Summary
Denne protokollen beskriver metoder for seksjonering, farging og avbildning av frittflytende vevsseksjoner av musehjernen, etterfulgt av en detaljert beskrivelse av analysen av astrocyttområdevolum og astrocyttområdeoverlapping eller flislegging.
Abstract
Astrocytter har en forbløffende grad av morfologisk kompleksitet som gjør dem i stand til å samhandle med nesten alle typer celler og strukturer i hjernen. Gjennom disse interaksjonene regulerer astrocytter aktivt mange kritiske hjernefunksjoner, inkludert synapsedannelse, nevrotransmisjon og ion homeostase. I gnagerhjernen vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet i løpet av de tre første postnatale ukene og etablerer distinkte, ikke-overlappende territorier for å flislegge hjernen. Denne protokollen gir en etablert metode for å analysere astrocyttområdevolum og astrocyttfliser ved hjelp av frittflytende vevsseksjoner fra musehjernen. For det første beskriver denne protokollen trinnene for vevsinnsamling, kryooseksjon og immunstaining av frittflytende vevsseksjoner. For det andre beskriver denne protokollen bildeanskaffelse og analyse av astrocyttområdevolum og territoriumoverlappingsvolum, ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare for bildeanalyse. Til slutt diskuterer dette manuskriptet fordelene, viktige hensyn, vanlige fallgruver og begrensninger ved disse metodene. Denne protokollen krever hjernevev med sparsom eller mosaikk fluorescerende merking av astrocytter, og er designet for å brukes med vanlig laboratorieutstyr, konfiskert mikroskopi og kommersielt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare.
Introduction
Astrocytter er forseggjort forgrenede celler som utfører mange viktige funksjoner i hjernen1. I musebarken gir radiale glial stamceller opphav til astrocytter i de sene embryonale og tidlige postnatale stadiene2. I løpet av de tre første postnatale ukene vokser astrocytter i størrelse og kompleksitet, og utvikler tusenvis av fine grener som direkte samhandler med synapser1. Samtidig samhandler astrocytter med nærliggende astrocytter for å etablere diskrete, ikke-overlappende territorier for å flislegge hjernen3, samtidig som kommunikasjonen opprettholdes via gapkrysskanaler4. Astrocyttmorfologi og organisasjon blir forstyrret i mange sykdomstilstander etter fornærmelse eller skade5, noe som indikerer viktigheten av disse prosessene for riktig hjernefunksjon. Analyse av astrocyttmorfologiske egenskaper under normal utvikling, aldring og sykdom kan gi verdifull innsikt i astrocyttbiologi og fysiologi. Videre er analyse av astrocyttmorfologi etter genetisk manipulasjon et verdifullt verktøy for å skjelne de cellulære og molekylære mekanismene som styrer etableringen og vedlikeholdet av astrocyttmorfologisk kompleksitet.
Analyse av astrocyttmorfologi i musehjernen er komplisert av både astrocyttforgrening av kompleksitet og astrocyttfliser. Antistofffarging ved hjelp av mellomliggende filament glial fibrillary acidic protein (GFAP) som en astrocyttspesifikk markør fanger bare de store grenene, og undervurderer i stor grad astrocyttmorfologiske kompleksitet1. Andre cellespesifikke markører som glutamattransportør 1 (GLT-1; slc1a2), glutaminsyntetase eller S100β gjør en bedre jobb med å merke astrocyttgrener6, men introdusere et nytt problem. Astrocyttområder er stort sett ikke-overlappende, men det finnes en liten grad av overlapping ved de perifere kantene. På grunn av kompleksiteten i forgrening, når nærliggende astrocytter er merket med samme farge, er det umulig å skille hvor den ene astrocytten slutter og den andre begynner. Sparsom eller mosaikkmerking av astrocytter med endogene fluorescerende proteiner løser begge problemene: Fluorescerende markør fyller cellen for å fange alle grenene og tillater avbildning av individuelle astrocytter som kan skille seg fra sine naboer. Flere forskjellige strategier har blitt brukt for å oppnå sparsom fluorescerende merking av astrocytter, med eller uten genetisk manipulasjon, inkludert viral injeksjon, plasmid elektroporasjon eller transgene muselinjer. Detaljer om gjennomføringen av disse strategiene er beskrevet i tidligere publiserte studier og protokoller 1,7,8,9,10,11,12,13.
Denne artikkelen beskriver en metode for måling av astrocyttområdevolum fra musehjerner med fluorescerende merking i en sparsom populasjon av astrocytter (figur 1). Fordi den gjennomsnittlige diameteren på en astrocytt i musebarken er ca. 60 μm, brukes 100 μm tykke seksjoner for å forbedre effektiviteten i å fange individuelle astrocytter i sin helhet. Immunostaining er ikke nødvendig, men anbefales å forbedre det endogene fluorescerende signalet for konfomisk avbildning og analyse. Immunstaining kan også muliggjøre bedre påvisning av fine astrocyttgrener og redusere fotobleaching av endogene proteiner under bildeoppkjøp. For å forbedre antistoffinntrengning i de tykke seksjonene, og for å bevare vevsvolumet fra seksjonering gjennom avbildning, brukes frittflytende vevsseksjoner. Analyse av astrocytt territorium volum utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bildeanalyse programvare. I tillegg beskriver denne protokollen en metode for analyse av astrocyttfliser i vevsseksjoner med mosaikkmerking, der nærliggende astrocytter uttrykker forskjellige fluorescerende etiketter. Denne protokollen har blitt brukt med hell i flere nyere studier 1,8,9 for å karakterisere astrocyttvekst under normal hjerneutvikling, samt effekten av genetisk manipulasjon på astrocyttutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble brukt i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina ved Chapel Hill og Division of Comparative Medicine (IACUC-protokollnummer 21-116.0). Mus av begge kjønn på barseldag 21 (P21) ble brukt til disse eksperimentene. CD1-mus ble oppnådd kommersielt (Materialliste), og MADM9 WT:WT- og MADM9 WT:KO-mus ble beskrevet tidligere9.
