Summary
该协议描述了用于切片，染色和成像小鼠大脑的自由浮动组织切片的方法，随后详细描述了星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞区域重叠或平铺的分析。
Abstract
星形胶质细胞具有惊人的形态复杂性，使它们能够与大脑中几乎每种类型的细胞和结构相互作用。通过这些相互作用，星形胶质细胞积极调节许多关键的大脑功能，包括突触形成、神经传递和离子稳态。在啮齿动物大脑中，星形胶质细胞在产后前三周的大小和复杂性增加，并建立不同的，不重叠的领土来平铺大脑。该协议提供了一种使用来自小鼠大脑的自由浮动组织切片分析星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺的既定方法。首先，该方案描述了自由浮动组织切片的组织收集，冷冻切片和免疫染色的步骤。其次，该协议描述了星形胶质细胞区域体积和区域重叠体积的图像采集和分析，使用市售的图像分析软件。最后，本文讨论了这些方法的优点，重要考虑因素，常见陷阱和局限性。该协议要求脑组织具有星形胶质细胞的稀疏或马赛克荧光标记，并且设计用于与常见的实验室设备，共聚焦显微镜和市售的图像分析软件一起使用。
Introduction
星形胶质细胞是精心分支的细胞，在大脑中执行许多重要功能1。在小鼠皮层中，桡骨神经胶质干细胞在胚胎晚期和产后早期阶段2中产生星形胶质细胞。在产后的前三周，星形胶质细胞的大小和复杂性增加，形成数千个直接与突触相互作用的细枝1。同时，星形胶质细胞与邻近的星形胶质细胞相互作用，以建立离散的、非重叠的区域来平铺大脑3，同时 通过 间隙连接通道4保持通信。在侮辱或损伤5之后的许多疾病状态中，星形胶质细胞的形态和组织被破坏，这表明这些过程对正常大脑功能的重要性。在正常发育、衰老和疾病期间分析星形胶质细胞的形态特性可以为星形胶质细胞生物学和生理学提供有价值的见解。此外，在遗传操作后分析星形胶质细胞形态是辨别控制星形胶质细胞形态复杂性的建立和维持的细胞和分子机制的宝贵工具。
由于星形胶质细胞分支的复杂性和星形胶质细胞平铺，对小鼠大脑中星形胶质细胞形态的分析很复杂。使用中间丝胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞特异性标记物的抗体染色仅捕获主要分支，并且大大低估了星形胶质细胞形态学复杂性1。其他细胞特异性标记物如谷氨酸转运蛋白1（GLT-1; slc1a2），谷氨酰胺合成酶或S100β在标记星形胶质细胞分支6方面做得更好，但引入了一个新问题。星形胶质细胞区域在很大程度上是非重叠的，但在外周边缘存在小程度的重叠。由于分支的复杂性，当相邻的星形胶质细胞被标记为相同的颜色时，无法区分一个星形胶质细胞结束和另一个开始的位置。用内源性荧光蛋白对星形胶质细胞进行稀疏或马赛克标记解决了这两个问题：荧光标记物填充细胞以捕获所有分支，并允许对可以与邻居区分开来的单个星形胶质细胞进行成像。已经使用了几种不同的策略来实现星形胶质细胞的稀疏荧光标记，无论是否具有遗传操作，包括病毒注射，质粒电穿孔或转基因小鼠系。有关执行这些策略的详细信息在先前发表的研究和协议1，7，8，9，10，11，12，13中描述。
本文描述了一种在稀疏的星形胶质细胞群体中用荧光标记测量小鼠大脑星形胶质细胞区域体积的方法（图1）。由于小鼠皮层中星形胶质细胞的平均直径约为60μm，因此使用100μm厚的部分来提高捕获单个星形胶质细胞的效率。免疫染色不是必需的，但建议用于增强共聚焦成像和分析的内源性荧光信号。免疫染色还可以更好地检测精细的星形胶质细胞分支，并减少图像采集过程中内源性蛋白质的光漂白。为了改善抗体对厚切片的渗透，并保持组织体积不通过成像切片，使用自由浮动的组织切片。星形胶质细胞区域体积的分析使用市售图像分析软件进行。此外，该协议描述了一种分析具有马赛克标记的组织切片中星形胶质细胞平铺的方法，其中相邻的星形胶质细胞表达不同的荧光标记。该协议已在最近的几项研究1，8，9中成功用于表征正常大脑发育过程中的星形胶质细胞生长，以及遗传操作对星形胶质细胞发育的影响。
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Protocol
