Summary
Bu protokol, fare beyninin serbest yüzen doku bölümlerini bölümleme, boyama ve görüntüleme yöntemlerini açıklar, ardından astrosit bölgesi hacminin ve astrosit bölgesi örtüşmesinin veya döşemesinin analizinin ayrıntılı bir açıklaması gelir.
Abstract
Astrositler, beyindeki hemen hemen her tür hücre ve yapı ile etkileşime girmelerini sağlayan şaşırtıcı derecede morfolojik karmaşıklığa sahiptir. Bu etkileşimler sayesinde, astrositler sinaps oluşumu, nörotransmisyon ve iyon homeostazı dahil olmak üzere birçok kritik beyin fonksiyonunu aktif olarak düzenler. Kemirgen beyninde, astrositler doğum sonrası ilk üç hafta boyunca boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve beyni döşemek için farklı, örtüşmeyen bölgeler oluşturur. Bu protokol, fare beyninden serbest yüzen doku kesitleri kullanarak astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için yerleşik bir yöntem sağlar. İlk olarak, bu protokol serbest yüzen doku kesitlerinin doku toplanması, kriyoseksiyonu ve immün boyama adımlarını açıklar. İkincisi, bu protokol, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımını kullanarak astrosit bölgesi hacminin ve bölge örtüşme hacminin görüntü alımını ve analizini açıklar. Son olarak, bu makale bu yöntemlerin avantajlarını, önemli hususlarını, ortak tuzaklarını ve sınırlamalarını tartışmaktadır. Bu protokol, astrositlerin seyrek veya mozaik floresan etiketlemeli beyin dokusunu gerektirir ve ortak laboratuvar ekipmanı, konfokal mikroskopi ve ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
Introduction
Astrositler, beyinde birçok önemli işlevi yerine getiren özenle dallanmış hücrelerdir1. Fare korteksinde, radyal glial kök hücreler, geç embriyonik ve erken doğum sonrası aşamalarda astrositlere yol açar2. Doğum sonrası ilk üç hafta boyunca, astrositler boyut ve karmaşıklık bakımından büyür ve sinapslarla doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal geliştirir1. Aynı zamanda, astrositler komşu astrositlerle etkileşime girerek beynidöşemek için ayrık, örtüşmeyen bölgeler oluşturur 3, aynı zamanda boşluk kavşak kanalları4 aracılığıyla iletişimi sürdürür. Astrosit morfolojisi ve organizasyonu, hakaret veya yaralanma5'i takiben birçok hastalık durumunda bozulur ve bu süreçlerin uygun beyin fonksiyonu için önemini gösterir. Normal gelişim, yaşlanma ve hastalık sırasında astrosit morfolojik özelliklerinin analizi, astrosit biyolojisi ve fizyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, genetik manipülasyonu takiben astrosit morfolojisinin analizi, astrosit morfolojik karmaşıklığının kurulmasını ve sürdürülmesini yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları ayırt etmek için değerli bir araçtır.
Fare beynindeki astrosit morfolojisinin analizi, hem astrosit dallanma karmaşıklığı hem de astrosit döşemesi ile karmaşıktır. Astrosit-spesifik bir belirteç olarak ara filament glial fibriler asidik proteini (GFAP) kullanan antikor boyaması, sadece ana dalları yakalar ve astrosit morfolojik karmaşıklığını büyük ölçüde hafife alır1. Glutamat taşıyıcı 1 (GLT-1; slc1a2), glutamin sentetaz veya S100β gibi diğer hücreye özgü belirteçler, astrosit dalları6'yı etiketlemek için daha iyi bir iş çıkarır, ancak yeni bir sorun ortaya çıkarır. Astrosit bölgeleri büyük ölçüde örtüşmez, ancak periferik kenarlarda küçük bir örtüşme derecesi vardır. Dallanmanın karmaşıklığı nedeniyle, komşu astrositler aynı renkte etiketlendiğinde, bir astrositin nerede bittiğini ve diğerinin nerede başladığını ayırt etmek imkansızdır. Astrositlerin endojen floresan proteinlerle seyrek veya mozaik etiketlenmesi her iki sorunu da çözer: floresan işaretleyici, tüm dalları yakalamak için hücreyi doldurur ve komşularından ayırt edilebilen bireysel astrositlerin görüntülenmesine izin verir. Viral enjeksiyon, plazmid elektroporasyonu veya transgenik fare çizgileri dahil olmak üzere genetik manipülasyon olsun veya olmasın, astrositlerin seyrek floresan etiketlemesini sağlamak için birkaç farklı strateji kullanılmıştır. Bu stratejilerin uygulanmasına ilişkin ayrıntılar daha önce yayınlanmış çalışmalarda veprotokoller 1,7,8,9,10,11,12,13'te açıklanmıştır.