MERK: Denne protokollen krever hjerner med fluorescerende proteinuttrykk i en sparsom populasjon av astrocytter. Fluorescerende proteinuttrykk kan introduseres genetisk, viralt eller ved elektroporasjon. Detaljer om metoder for å sparsommelig merke astrocytter er beskrevet i tidligere publiserte studier og protokoller 1,7,8,9,10,11,12,13.
1. Vevsinnsamling og forberedelse
FORSIKTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farlig kjemikalie. Utfør alle trinnene med PFA i en kjemisk avtrekkshette.
- Bedøv mus med injiserbar bedøvelse (f.eks. Avertin; 0,8 mg/kg) og sørg for dybden av anestesi med en tåklemme. Bruk en peristaltisk pumpe til å utføre intrakariac perfusjon med iskald Tris-bufret saltvann (TBS) + Heparin med en hastighet på ~ 3 ml / min til leveren er klar (vanligvis 3-5 min), etterfulgt av iskald 4% PFA i TBS med en hastighet på ~ 3 ml / min i 5 min.
MERK: Strømningshastighet og -tider er optimalisert for mus på postnatal dag 21 (P21). Justeringer av strømningshastighet og perfusjonstid kan være nødvendig for mus i forskjellige aldre. - Etter perfusjon, bruk et par operasjonssaks for å løsne hodet og fjerne huden for å eksponere skallen. Deretter bruker du et par mikro-dissekerende saks for å fjerne toppen av skallen for å eksponere hjernen. Bruk et par tang eller en liten spatel for å fjerne hjernen og overføre den til et rør som inneholder iskald 4% PFA og inkuber over natten ved 4 °C.
MERK: Pass på å bruke et rør med en flat bunn, for eksempel et 7 ml scintillasjonshetteglass, slik at hjernen ikke blir kilt i bunnen av røret, noe som kan komprimere vevet og endre astrocyttvolumet. - Neste dag, hell ut PFA fra røret. Tilsett 5 ml 1x TBS i røret for å skylle hjernen og fjerne gjenværende PFA. Hell ut TBS og gjenta denne prosessen to ganger til for totalt tre skyllinger.
- Tilsett 4-5 ml 30% sukrose i TBS og inkuber hjernen ved 4 °C i 1-2 dager, eller til hjernen synker til bunnen av røret.
MERK: Hjernen er klar til frysing når de har sunket, men kan lagres i sukroseoppløsning ved 4 °C i flere uker. - Forbered frysemedium i et 50 ml rør ved å blande 15 ml 100% optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse med 30 ml 30% sukrose i TBS. Bland på en mutter eller en orbital shaker i minst 1 time for å sikre at løsningen er fullstendig blandet. Hold røret oppreist i en ekstra time slik at eventuelle bobler kan stige til overflaten.
MERK: Frysemediet kan tilberedes på forhånd og oppbevares ved romtemperatur i flere uker. - Bruk en serologisk pipet for å legge til frysemedium til en firkantet innebyggingsform (Tabell over materialer). Pass på å unngå å introdusere bobler i mediet. For en P21-musehjerne er 3 ml tilstrekkelig. Juster volumet etter behov for forskjellige aldre, slik at hjernen er helt nedsenket.
- Legg hjernen til mediet og bruk et par #5 tang for å fjerne enhver hjernestamme som kan hindre hjernen i å sitte flatt i formen. Still opp forsiden av hjernen med en kant av formen.
- Overfør formen til en flat overflate avkjølt med tørris. En metalllunsj tinn fylt med tørris fungerer bra for dette formålet. Omgi formen med tørrispellets for å sikre langsom og jevn frysing.
- Når frysemediet er helt hvitt og fast, oppbevar formen ved -80 °C.
MERK: Hjernen kan oppbevares ved -80 °C i flere år.
2. Cyrosectioning
MERK: Denne seksjoneringsmetoden er ment å fungere med mange forskjellige kommersielt tilgjengelige kryostater. Med kryostaten som brukes her (Materialbord), er den optimale prøvehodeskjæringstemperaturen -23 °C, med en omgivelseskammertemperatur mellom -23 °C og -25 °C.
FORSIKTIG: Kryostatbladet er ekstremt skarpt. Vær forsiktig når du manipulerer bladet og bruker kryostaten.
- Forbered seksjoneringsmedium ved å blande 25 ml 1x TBS og 25 ml glyserol i et 50 ml rør. Det er enklest å legge til glyserol ved å helle det direkte inn i røret og bruke markørene på røret for måling. Rist/virvel røret som skal blandes. Denne løsningen kan lagres ved romtemperatur i flere uker.
- Forbered deg på å samle vevsseksjoner ved å legge til 2 ml seksjonsmedium per brønn til en 12-brønnsplate. Merk toppen og bunnen av platen med prøveinformasjon. Plasser platen, sammen med andre forsyninger (kryostatblad, barberblad, chucker og pensler), direkte inn i kryostaten, og la dem akklimatisere seg til temperatur i ~ 5 min.
- Flytt hjernen inn i kryostatkammeret og la dem akklimatisere seg til temperatur sammen med forsyningene.
- Fjern den frosne vevsblokken fra formen ved å kutte to hjørner av formen med et barberblad og skrelle formen bort fra vevet. Orienter blokken slik at forsiden av hjernen vender oppover.
- Legg OCT til chucken slik at ~ 2/3 av chucken er dekket med OCT og plasser umiddelbart vevsblokken på chucken, og hold orienteringen beskrevet ovenfor. Trykk blokken ned i OKT slik at den er flat på chuckens overflate.
- Når OCT er helt frosset og vevsblokken er godt på plass, klemmer du chucken til prøvehodet. Sett inn kryostatbladet og plasser bladet nær prøven.
- Trim gjennom hjernen med 100 μm intervaller til like før hjerneregionen av interesse er nådd. For å redusere mengden OKT som oppløses i seksjonsmediet, bruk et barberblad for å trimme overflødig frysemedium fra sidene av vevsblokken.