所有小鼠均按照北卡罗来纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）和比较医学部（IACUC协议编号21-116.0）使用。产后第21天（P21）的两性小鼠用于这些实验。以商业方式获得CD1小鼠（材料表），前面描述了MADM9的WT：WT和MADM9 WT：KO小鼠。
注意：该协议要求在稀疏的星形胶质细胞群体中具有荧光蛋白表达的大脑。荧光蛋白表达可以通过遗传、病毒或电穿孔引入。稀疏标记星形胶质细胞的方法的细节在先前发表的研究和方案1，7，8，9，10，11，12，13中有所描述。
1. 组织收集和制备
注意：多聚甲醛 （PFA） 是一种危险化学品。在化学通风橱中使用PFA执行所有步骤。
- 用注射麻醉剂（例如，阿维丁; 0.8mg / kg）麻醉小鼠，并用脚趾捏确保麻醉深度。使用蠕动泵以~3 mL /min的速率用冰冷的Tris缓冲盐水（TBS）+肝素进行心内灌注，直到肝脏清澈（通常为3-5分钟），然后以~3 mL / min的速度在TBS中冰冷的4%PFA进行5分钟。
注意：流速和时间针对产后第21天（P21）小鼠进行了优化。对于不同年龄的小鼠，可能需要调整流速和灌注时间。 - 灌注后，使用一把手术剪刀将头部拆下并取出皮肤以暴露颅骨。接下来，使用一把微解剖剪刀取出颅骨顶部以暴露大脑。使用一对镊子或一把小刮刀取出大脑并将其转移到含有冰冷的4%PFA的管中，并在4°C下孵育过夜。
注意：一定要使用底部平坦的试管，例如7 mL闪烁小瓶，这样大脑就不会楔入管的底部，这可能会压缩组织并改变星形胶质细胞体积。 - 第二天，从管中倒出PFA。向管中加入5毫升1x TBS以冲洗大脑并去除残留的PFA。倒出TBS并重复此过程两次，总共冲洗三次。
- 在TBS中加入4-5 mL 30%蔗糖，并在4°C下孵育大脑1-2天，或直到大脑沉入管底。
注意：大脑一旦沉没就准备好冷冻，但可以在4°C的蔗糖溶液中储存数周。 - 通过将15 mL 100%最佳切割温度（OCT）化合物与TBS中的30 mL 30%蔗糖混合，在50 mL管中制备冷冻培养基。将管子再直立一个小时，以使任何气泡上升到表面。
注意：冷冻培养基可以提前制备并在室温下储存数周。 - 使用血清移液器将冷冻培养基添加到方形包埋模具中（材料表）。注意避免将气泡引入培养基中。对于P21小鼠大脑，3毫升就足够了。根据需要调整不同年龄的音量，使大脑完全淹没。
- 将大脑添加到培养基中，并使用一对#5镊子去除任何可能阻止大脑平放在模具中的脑干。将大脑的前部与模具的一个边缘对齐。
- 将模具转移到用干冰冷却的平坦表面上。装满干冰的金属午餐罐非常适合用于此目的。用干冰颗粒包围模具，以确保缓慢甚至冻结。
- 一旦冷冻介质完全变白和固体，将模具储存在-80°C。
注意：大脑可以在-80°C下储存数年。
2. 旋转
注意：此切片方法旨在与许多不同的市售低温恒温器一起使用。使用此处使用的低温恒温器（材料表），最佳试样头切割温度为-23°C，环境室温度在-23°C至-25°C之间。
注意：低温恒温器刀片非常锋利。操作刀片和操作低温恒温器时要小心。
- 通过在50 mL管中混合25 mL 1x TBS和25 mL甘油来制备切片培养基。最简单的方法是将甘油直接倒入管中并使用管上的标记进行测量。摇晃/涡旋管以混合。该溶液可以在室温下储存数周。
- 通过将每孔2 mL切片培养基加入12孔板来准备收集组织切片。用样品信息标记板的顶部和底部。将板与其他用品（低温恒温器刀片，剃须刀片，卡盘和画笔）一起直接放入低温恒温器中，并让它们适应温度约5分钟。
- 将大脑移入低温恒温器室，让它们与供应一起适应温度。
- 通过用剃须刀片切割模具的两个角并将模具从组织中剥离出来，从模具中取出冷冻的组织块。调整块的方向，使大脑的前部朝上。
- 将OCT添加到卡盘中，使约2/3的卡盘被OCT覆盖，并立即将组织块放在卡盘上，保持上述方向。将块向下按入 OCT 中，使其平放在卡盘表面上。
- 一旦OCT完全冷冻并且组织块牢固到位，将卡盘夹在标本头上。插入低温恒温器刀片，使刀片靠近试样。
- 以100μm的间隔修剪大脑，直到到达感兴趣的大脑区域之前。为了减少溶解在切片培养基中的OCT量，请使用剃须刀片从组织块的侧面修剪多余的冷冻培养基。
- 一旦达到感兴趣的区域，就开始收集100μm厚的部分。使用防滚板收集截面，或者用一只手缓慢推进低温恒温器，另一只手使用画笔将截面从块上引出，因为它与刀片相遇。如果低温恒温器型号有踏板，则使用踏板推进低温恒温器，以便双手可用于引导该部分离开块。
