Summary
Этот протокол описывает методы секционирования, окрашивания и визуализации свободно плавающих участков тканей мозга мыши с последующим подробным описанием анализа объема территории астроцитов и перекрытия территории астроцитов или облицовки.
Abstract
Астроциты обладают поразительной степенью морфологической сложности, которая позволяет им взаимодействовать почти с каждым типом клеток и структур в мозге. Благодаря этим взаимодействиям астроциты активно регулируют многие критические функции мозга, включая образование синапсов, нейротрансмиссию и ионный гомеостаз. В мозге грызунов астроциты растут в размерах и сложности в течение первых трех послеродовых недель и создают четкие, не перекрывающиеся территории, чтобы выложить черепицу мозга. Этот протокол обеспечивает установленный метод анализа объема территории астроцитов и облицовки астроцитов с использованием свободно плавающих участков ткани из мозга мыши. Во-первых, этот протокол описывает этапы сбора тканей, криосечения и иммуноокрашения свободно плавающих участков тканей. Во-вторых, этот протокол описывает получение и анализ изображений объема территории астроцитов и объема перекрытия территории с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Наконец, в этой рукописи обсуждаются преимущества, важные соображения, общие подводные камни и ограничения этих методов. Этот протокол требует мозговой ткани с разреженной или мозаичной флуоресцентной маркировкой астроцитов и предназначен для использования с общим лабораторным оборудованием, конфокальной микроскопией и коммерчески доступным программным обеспечением для анализа изображений.
Introduction
Астроциты представляют собой тщательно разветвленные клетки, которые выполняют многие важные функции в мозге1. В коре головного мозга мышей радиальные глиальные стволовые клетки дают начало астроцитам во время поздней эмбриональной и ранней постнатальной стадий2. В течение первых трех послеродовых недель астроциты растут в размерах и сложности, развивая тысячи тонких ветвей, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами1. Одновременно астроциты взаимодействуют с соседними астроцитами, чтобы установить дискретные, неперекрывающиеся территории для плитки мозга3, сохраняя при этом связь через каналы щелевого соединения4. Морфология и организация астроцитов нарушаются во многих болезненных состояниях после инсульта или травмы5, что указывает на важность этих процессов для правильной работы мозга. Анализ морфологических свойств астроцитов во время нормального развития, старения и заболевания может дать ценную информацию о биологии и физиологии астроцитов. Кроме того, анализ морфологии астроцитов после генетических манипуляций является ценным инструментом для распознавания клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют установлением и поддержанием морфологической сложности астроцитов.
Анализ морфологии астроцитов в мозге мыши осложняется как сложностью ветвления астроцитов, так и астроцитарной плиткой. Окрашивание антител с использованием промежуточной нити глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в качестве астроцит-специфического маркера захватывает только основные ветви и значительно недооценивает морфологическую сложность астроцитов1. Другие клеточные маркеры, такие как транспортер глутамата 1 (GLT-1; slc1a2), глютаминсинтетаза или S100β, лучше маркируют ветви астроцитов6, но создают новую проблему. Астроцитарные территории в значительной степени не перекрываются, но небольшая степень перекрытия существует на периферических краях. Из-за сложности ветвления, когда соседние астроциты помечены одним цветом, невозможно различить, где заканчивается один астроцит и начинается другой. Разреженная или мозаичная маркировка астроцитов эндогенными флуоресцентными белками решает обе проблемы: флуоресцентный маркер заполняет клетку, чтобы захватить все ветви и позволяет визуализировать отдельные астроциты, которые можно отличить от их соседей. Несколько различных стратегий были использованы для достижения разреженной флуоресцентной маркировки астроцитов с генетическими манипуляциями или без них, включая вирусную инъекцию, плазмидную электропорацию или трансгенные линии мыши. Подробная информация о выполнении этих стратегий описана в ранее опубликованных исследованиях и протоколах 1,7,8,9,10,11,12,13.
В данной статье описан метод измерения объема территории астроцитов из мозга мыши с флуоресцентной маркировкой в разреженной популяции астроцитов (рисунок 1). Поскольку средний диаметр астроцита в коре головного мозга мыши составляет примерно 60 мкм, для повышения эффективности захвата отдельных астроцитов в их совокупности используются участки толщиной 100 мкм. Иммуноокрашивание не требуется, но рекомендуется для усиления эндогенного флуоресцентного сигнала для конфокальной визуализации и анализа. Иммуноокрашивание может также позволить лучше обнаруживать тонкие ветви астроцитов и уменьшать фотоотбеливание эндогенных белков во время получения изображения. Для улучшения проникновения антител в толстые срезы и для сохранения объема ткани от разрезания с помощью визуализации используются свободно плавающие участки тканей. Анализ объема территории астроцитов выполняется с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Дополнительно в этом протоколе описан метод анализа астроцитарной плитки в участках тканей с мозаичной маркировкой, где соседние астроциты экспрессируют различные флуоресцентные метки. Этот протокол был успешно использован в нескольких недавних исследованиях 1,8,9 для характеристики роста астроцитов во время нормального развития мозга, а также влияния генетических манипуляций на развитие астроцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши использовались в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл и Отделом сравнительной медицины (протокол IACUC No 21-116.0). Мыши обоих полов на 21-й послеродовой день (P21) были использованы для этих экспериментов. Мыши CD1 были получены коммерчески (Таблица материалов), а мыши MADM9 WT:WT и MADM9 WT:KO были описаны ранее9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует мозга с флуоресцентной экспрессией белка в разреженной популяции астроцитов. Флуоресцентная экспрессия белка может быть введена генетически, вирусно или путем электропорации. Подробности способов разреженной маркировки астроцитов описаны в ранее опубликованных исследованиях и протоколах 1,7,8,9,10,11,12,13.