Bu makalede, seyrek bir astrosit popülasyonunda floresan etiketleme ile fare beyinlerinden astrosit bölgesi hacmini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Fare korteksindeki bir astrositin ortalama çapı yaklaşık 60 μm olduğundan, bireysel astrositleri bütünüyle yakalamadaki verimliliği artırmak için 100 μm kalınlığında bölümler kullanılır. İmmünoboyama gerekli değildir, ancak konfokal görüntüleme ve analiz için endojen floresan sinyalini arttırmak için önerilir. İmmün boyama ayrıca ince astrosit dallarının daha iyi tespit edilmesini sağlayabilir ve görüntü elde etme sırasında endojen proteinlerin fotobeyazlatmasını azaltabilir. Kalın kesitlere antikor penetrasyonunu arttırmak ve doku hacmini görüntüleme yoluyla kesitlemeden korumak için serbest yüzen doku kesitleri kullanılır. Astrosit bölgesi hacminin analizi, ticari olarak temin edilebilen görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ek olarak, bu protokol, komşu astrositlerin farklı floresan etiketlerini ifade ettiği mozaik etiketli doku kesitlerinde astrosit döşemesinin analizi için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, normal beyin gelişimi sırasında astrosit büyümesini ve genetik manipülasyonun astrosit gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmek için 1,8,9 numaralı son çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Karşılaştırmalı Tıp Bölümü (IACUC protokol numarası 21-116.0) uyarınca kullanılmıştır. Bu deneyler için doğum sonrası 21. günde (P21) her iki cinsiyetten fareler kullanıldı. CD1 fareleri ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosu) ve MADM9 WT: WT ve MADM9 WT: KO fareleri daha önce9 olarak tanımlandı.
NOT: Bu protokol, seyrek bir astrosit popülasyonunda floresan protein ekspresyonuna sahip beyinler gerektirir. Floresan protein ekspresyonu genetik, viral veya elektroporasyon yoluyla tanıtılabilir. Astrositleri seyrek etiketleme yöntemlerinin ayrıntıları daha önce yayınlanmış çalışmalarda veprotokoller 1,7,8,9,10,11,12,13'te açıklanmıştır.
1. Doku toplama ve hazırlama
DİKKAT: Paraformaldehit (PFA) tehlikeli bir kimyasaldır. PFA ile tüm adımları kimyasal bir davlumbazda gerçekleştirin.
- Enjekte edilebilir bir anestezi ile fareleri anestezik (örneğin, Avertin; 0.8 mg / kg) ile uyuşturun ve bir ayak parmağı sıkışması ile anestezi derinliği sağlayın. Karaciğer berraklaşana kadar (tipik olarak 3-5 dakika) buz gibi soğuk Tris-tamponlu salin (TBS) + Heparin ile ~3 mL / dak oranında intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirmek için peristaltik bir pompa kullanın, ardından TBS'de buz soğuk% 4 PFA, 5 dakika boyunca ~3 mL / dak oranında.
NOT: Akış hızı ve süreleri, doğum sonrası gün 21 (P21) fareler için optimize edilmiştir. Farklı yaşlardaki fareler için akış hızı ve perfüzyon süresinde ayarlamalar gerekebilir. - Perfüzyonu takiben, kafatayı ayırmak ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi çıkarmak için bir çift ameliyat makası kullanın. Daha sonra, beyni açığa çıkarmak için kafatasının üstünü çıkarmak için bir çift mikro diseksiyon makası kullanın. Beyni çıkarmak ve buz soğuk% 4 PFA içeren bir tüpe aktarmak için bir çift forseps veya küçük bir spatula kullanın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: 7 mL sintilasyon şişesi gibi düz tabanlı bir tüp kullandığınızdan emin olun, böylece beyin tüpün dibinde sıkışmaz, bu da dokuyu sıkıştırabilir ve astrosit hacmini değiştirebilir. - Ertesi gün, PFA'yı tüpten dökün. Beyni durulamak ve artık PFA'yı çıkarmak için tüpe 5 mL 1x TBS ekleyin. TBS'yi dökün ve toplam üç durulama için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
- TBS'ye 4-5 mL% 30 sakkaroz ekleyin ve beyni 1-2 gün boyunca 4 ° C'de veya beyin tüpün dibine batana kadar inkübe edin.