- Når interesseområdet er nådd, begynn å samle 100 μm tykke seksjoner. Samle seksjoner enten ved hjelp av anti-roll plate eller ved å sakte fremme cryostat med den ene hånden mens du bruker en pensel i den andre hånden for å lede delen av blokken som den møter bladet. Hvis cryostat-modellen har en pedal, bruker du pedalen til å føre kryostaten frem slik at begge hender kan brukes til å lede delen av blokken.
- Overfør seksjonene til 12-brønnsplaten ved hjelp av en pensel eller tang. Hver brønn kan inneholde minst 10-12 seksjoner. Når du legger til delen i mediet, er det vanligvis tilstrekkelig å berøre den nederste kanten av delen til seksjonsmediet og la delen smelte inn i mediet uten å få børsten eller tangene våte. Hvis børsten berører mediet, må du tørke det med et papirhåndkle eller vev, da en altfor våt børste vil gjøre det vanskelig å overføre vevsseksjoner.
- Fest platen ved å pakke den inn med folie eller parafinfilm. Pass på å merke den tydelig, og oppbevar den deretter ved -20 °C.
MERK: For de fleste fargingsprotokoller kan seksjoner lagres ved -20 °C i minst 1-2 år uten betydelig tap av signal.
3. Immunstaining
MERK: Utfør alle vasker og inkubasjoner på en orbital plattform shaker satt til ca 100 rpm. Alle trinn utføres ved romtemperatur, unntatt den primære antistoffinkubasjonen, som utføres ved 4 °C. Forbered monteringsmedier på forhånd ved å kombinere ingrediensene i et 50 ml rør og blande på en mutter over natten. Beskytt mot lys og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 måneder. Hvis det endogene fluorescerende signalet er tilstrekkelig for avbildning og analyse uten behov for immunstaining, kan trinn 3.1-3.9 hoppes over. Hvis du hopper over immunstaining, utfør tre 10 min vasker i TBS og fortsett til trinn 3.10.
- Forbered en ny løsning av TBST (0,2% Triton i TBS) ved å legge til 1 ml 10% Triton-X til et 50 ml rør og fylle røret til 50 ml med 1x TBS. Forbered 2 ml blokkerings- og antistoffløsninger (10% geitserum i TBST) for hver hjerne.
MERK: For best resultat, lag fersk TBST for hvert nye fargeeksperiment og bruk en kilde av høy kvalitet på 10% vandig Triton-X (Materialbord). - Merk en 24-brønnsplate i henhold til skjematisk (figur 1). Plasser forskjellige prøver i forskjellige rader, og forskjellige løsninger i forskjellige kolonner. Legg til 1 ml TBST i de tre første kolonnene ('Vask 1', 'Vask 2' og 'Vask 3'). Legg til 1 ml blokkeringsløsning i den fjerde kolonnen.
- Forbered et glassplukk ved å smelte enden av en 5,75 i Pasteur pipet i en liten krok ved hjelp av en Bunsen-brenner. Bruk dette valget til å overføre vevsseksjoner fra 12-brønnsplaten til vask 1-kolonnen på 24-brønnsplaten.
MERK: For best resultat, screen seksjonene før du begynner å fargelegge. For å skjerme seksjoner, overfør seksjonene en etter en til en Petri-tallerken fylt med 1x TBS og undersøk seksjonene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med et 5x eller 10x mål for å sikre at et tilstrekkelig antall fluorescerende merkede celler er til stede. Farging av fire til seks seksjoner per brønn anbefales, men opptil åtte per brønn kan farges om nødvendig. - Vask seksjonene i 10 min hver i Vask 1, 2 og 3 brønner, etterfulgt av inkubering av seksjonene i 1 time i blokkeringsløsningen. Bruk glassplukkingen til å overføre seksjonene fra en brønn til den neste. Valget kan brukes til å overføre flere hjerneseksjoner samtidig.
- Forbered 1 ml primær antistoffløsning for hver prøve (f.eks. kanin RFP 1:2000 eller kylling GFP 1:2000). Tilsett antistoffet til antistoffoppløsningen, virvel kort, og sentrifuger deretter i 5 min ved ≥ 4000 x g ved 4 °C. Inkuber seksjonene i primært antistoff i to til tre netter ved 4 °C mens du rister.
- Etter primær antistoffinkubasjon aspirerer du dag 1 TBST fra vaskebrønnene, tilsett 1 ml ny TBST til hver vaskebrønn, og flytt seksjonene inn i den første vaskebrønnen. Vask seksjonene 3x i 10 min hver.
MERK: For aspirasjon, bruk en 9 i Pasteur pipet forbundet med slanger til en vakuumflaske. Husvakuumledninger eller en elektrisk vakuumpumpe kan brukes som vakuumkilde. - Mens seksjonene vaskes, lag sekundære antistoffløsninger i en konsentrasjon på 1:200 ved å legge til antistoffer mot antistoffløsningen (f.eks. geit anti-kanin 594 eller geit anti-kylling 488). Virvel kort, og spinn deretter i 5 min ved ≥ 4000 x g ved 4 °C.
- Inkuber seksjoner i sekundært antistoff i 3 timer ved romtemperatur. Beskytt seksjonene mot lys i dette trinnet og alle følgende trinn for å redusere bleking av sekundære antistoffer.
- Etter sekundær antistoffinkubasjon aspirerer du dag 2 TBST fra vaskebrønnene, tilsett 1 ml ny TBST til hver vaskebrønn, og flytt seksjonene inn i den første vaskebrønnen. Vask seksjonene 3x i TBST i 10 min hver.
- Under den endelige vasken, ta monteringsmediet ut fra 4 °C og la det varmes opp til romtemperatur. Forbered en 2:1 blanding av 1x TBS:dH2O og legg dette til en Petri-tallerken. Forbered et mikroskopsklie ved å legge til 800 μL 2:1 TBS:dH2O på overflaten.
MERK: Bruk av ikke-herdende monteringsmedier anbefales på det sterkeste. Herding monteringsmedier kan endre volumet av vevet som kan forvirre analysen av astrocytt territorium volum. En oppskrift på et enkelt og billig hjemmelaget monteringsmedie er gitt i materialtabellen. - Bruk en fin pensel, overfør seksjonene en om gangen fra Vask 3 godt til Petri-parabolen. Dette trinnet fjerner triton og hjelper inndelingene med å flate ut. Deretter overfører du seksjonene fra Petri-parabolen til væsken på lysbildet.