- 使用画笔或镊子将切片转移到12孔板中。每个井至少可以容纳10-12个部分。将切片添加到介质中时，通常将切片的底部边缘接触切片介质并使其部分熔化到介质中而不弄湿刷子或镊子就足够了。如果刷子接触到培养基，请务必用纸巾或纸巾擦干，因为过湿的刷子会使组织切片难以转移。
- 用铝箔或石蜡薄膜包裹板，固定板。确保清楚地标记它，然后将其储存在-20°C。
注意：对于大多数染色方案，切片可以在-20°C下储存至少1-2年，而不会有实质性的信号损失。
3. 免疫染色
注：在设置为约 100 rpm 的轨道平台摇床上进行所有洗涤和孵育。所有步骤均在室温下进行，但一抗孵育除外，其在4°C下进行。 通过将配料在50 mL管中混合并在螺母上混合过夜，提前准备安装介质。避光，在4°C下储存长达2个月。如果内源性荧光信号足以用于成像和分析而不需要免疫染色，则可以跳过步骤3.1-3.9。如果跳过免疫染色，请在TBS中进行三次10分钟的洗涤，然后继续步骤3.10。
- 通过将1 mL 10%Triton-X加入50 mL管中，并用1x TBS将管子填充至50 mL来制备TBST（TBS中0.2%海卫一）的新鲜溶液。
注意：为获得最佳效果，请为每个新的染色实验制作新鲜的TBST，并使用高质量的10%Triton-X水源（材料表）。 - 根据原理图标记24孔板（图1）。将不同的示例放在不同的行中，将不同的解决方案放在不同的列中。在前三列中加入 1 mL TBST（“洗涤 1”、“洗涤 2”和“洗涤 3”）。向第四列中加入1mL封闭溶液。
- 使用本生燃烧器将巴斯德移液器的5.75末端熔化到一个小钩子中，以准备玻璃镐。使用此拾取将组织切片从12孔板转移到24孔板的Wash 1柱中。
注：为获得最佳效果，请在开始染色前对切片进行筛选。为了筛选切片，将切片逐个转移到装有1x TBS的培养皿中，并使用具有5x或10x物镜的荧光显微镜检查切片，以确保存在足够数量的荧光标记细胞。建议每孔染色四到六段，但如有必要，每孔最多可以染色八段。 - 在洗涤1，2和3孔中洗涤切片10分钟，然后在封闭溶液中孵育切片1小时。使用玻璃拾取将部分从一个孔转移到下一个孔。该镐头可用于一次转移多个大脑切片。
- 为每个样品准备1 mL一抗溶液（例如，兔RFP 1：2000或鸡GFP 1：2000）。将抗体加入抗体溶液中，短暂涡旋，然后在4°C下以≥4，000× g 离心5分钟。 在一抗中将切片在4°C下孵育两到三个晚上，同时摇动。
- 一抗孵育后，从洗涤孔中吸取第1天TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新TBST，然后将切片移入第一个洗涤孔中。将各部分清洗 3 次，每次 10 分钟。
注意：对于抽吸，请使用与管道连接的9英寸巴斯德移液器连接到真空瓶。室内真空管路或电动真空泵可用作真空源。 - 在洗涤切片时，通过向抗体溶液中添加抗体（例如，山羊抗兔594或山羊抗鸡488），制备浓度为1：200的二抗溶液。短暂涡旋，然后在4°C下以≥4，000× g 旋转5分钟。
- 在室温下在二抗中孵育切片3小时。在此步骤和所有后续步骤中保护切片免受光照，以减轻二抗的漂白。
- 二抗孵育后，从洗涤孔中吸取第2天TBST，向每个洗涤孔中加入1 mL新TBST，然后将切片移入第一个洗涤孔中。在TBST中洗涤3x切片，每次10分钟。
- 在最后一次洗涤期间，将安装介质从4°C取出，并使其升温至室温。准备1x TBS：dH 2 O的2：1混合物，并将其添加到培养皿中。通过在表面加入800μL的2：1 TBS：dH2O来制备显微镜载玻片。
注：强烈建议使用非固化安装介质。硬化的安装介质可以改变组织的体积，这可能混淆星形胶质细胞区域体积的分析。材料表中提供了简单而廉价的自制安装介质 的配方。 - 使用细画笔，将切片一次一个地从洗涤3孔转移到培养皿中。此步骤将去除海卫一，并帮助各部分变平。接下来，将培养皿中的部分转移到载玻片上的液体中。
- 使用画笔帮助排列各部分，使它们平放在幻灯片上。用P1000移液管小心地从载玻片中取出多余的液体，然后进行真空抽吸。
