाले एस्ट्रोसाइट्स अधूरे एस्ट्रोसाइट्स होंगे। पूर्ण एस्ट्रोसाइट्स पूरी तरह से ऊतक अनुभाग के भीतर निहित होंगे। पूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की पहचान करने के लिए, एस्ट्रोसाइट के बीच में एक केंद्र बिंदु से शुरू करें। एस्ट्रोसाइट के शीर्ष पर जाने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें। जब एस्ट्रोसाइट अब फोकस में नहीं होता है, तो ऊतक की अन्य विशेषताओं को फोकस में रहना चाहिए। एस्ट्रोसाइट के नीचे के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। अधूरे एस्ट्रोसाइट्स की छवि न बनाएं। वर्गों की मोटाई के कारण, एंटीबॉडी प्रवेश अनुभाग के बीच में उतना मजबूत नहीं है। लेबलिंग एस्ट्रोसाइट के बाहरी किनारों के आसपास मजबूत हो सकती है और केंद्र में कमजोर हो सकती है। यह आमतौर पर मनाया जाता है और क्षेत्र विश्लेषण को प्रभावित नहीं करता है।

छवि विश्लेषण के लिए युक्तियाँ
प्रोटोकॉल के छवि विश्लेषण भाग के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार यह सुनिश्चित करना है कि उत्तल पतवार केवल एक एस्ट्रोसाइट का प्रतिनिधित्व करता है। हर बार समावेश और बहिष्करण मानदंडों का पालन करें। कभी-कभी दो एस्ट्रोसाइट्स के कोशिका शरीर एक दूसरे के बहुत करीब होंगे। यह 3 डी दृश्य में पहचानना मुश्किल हो सकता है, लेकिन स्लाइस दृश्य का उपयोग करके पहचानने योग्य है। यदि ब्याज के एस्ट्रोसाइट से संपर्क करने वाले अन्य फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एस्ट्रोसाइट्स हैं, तो यह सतह निर्माण प्रक्रिया को जटिल कर सकता है। यदि दो कोशिकाओं के बीच एक यथोचित स्पष्ट सीमा दिखाई देती है (उदाहरण के लिए, वे केवल एक छोटी शाखा बिंदु पर कनेक्ट होते हैं), तो क्लिप टूल का उपयोग सतह में कटौती करने के लिए किया जा सकता है, और सतह के इस हिस्से को हटाया जा सकता है। सतह बनाने के बाद, सेल को 3 डी दृश्य में घुमाएं ताकि सतह के छोटे बिट्स की जांच की जा सके जो सेल के पीछे छिपे हो सकते हैं, लेकिन सेल का हिस्सा नहीं हैं। आगे बढ़ने से पहले इन्हें हटा दें। यदि उत्तल पतवार एस्ट्रोसाइट क्षेत्र के बाहर एक बिंदु पर काफी हद तक फैलता है, तो संभवतः गैर-सेल सतह का एक टुकड़ा होता है जिसे हटाया नहीं गया था। यदि सॉफ़्टवेयर नियमित रूप से सतह निर्माण के दौरान क्रैश हो जाता है, तो सतह विवरण संख्या को कम किया जा सकता है। यदि यह स्पॉट निर्माण के दौरान दुर्घटनाग्रस्त हो जाता है, तो केवल सतह ऑब्जेक्ट के पास स्पॉट बनाने के लिए ब्याज के क्षेत्र का उपयोग करें।

प्रोटोकॉल की सीमाएं
जबकि इस प्रोटोकॉल के कई उपयोग और फायदे हैं, कई सीमाएं भी हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए चूहों की आवश्यकता होती है जो पहले से ही एस्ट्रोसाइट्स की विरल आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति शुरू करने के तरीकों का वर्णन नहीं करते हैं। इमेजिंग और विश्लेषण पाइपलाइनें समय लेने वाली हैं और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं। इसके अलावा, वे विशेष रूप से व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स की विस्तृत रूपात्मक विशेषताओं को परिभाषित करने के बजाय एस्ट्रोसाइट क्षेत्र की मात्रा और टाइलिंग को मापने की दिशा में तैयार हैं। दूसरों को हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ इस प्रोटोकॉल के दृष्टिकोण और रणनीतियों को संयोजित करना उपयोगी लग सकता है जो एस्ट्रोसाइट रूपात्मक जटिलता 7,11 को मापने के तरीकों का विस्तार करते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल (यानी, इमारिस और मैटलैब) में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म महंगे हैं और उपयोग करने के लिए लाइसेंस की आवश्यकता होती है। जबकि बड़े संस्थान अक्सर इन सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के लिए लाइसेंस खरीदते हैं, यह छोटे संस्थानों और व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकता है। माइक्रोस्कोपी, ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर और मशीन लर्निंग एल्गोरिदम में प्रगति इस प्रोटोकॉल को सभी प्रयोगशालाओं के लिए व्यापक रूप से सुलभ बनाने में मदद कर सकती है, और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की दक्षता में भी सुधार कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