NOT: Beyinler battıktan sonra donmaya hazırdır, ancak birkaç hafta boyunca 4 ° C'de sakkaroz çözeltisinde saklanabilir. - TBS'de 30 mL% 30 sakkaroz ile 15 mL% 100 optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğini karıştırarak 50 mL'lik bir tüpte dondurma ortamı hazırlayın. Herhangi bir kabarcığın yüzeye çıkmasına izin vermek için tüpü bir saat daha dik tutun.
NOT: Dondurucu ortam önceden hazırlanabilir ve birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir. - Kare gömme kalıbına dondurucu bir ortam eklemek için serolojik bir pipet kullanın (Malzeme Tablosu). Ortama kabarcıklar sokmaktan kaçınmaya özen gösterin. Bir P21 fare beyni için 3 mL yeterlidir. Ses seviyesini farklı yaşlar için gerektiği gibi ayarlayın, böylece beyin tamamen suya batırılır.
- Beyni ortama ekleyin ve beynin kalıpta düz oturmasını engelleyebilecek herhangi bir beyin sapını çıkarmak için bir çift # 5 forseps kullanın. Beynin ön tarafını kalıbın bir kenarı ile hizalayın.
- Kalıbı kuru buzla soğutulmuş düz bir yüzeye aktarın. Kuru buzla doldurulmuş metal bir öğle yemeği kalıbı bu amaç için iyi çalışır. Yavaş ve hatta donmayı sağlamak için kalıbı kuru buz topaklarıyla çevreleyin.
- Donma ortamı tamamen beyaz ve katı olduğunda, kalıbı -80 ° C'de saklayın.
NOT: Beyinler birkaç yıl boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
2. Tiroseksiyon
NOT: Bu bölümleme yöntemi, piyasada bulunan birçok farklı kriyostatla çalışmak üzere tasarlanmıştır. Burada kullanılan kriyostat ile (Malzeme Tablosu), optimum numune kafası kesme sıcaklığı -23 °C'dir ve ortam haznesi sıcaklığı -23 °C ile -25 °C arasındadır.
DİKKAT: Kriyostat bıçağı son derece keskindir. Bıçağı manipüle ederken ve kriyostatı çalıştırırken dikkatli olun.
- 50 mL'lik bir tüpte 25 mL 1x TBS ve 25 mL gliserol karıştırarak kesit ortamı hazırlayın. Gliserolü doğrudan tüpe dökerek ve ölçüm için tüp üzerindeki belirteçleri kullanarak eklemek en kolay yoldur. Karıştırmak için tüpü sallayın / vorteksleyin. Bu çözelti birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
- 12 delikli bir plakaya kuyu başına 2 mL kesit ortamı ekleyerek doku kesitlerini toplamaya hazırlanın. Plakanın üstünü ve altını numune bilgileriyle etiketleyin. Plakayı, diğer malzemelerle (kriyostat bıçağı, tıraş bıçağı, mandrenler ve boya fırçaları) birlikte doğrudan kriyostatın içine yerleştirin ve ~ 5 dakika boyunca sıcaklığa alışmalarını sağlayın.
- Beyinleri kriyostat odasına taşıyın ve malzemelerle birlikte sıcaklığa alışmalarına izin verin.
- Kalıbın iki köşesini jilet bıçağı ile keserek ve kalıbı dokudan uzaklaştırarak donmuş doku bloğunu kalıptan çıkarın. Bloğu, beynin önü yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
- Aynaya OCT'yi ekleyin, böylece aynanın ~ 2 / 3'ü OCT ile kaplanır ve doku bloğunu hemen yukarıda açıklanan oryantasyonu koruyarak mandren üzerine yerleştirin. Bloğu OCT'ye doğru bastırın, böylece aynanın yüzeyinde düz olur.
- OCT tamamen dondurulduktan ve doku bloğu güvenli bir şekilde yerine oturduğunda, mandren numune kafasına kelepçeleyin. Kriyostat bıçağını takın ve bıçağı numuneye yaklaştırın.