1. Сбор и подготовка тканей
ВНИМАНИЕ: Параформальдегид (PFA) является опасным химическим веществом. Выполните все шаги с PFA в химическом вытяжном шкафу.
- Обезболивать мышей инъекционным анестетиком (например, Авертином; 0,8 мг/кг) и обеспечивать глубину анестезии щипцом пальца ноги. Используйте перистальтический насос для выполнения внутрисердечной перфузии ледяным трис-буферным физиологическим раствором (TBS) + гепарин со скоростью ~ 3 мл / мин до тех пор, пока печень не станет чистой (обычно 3-5 мин), с последующим ледяным холодным 4% PFA в TBS со скоростью ~ 3 мл / мин в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока и время оптимизированы для мышей послеродового дня 21 (P21). Корректировка скорости потока и времени перфузии может потребоваться для мышей разного возраста. - После перфузии используйте пару операционных ножниц, чтобы отсоединить голову и удалить кожу, чтобы обнажить череп. Затем используйте пару микро-рассекающих ножниц, чтобы удалить верхнюю часть черепа, чтобы обнажить мозг. Используйте пару щипцов или небольшой шпатель, чтобы удалить мозг и перенести его в трубку, содержащую ледяные 4% PFA, и инкубировать в течение ночи при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте трубку с плоским дном, например, сцинтилляционный флакон объемом 7 мл, чтобы мозг не заклинивался в нижней части трубки, что могло бы сжать ткань и изменить объем астроцитов. - На следующий день вылейте PFA из трубки. Добавьте 5 мл 1x TBS в трубку, чтобы промыть мозг и удалить остаточный PFA. Вылейте TBS и повторите этот процесс еще два раза, в общей сложности три полоскания.
- Добавьте 4-5 мл 30% сахарозы в TBS и инкубируйте мозг при 4 °C в течение 1-2 дней или до тех пор, пока мозг не опустится на дно трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозги готовы к замораживанию после того, как они утонули, но могут храниться в растворе сахарозы при 4 °C в течение нескольких недель. - Готовят морозильную среду в пробирке объемом 50 мл, смешивая 15 мл 100% соединения оптимальной температуры резания (ОКТ) с 30 мл 30% сахарозы в TBS. Смешайте на нутаторе или орбитальном шейкере в течение не менее 1 ч, чтобы убедиться, что раствор полностью перемешан. Держите трубку в вертикальном положении в течение дополнительного часа, чтобы любые пузырьки поднялись на поверхность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морозильную среду можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель. - Используйте серологический пипетку, чтобы добавить морозильную среду в квадратную форму для встраивания (Таблица материалов). Позаботьтесь о том, чтобы избежать введения пузырьков в среду. Для мозга мыши P21 достаточно 3 мл. Отрегулируйте громкость по мере необходимости для разных возрастов, чтобы мозг был полностью погружен в воду.
- Добавьте мозг к среде и используйте пару щипцов No 5, чтобы удалить любой ствол мозга, который может помешать мозгу сидеть в плесени. Выровняйте переднюю часть мозга одним краем формы.
- Переложите форму на ровную поверхность, охлажденную сухим льдом. Металлическая банка для обеда, наполненная сухим льдом, хорошо подходит для этой цели. Окружите форму гранулами сухого льда, чтобы обеспечить медленное и равномерное замораживание.
- Как только морозильная среда станет полностью белой и твердой, храните форму при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг может храниться при -80 °C в течение нескольких лет.
2. Киросекционирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод секционирования предназначен для работы со многими различными коммерчески доступными криостатами. С криостатом, используемым здесь (Таблица материалов), оптимальная температура резки головки образца составляет -23 ° C, с температурой окружающей среды в камере от -23 ° C до -25 ° C.
ВНИМАНИЕ: Лезвие криостата чрезвычайно острое. Соблюдайте осторожность при манипулировании лезвием и работе с криостатом.
- Подготовьте среду для секционирования, смешав 25 мл 1x TBS и 25 мл глицерина в пробирке объемом 50 мл. Проще всего добавить глицерин, налив его непосредственно в трубку и используя маркеры на трубке для измерения. Встряхните/вихрьте трубку, чтобы перемешать. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
- Подготовьтесь к сбору тканевых срезов, добавив 2 мл секционной среды на скважину в 12-луночную пластину. Пометьте верхнюю и нижнюю части пластины информацией о образце. Поместите пластину вместе с другими материалами (лезвие криостата, лезвие бритвы, патроны и кисти) непосредственно в криостат и дайте им акклиматизироваться к температуре в течение ~ 5 минут.
- Переместите мозг в криостатную камеру и позвольте им акклиматизироваться к температуре вместе с припасами.
- Удалите замороженный блок ткани из формы, срезав два угла формы лезвием бритвы и отклеив форму от ткани. Ориентируйте блок так, чтобы передняя часть мозга была обращена вверх.
- Добавьте OCT к патрону таким образом, чтобы ~2/3 патрона было покрыто OCT, и сразу же поместите блок ткани на патрон, сохраняя ориентацию, описанную выше. Вдавите блок в центр развертывания Office так, чтобы он был плоским на поверхности патрона.
- После того, как OCT полностью заморожен и блок тканей надежно закреплен на месте, прижмите патрон к головке образца. Вставьте лезвие криостата и поднесите лезвие близко к образцу.
- Проходите через мозг с интервалом 100 мкм до тех пор, пока не будет достигнута интересующая область мозга. Чтобы уменьшить количество ОКТ, которое растворяется в секционной среде, используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать лишнюю морозильную среду со стороны блока тканей.