注意：在巴斯德移液器的末端添加一个 P200 移液器吸头，以便更好地控制真空吸吸。 - 从载玻片中取出所有多余的液体后，使用转移移液器立即向每个部分添加一滴安装介质，并在载玻片上轻轻地铺上盖玻片。让安装介质扩散几分钟，然后通过真空抽吸从盖玻片下取出的任何多余的安装介质。
注：在添加安装介质之前，请勿让切片干燥。如果在添加镶样介质之前切片开始干燥，这可能会影响组织体积并阻碍准确的数据收集。 - 用透明指甲油密封盖玻片的所有四个边缘。让载玻片在室温下干燥30分钟，然后将其平放在4°C。 等待至少2小时，然后再成像，或者第二天成像。
注意：用抗GFP和RFP抗体染色的部分可以在成像前储存长达2周，前提是它们用指甲油完全密封。
4. 共聚焦成像
注意：该协议提供了广泛适用于不同共聚焦显微镜的一般图像采集指南，而不是特定共聚焦和软件界面的特定细节。
- 使用10倍物镜定位单个细胞进行成像，注意与实验相关的特定大脑区域或子区域（例如，视觉皮层的第5层）。使用聚焦旋钮尝试确定整个星形胶质细胞是否包含在该部分中。
- 切换到更高放大倍率的油物镜（例如，40x、60x或63x），使细胞聚焦。通过目镜观察时，使用对焦旋钮从细胞的顶部移动到底部。
- 目视检查单元格，以确保整个单元格都包含在该部分中。如果单元格突然失焦并在该部分的边缘被切断，请排除此单元格并找到另一个单元格。
- 使用共聚焦显微镜的相关采集软件，调整采集参数以获得适当的信噪比和细节水平（512 x 512分辨率将为区域分析提供足够的细节，并将减少图像采集时间）。如果使用 40 倍物镜，则使用 2 倍变焦，如果使用 60 倍或 63 倍物镜，则不进行变焦。
- 设置 z 堆栈的上限和下限。为了确保整个星形胶质细胞被捕获，z-stack的第一个和最后一个图像不应包含细胞的任何荧光标记。为了获得充分的采样，请使用0.5μm的步长。
5. 图像分析
注意：该协议描述了使用市售图像分析软件（即Imaris，参见 材料表）执行图像分析的步骤。该软件的其他版本可用于对工作流程进行细微修改。此协议还要求 MATLAB 运行凸壳 XTension 文件（补充文件）。
- 在开始分析之前，通过将凸壳 XT 结构文件粘贴到 XT 文件夹的 rtmatlab 子文件夹中来安装该文件。
- 使用伊玛里斯文件转换器将图像转换为“.ims”格式。在图像分析软件中打开图像文件，然后通过选择 3D 视图按钮以 3D 查看模式查看图像 。
- 在分析之前，检查单元格以确保其符合包含条件。
- 确保整个单元格都存在于图像中（即，不应从图像中剪切出单元格的任何部分）。旋转图像以检查前边缘和后边缘。
- 确保细胞只有一个细胞体。单击 切片按钮， 拖动屏幕左侧的光标以在 z 堆栈中移动，并验证标记的单元格是否只包含一个单元格正文。
- 确保有一个单独的星形胶质细胞可以与任何标记具有相同颜色的相邻星形胶质细胞区分开来。
- 创建曲面
- 再次选中 “3D 视图 ”按钮后，通过单击蓝色的“ 添加新曲面”图标来创建新曲面 。
- 在软件窗口左下角显示的“创建”选项卡中，确保仅选中“算法设置”的“仅分割感兴趣区域”和“对象-对象统计信息”框，并且未选中“创建首选项”的“使用切片器视图开始创建”框。单击蓝色箭头继续。
注意：如果目标细胞以外的图像中没有额外的荧光信号，则可能不需要感兴趣区域。在这种情况下，请保持仅 对感兴趣区域 进行未选中状态，然后继续执行步骤 5.4.3。
- 在软件窗口左下角显示的“创建”选项卡中，确保仅选中“算法设置”的“仅分割感兴趣区域”和“对象-对象统计信息”框，并且未选中“创建首选项”的“使用切片器视图开始创建”框。单击蓝色箭头继续。
- 通过在“曲面创建”工具的“大小”下的框中输入尺寸，或拖动黄色框的边缘，在单元格周围创建感兴趣的区域（图 2A）。单击蓝色箭头继续。
- 从下拉列表中选择正确的 源通道 进行分析（例如，通道1或包含荧光细胞填充的通道）。“ 曲面详细信息 ”框中的值由软件根据图像采集参数确定。确保此值对于实验中的所有样品保持恒定。单击 蓝色箭头 继续。
- 通过拖动黄色条或在框中输入值来调整 阈值（绝对强度）， 以便灰色表面填充尽可能多的单元格信号，而不会超出单元格的边界。在表面边缘可以看到少量荧光信号（图2B）。单击 蓝色箭头 继续。
- “曲面创建”工具的最后一个面板设置最小质量值，即软件的默认阈值下限值。在下拉列表中，确保选中“体素数 Img=1”。检查是否只有“下限阈值”的左侧电源按钮为绿色（活动）;右侧电源按钮应为红色（非活动）。软件将“阈值下限”默认为 10。保持此值不变，然后单击绿色箭头以完成曲面的生成。