- İlgilenilen beyin bölgesine ulaşılmadan hemen öncesine kadar 100 μm aralıklarla beyinden kesin. Kesitleme ortamında çözünen OCT miktarını azaltmak için, fazla donma ortamını doku bloğunun yanlarından kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
- İlgilenilen bölgeye ulaşıldığında, 100 μm kalınlığında bölümler toplamaya başlayın. Yuvarlanma önleyici plakayı kullanarak veya bir elinizle kriyostatı yavaşça ilerletirken, diğer elinizde bir boya fırçası kullanarak kesitleri toplayın ve bıçağı karşılarken bölümü bloktan uzaklaştırın. Kriyostat modelinde bir pedal varsa, kriyostatı ilerletmek için pedalı kullanın, böylece her iki el de bölümü bloktan çıkarmak için kullanılabilir.
- Bölümleri bir boya fırçası veya forseps kullanarak 12 delikli plakaya aktarın. Her kuyu en az 10-12 bölüm tutabilir. Bölümü ortama eklerken, bölümün alt kenarını kesit ortamına dokunmak ve fırça veya forseps ıslanmadan bölümün ortama erimesine izin vermek genellikle yeterlidir. Fırça ortama dokunursa, aşırı ıslak bir fırça doku bölümlerinin aktarılmasını zorlaştıracağından, bir kağıt havlu veya mendille kurutduğunuzdan emin olun.
- Plakayı folyo veya parafin film ile sararak sabitleyin. Açıkça etiketlediğinizden emin olun, ardından -20 ° C'de saklayın.
NOT: Çoğu boyama protokolü için, kesitler önemli miktarda sinyal kaybı olmadan en az 1-2 yıl boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
3. İmmün boyama
NOT: Tüm yıkama ve inkübasyonları yaklaşık 100 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel platform çalkalayıcısında gerçekleştirin. 4 °C'de gerçekleştirilen birincil antikor inkübasyonu hariç tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Malzemeleri 50 mL'lik bir tüpte birleştirerek ve gece boyunca bir nutatörde karıştırarak montaj ortamını önceden hazırlayın. Işıktan koruyun ve 4 °C'de 2 aya kadar saklayın. Endojen floresan sinyali, immün boyamaya gerek kalmadan görüntüleme ve analiz için yeterliyse, adım 3.1-3.9 atlanabilir. İmmün boyamayı atlıyorsanız, TBS'de üç adet 10 dakikalık yıkama yapın ve adım 3.10'a geçin.
- 50 mL'lik bir tüpe 1 mL% 10 Triton-X ekleyerek ve tüpü 1x TBS ile 50 mL'ye doldurarak taze bir TBST çözeltisi (TBS'de% 0.2 Triton) hazırlayın. Her beyin için 2 mL blokaj ve antikor çözeltisi (TBST'de% 10 keçi serumu) hazırlayın.
NOT: En iyi sonuçlar için, her yeni boyama deneyi için taze TBST yapın ve yüksek kaliteli% 10 sulu Triton-X (Malzeme Tablosu) kaynağı kullanın. - 24 delikli bir plakayı şemaya göre etiketleyin (Şekil 1). Farklı örnekleri farklı satırlara ve farklı sütunlara farklı çözümler yerleştirin. İlk üç sütuna 1 mL TBST ekleyin ("1'i Yıka", "2'yi Yıka" ve "3'ü Yıka"). Dördüncü sütuna 1 mL engelleme çözeltisi ekleyin.
- Bir Bunsen brülörü kullanarak Pasteur pipetindeki 5.75'in ucunu küçük bir kancada eriterek bir cam toplama hazırlayın. 12 delikli plakadan doku kesitlerini 24 delikli plakanın Wash 1 sütununa aktarmak için bu seçimi kullanın.
NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, boyamaya başlamadan önce bölümleri tarayın. Bölümleri taramak için, bölümleri tek tek 1x TBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve yeterli sayıda floresan etiketli hücrenin bulunduğundan emin olmak için 5x veya 10x hedefli bir floresan mikroskop kullanarak bölümleri inceleyin. Kuyu başına dört ila altı bölümün boyanması önerilir, ancak gerekirse kuyu başına sekize kadar boyanabilir. - Bölümleri 1, 2 ve 3 kuyucuklarında her biri 10 dakika boyunca yıkayın, ardından bölümleri blokaj çözeltisinde 1 saat inkübe edin. Bölümleri bir kuyudan diğerine aktarmak için cam tutucuyu kullanın. Seçim, aynı anda birden fazla beyin bölümünü aktarmak için kullanılabilir.