- Bruk en pensel til å ordne inndelingene slik at de er flate på lysbildet. Fjern forsiktig overflødig væske fra lysbildet med en P1000 pipet, etterfulgt av vakuumaspirasjon.
MERK: Legg til en P200 pipetspiss på enden av Pasteur-røret for finere kontroll av vakuumaspirasjon. - Når all overflødig væske er fjernet fra lysbildet, bruker du en overføringspipet for umiddelbart å legge til en dråpe monteringsmedier i hver seksjon og forsiktig legge en deksle over lysbildet. La monteringsmediet spre seg i noen minutter, og fjern deretter overflødige monteringsmedier som kommer ut fra under dekslene ved vakuumaspirasjon.
MERK: Ikke la seksjonene tørke før monteringsmediet legges til. Hvis seksjonene begynner å tørke før monteringsmedier legges til, kan dette påvirke vevsvolumet og hindre nøyaktig datainnsamling. - Forsegle alle fire kantene på dekslene med klar neglelakk. La skliene tørke i 30 min ved romtemperatur, og oppbevar dem deretter flatt ved 4 °C. Vent minst 2 timer før avbildning, eller, bilde neste dag.
MERK: Seksjoner farget med antistoffer mot GFP og RFP kan lagres i opptil 2 uker før avbildning, forutsatt at de er helt forseglet med neglelakk.
4. Konfomisk bildebehandling
MERK: Denne protokollen gir generelle retningslinjer for bildeanskaffelse som er allment anvendelige for forskjellige konfokale mikroskoper, i stedet for spesifikke detaljer for et bestemt konfokal- og programvaregrensesnitt.
- Bruk et 10x mål for å finne individuelle celler for avbildning, og legg merke til den spesifikke hjerneregionen eller underregionen (f.eks. lag 5 av den visuelle cortexen) som er relevant for eksperimentet. Bruk fokusknappen til å prøve å finne ut om hele astrocytten finnes i seksjonen.
- Bytt til et høyere forstørrelsesoljemål (f.eks. 40x, 60x eller 63x) og sett cellen i fokus. Mens du ser gjennom okularet, bruk fokusknappen til å bevege deg fra toppen til bunnen av cellen.
- Kontroller cellen visuelt for å sikre at hele cellen befinner seg i inndelingen. Hvis cellen brått går ut av fokus og er avskåret på kanten av inndelingen, utelater du denne cellen og finner en annen.
- Ved hjelp av det konfokale mikroskopets tilhørende anskaffelsesprogramvare justerer du anskaffelsesparametrene for å oppnå et passende signal-til-støy-forhold og detaljnivå (512 x 512 oppløsning vil gi nok detaljer for territoriumanalyse og vil redusere bildeanskaffelsestiden). Bruk 2x zoom hvis du bruker en 40x målsetting, og ingen zoom hvis du bruker en målsetting på 60x eller 63x.
- Angi øvre og nedre grense for z-stakken. For å sikre at hele astrocytten fanges opp, bør ikke det første og siste bildet av z-stabelen inneholde fluorescerende merking av cellen. For tilstrekkelig prøvetaking, bruk en trinnstørrelse på 0,5 μm.
5. Bildeanalyse
MERK: Denne protokollen beskriver trinnene for å utføre bildeanalyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelig bildeanalyseprogramvare (dvs. Imaris; se Materialfortegnelser). Andre versjoner av denne programvaren kan brukes med mindre endringer i arbeidsflyten. Denne protokollen krever også at MATLAB kjører Convex Hull XTension-filen (Supplemental File).
- Før du begynner analysen, installerer du Convex Hull XTension-filen XTSpotsConvexHull.m ved å lime inn filen i rtmatlab-undermappen i XT-mappen.
- Bruk Imaris File Converter til å konvertere bilder til ims-format. Åpne en bildefil i bildeanalyseprogramvaren og vis bildet i 3D-visningsmodus ved å velge 3D-visning-knappen .
- Før analyse må du undersøke cellen for å sikre at den oppfyller inklusjonskriteriene.
- Kontroller at hele cellen er til stede i bildet (det vil si at ingen del av cellen skal klippes ut av bildet). Roter bildet for å undersøke for- og bakkantene.
- Kontroller at cellen bare har én celletekst. Klikk på Slice-knappen , dra markøren til venstre på skjermen for å gå gjennom z-stabelen, og kontroller at den merkede cellen bare inneholder én celletekst.
- Forsikre deg om at det er en individuell astrocytt som kan skille seg fra eventuelle nærliggende astrocytter som er merket med samme farge.
- Opprette en overflate
- Når 3D-visningsknappen er valgt på nytt, oppretter du en ny overflate ved å klikke på det blå ikonet Legg til nye overflater .
- I kategorien Opprett som vises nederst til venstre i programvarevinduet, må du kontrollere at det bare er merket av for Segment bare et område av interesse - og objektobjektstatistikk for Algoritmeinnstillinger, og at det ikke er merket av for Start oppretting med slicervisning for Opprettingsinnstillinger . Klikk på den blå pilen for å fortsette.
MERK: En interesseregion er kanskje ikke nødvendig hvis det ikke er noe ekstra fluorescerende signal i bildet utenfor cellen av interesse. I dette tilfellet lar du segment bare være et interesseområde som ikke er merket av, og går videre til trinn 5.4.3.
- I kategorien Opprett som vises nederst til venstre i programvarevinduet, må du kontrollere at det bare er merket av for Segment bare et område av interesse - og objektobjektstatistikk for Algoritmeinnstillinger, og at det ikke er merket av for Start oppretting med slicervisning for Opprettingsinnstillinger . Klikk på den blå pilen for å fortsette.
- Opprett et område av interesse rundt cellen ved å skrive inn dimensjoner i boksene under Størrelse på overflateopprettingsverktøyet, eller dra kantene på den gule boksen (figur 2A). Klikk på den blå pilen for å fortsette.