- 仔细检查新生成的表面。删除不属于单元格的任何曲面块，方法是选择它们，单击铅笔 编辑 工具，然后单击“ 删除 ”选项。
- 通过单击漏斗过滤器图标以全选，单击铅笔“编辑”图标，然后单击“统一”选项（图2C），统一剩余的表面部分。
注意：对于较大的映像文件，软件可能会在此协议的后续步骤中偶尔崩溃。此时保存文件是个好主意。
- 再次选中 “3D 视图 ”按钮后，通过单击蓝色的“ 添加新曲面”图标来创建新曲面 。
- 在靠近表面的地方生成斑点
- 单击橙色的“添加新广告点”图标。选中新 Spot（例如，“Spot 1”）后，在“创建”选项卡中，确保仅选中“算法设置”的“对象-对象统计信息”框，而未选中“创建首选项”的“使用切片器视图开始创建”框。单击蓝色箭头继续。
- 从下拉列表中选择正确的 源通道 （例如，通道 1），然后在框中输入 估计 XY 直径 值 0.400 μm。确保仅选中“ 背景减法 ”框。单击 蓝色箭头 继续。
注：0.400 μm 适用于使用 63x、60x 或 40x 物镜的 1024 x 1024 或 512 x 512 图像。对于其他成像条件，必须根据成像条件确定直径，并在所有分析过程中保持恒定。适当的值将创建足够的斑点来覆盖所有正信号，但不会在背景信号上添加斑点。 - “创建点”工具的最后一个面板设置最小质量值，这是软件的默认阈值下限值;确保该值保持不变，除非斑点的位置/分布存在明显差异（例如，由于染色质量较差）。单击绿色箭头以完成点的创建。
- 若要更好地查看斑点，请通过选择“曲面”并单击“多色颜色”工具来更改曲面的透明度。在“材料”下，选择使表面足够透明的材料，以查看整个单元格中的斑点（列表中倒数第四种材料）（图 2D，E）。
- 重新选择 “点”，单击“ 过滤器 ”图标，然后从下拉列表中选择“ 到曲面的最短距离”曲面=曲面 X，其中“曲面 X”是要分析的曲面（例如曲面 1）。确保 “阈值下限” 和 “阈值上限” 电源按钮均为绿色（活动）。
- 在下阈值框中输入-1.0μm的 最小距离 （斑点与表面内部的距离）， 在上限阈值 框中输入0.1μm（与外部的距离） 的最大距离 。 单击“ 复制所选内容以新建点 ”按钮以完成生成靠近曲面的点。
注：最小和最大距离值可能因不同的图像采集参数（如物镜、变焦和分辨率）而异。这些数字必须根据经验来确定。透明表面有助于判断这些值是否捕获了准确表示表面形状的所有点。
- 在下阈值框中输入-1.0μm的 最小距离 （斑点与表面内部的距离）， 在上限阈值 框中输入0.1μm（与外部的距离） 的最大距离 。 单击“ 复制所选内容以新建点 ”按钮以完成生成靠近曲面的点。
- 生成凸面船体并收集区域测量值
- 确保在软件窗口的左上角面板中选择了新创建的 点 （例如，“点 1 选择 ['最短距离...]”）。单击齿轮 工具 图标，然后单击 凸壳 插件。仅单击插件一次，然后等待MATLAB窗口出现然后消失（这可能需要几秒钟）。实体船体将出现在 3D 视图中。
- 在左上图面板中，选择 “点 X 选择凸船体”[“最短距离...”），其中“点 X 选择”是新创建的点（例如，“点 1 选择”），然后单击 船体 进行选择（图 2F）。
- 单击图形 “统计信息” 图标，选择“ 选择 ”选项卡，确保从顶部下拉列表中选择“ 特定值 ”，然后从底部下拉列表中选择“音量”。记录船体的体积。 保存 文件并继续下一个图像。
- 测量具有不同荧光标记的相邻细胞的区域重叠体积
注意：如果样品含有表达不同荧光标记的相邻星形胶质细胞（例如，星形胶质细胞1仅表达GFP，星形胶质细胞2仅表达RFP），则可以使用该方案的这一部分。该标记是使用病毒或遗传策略实现的，如前所述9，10 （图3A）。- 使用步骤5.4-5.6中详述的步骤，为每个星形胶质细胞创建表面，靠近表面的斑点和凸壳（图3B）。
- 选择 “点 1 个选区的凸壳... ”后，单击铅笔“ 编辑” 图标，然后单击“ 蒙版选择”。在“ 掩码通道 ”窗口中，确保已选中 通道 1 （或表示星形胶质细胞 1 的通道），并确保已选中 应用掩码选项之前重复通道 旁边的框。单击 “确定” 以创建 通道“蒙版 CH1”。