- Her numune için 1 mL birincil antikor çözeltisi hazırlayın (örneğin, Tavşan RFP 1:2000 veya Tavuk GFP 1:2000). Antikoru antikor çözeltisine ekleyin, kısaca vorteks yapın ve ardından 4 ° C'de 4.000 x g '≥ 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Sallarken 4 ° C'de iki ila üç gece boyunca primer antikordaki bölümleri inkübe edin.
- Birincil antikor inkübasyonundan sonra, yıkama kuyularından 1 TBST Gününü aspire edin, her yıkama kuyusuna 1 mL yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Bölümleri her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın.
NOT: Aspirasyon için, bir vakum şişesine boru ile bağlanmış 9 inçlik bir Pasteur pipet kullanın. Ev vakum hatları veya elektrikli vakum pompası vakum kaynağı olarak kullanılabilir. - Bölümler yıkanırken, antikor çözeltisine antikorlar ekleyerek 1:200 konsantrasyonunda ikincil antikor çözeltileri hazırlayın (örneğin, keçi anti-tavşan 594 veya keçi anti-tavuk 488). Vorteksi kısaca yapın ve ardından 4 ° C'de 4.000 x g '≥ 5 dakika boyunca döndürün.
- Sekonder antikordaki bölümleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca inkübe edin. Bu adımda ve ikincil antikorların ağartılmasını azaltmak için aşağıdaki tüm adımlar sırasında bölümleri ışıktan koruyun.
- İkincil antikor inkübasyonundan sonra, 2. Gün TBST'yi yıkama kuyularından aspire edin, her yıkama kuyusuna 1 mL yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın. Bölümleri TBST'de her biri 10 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
- Son yıkama sırasında, montaj ortamını 4 ° C'den çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. 2: 1 TBS: dH2O karışımı hazırlayın ve bunu bir Petri kabına ekleyin. Yüzeye 800 μL 2:1 TBS:dH2O ekleyerek bir mikroskop slaytı hazırlayın.
NOT: Kürlenmeyen montaj ortamının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Sertleşen montaj ortamı, astrosit bölgesi hacminin analizini karıştırabilecek doku hacmini değiştirebilir. Malzeme Tablosunda basit ve ucuz bir ev yapımı montaj ortamı için bir tarif verilmiştir. - İnce bir boya fırçası kullanarak, bölümleri birer birer Wash 3 kuyusundan Petri kabına aktarın. Bu adım tritonu kaldırır ve bölümlerin düzleşmesine yardımcı olur. Daha sonra bölümleri Petri kabından slayttaki sıvıya aktarın.
- Bölümleri slaytta düz olacak şekilde düzenlemeye yardımcı olması için bir boya fırçası kullanın. P1000 pipet ile slayttaki fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın ve ardından vakum aspirasyonu uygulayın.
NOT: Vakum aspirasyonunun daha hassas kontrolü için Pasteur pipetin sonuna bir P200 pipet ucu ekleyin. - Slayttan tüm fazla sıvı çıkarıldıktan sonra, her bölüme hemen bir damla montaj malzemesi eklemek için bir transfer pipeti kullanın ve slaytın üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirin. Montaj ortamının birkaç dakika yayılmasına izin verin ve ardından kapak kapağının altından vakum aspirasyonu ile çıkan fazla montaj ortamını çıkarın.
NOT: Montaj ortamını eklemeden önce bölümlerin kurumasına izin vermeyin. Montaj ortamı eklenmeden önce bölümler kurumaya başlarsa, bu doku hacmini etkileyebilir ve doğru veri toplamayı engelleyebilir. - Kapak kapağının dört kenarını da şeffaf oje ile kapatın. Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurumaya bırakın ve ardından 4 ° C'de düz bir şekilde saklayın. Görüntülemeden önce en az 2 saat bekleyin veya ertesi gün görüntüleyin.
NOT: GFP ve RFP'ye karşı antikorlarla boyanmış kesitler, oje ile tamamen kapatılmaları koşuluyla, görüntülemeden önce 2 haftaya kadar saklanabilir.
4. Konfokal görüntüleme
NOT: Bu protokol, belirli bir konfokal ve yazılım arabirimi için belirli ayrıntılar yerine, farklı konfokal mikroskoplara yaygın olarak uygulanan genel görüntü yakalama yönergeleri sağlar.