- Как только область будет достигнута, начните собирать участки толщиной 100 мкм. Собирайте секции, используя либо стабилизирующую пластину, либо медленно продвигая криостат одной рукой, используя кисть в другой руке, чтобы направить секцию от блока по мере его приближения к лезвию. Если модель криостата имеет педаль, то используйте педаль для продвижения криостата, чтобы обе руки могли быть использованы для направления секции от блока.
- Переложите срезы на 12-луночную пластину с помощью кисти или щипцов. Каждая скважина может вместить не менее 10-12 секций. При добавлении секции к среде обычно достаточно прикоснуться нижним краем секции к секционной среде и позволить секции расплавиться в среде, не намочив щетку или щипцы. Если щетка касается среды, обязательно высушите ее бумажным полотенцем или салфеткой, так как чрезмерно влажная щетка затруднит перенос участков ткани.
- Закрепите пластину, обернув ее фольгой или парафиновой пленкой. Убедитесь, что он четко обозначен, а затем храните его при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства протоколов окрашивания срезы могут храниться при температуре -20 °C в течение не менее 1-2 лет без существенной потери сигнала.
3. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все промывки и инкубации на орбитальной платформе шейкера, установленной примерно на 100 оборотов в минуту. Все этапы выполняются при комнатной температуре, за исключением первичной инкубации антител, которая проводится при 4 °C. Подготовьте монтажную среду заранее, объединив ингредиенты в пробирке объемом 50 мл и перемешав на питателе в течение ночи. Защитите от света и храните при температуре 4 °C до 2 месяцев. Если эндогенный флуоресцентный сигнал достаточен для визуализации и анализа без необходимости иммуноокрашивания, этапы 3.1-3.9 можно пропустить. При пропуске иммуноокрашивания выполните три 10-минутные промывки в TBS и перейдите к шагу 3.10.
- Приготовьте свежий раствор TBST (0,2% Triton in TBS), добавив 1 мл 10% Triton-X в пробирку объемом 50 мл и заполнив трубку до 50 мл 1x TBS. Приготовьте 2 мл блокирующих и антителовых растворов (10% козьей сыворотки в TBST) для каждого мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов делайте свежий TBST для каждого нового эксперимента по окрашиванию и используйте высококачественный источник 10% водного раствора Triton-X (Таблица материалов). - Маркировка 24-луночной плиты согласно схеме (рисунок 1). Размещайте разные образцы в разных рядах, а разные решения в разных столбцах. Добавьте 1 мл TBST в первые три столбца («Wash 1», «Wash 2» и «Wash 3»). Добавьте 1 мл блокирующего раствора в четвертую колонку.
- Подготовьте стеклянную кирку, расплавив конец пипетки Пастера 5,75 в небольшой крючок с помощью горелки Бунзена. Используйте эту кирку для переноса участков ткани из 12-луночной пластины в колонну Wash 1 24-луночной пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов просеивайте секции перед началом окрашивания. Чтобы отсеять секции, перенесите секции одну за другой на чашку Петри, заполненную 1x TBS, и исследуйте секции с помощью флуоресцентного микроскопа с объективом 5x или 10x, чтобы обеспечить наличие достаточного количества флуоресцентно меченых клеток. Рекомендуется окрашивать от четырех до шести секций на лунку, хотя при необходимости может быть окрашено до восьми на лунку. - Промыть секции по 10 мин в промыть 1, 2 и 3 лунки, а затем инкубировать секции в течение 1 ч в блокирующем растворе. Используйте стеклянную кирку для переноса секций из одного колодца в другой. Кирка может быть использована для передачи нескольких участков мозга одновременно.
- Приготовьте 1 мл первичного раствора антител для каждого образца (например, Rabbit RFP 1:2000 или Chicken GFP 1:2000). Добавляют антитело к раствору антитела, кратковременно вихрь, а затем центрифугируют в течение 5 мин при ≥ 4000 х г при 4 °C. Инкубируют срезы в первичных антителах в течение двух-трех ночей при 4 °C при встряхивании.
- После первичной инкубации антител аспирируйте 1-й день TBST из промывочных колодцев, добавьте 1 мл нового TBST в каждую промывочную скважину и переместите секции в первый промывочный колодец. Промывайте секции 3x в течение 10 минут каждая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для аспирации используйте пипетку Пастера 9, соединенную с трубкой в вакуумную колбу. В качестве источника вакуума могут использоваться домашние вакуумные линии или электрический вакуумный насос. - Пока срезы промывают, готовят вторичные растворы антител в концентрации 1:200, добавляя антитела к раствору антител (например, козий анти-кролик 594 или козий анти-курица 488). Вихрь ненадолго, а затем вращайтесь в течение 5 мин при ≥ 4000 х г при 4 °C.
- Инкубировать срезы во вторичных антителах в течение 3 ч при комнатной температуре. Защитите участки от света на этом этапе и всех последующих шагах, чтобы смягчить отбеливание вторичных антител.
- После вторичной инкубации антител аспирируйте День 2 TBST из промывочных колодцев, добавьте 1 мл нового TBST в каждую промывочную скважину и переместите секции в первый промывочный колодец. Промывайте секции 3x в TBST в течение 10 мин каждый.
- Во время окончательной стирки выньте монтажную среду от 4 °C и дайте ей нагреться до комнатной температуры. Приготовьте смесь 2:1 из 1X TBS:dH2O и добавьте ее в чашку Петри. Подготовьте слайд микроскопа, добавив на поверхность 800 мкл 2:1 TBS:dH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать неотверждаемый монтажный носитель. Затвердевающая монтажная среда может изменить объем ткани, что может сбить с толку анализ объема территории астроцитов. Рецепт простого и недорогого самодельного монтажного носителя приведен в Таблице материалов. - Используя тонкую кисть, перенесите участки по одному из колодца Wash 3 в чашку Петри. Этот шаг удаляет тритон и помогает секциям выровняться. Далее переложите срезы из чашки Петри в жидкость на слайде.