- 与 凸壳的斑点2选择... 选择后，单击铅笔 编辑 图标，然后单击 蒙版选择。在 “掩码通道 ”窗口中，从下拉菜单中选择通道 2 （或表示星形胶质细胞 2 的通道），并确保已选中 应用掩码选项之前重复通道 旁边的框。单击 “确定” 以创建 通道“屏蔽CH2 ”（图3C）。
- 单击屏幕顶部的 Coloc 按钮，然后使用 Coloc 工具创建两个屏蔽通道的协同本地化通道。将 通道A 设置为 通道3 - 屏蔽CH1 和 通道B 至 通道4 - 屏蔽CH2 （图3D）。
- 将两个通道的黄色 直方图条 向左拖动。使用下面的 切片视图 观察共定位信号，该信号将以灰色显示。请注意，由于两个细胞的荧光信号实际上不是共定位的，因此 需要将阈值 向左移动，以便错误的共定位开始出现在细胞 - 细胞接触点。
- 单击右侧的 “构建 Coloc 通道 ”以完成该过程。单击 3D 视图 以返回到标准 3D 视图。 共置结果 通道现在将以灰色显示，并显示在显示调整框中。
- 使用5.4-5.7中描述的步骤创建曲面，靠近表面的点以及 共定位结果 通道的凸壳（图3E，F）。
- 记录凸起船体的体积。这是区域重叠体积。将此数字除以其中一个星形胶质胶质细胞的面积体积，以计算领土重叠的百分比。选择对照型或野生型星形胶质细胞，如果其中一个星形胶质细胞相对于另一个星形胶质细胞进行遗传操纵。
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Representative Results
图1给出了该协议的主要步骤和工作流程的示意图。 图2 显示了使用图像分析软件生成表面，生成靠近表面的斑点并生成凸起船体的关键步骤的屏幕截图。 图3 演示了该技术在确定星形胶质胶质细胞区域重叠/平铺中的应用。在 图4中，先前发表的手稿9 的代表性结果证明了该协议的应用。在 图4A 和 图4B中，敲低富含星形胶质细胞的细胞粘附分子hepaCAM显著减小星形胶质细胞的面积体积。在 图4C 和 图4D中，使用双标记的马赛克分析（MADM）将稀疏马赛克标记和并发遗传修饰引入小鼠皮层。使用MADM，产生小鼠，其中野生型星形胶质细胞表达红色荧光蛋白（RFP）， 而赫帕卡姆 敲除星形胶质细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。使用上述方案，计算相邻RFP和GFP星形胶质胶质细胞对（WT：KO）之间的区域重叠百分比。作为对照，将其与没有 肝豆（ WT：WT）遗传修饰的小鼠中的相邻RFP和GFP星形胶质细胞对进行比较。与WT：WT星形胶质胶质细胞对相比，WT：KO星形胶质细胞对的面积重叠体积百分比显着增加。总的来说，这些结果表明，hepaCAM是正常星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺所必需的。
图1：分析星形胶质细胞区域体积的工作流程概述 （A）该方案需要一只具有稀疏或马赛克荧光标记星形胶质细胞的小鼠。（B）将小鼠灌注，然后切除，处理和冷冻大脑。（C）使用低温恒温器对冷冻的大脑进行切片，并（D）收集自由漂浮的组织切片。（E）切片后，通过免疫组化对漂浮组织切片进行染色，然后将（F）安装到载玻片上。（G）使用共聚焦显微镜对安装的组织切片内的星形胶质胶质细胞进行成像。（H）最后，使用图像分析软件对成像细胞的面积体积进行量化。 请点击此处查看此图的大图。
图2：星形胶质细胞区域体积的图像分析过程中的关键步骤 （A）具有感兴趣区域框的细胞视图，该框从分析过程中排除了图像中的其他信号。（B） 使用信号（红色）的表面创建（灰色）的可接受相对阈值。（C） 选定主单元格的已完成曲面（黄色）。曲面中不是单元格的其他部分将被删除（红色）。（D） 具有斑点的半透明表面。（E）半透明表面的特写，创建斑点以显示相对于表面的可接受的斑点分布。（F） 最终凸起的船体。比例尺 = 20 μm .请点击此处查看此图的大图。
图3：星形胶质细胞领域的关键步骤重叠分析（A）表达不同荧光标记物GFP（绿色）和RFP（洋红色）的两个星形胶质细胞的代表性图像。（B）为每个星形胶质细胞生成凸壳。（C） 已屏蔽的 GFP 和 RFP 通道的视图，并删除了原始通道。（D） 使用“共定位”工具创建“共定位结果”通道的阈值示例。“共定位”信号以灰色显示。（E） 两个屏蔽通道的视图。（F） “共定位结果”通道（灰色）凸壳的旋转视图，表示区域重叠体积。比例尺 = 20 μm.请点击此处查看此图的大图。