- Velg riktig kildekanal fra rullegardinlisten for analyse (for eksempel Kanal 1 eller kanalen som inneholder det fluorescerende cellefyllet). Verdien i Surfaces Detail-boksen bestemmes av programvaren og basert på bildeanskaffelsesparametere. Kontroller at denne verdien forblir konstant for alle prøvene i eksperimentet. Klikk på den blå pilen for å fortsette.
- Juster terskelverdien (absolutt intensitet) ved å dra den gule linjen eller ved å skrive inn verdier i boksen slik at den grå overflaten fyller så mye av cellens signal som mulig uten å gå utover cellegrensen. En liten mengde fluorescerende signal vil være synlig ved kantene av overflaten (figur 2B). Klikk på den blå pilen for å fortsette.
- Det siste panelet i Surface Creation-verktøyet angir minimumsverdien for kvalitet, som er programvarens standard lavere terskelverdi . I rullegardinlisten kontrollerer du at Antall Voxels Img=1 er valgt. Kontroller at bare venstre av/på-knapp for Nedre terskelverdi er grønn (aktiv). høyre av/på-knapp skal være rød (inaktiv). Programvaren setter verdien for nedre terskelverdi som standard til 10. La dette være uendret og klikk på den grønne pilen for å fullføre genereringen av overflaten.
- Kontroller forsiktig den nylig genererte overflaten. Slett eventuelle overflatestykker som ikke er en del av cellen, ved å merke dem, klikke på blyantredigeringsverktøyet og klikke på Slett-alternativet .
- Foren de resterende overflatestykkene ved å klikke på traktfilterikonet for å velge alle, klikke på blyantredigeringsikonet og klikke på Unify-alternativet (figur 2C).
MERK: Med en stor bildefil kan programvaren av og til krasje under de påfølgende trinnene i denne protokollen. Det er lurt å lagre filen nå.
- Når 3D-visningsknappen er valgt på nytt, oppretter du en ny overflate ved å klikke på det blå ikonet Legg til nye overflater .
- Generer flekker nær overflaten
- Klikk på det oransje Legg til nye flekker-ikonet . Når det er merket av for nye spotfarger (f.eks. "Spots 1") i kategorien Opprett , kontrollerer du at det ikke er merket av for Statistikk for objektobjekt for Algoritmeinnstillinger, og at det ikke er merket av for Start oppretting med slicervisning for Opprettingsinnstillinger . Klikk på den blå pilen for å fortsette.
- Velg riktig kildekanal fra rullegardinlisten (f.eks. kanal 1), og skriv deretter inn en anslått XY-diameterverdi på 0,400 μm i esken. Kontroller at det bare er merket av for Bakgrunnsdeldetraksjon . Klikk på den blå pilen for å fortsette.
MERK: 0,400 μm passer for bilder på 1024 x 1024 eller 512 x 512 med målsettingen 63x, 60x eller 40x. For andre bildeforhold må diameteren bestemmes basert på bildeforhold og forbli konstant gjennom hele analysen. Den aktuelle verdien vil skape nok flekker til å dekke alt positivt signal, men vil ikke legge flekker på bakgrunnssignalet. - Det siste panelet i Spots Creation-verktøyet angir minimumsverdien for kvalitet, som er programvarens standard verdi for nedre terskelverdi . sikre at denne verdien forblir uendret med mindre det er merkbar forskjell i plassering/fordeling av flekkene (f.eks. på grunn av dårligere kvalitetsfarging). Klikk på den grønne pilen for å fullføre opprettingen av flekkene.
- Hvis du vil vise flekkene bedre, endrer du gjennomsiktigheten på overflaten ved å merke Surface og klikke fargeverktøyet med flere farger. Under Materiale velger du materialet som gjør overflaten gjennomsiktig nok til å vise flekker i hele cellen (det fjerde til siste materialet i listen) (figur 2D, E).
- Velg flekkene på nytt, klikk filterikonet og velg Kortest avstand til overflater overflater=Overflater X, der "Overflater X" er overflaten som analyseres (f.eks. overflater 1), fra rullegardinlisten. Kontroller at strømknappene Nedre terskelverdi og Øvre terskelverdi er grønne (aktive).
- Angi en minimumsavstand på -1,0 μm (avstand til flekkene fra innsiden av overflaten) i nedre terskelboks , og en maksimal avstand på 0,1 μm (avstand fra utsiden) i Øvre terskel-boksen . Klikk knappen Dupliser merket område til nye flekker for å fullføre genereringen av flekker nær overflaten.
MERK: Minimums- og maksimumsavstandsverdiene kan variere med forskjellige parametere for bildeanskaffelse, for eksempel målsetting, zoom og oppløsning. Disse tallene må bestemmes empirisk. Den gjennomsiktige overflaten hjelper deg med å bedømme om verdiene fanger opp alle flekker som nøyaktig representerer formen på overflaten.
- Angi en minimumsavstand på -1,0 μm (avstand til flekkene fra innsiden av overflaten) i nedre terskelboks , og en maksimal avstand på 0,1 μm (avstand fra utsiden) i Øvre terskel-boksen . Klikk knappen Dupliser merket område til nye flekker for å fullføre genereringen av flekker nær overflaten.
- Generer konveks skrog og samle inn territoriummåling
- Kontroller at de nyopprettede Spots er valgt øverst til venstre i programvarevinduet (f.eks. Klikk på tannhjulverktøyikonet , og deretter Convex Hull-plugin . Klikk på plugin-modulen bare en gang og vent til MATLAB-vinduet vises og deretter forsvinne (dette kan ta flere sekunder). Et solid skrog vil dukke opp i 3D-visningen.
- I panelet øverst til venstre velger du Konveks skrog av spots X-valg ['Korteste avstand...], der 'Spots X Selection' er de nyopprettede stedene (f.eks. valg av punkt 1), og klikk deretter på skroget for å velge det (figur 2F).
- Klikk på grafstatistikkikonet , velg kategorien Utvalg , sørg for at bestemte verdier er valgt fra den øverste rullegardinlisten, og velg deretter Volum fra den nederste rullegardinlisten. Registrer volumet på skroget. Lagre filen, og fortsett til neste bilde.