- Используйте кисть, чтобы помочь расположить секции так, чтобы они были плоскими на слайде. Аккуратно удалите лишнюю жидкость с горки с помощью пипетки P1000 с последующей вакуум-аспирацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте наконечник пипетки P200 в конец пипетки Пастера для более точного контроля вакуум-аспирации. - После того, как вся лишняя жидкость будет удалена с слайда, используйте передаточный пипетку, чтобы немедленно добавить одну каплю монтажного материала в каждую секцию и аккуратно положить крышку на слайд. Дайте монтажному материалу распространиться в течение нескольких минут, а затем удалите все лишние монтажные материалы, которые выходят из-под крышки вакуум-аспирацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания секций перед добавлением монтажного носителя. Если срезы начинают высыхать до добавления монтажной среды, это может повлиять на объем тканей и затруднить точный сбор данных. - Запечатайте все четыре края обшивки прозрачным лаком для ногтей. Дайте слайдам высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем храните их при температуре 4 °C. Подождите не менее 2 часов перед визуализацией или изображением на следующий день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Участки, окрашенные антителами против GFP и RFP, могут храниться до 2 недель до визуализации, при условии, что они полностью запечатаны лаком для ногтей.
4. Конфокальная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол дает общие рекомендации по получению изображений, которые широко применимы к различным конфокальным микроскопам, а не конкретные детали для конкретного конфокального и программного интерфейса.
- Используйте 10-кратный объектив, чтобы найти отдельные клетки для визуализации, принимая во внимание конкретную область мозга или подобласти (например, слой 5 зрительной коры), как это актуально для эксперимента. Используйте ручку фокусировки, чтобы попытаться определить, содержится ли весь астроцит в секции.
- Переключитесь на масляный объектив с более высоким увеличением (например, 40x, 60x или 63x) и поместите ячейку в фокус. Просматривая окуляр, используйте ручку фокусировки, чтобы переместиться сверху вниз ячейки.
- Визуально осмотрите ячейку, чтобы убедиться, что вся ячейка содержится в секции. Если ячейка резко выходит из фокуса и обрезается на краю раздела, исключите эту ячейку и найдите другую.
- Используя связанное с конфокальным микроскопом программное обеспечение для сбора, настройте параметры захвата для получения соответствующего отношения сигнал/шум и уровня детализации (разрешение 512 x 512 обеспечит достаточную детализацию для анализа территории и сократит время получения изображения). Используйте 2-кратный зум, если используется 40-кратный объектив, и без масштабирования, если используется объектив 60x или 63x.
- Установите верхнюю и нижнюю границы z-стека. Чтобы гарантировать, что весь астроцит захватывается, первое и последнее изображения z-стека не должны содержать флуоресцентной маркировки клетки. Для адекватного отбора проб используйте шаг размером 0,5 мкм.
5. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает этапы выполнения анализа изображений с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений (например, Imaris; см. Таблицу материалов). Другие версии этого программного обеспечения могут использоваться с незначительными изменениями в рабочем процессе. Этот протокол также требует, чтобы MATLAB запустил файл Convex Hull XTension (дополнительный файл).
- Перед началом анализа установите файл XTSpotsConvexHull.m , вставив файл в подпапку rtmatlab папки XT.
- Используйте конвертер файлов Imaris для преобразования изображений в формат '.ims'. Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений и просмотрите изображение в режиме 3D-просмотра, нажав кнопку 3D View .
- Перед анализом осмотрите ячейку, чтобы убедиться, что она соответствует критериям включения.
- Убедитесь, что вся ячейка присутствует в изображении (т. е. ни одна часть ячейки не должна быть вырезана из изображения). Поверните изображение, чтобы осмотреть передний и задний края.
- Убедитесь, что клетка имеет только одно тело клетки. Нажмите кнопку «Фрагмент», перетащите курсор в левой части экрана, чтобы переместиться по z-стеку, и убедитесь, что помеченная ячейка содержит только одно тело ячейки.
- Убедитесь, что есть отдельный астроцит, который можно отличить от любых соседних астроцитов, которые помечены тем же цветом.
- Создание поверхности
- Снова выбрав кнопку 3D View , создайте новую поверхность, щелкнув синий значок Добавить новые поверхности .
- На вкладке Создание, которая отображается в левом нижнем углу окна программного обеспечения, убедитесь, что в параметрах алгоритма установлены флажки Сегментировать только область интереса и Статистика объект-объект, а в настройках создания снят флажок Начать создание в режиме среза. Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующая область может не понадобиться, если на изображении за пределами интересующей ячейки нет дополнительного флуоресцентного сигнала. В этом случае оставьте без флажка Сегмент только интересующий регион и перейдите к шагу 5.4.3.
- На вкладке Создание, которая отображается в левом нижнем углу окна программного обеспечения, убедитесь, что в параметрах алгоритма установлены флажки Сегментировать только область интереса и Статистика объект-объект, а в настройках создания снят флажок Начать создание в режиме среза. Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжить.
