Este protocolo describe métodos para seccionar, teñir e obtener imágenes de secciones de tejido flotantes del cerebro del ratón, seguidos de una descripción detallada del análisis del volumen del territorio de los astrocitos y la superposición o mosaico del territorio de los astrocitos.
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Artículo de método
Análisis del volumen del territorio de astrocitos y mosaicos en secciones gruesas de tejido de flotación libre
En este artículo
Resumen
Resumen
Los astrocitos poseen un asombroso grado de complejidad morfológica que les permite interactuar con casi todos los tipos de células y estructuras dentro del cerebro. A través de estas interacciones, los astrocitos regulan activamente muchas funciones cerebrales críticas, incluida la formación de sinapsis, la neurotransmisión y la homeostasis iónica. En el cerebro de los roedores, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad durante las primeras tres semanas postnatales y establecen territorios distintos y no superpuestos para alicatar el cerebro. Este protocolo proporciona un método establecido para analizar el volumen del territorio de los astrocitos y el mosaico de astrocitos utilizando secciones de tejido que flotan libremente del cerebro del ratón. En primer lugar, este protocolo describe los pasos para la recolección de tejidos, la criosecciona y la inmunotinción de secciones de tejido que flotan libremente. En segundo lugar, este protocolo describe la adquisición de imágenes y el análisis del volumen del territorio de los astrocitos y el volumen de superposición del territorio, utilizando el software de análisis de imágenes disponible comercialmente. Por último, este manuscrito discute las ventajas, consideraciones importantes, trampas comunes y limitaciones de estos métodos. Este protocolo requiere tejido cerebral con marcado fluorescente escaso o mosaico de astrocitos, y está diseñado para ser utilizado con equipos de laboratorio comunes, microscopía confocal y software de análisis de imágenes disponible comercialmente.
Introducción
Los astrocitos son células elaboradamente ramificadas que realizan muchas funciones importantes en el cerebro1. En la corteza del ratón, las células madre gliales radiales dan lugar a astrocitos durante las etapas embrionaria tardía y postnatal temprana2. Durante las tres primeras semanas postnatales, los astrocitos crecen en tamaño y complejidad, desarrollando miles de ramas finas que interactúan directamente con las sinapsis1. Al mismo tiempo, los astrocitos interactúan con los astrocitos vecinos para establecer territorios discretos y no superpuestos para alicatar el cerebro3<....
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Protocolo
Todos los ratones se utilizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill y la División de Medicina Comparada (número de protocolo IACUC 21-116.0). Se utilizaron ratones de ambos sexos en el día postnatal 21 (P21) para estos experimentos. Los ratones CD1 se obtuvieron comercialmente (Tabla de Materiales), y los ratones MADM9 WT:WT y MADM9 WT:KO fueron descritos previamente9.
NOTA: Este protocolo requiere cerebros con expresión de proteínas fluorescentes en una población escasa de astrocitos. La expresión de prote....
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Resultados
La Figura 1 presenta un esquema esquemático de los principales pasos y flujo de trabajo para este protocolo. La Figura 2 muestra capturas de pantalla de pasos clave utilizando el software de análisis de imágenes para generar una superficie, generar manchas cerca de la superficie y generar un casco convexo. La Figura 3 demuestra la aplicación de esta técnica para determinar la superposición/mosaico del territorio de los astrocitos. E.......
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Discusión
Este protocolo describe un método establecido para analizar el volumen del territorio de astrocitos y el mosaico de astrocitos en la corteza del ratón, detallando todos los pasos principales que comienzan con la perfusión y terminan con el análisis de imágenes. Este protocolo requiere cerebros de ratones que expresan proteínas fluorescentes en una población escasa o en mosaico de astrocitos. Fuera de este requisito, se pueden usar ratones de cualquier edad para este protocolo, con solo ajustes menores en la configuración.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
La microscopía se realizó en el NÚCLEO de Microscopía de Neurociencia de la UNC (RRID: SCR_019060), apoyado en parte por la subvención de apoyo del Centro de Neurociencia NIH-NINDS P30 NS045892 y la subvención de apoyo del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo NIH-NICHD U54 HD079124. La Figura 1 se creó con BioRender.com. Las imágenes y los datos de la Figura 4 se reimprimen de una publicación anterior9 con permiso del editor.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #5 pinzas | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Jeringa | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (solución salina tamponada tris) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl a pH 7.4, dH2O a 1 L; almacenar a temperatura ambiente (RT) | ||
| Placa de 12 pocillos | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; almacenar en RT | ||
| 1x TBS + Heparina | 28.2 mg Heparina + 250 mL 1x TBS; almacenar en 4 & grados; C | ||
| Placa de 24 pocillos | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sacarosa en TBS | 15 g de sacarosa, 1x TBS a 50 mL; almacenar a 4 & grados; C | ||
| 4% de PFA (paraformaldehído) en TBS | PFA, 4-6 gránulos de NaOH, 100 mL 10x TBS, dH2O a 1 L; almacenar a 4 & grados; C | ||
| Avertin | 0,3125 g de tri-bromoetanol, 0,625 mL de metilbutanol, dH2O a 25 mL; almacenar a 4 & grados; C; desechar 2 semanas después de hacer | ||
| el bloqueo y tampón | 10% suero de cabra en TBST; almacenar a 4 & grados; C | ||
| Ratones CD1 | Charles River | 022 | |
| Frasco de colección para cerebros | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Software de adquisición confocal | Olympus | FV31S-SW | |
| Microscopio confocal | Olympus | FV3000RS | |
| Cubreobjetos | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cuchilla de criostato | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Molde de incrustación | Polysciences | 18646A-1 | |
| Medio de congelación | 2:1 30% sacarosa:OCT; almacenar en RT | ||
| GFP anticuerpo | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glicerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Cabra anti-pollo 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Cabra anti-conejo 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Suero de cabra | Gibco | 16210064 | |
| Heparina | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Ácido clorhídrico | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Versión 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A Lata | |
| almuerzo de metal | AQUARIUS | N/A | de Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Metilbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Tijeras de Disección | Roboz | RS-5921 | |
| Medio de montaje | 20 mM Tris pH 8.0, 90% glicerol, 0.5% N-galato de propilo; tienda a 4 ° C; Hasta 2 meses | ||
| Esmalte de uñas | VWR | 100491-940 | |
| N-galato de propilo | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Aceite | Olympus | IMMOIL-F30CC | Específico para microscopio/objetivo |
| Tijeras de operación 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Agitador de plataforma orbital | Fisher Scientific 88861043 | Velocidad mínima necesaria: 25 rpm | |
| Pincel | Bogrinuo | N/A | de Amazon, "Pinceles de Detalle - Pinceles en miniatura" |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipeta Pasteur (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pipeta Pasteur (9") | VWR | 14672-380 | |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Hoja de afeitar | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP anticuerpo | Rockland | 600-401-379 | |
| Medio | 1:1 glicerol:1x TBS; almacenar en RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Criloide de sodio | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton en 1x TBS; almacenar en RT | ||
| Pipeta de transferencia | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hidroximetil)aminometano | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 ( de alta calidad) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension proporcionar como material complementario |
Referencias
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
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Reimpresiones y permisos