- Måleområde overlapper volumet for nærliggende celler med forskjellige fluorescerende etiketter
MERK: Denne delen av protokollen kan brukes hvis prøvene bare inneholder nærliggende astrocytter som uttrykker distinkte fluorescerende etiketter (astrocytt 1 uttrykker kun GFP og Astrocyte 2 uttrykker kun RFP). Denne merkingen ble oppnådd ved hjelp av virale eller genetiske strategier som tidligere beskrevet 9,10 (figur 3A).- Bruk trinnene som er beskrevet i trinn 5.4-5.6, til å skape overflaten, flekkene nær overflaten og det konvekse skroget for hver astrocytt (figur 3B).
- Med Convex Hull of Spots 1 Selection... valgt, klikk på blyantredigeringsikonet og klikk på Maskevalg. Kontroller at det er merket av for Kanal 1 (eller kanalen som representerer astrocytt 1) i Maskekanal-vinduet, og kontroller at det er merket av for boksen ved siden av duplikatkanalen før du bruker maske . Klikk på OK for å opprette kanalen Maskert CH1.
- Med konvekse hull av flekker 2 utvalg... valgt, klikker du på blyantredigeringsikonet og klikker på Maskevalg. I Maskekanal-vinduet velger du Kanal 2 (eller kanalen som representerer astrocytt 2) fra rullegardinmenyen, og kontrollerer at boksen ved siden av duplikatkanalen før du bruker maskealternativet , er merket av. Klikk ok for å opprette kanalen Maskert CH2 (figur 3C).
- Klikk på Coloc-knappen øverst på skjermen og bruk Coloc-verktøyet til å opprette en samlokaliseringskanal for de to maskerte kanalene. Sett kanal A til kanal 3 - maskert CH1 og kanal B til kanal 4 - maskert CH2 (figur 3D).
- Dra den gule histogramlinjen mot venstre for begge kanalene. Bruk stykkevisningen nedenfor til å observere samlokaliseringssignalet, som vil være synlig i grått. Legg merke til at siden fluorescerende signaler fra de to cellene faktisk ikke er samlokalisering, må terskelen flyttes til venstre slik at falske samlokaliseringer begynner å vises på punkter av cellecellekontakt.
- Klikk på Bygg Coloc Channel på høyre side for å fullføre prosessen. Klikk på 3D-visningen for å gå tilbake til standard 3D-visning. En Colocalization Result-kanal vil nå være synlig i grått og vises i visningsjusteringsboksen.
- Lag overflaten, flekkene nær overflaten og det konvekse skroget til Colocalization Result-kanalen ved hjelp av trinnene som er beskrevet i 5.4-5.7 (figur 3E,F).
- Registrer volumet på konveks skroget. Dette er territoriets overlappingsvolum. Del dette tallet på distriktsvolumet til en av astrocyttene for å beregne prosentandelen av distriktsoverlapping. Velg kontroll eller wild-type astrocytt hvis en av astrocyttene er genetisk manipulert med hensyn til den andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en skjematisk oversikt over hovedtrinnene og arbeidsflyten for denne protokollen. Figur 2 viser skjermbilder av viktige trinn ved hjelp av bildeanalyseprogramvaren for å generere en overflate, generere flekker nær overflaten og generere et konveks skrog. Figur 3 viser anvendelsen av denne teknikken for å bestemme astrocyttområdeoverlapping/-flislegging. I figur 4 viser representative resultater fra et tidligere publisert manuskript9 anvendelsen av denne protokollen. I figur 4A og figur 4B reduserer nedslag av det astrocyttberikede celleadhesjonsmolekylet hepaCAM betydelig astrocyttområdevolumet. I figur 4C og figur 4D ble mosaikkanalyse med doble markører (MADM) brukt til å introdusere sparsom mosaikkmerking og samtidig genetisk modifikasjon i musebarken. Med MADM ble mus generert der ville astrocytter uttrykker et rødt fluorescerende protein (RFP) og Hepacam knockout astrocytter uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP). Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor ble prosentandelen av distrikt overlapping mellom nærliggende RFP og GFP astrocyttpar (WT:KO) beregnet. Som en kontroll ble dette sammenlignet med nærliggende RFP- og GFP-astrocyttpar hos mus uten genetisk modifikasjon av Hepacam (WT:WT). WT:KO astrocyttpar viste en signifikant økt prosentandel av territoriets overlappingsvolum sammenlignet med WT:WT astrocyttpar. Samlet viser disse resultatene at hepaCAM er nødvendig for normalt astrocyttområdevolum og astrocyttfliser.