- Создайте интересующую область вокруг ячейки, введя размеры в поля в разделе «Размер » инструмента «Создание поверхности» или перетащив края желтого поля (рисунок 2A). Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
- Выберите правильный исходный канал из раскрывающегося списка для анализа (например, канал 1 или канал, содержащий флуоресцентную заливку ячейки). Значение в поле Surfaces Detail определяется программным обеспечением и на основе параметров получения изображения. Убедитесь, что это значение остается постоянным для всех образцов в эксперименте. Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
- Отрегулируйте пороговое значение (абсолютную интенсивность), перетащив желтую полосу или введя значения в поле, чтобы серая поверхность заполняла как можно больше сигнала ячейки, не выходя за границу ячейки. Небольшое количество флуоресцентного сигнала будет видно по краям поверхности (рисунок 2B). Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
- Последняя панель инструмента Surface Creation задает минимальное значение качества, которое является значением нижнего порога программного обеспечения по умолчанию. В раскрывающемся списке убедитесь, что выбран параметр Количество вокселей Img=1. Убедитесь, что только левая кнопка питания для Нижнего порога является зеленой (активной); правая кнопка питания должна быть красного цвета (неактивна). Программное обеспечение по умолчанию устанавливает значение Lower Threshold равным 10. Оставьте это без изменений и нажмите на зеленую стрелку, чтобы завершить генерацию поверхности.
- Внимательно осмотрите вновь образовавшуюся поверхность. Удалите все части поверхности, которые не являются частью ячейки, выделив их, щелкнув инструмент «Редактирование карандаша» и щелкнув параметр «Удалить ».
- Объедините оставшиеся части поверхности, щелкнув значок воронки Filter , чтобы выбрать все, щелкнув значок редактирования карандаша и щелкнув опцию Unify (рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: При большом файле изображения программное обеспечение может иногда аварийно завершать работу на последующих этапах этого протокола. На этом этапе рекомендуется сохранить файл.
- Снова выбрав кнопку 3D View , создайте новую поверхность, щелкнув синий значок Добавить новые поверхности .
- Создание пятен вблизи поверхности
- Нажмите на оранжевый значок Добавить новые пятна. Выбрав новые точки (например, «Пятна 1»), на вкладке «Создать» убедитесь, что для параметров алгоритма установлен флажок «Статистика объект-объект», а в настройках «Создание» снят флажок «Начать создание с помощью режима с помощью срезов». Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжить.
- Выберите правильный исходный канал из раскрывающегося списка (например, канал 1), а затем введите в поле расчетное значение диаметра XY 0,400 мкм. Убедитесь, что выбрано только поле Вычитание фона . Нажмите на синюю стрелку , чтобы продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,400 мкм подходит для изображений 1024 x 1024 или 512 x 512 с использованием объектива 63x, 60x или 40x. Для других условий визуализации диаметр должен определяться на основе условий визуализации и оставаться постоянным на протяжении всего анализа. Соответствующее значение создаст достаточно пятен, чтобы покрыть весь положительный сигнал, но не добавит пятен на фоновом сигнале. - Последняя панель инструмента Spots Creation устанавливает минимальное значение качества, которое является значением нижнего порога программного обеспечения по умолчанию; убедитесь, что это значение остается неизменным, если нет заметной разницы в размещении/распределении пятен (например, из-за более низкого качества окрашивания). Нажмите на зеленую стрелку , чтобы завершить создание пятен.
- Чтобы лучше просматривать пятна, измените прозрачность поверхности, выбрав «Поверхность » и щелкнув инструмент «Многоцветный цвет ». В разделе Материал выберите материал, который делает поверхность достаточно прозрачной для просмотра пятен по всей ячейке (предпоследний материал в списке) (рисунок 2D, E).
- Повторно выберите точки, щелкните значок Фильтр и выберите Из раскрывающегося списка «Кратчайшее расстояние до поверхностей Surfaces= SurfaceS X», где «Поверхности X» — это анализируемая поверхность (например, Surfaces 1). Убедитесь, что кнопки питания Нижнего и Верхнего пороговых значений зеленые (активные).
- Введите минимальное расстояние -1,0 мкм (расстояние пятен от внутренней части поверхности) в поле Нижнее пороговое значение и максимальное расстояние 0,1 мкм (расстояние снаружи) в поле Верхнее пороговое значение . Нажмите кнопку «Дублировать выделение в новые места», чтобы завершить создание пятен близко к поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальные и максимальные значения расстояния могут варьироваться в зависимости от различных параметров получения изображения, таких как цель, масштаб и разрешение. Эти цифры должны быть определены эмпирически. Прозрачная поверхность помогает судить, охватывают ли значения все пятна, которые точно представляют форму поверхности.
- Введите минимальное расстояние -1,0 мкм (расстояние пятен от внутренней части поверхности) в поле Нижнее пороговое значение и максимальное расстояние 0,1 мкм (расстояние снаружи) в поле Верхнее пороговое значение . Нажмите кнопку «Дублировать выделение в новые места», чтобы завершить создание пятен близко к поверхности.
- Создание выпуклого корпуса и измерение территории
- Убедитесь, что вновь созданные Spots выбраны в верхней левой панели окна программного обеспечения (например, «Spots 1 Selection ['Shortest Distance...]»). Нажмите на значок шестеренки Tools , а затем на плагин Convex Hull . Нажмите на плагин только один раз и подождите, пока появится окно MATLAB, а затем исчезнет (это может занять несколько секунд). Сплошной корпус появится в 3D-виде.
- В левой верхней панели выберите Выпуклый корпус Spots X Selection ['Кратчайшее расстояние...], где 'Spots X Selection' - это вновь созданные пятна (например, Spots 1 Selection), а затем нажмите на корпус , чтобы выбрать его (рисунок 2F).
- Щелкните значок графика Статистика , перейдите на вкладку Выбор , убедитесь, что в верхнем раскрывающемся списке выбран пункт Конкретные значения , а затем выберите Том из нижнего раскрывающегося списка. Запишите объем корпуса. Сохраните файл и перейдите к следующему изображению.