माइक्रोस्कोपी यूएनसी न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी कोर (आरआरआईडी: SCR_019060) में किया गया था, जो एनआईएच-एनआईएनडीएस न्यूरोसाइंस सेंटर सपोर्ट ग्रांट पी 30 एनएस 045892 और एनआईएच-एनआईसीएचडी बौद्धिक और विकासात्मक विकलांगता अनुसंधान केंद्र सहायता अनुदान यू 54 एचडी 079124 से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था। चित्र4 में छवियों और डेटा प्रकाशक से अनुमति के साथ एक पिछले प्रकाशन9 से पुनर्मुद्रित कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps Roboz RS-5045
1 mL TB Syringe Becton Dickinson (BD) 309623
10x TBS (tris-buffered saline) 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT)
12-well plate Genesee Scientific 25-106MP
1x TBS 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT
1x TBS + Heparin 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C
24-well plate Genesee Scientific 25-107MP
30% Sucrose in TBS 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C
4% PFA (paraformaldehyde) in TBS 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C
Avertin 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making
Blocking and antibody buffer 10% goat serum in TBST; store at 4 °C
CD1 mice Charles River 022
Collection vial for brains Fisher Scientific 03-337-20
Confocal acquisition software Olympus FV31S-SW
Confocal microscope Olympus FV3000RS
Coverslips Fisher Scientific 12544E
Cryostat Thermo Scientific CryoStar NX50
Cryostat blade Thermo Scientific 3052835
DAPI Invitrogen D1306
Embedding mold Polysciences 18646A-1
Freezing Medium 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT
GFP antibody Aves Labs GFP1010
Glycerol Thermo Scientific 158920010
Goat anti-chicken 488 Invitrogen A-11039
Goat anti-rabbit 594 Invitrogen A11037
Goat Serum Gibco 16210064
Heparin Sigma-Aldrich H3149
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Imaris Bitplane N/A Version 9.8.0
MATLAB MathWorks N/A
Metal lunch tin AQUARIUS N/A From Amazon, "DIY Large Fun Box"
Methylbutanol Sigma-Aldrich 152463
Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5921
Mounting medium 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months
Nail polish VWR 100491-940
N-propyl gallate Sigma-Aldrich 02370-100G
O.C.T. Fisher Scientific 23-730-571
Oil Olympus IMMOIL-F30CC Specific to microscope/objective
Operating Scissors 6" Roboz RS-6820
Orbital platform shaker Fisher Scientific 88861043 Minimum speed needed: 25 rpm
Paintbrush Bogrinuo N/A From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes"
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Pasteur pipet (5.75") VWR 14672-608
Pasteur pipet (9") VWR 14672-380
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541-500G
Razor blade Fisher Scientific 12-640
RFP antibody Rockland 600-401-379
Sectioning medium 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT
Slides VWR 48311-703
Sodium chrloide Fisher Scientific BP358-212
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
TBST (TBS + Triton X-100) 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT
Transfer Pipet VWR 414004-002
Tri-bromoethanol Sigma-Aldrich T48402
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Thermo Scientific 424570025
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Triton X-100 (high-quality) Fisher Scientific 50-489-120
XTSpotsConvexHull N/A N/A custom XTension provide as supplementary material

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References

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  3. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 182
मोटी फ्री-फ्लोटिंग ऊतक वर्गों में एस्ट्रोसाइट क्षेत्र मात्रा और टाइलिंग का विश्लेषण
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Eaker, A. R., Baldwin, K. T.… More

Eaker, A. R., Baldwin, K. T. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (182), e63804, doi:10.3791/63804 (2022).

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