Figur 1: Oversikt over arbeidsflyt for analyse av astrocyttområdevolum. (A) Protokollen krever en mus med sparsom eller mosaikk fluorescerende merking av astrocytter. (B) Musen er perfundert og deretter hjernen blir oppdaget, behandlet og frosset. (C) Den frosne hjernen er seksjonert ved hjelp av en kryostat og (D) de frittflytende vevsdelene samles inn. (E) Etter seksjonering blir de flytende vevsdelene farget av immunhiistokjemi og deretter (F) montert på lysbilder. (G) Astrocytter i de monterte vevsdelene er avbildet ved hjelp av konfektmikroskopi. (H) Til slutt kvantifiseres bildecellenes territoriumvolumer ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Viktige trinn i bildeanalyseprosedyren for astrocyttområdevolum. (A) Visning av celle med interesseområdeboks som utelukker andre signaler i bildet fra analyseprosedyren. (B) En akseptabel relativ terskel for overflateoppretting (grå) ved hjelp av signal (rød). (C) Fullført overflate med hovedcelle valgt (gul). Andre deler av overflaten som ikke er cellen, slettes (rødt). (D) Gjennomskinnelig overflate med flekker opprettet. (E) Nærbilde av den gjennomskinnelige overflaten med flekker opprettet for å vise en akseptabel fordeling av flekker i forhold til overflaten. (F) Endelig konveks skrog. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Viktige trinn i astrocyttområdeoverlappingsanalyse. (A) Representativt bilde av to astrocytter som uttrykker forskjellige fluorescerende markører, GFP (grønn) og RFP (magenta). (B) Generering av et konveks skrog for hver astrocytt. (C) Visning av maskerte GFP- og RFP-kanaler, med originale kanaler fjernet. (D) Eksempel på terskelverdi ved hjelp av "Coloc"-verktøyet for å opprette en "Colocalization Result"-kanal. Det "colokaliserte" signalet vises i grått. (E) Visning av de to maskerte kanalene. (F) En rotert visning av det konvekse skroget til kanalen "Colocalization Result" (grå) som representerer territoriets overlappingsvolum. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vellykket anvendelse av protokollen for å måle astrocyttområdevolum og astrocyttområdeoverlapping. (A) Astrocytter i visuell cortex av wild-type CD1-mus på postnatal dag 21, som uttrykker mCherry-CAAX (cyan) og en kontroll shRNA (shScramble) eller en shRNA rettet mot hepaCAM (shHepacam). Astrocyttområdet er skissert i rødt. (B) Tap av hepaCAM reduserer astrocyttområdevolumet betydelig. Datapunkt representerer individuelle musegjennomsnitt. Feilfelt er ± s.e.m. Nestet t-test. (C) Nærliggende astrocytter i musebarken på barseldag 21 som uttrykker GFP (grønn) eller RFP (magenta). I MADM9 WT:WT-mus er begge astrocytter ville. I MADM9 WT:KO-mus er den grønne astrocytten villtype og magenta astrocytten er null for Hepacam. Overlappingsvolumet for distriktet vises i blått. (MADM9 WT:WT genotype: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO genotype: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). (D) Kvantifisering av prosentandelen av distriktsvolumet overlapper. Datapunkt representerer individuelle musegjennomsnitt. Feilfelt er ± s.e.m. Nestet t-test. Skalastenger = 20 μm. Panelene i denne figuren er gjengitt fra Baldwin et al9 med tillatelse fra utgiveren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en etablert metode for å analysere astrocyttområdevolum og astrocyttfliser i musebarken, som beskriver alle de viktigste trinnene som begynner med perfusjon og slutter med bildeanalyse. Denne protokollen krever hjerner fra mus som uttrykker fluorescerende proteiner i en sparsom eller mosaikkpopulasjon av astrocytter. Utenfor dette kravet kan mus i alle aldre brukes til denne protokollen, med bare mindre justeringer av perfusjonsinnstillinger og volumet av frysemedier lagt til innebyggingsformen. Mens andre metoder har blitt publisert for analyse av astrocytt forgrening av kompleksitet og volum i hjernevevsseksjoner 7,11, har denne protokollen flere unike fordeler. Først beskriver denne protokollen en egendefinert kode som kan brukes til å hente astrocyttdistriktsvolum. Astrocytt territorium volum er en distinkt måling fra astrocytt cellevolum, ved at den måler hele rommet okkupert av en astrocytt, uavhengig av dens forgrening kompleksitet. Videre beskriver denne protokollen hvordan du bruker astrocyttdistriktets volummåling for å måle astrocyttområdeoverlappingsvolum, og derfor astrocyttfliser. Til slutt gir denne protokollen en detaljert drøfting av potensielle variabler som kan påvirke astrocyttområdevolum og datainnsamling, inkludert monteringsbetingelser, prøvelagringsforhold og inklusjons- og ekskluderingskriterier for avbildning og analyse. I tillegg til disse unike funksjonene, kan mange aspekter av denne protokollen, inkludert perfusjon, kryoseksjon og immunoppfatning av frittflytende seksjoner, brukes bredt på farging av hjernevevsdeler av forskjellige tykkelser og med forskjellige antistoffkombinasjoner. Nedenfor diskuteres kritiske trinn, viktige hensyn, feilsøking og begrensninger i detalj.
Vurderinger ved eksempelinnsamling
En svært viktig vurdering for eksperimenter designet for å undersøke astrocyttmorfologi er å opprettholde en konsekvent tid på dagen for prøveinnsamling. Voksende bevis tyder på at astrocyttfunksjonelle tilstander er knyttet til døgnrytme og søvnatferd14. For å fjerne variasjoner som kan innføres ved at prøver samles inn på forskjellige tidspunkter på dagen, bør perfusjoner planlegges slik at alle prøver for et eksperiment samles inn omtrent på samme tid på dagen, innen et tidsrom på 2-3 timer. For konsistente perfusjoner anbefales det på det sterkeste å bruke en peristaltisk pumpe. Tilsetningen av heparin til TBS er nyttig for å redusere dannelsen av blodpropper. Selv om denne protokollen ikke er testet med kortere etterfikseringstider, kan det hende at etterfiksering over natten ikke er nødvendig, og en kortere etterfiksering på 4 timer kan vurderes.
Feilsøkingstips for kryoosectioning
Frysende hjerner i frysemediet 2:1 Sukrose:OCT reduserer mengden OKT i oppsamlingsbrønnene etter seksjonering. Når det er frosset, oppfører frysemediet seg på samme måte som OCT selv, men er mindre sprø. Når du fryser vevsblokken til chucken, må du trykke den flatt på chucken umiddelbart etter at du har lagt OCT til chucken. Hvis vevsblokken bryter av chucken under seksjonering, bruk et barberblad til å kutte en ny flat overflate på bunnen og fryse på chucken igjen. Å gi chucken tilstrekkelig tid til å avkjøles til kryostatkammertemperaturen før du legger til OCT og sørger for at chucken er ren og tørr, vil forbedre overholdelsen. Når du flytter vevsseksjoner med penselen, berører du penselen til hjørnekanten av delen, slik at den berører OCT og ikke selve vevet. Med litt fuktighet vil delen holde seg til børsten. Plasser vevet forsiktig inn i seksjonsmediet ved å berøre motsatt kant av delen til mediet og la det trekkes inn i mediet. Hvis børsten berører frysemediet, tørker du det av på et papirhåndkle i kryostaten. En børste som er for våt, vil gjøre det vanskelig å overføre seksjoner til parabolen. OKT skal oppløses når vevsseksjonen er plassert i seksjonsmediet. Hvis den ikke gjør det, kan kryostatkammertemperaturen være for lav.