- Измерение объема перекрытия территории для соседних ячеек с различными флуоресцентными метками
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола может быть использован, если образцы содержат соседние астроциты, которые экспрессируют различные флуоресцентные метки (например, астроцит 1 экспрессирует только GFP, а астроцит 2 экспрессирует только RFP). Эта маркировка была достигнута с использованием вирусных или генетических стратегий, какописано ранее 9,10 (рисунок 3A).- Используя шаги, описанные в шагах 5.4-5.6, создайте поверхность, пятна, близкие к поверхности, и выпуклую оболочку для каждого астроцита (рисунок 3B).
- Выбрав Выпуклый корпус пятен 1 Selection... , нажмите на значок карандаша Редактировать и нажмите на Выбор маски. В окне Канал маски убедитесь, что выбран канал 1 (или канал, представляющий астроцит 1) и убедитесь, что установлен флажок рядом с дублирующимся каналом перед применением параметра маски . Нажмите OK , чтобы создать канал Masked CH1.
- С выпуклым корпусом пятен 2 Выбор... выберите, нажмите на значок карандаша Редактировать и нажмите на Выбор маски. В окне Канал маски выберите Канал 2 (или канал, представляющий астроцит 2) в раскрывающемся меню и убедитесь, что установлен флажок рядом с дублирующимся каналом перед применением параметра маски . Нажмите OK , чтобы создать канал Masked CH2 (рисунок 3C).
- Нажмите кнопку Coloc в верхней части экрана и используйте инструмент Coloc для создания канала совместной локализации двух замаскированных каналов. Установите для параметра Канал A значение Канал 3 - Замаскированный КАНАЛ CH1 и Канал B - Канал 4 - Замаскированный КАНАЛ 2 (рисунок 3D).
- Перетащите желтую полосу гистограммы влево для обоих каналов. Используйте вид фрагмента ниже, чтобы наблюдать сигнал совместной локализации, который будет виден серым цветом. Обратите внимание, что, поскольку флуоресцентные сигналы двух ячеек фактически не колокализованы, порог необходимо будет переместить влево, чтобы ложные колокализации начали появляться в точках контакта клетки с клеткой.
- Нажмите «Построить канал Колок» справа, чтобы завершить процесс. Нажмите на 3D-вид , чтобы вернуться к стандартному 3D-виду. Канал результатов колокализации теперь будет виден серым цветом и появится в поле настройки дисплея.
- Создайте поверхность, пятна, близкие к поверхности, и выпуклую оболочку канала результата колокализации , используя шаги, описанные в 5.4-5.7 (рисунок 3E, F).
- Запишите объем выпуклого корпуса. Это объем перекрытия территории. Разделите это число на объем территории одного из астроцитов, чтобы рассчитать процент перекрытия территории. Выберите контрольный или астроцит дикого типа, если один из астроцитов генетически манипулируется по отношению к другому.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 представлен схематический обзор основных шагов и рабочего процесса для этого протокола. На рисунке 2 показаны скриншоты ключевых шагов с использованием программного обеспечения для анализа изображений для создания поверхности, создания пятен вблизи поверхности и создания выпуклого корпуса. На рисунке 3 показано применение данного метода для определения перекрытия территории астроцитов/облицовки. На рисунке 4 репрезентативные результаты из ранее опубликованной рукописи9 демонстрируют применение этого протокола. На рисунках 4А и 4В нокдаун обогащенной астроцитами молекулы клеточной адгезии гепаКАМ значительно уменьшает объем территории астроцитов. На рисунках 4C и 4D анализ мозаики с двойными маркерами (MADM) использовался для введения разреженной мозаичной маркировки и одновременной генетической модификации в кору головного мозга мыши. С MADM мыши были получены, где астроциты дикого типа экспрессируют красный флуоресцентный белок (RFP), а нокаутирующие астроциты Hepacam экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP). Используя протокол, описанный выше, был рассчитан процент перекрытия территории между соседними парами астроцитов RFP и GFP (WT:KO). В качестве контрольной группы это сравнивали с соседними парами астроцитов RFP и GFP у мышей без генетической модификации гепакама (WT: WT). Пары астроцитов WT:KO показали значительно увеличенный процент перекрытия территории по сравнению с парами астроцитов WT:WT. В совокупности эти результаты демонстрируют, что гепаКАМ необходим для нормального объема территории астроцитов и астроцитарной плитки.