图4：成功应用该方案测量星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞区域重叠（A）在出生后第21天野生型CD1小鼠的视觉皮层中的星形胶质细胞，表达mCherry-CAAX（青色）和对照shRNA（shScramble）或靶向hepaCAM（shHepacam）的shRNA。星形胶质细胞区域以红色勾勒。（B）肝CAM的丧失显着减少星形胶质细胞的体积。数据点表示单个鼠标平均值。误差线± s.e.m. 嵌套 t 检验。（C）出生后第21天小鼠皮层中表达GFP（绿色）或RFP（品红色）的相邻星形胶质细胞。在MADM9 WT：WT小鼠中，两个星形胶质细胞都是野生型。在MADM9 WT：KO小鼠中，绿色星形胶质细胞是野生型，洋红色星形胶质细胞对赫帕卡姆是空的。区域重叠体积以蓝色显示。（马德姆9 重量：分子量：马德姆9埃姆斯-克雷Tg/0;赫帕卡姆+/+。红豆蔻9 基因型： 红豆蔻9埃姆斯-克雷Tg/0;赫帕卡姆+/-）。（D） 量化领土体积重叠的百分比。数据点表示单个鼠标平均值。误差线± s.e.m. 嵌套 t 检验。比例尺 = 20 μm。图中的面板经出版商许可转载自鲍德温等人9。请点击此处查看此图的大图。
补充文件。请按此下载此档案。
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Discussion
该协议描述了一种用于分析小鼠皮层中星形胶质细胞区域体积和星形胶质细胞平铺的既定方法，详细介绍了从灌注开始并以图像分析结束的所有主要步骤。该协议要求在稀疏或马赛克的星形胶质细胞群中表达荧光蛋白的小鼠的大脑。除此要求外，任何年龄的小鼠都可以用于该方案，只需对灌注设置和添加到包埋模具中的冷冻介质体积进行微小的调整。虽然已经发表了用于分析脑组织切片中星形胶质细胞分支复杂性和体积的其他方法7，11，但该方案具有几个独特的优点。首先，该协议描述了可用于获得星形胶质细胞区域体积的自定义代码。星形胶质细胞区域体积是与星形胶质细胞体积不同的测量方法，因为它测量星形胶质细胞占据的整个空间，而不管其分支复杂性如何。此外，该协议描述了如何应用星形胶质细胞区域体积测量来测量星形胶质细胞区域重叠体积，从而测量星形胶质细胞的平铺行为。最后，该方案详细讨论了可能影响星形胶质细胞区域体积和数据收集的潜在变量，包括安装条件、样品储存条件以及用于成像和分析的包含和排除标准。除了这些独特的功能外，该方案的许多方面，包括自由浮动切片的灌注，冷冻切片和免疫染色，可以广泛应用于不同厚度和不同抗体组合的脑组织切片染色。下面将详细讨论关键步骤、重要注意事项、故障排除和限制。
样品采集注意事项
对于旨在研究星形胶质细胞形态的实验，一个非常重要的考虑因素是保持一天中一致的样本收集时间。越来越多的证据表明，星形胶质细胞的功能状态与昼夜节律和睡眠行为有关14.为了消除在一天中的不同时间收集样品可能引入的任何变异性，应计划灌注，以便在一天中大致相同的时间，在2-3小时的时间范围内收集用于实验的所有样品。对于持续的灌注，强烈建议使用蠕动泵。在TBS中添加肝素有助于减少血栓的形成。虽然该方案尚未经过较短的固定后时间的测试，但可能不需要固定后过夜，并且可以考虑较短的固定后4小时。
冷冻切片疑难解答提示
在2：1蔗糖：OCT冷冻培养基中冷冻大脑可减少切片后收集孔中的OCT量。冷冻时，冷冻介质的行为类似于OCT本身，但脆性较小。将纸巾块冷冻到卡盘上时，确保在将OCT添加到卡盘后立即将其平压在卡盘上。如果在切片过程中组织块从卡盘上脱落，请使用剃须刀片在底部切割新的平坦表面并重新冻结到卡盘上。在添加OCT并确保卡盘清洁干燥之前，给卡盘足够的时间冷却到低温恒温器室温度将提高附着力。当用画笔移动组织切片时，将画笔触摸到该部分的角边缘，这样它就是触摸OCT而不是组织本身。有了一点点水分，该部分就会粘在刷子上。通过将切片的另一边缘接触培养基并使其被拉入培养基中，轻轻地将组织放入切片培养基中。如果刷子接触到冷冻介质，请在低温恒温器内的纸巾上擦拭。太湿的刷子会使切片难以转移到盘子上。一旦将组织切片放入切片培养基中，OCT应溶解。否则，低温恒温器室温度可能太低。
染色和安装组织切片的重要注意事项