Viktige hensyn for farging og montering av vevsseksjoner
For å forbedre fargekvaliteten, forberede TBST frisk før hvert eksperiment. Bruk en høykvalitets 10 % vandig Triton-kilde (Materialfortegnelser). Velg et serum som samsvarer med arten der det sekundære antistoffet ble laget (bruk for eksempel geitserum for en geit anti-kanin sekundær). Antistoffløsninger sentrifugeres før bruk, til pellets og fjerner eventuelt utfelt antistoff. Pass på at du ikke forstyrrer pelletsen når du overfører antistoffoppløsning fra røret til platen (dette kan bety pipettering litt mindre enn 1 ml antistoffoppløsning per brønn for ikke å berøre bunnen av røret med pipettespissen). Dette trinnet bidrar til å redusere bakgrunnsfarging. Når seksjoner plasseres i TBS:dH2O, vil de fleste utfolde seg/løsne seg selv, men noen kan forbli brettet eller vridd. Når du overfører deler til lysbildet med en pensel, bruker du en P200-spiss i den andre hånden for å hjelpe til med å lede vevsdelen til riktig sted. Bruk børsten til forsiktig å brette ut eller løsne deler slik at de ligger flatt. Seksjoner har en tendens til å bevege seg mot den aspirerende pipetten når væsken fjernes. Bruk P200-spissen til å holde mobile seksjoner på plass mens du aspirerer. Monteringsmedier må legges til seksjonene umiddelbart etter at all overflødig væske er fjernet og før seksjonene har tid til å tørke. Å la seksjonene tørke selv i noen minutter vil drastisk påvirke volumet av cellene i seksjonen. Når du har lagt til monteringsmediet i lysbildet, bruker du en pipet til å fjerne eventuelle synlige bobler. Etter å ha lagt til dekslene, sørg for å fjerne overflødige monteringsmedier fra sidene, da dette vil forstyrre neglelakkens evne til å tørke. La neglelakken tørke ved romtemperatur. Vent i minst 2 timer eller til neste dag for å avbilde seksjonene, for å sikre at monteringsmediet har nok tid til å trenge helt inn i de tykke seksjonene.
Bilde av fullstendige astrocytter
Ved avbildning av astrocytter for volumanalyse for distrikt, er det viktig at bildet fanger opp hele volumet av astrocytten. Mange merkede astrocytter i vevsdelen vil være ufullstendige astrocytter. Komplette astrocytter vil være fullt inneholdt i vevsseksjonen. For å identifisere komplette astrocytter, begynn med et fokuspunkt midt i astrocytten. Bruk fokusknappen til å gå til toppen av astrocytten. Når astrocytten ikke lenger er i fokus, bør andre egenskaper i vevet forbli i fokus. Gjenta denne prosessen for bunnen av astrocytten. Ikke bilde ufullstendige astrocytter. På grunn av tykkelsen på seksjonene er antistoffinntrengning ikke så robust midt i delen. Merkingen kan være sterkere rundt ytterkantene av astrocytten og svakere i midten. Dette observeres ofte og påvirker ikke territoriumanalyse.
Tips for bildeanalyse
Det viktigste hensynet for bildeanalysedelen av protokollen er å sikre at konveks skroget bare representerer en astrocytt. Følg inklusjons- og eksklusjonskriteriene hver gang. Noen ganger vil to astrocytter ha cellekroppene sine veldig nær hverandre. Dette kan være vanskelig å identifisere i 3D-visningen, men kan identifiseres ved hjelp av stykkevisningen. Hvis det er andre fluorescerende merket astrocytter som kontakter astrocytten av interesse, kan dette komplisere overflateopprettingsprosessen. Hvis en rimelig klar grense er synlig mellom de to cellene (for eksempel kobler de bare sammen på ett lite grenpunkt), kan klippverktøyet brukes til å lage et kutt i overflaten, og denne delen av overflaten kan slettes. Når du har opprettet overflaten, roterer du cellen i 3D-visning for å se etter små biter av overflate som kan gjemme seg bak cellen, men som ikke er en del av cellen. Slett disse før du fortsetter. Hvis det konvekse skroget stikker drastisk ut til et punkt utenfor astrocyttområdet, er det sannsynligvis et stykke ikke-celleoverflate som ikke ble fjernet. Hvis programvaren rutinemessig krasjer under overflateoppretting, kan overflatedetaljnummeret reduseres. Hvis den krasjer under oppretting av flekker, bruker du en interesseregion til å opprette flekker bare i nærheten av overflateobjektet.
Begrensninger i protokollen
Selv om det er mange bruksområder og fordeler med denne protokollen, er det også flere begrensninger. Denne protokollen krever mus som allerede uttrykker fluorescerende proteiner i en sparsom populasjon av astrocytter, men beskriver ikke metodene for å introdusere uttrykket av fluorescerende proteiner i astrocytter. Bilde- og analyserørledningene er tidkrevende og er ikke godt egnet for analyse av høy gjennomstrømning. Videre er de rettet spesielt mot å måle astrocytt territorium volum og flislegging, i stedet for å definere de detaljerte morfologiske egenskapene til individuelle astrocytter. Andre kan finne det nyttig å kombinere tilnærminger og strategier i denne protokollen med nylig publiserte protokoller som beskriver metoder for måling av astrocyttmorfologiske kompleksitet 7,11. Til slutt er de kommersielle programvareplattformene som brukes i denne protokollen (dvs. Imaris og MATLAB) dyre og krever lisens til å bruke. Mens store institusjoner ofte kjøper lisenser for disse programvareplattformene, kan dette være kostnadsforbudende for mindre institusjoner og individuelle laboratorier. Fremskritt innen mikroskopi, åpen kildekode-bildeanalyseprogramvare og maskinlæringsalgoritmer kan bidra til å gjøre denne protokollen allment tilgjengelig for alle laboratorier, og kan også forbedre effektiviteten av bildeanskaffelse og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Mikroskopi ble utført ved UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060), delvis støttet av finansiering fra NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124. Figur 1 ble opprettet med BioRender.com. Bildene og dataene i figur 4 skrives ut på nytt fra en tidligere publikasjon9 med tillatelse fra utgiveren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