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса анализа объема территории астроцитов. (А) Протокол требует мыши с разреженной или мозаичной флуоресцентной маркировкой астроцитов. (Б) Мышь перфузируется, а затем мозг резецируется, обрабатывается и замораживается. (C) Замороженный мозг разделяют с помощью криостата и (D) собирают свободно плавающие участки тканей. (E) После разрезания плавающие участки ткани окрашиваются иммуногистохимией, а затем (F) устанавливаются на слайды. (G) Астроциты в смонтированных участках ткани визуализируются с помощью конфокальной микроскопии. (H) Наконец, объемы территории изображенных ячеек количественно оцениваются с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Ключевые этапы процедуры анализа изображения для объема территории астроцитов. (А) Вид клетки с областью интереса, исключающий другой сигнал на изображении из процедуры анализа. (B) Приемлемый относительный порог для создания поверхности (серый) с использованием сигнала (красный). (C) Завершенная поверхность с выбранной основной ячейкой (желтый). Другие части поверхности, которые не являются ячейкой, будут удалены (красный). (D) Полупрозрачная поверхность с созданными пятнами. (E) Крупный план полупрозрачной поверхности с пятнами, созданными для демонстрации приемлемого распределения пятен относительно поверхности. (F) Конечный выпуклый корпус. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Ключевые этапы анализа перекрытия территории астроцитов. (A) Репрезентативное изображение двух астроцитов, экспрессирующих различные флуоресцентные маркеры, GFP (зеленый) и RFP (пурпурный). (B) Генерация выпуклой оболочки для каждого астроцита. (C) Просмотр замаскированных каналов GFP и RFP с удаленными исходными каналами. (D) Пример пороговых значений с использованием инструмента "Coloc" для создания канала "Результат колокализации". «Колокализованный» сигнал показан серым цветом. (E) Вид двух замаскированных каналов. (F) Повернутый вид выпуклого корпуса канала "Результат колокализации" (серый), который представляет собой объем перекрытия территории. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Успешное применение протокола для измерения объема территории астроцитов и перекрытия территории астроцитов. (А) Астроциты в зрительной коре мышей дикого типа CD1 на постнатальный 21 день, экспрессирующие mCherry-CAAX (голубой) и контрольную шРНК (shScramble) или шРНК, нацеленную на гепаКАМ (shHepacam). Территория астроцитов очерчена красным цветом. (B) Потеря гепаКАМ значительно уменьшает объем территории астроцитов. Точки данных представляют собой отдельные средние значения мыши. Полосы ошибок ± s.e.m. Nested t-test. (C) Соседние астроциты в коре головного мозга мыши на 21-й день, экспрессирующие GFP (зеленый) или RFP (пурпурный). У мышей MADM9 WT:WT оба астроцита относятся к дикому типу. У мышей MADM9 WT:KO зеленый астроцит относится к дикому типу, а пурпурный астроцит равен нулю для гепакама. Объем перекрытия территории показан синим цветом. (MADM9 WT:WT генотип: MADM9TG/GT; ЭМХ-КреTg/0; Гепакам+/+. MADM9 WT:KO генотип: MADM9TG/GT; ЭМХ-КреTg/0; Гепакам+/-). D) количественная оценка процентной доли перекрытия объема территории. Точки данных представляют собой отдельные средние значения мыши. Полосы ошибок ± s.e.m. Nested t-test. Шкала стержней = 20 мкм. Панели на этом рисунке перепечатаны из Baldwin et al9 с разрешения издателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает установленный метод анализа объема территории астроцитов и мозаики астроцитов в коре мыши, подробно описывая все основные этапы, начиная с перфузии и заканчивая анализом изображений. Этот протокол требует мозга от мышей, которые экспрессируют флуоресцентные белки в разреженной или мозаичной популяции астроцитов. Помимо этого требования, мыши любого возраста могут быть использованы для этого протокола, с незначительными корректировками настроек перфузии и объема замораживающей среды, добавленной к встраиваемой форме. В то время как другие методы были опубликованы для анализа сложности и объема ветвления астроцитов в участкахткани мозга 7,11, этот протокол имеет несколько уникальных преимуществ. Во-первых, этот протокол описывает пользовательский код, который может быть использован для получения объема территории астроцитов. Объем территории астроцитов отличается от объема клеток астроцитов, поскольку он измеряет все пространство, занимаемое астроцитом, независимо от его ветвящейся сложности. Кроме того, этот протокол описывает, как применять измерение объема территории астроцитов для измерения объема перекрытия территории астроцитов и, следовательно, поведения астроцитарных плиток. Наконец, этот протокол обеспечивает подробное обсуждение потенциальных переменных, которые могут влиять на объем территории астроцитов и сбор данных, включая условия монтажа, условия хранения образцов, а также критерии включения и исключения для визуализации и анализа. В дополнение к этим уникальным особенностям, многие аспекты этого протокола, включая перфузию, криосекцию и иммуноокрашивание свободно плавающих участков, могут широко применяться для окрашивания участков ткани мозга различной толщины и с различными комбинациями антител. Ниже подробно обсуждаются критические шаги, важные соображения, устранение неполадок и ограничения.
Рекомендации по сбору образцов
Одним из очень важных соображений для экспериментов, направленных на изучение морфологии астроцитов, является поддержание постоянного времени суток для сбора образцов. Растущие данные указывают на то, что функциональные состояния астроцитов связаны с циркадным ритмом и поведением во сне14. Чтобы устранить любую изменчивость, которая может быть внесена образцами, собираемыми в разное время суток, перфузии должны планироваться таким образом, чтобы все образцы для эксперимента собирались примерно в одно и то же время суток, в пределах времени 2-3 ч. Для последовательных перфузий настоятельно рекомендуется использовать перистальтический насос. Добавление гепарина к TBS полезно для уменьшения образования тромбов. Хотя этот протокол не был протестирован с более коротким временем постфиксации, постфиксация в одночасье может не потребоваться, и может быть рассмотрена более короткая постфиксация в 4 ч.
Советы по поиску и устранению неисправностей при криосечении
Замораживание мозга в морозильной среде 2:1 Sucrose:OCT уменьшает количество OCT в коллекторных колодцах после секционирования. При замораживании морозильная среда ведет себя аналогично самой ОКТ, но менее хрупкая. При замораживании блока ткани к патрону обязательно прижмите его плоско на патрон сразу после добавления OCT к патрону. Если тканевый блок отрывается от патрона во время сечения, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать новую плоскую поверхность на дне и повторно замерзнуть в патрон. Предоставление патрону достаточного времени для охлаждения до температуры криостатной камеры перед добавлением OCT и обеспечение того, чтобы патрон был чистым и сухим, улучшит сцепление. При перемещении участков ткани кистью прикасайтесь кистью к угловому краю участка, чтобы она касалась ОКТ, а не самой ткани. С небольшим количеством влаги секция будет прилипать к кисти. Осторожно поместите ткань в среду срезания, коснувшись противоположного края участка к среде и позволив ей втянуться в среду. Если щетка касается замерзающей среды, протрите ее бумажным полотенцем внутри криостата. Слишком влажная щетка затруднит перенос секций на блюдо. ОКТ должен раствориться после того, как срез ткани помещен в среду для срезания. Если это не так, температура криостатной камеры может быть слишком низкой.