为了提高染色质量，请在每次实验前准备新的TBST。使用高质量的10%水曲拉通源（材料表）。选择与产生二抗的物种相匹配的血清（例如，将山羊血清用于山羊抗兔二级）。抗体溶液在使用前离心，以沉淀和除去任何沉淀的抗体。在将抗体溶液从管中转移到板时，请注意不要干扰沉淀（这可能意味着每孔移液略少于1mL的抗体溶液，并且不要用移液器尖端接触管的底部）。此步骤有助于减少背景染色。当将部分放置在TBS：dH2O中时，大多数会展开/解开，但有些可能会保持折叠或扭曲。使用刷子将切片转移到载玻片上时，另一只手使用 P200 吸头帮助将组织切片引导到适当的位置。使用刷子轻轻展开或解开部分，使其平放。当液体被移除时，切片倾向于向吸液器移动。吸气时，使用 P200 吸头将移动部分保持在适当的位置。在所有多余的液体被去除后，在各段有时间干燥之前，必须立即将安装介质添加到各段。即使允许切片干燥几分钟，也会极大地影响切片内细胞的体积。将安装介质添加到载玻片后，使用移液器去除任何可见的气泡。添加盖玻片后，请确保从侧面去除多余的安装介质，因为这会干扰指甲油干燥的能力。让指甲油在室温下干燥。等待至少2小时或直到第二天对切片进行成像，以确保安装介质有足够的时间完全穿透厚切片。
对完全星形胶质细胞进行成像
当对星形胶质胶质细胞进行区域体积分析时，图像捕获星形胶质细胞的整个体积至关重要。组织切片中许多标记的星形胶质细胞将是不完整的星形胶质细胞。完整的星形胶质细胞将完全包含在组织部分。要识别完整的星形胶质细胞，请从星形胶质胶质细胞中间的焦点开始。使用聚焦旋钮移动到星形胶质胶质细胞的顶部。当星形胶质细胞不再聚焦时，组织的其他特征应保持聚焦。对星形胶质细胞的底部重复此过程。不要对不完整的星形胶质细胞进行成像。由于切片的厚度，抗体渗透在切片中间不那么强大。星形胶质细胞外缘周围的标记可能较强，而中心标记较弱。这是通常观察到的，不会影响区域分析。
图像分析提示
该协议的图像分析部分最重要的考虑因素是确保凸壳仅代表一个星形胶质细胞。每次都遵循包含和排除标准。有时两个星形胶质细胞的细胞体会彼此非常接近。这可能很难在 3D 视图中识别，但可以使用切片视图进行识别。如果有其他荧光标记的星形胶质细胞接触感兴趣的星形胶质细胞，这可能会使表面创建过程复杂化。如果两个像元之间有相当清晰的边界可见（例如，它们仅在一个小分支点处连接），则可使用修剪工具在曲面中进行切口，并且可以删除曲面的这一部分。创建曲面后，在 3D 视图中旋转单元格以检查可能隐藏在单元格后面但不是单元格一部分的小块表面。请先删除这些内容，然后再继续。如果凸起的船体急剧突出到星形胶质细胞区域外的点，则可能有一块非细胞表面未被移除。如果软件在曲面创建过程中经常崩溃，则可以减少曲面细节数。如果在创建光斑期间崩溃，请使用感兴趣区域仅在表面对象附近创建光斑。
协议的限制
虽然该协议有许多用途和优点，但也存在一些限制。该协议要求已经在稀疏的星形胶质细胞群中表达荧光蛋白的小鼠，但没有描述在星形胶质细胞中引入荧光蛋白表达的方法。成像和分析管道非常耗时，不适合高通量分析。此外，它们专门用于测量星形胶质细胞的面积体积和平铺，而不是定义单个星形胶质细胞的详细形态特征。其他人可能会发现将该方案的方法和策略与最近发布的方案相结合是有用的，这些方案详细介绍了测量星形胶质细胞形态复杂性的方法7，11。最后，该协议中使用的商业软件平台（即Imaris和MATLAB）价格昂贵，需要许可证才能使用。虽然大型机构经常购买这些软件平台的许可证，但对于小型机构和单个实验室来说，这可能是成本过高的。显微镜、开源图像分析软件和机器学习算法的进步可能有助于使该协议被所有实验室广泛使用，也可能提高图像采集和分析的效率。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
显微镜检查在UNC神经科学显微镜核心（RRID：SCR_019060）进行，部分由NIH-NINDS神经科学中心支持资助P30 NS045892和NIH-NICHD智力和发育障碍研究中心支持资助U54 HD079124资助。图 1 是使用 BioRender.com 创建的。图 4 中的图像和数据是在出版商的许可下从以前的出版物9 转载而来的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
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