Важные соображения при окрашивании и монтаже участков тканей
Чтобы улучшить качество окрашивания, готовьте TBST свежим перед каждым экспериментом. Используйте высококачественный 10% водный источник Тритон (Таблица материалов). Выберите сыворотку, которая соответствует видам, в которых было получено вторичное антитело (например, используйте козью сыворотку для вторичного против кролика козы). Растворы антител центрифугируют перед использованием, чтобы гранулировать и удалить любые осажденные антитела. Позаботьтесь о том, чтобы не потревожить гранулу при переносе раствора антител из трубки на пластину (это может означать пипетку чуть менее 1 мл раствора антител на хорошо, а также не касаться нижней части трубки кончиком пипетки). Этот шаг помогает уменьшить фоновое окрашивание. Когда секции помещаются в TBS:dH2O, большинство из них разворачиваются/распутываются сами, но некоторые могут оставаться сложенными или скрученными. При переносе секций на слайд с помощью кисти используйте наконечник P200 в другой руке, чтобы помочь направить участок ткани в соответствующее место. Используйте кисть, чтобы аккуратно развернуть или раскрутить секции так, чтобы они лежали ровно. Секции имеют тенденцию двигаться к аспирирующей пипетке по мере удаления жидкости. Используйте подсказку P200, чтобы удерживать мобильные секции на месте во время аспирации. Монтажные материалы должны быть добавлены в секции сразу после удаления всей лишней жидкости и до того, как секции успеют высохнуть. Если позволить секциям высохнуть даже в течение нескольких минут, это резко повлияет на объем клеток внутри секции. После добавления монтажного носителя на слайд используйте пипетку для удаления видимых пузырьков. После добавления крышки обязательно удалите лишние монтажные материалы с боков, так как это будет мешать способности лака для ногтей высыхать. Дайте лаку для ногтей высохнуть при комнатной температуре. Подождите не менее 2 часов или до следующего дня, чтобы получить изображение секций, чтобы убедиться, что монтажный носитель имеет достаточно времени, чтобы полностью проникнуть в толстые участки.
Визуализация полных астроцитов
При визуализации астроцитов для анализа объема территории крайне важно, чтобы изображение захватывало весь объем астроцита. Многие меченые астроциты в тканевом сечении будут неполными астроцитами. Полные астроциты будут полностью содержаться в тканевом срезе. Чтобы определить полные астроциты, начните с очага в середине астроцита. Используйте ручку фокусировки, чтобы переместиться в верхнюю часть астроцита. Когда астроцит больше не находится в фокусе, другие особенности ткани должны оставаться в фокусе. Повторите этот процесс для дна астроцита. Не изображайте неполные астроциты. Из-за толщины срезов проникновение антител не такое надежное в середине секции. Маркировка может быть сильнее вокруг внешних краев астроцита и слабее в центре. Это обычно наблюдается и не влияет на анализ территории.
Советы по анализу изображений
Наиболее важным соображением для части протокола, посвященной анализу изображений, является обеспечение того, чтобы выпуклая оболочка представляла только один астроцит. Каждый раз следуйте критериям включения и исключения. Иногда два астроцита будут иметь свои клеточные тела очень близко друг к другу. Это может быть трудно определить в 3D-представлении, но его можно определить с помощью фрагментового представления. Если есть другие флуоресцентно меченые астроциты, контактирующие с интересующим астроцитом, это может усложнить процесс создания поверхности. Если между двумя ячейками видна достаточно четкая граница (например, они соединяются только в одной небольшой точке ветвления), то клиповый инструмент можно использовать для того, чтобы сделать разрез на поверхности, и эту часть поверхности можно удалить. После создания поверхности поверните ячейку в 3D-виде, чтобы проверить наличие небольших кусочков поверхности, которые могут скрываться за ячейкой, но не являются частью ячейки. Удалите их, прежде чем продолжить. Если выпуклая оболочка резко выступает в точку за пределами территории астроцитов, вероятно, есть кусок неклеточной поверхности, который не был удален. Если программное обеспечение регулярно аварийно завершает работу во время создания поверхности, количество деталей поверхности может быть уменьшено. Если он падает во время создания пятен, используйте интересующую область для создания пятен только вблизи поверхностного объекта.
Ограничения протокола
Хотя у этого протокола есть много применений и преимуществ, есть также несколько ограничений. Этот протокол требует мышей, которые уже экспрессируют флуоресцентные белки в разреженной популяции астроцитов, но не описывает методы введения экспрессии флуоресцентных белков в астроциты. Конвейеры визуализации и анализа отнимают много времени и не очень хорошо подходят для высокопроизводительного анализа. Кроме того, они ориентированы конкретно на измерение объема территории астроцитов и облицовки плитки, а не на определение подробных морфологических особенностей отдельных астроцитов. Другие могут счесть полезным объединить подходы и стратегии этого протокола с недавно опубликованными протоколами, в которых подробно описываются методы измерения морфологической сложности астроцитов 7,11. Наконец, коммерческие программные платформы, используемые в этом протоколе (например, Imaris и MATLAB), являются дорогостоящими и требуют лицензии на использование. В то время как крупные учреждения часто покупают лицензии на эти программные платформы, это может быть непомерно дорого для небольших учреждений и отдельных лабораторий. Достижения в области микроскопии, программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом и алгоритмов машинного обучения могут помочь сделать этот протокол широко доступным для всех лабораторий, а также могут повысить эффективность получения и анализа изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Микроскопия была выполнена в UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID: SCR_019060), частично поддержанной финансированием гранта NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 и гранта NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Изображения и данные на рисунке 4 перепечатываются из предыдущей публикации9 с разрешения издателя.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