- Görüntüleme için bireysel hücreleri bulmak için 10x hedefi kullanın, deneyle ilgili olarak spesifik beyin bölgesini veya alt bölgesini (örneğin, görsel korteksin 5. katmanı) not alın. Tüm astrositin bölüm içinde olup olmadığını belirlemek için odak düğmesini kullanın.
- Daha yüksek büyütmeli bir yağ hedefine (örneğin, 40x, 60x veya 63x) geçin ve hücreyi odaklayın. Göz merceğinden bakarken, hücrenin üstünden altına doğru hareket etmek için odak düğmesini kullanın.
- Tüm hücrenin bölüm içinde bulunduğundan emin olmak için hücreyi görsel olarak inceleyin. Hücre aniden odak dışına çıkarsa ve bölümün kenarında kesilirse, bu hücreyi hariç tutun ve başka bir tane bulun.
- Konfokal mikroskobun ilişkili yakalama yazılımını kullanarak, uygun bir sinyal-gürültü oranı ve ayrıntı seviyesi elde etmek için yakalama parametrelerini ayarlayın (512 x 512 çözünürlük, bölge analizi için yeterli ayrıntı sağlayacak ve görüntü elde etme süresini azaltacaktır). 40x objektif kullanıyorsanız 2x yakınlaştırma kullanın, 60x veya 63x hedef kullanıyorsanız yakınlaştırma kullanmayın.
- Z-yığınının üst ve alt sınırlarını ayarlayın. Tüm astrositin yakalandığından emin olmak için, z-yığınının ilk ve son görüntüleri hücrenin herhangi bir floresan etiketini içermemelidir. Yeterli örnekleme için, 0,5 μm'lik bir adım boyutu kullanın.
5. Görüntü analizi
NOT: Bu protokol, piyasada satılan görüntü analiz yazılımını (örneğin, Imaris ; bkz. Bu yazılımın diğer sürümleri, iş akışında küçük değişikliklerle kullanılabilir. Bu protokol ayrıca MATLAB'ın Convex Hull XTension dosyasını (Ek Dosya) çalıştırmasını gerektirir.
- Çözümlemeye başlamadan önce, dosyayı XT klasörünün rtmatlab alt klasörüne yapıştırarak Convex Hull XTension dosyası XTSpotsConvexHull.m dosyasını yükleyin.
- Görüntüleri '.ims' biçimine dönüştürmek için Imaris Dosya Dönüştürücüsü'nü kullanın. Görüntü analiz yazılımında bir görüntü dosyası açın ve 3B Görünüm düğmesini seçerek görüntüyü 3B görüntüleme modunda görüntüleyin .
- Analizden önce, dahil etme ölçütlerini karşıladığından emin olmak için hücreyi inceleyin.
- Tüm hücrenin görüntü içinde bulunduğundan emin olun (yani, hücrenin hiçbir kısmı görüntüden kesilmemelidir). Ön ve arka kenarları incelemek için görüntüyü döndürün.
- Hücrenin yalnızca bir hücre gövdesine sahip olduğundan emin olun. Dilimle düğmesine tıklayın, z yığınında gezinmek için ekranın solundaki imleci sürükleyin ve etiketli hücrenin yalnızca bir hücre gövdesi içerdiğini doğrulayın.
- Aynı renkle etiketlenmiş komşu astrositlerden ayırt edilebilecek bireysel bir astrosit olduğundan emin olun.
- Yüzey oluşturma
- 3B Görünüm düğmesi tekrar seçiliyken, mavi renkli Yeni Yüzeyler ekle simgesine tıklayarak yeni bir yüzey oluşturun.
- Yazılım penceresinin sol alt köşesinde görünen Oluştur sekmesinde, Algoritma Ayarları için yalnızca İlgi Çekici Bölgeyi Segmente Et ve Nesne-Nesne İstatistikleri kutularının işaretli olduğundan ve Oluşturma Tercihleri için Oluşturmayı Dilimleyici görünümüyle başlat kutusunun işaretli olmadığından emin olun. Devam etmek için mavi oka tıklayın.
NOT: Görüntüde ilgili hücrenin dışında ek bir floresan sinyali yoksa, ilgilenilen bir bölgeye ihtiyaç duyulmayabilir. Bu durumda, Segmenti yalnızca bir İlgi Bölgesi işaretsiz bırakın ve adım 5.4.3'e geçin.
- Yazılım penceresinin sol alt köşesinde görünen Oluştur sekmesinde, Algoritma Ayarları için yalnızca İlgi Çekici Bölgeyi Segmente Et ve Nesne-Nesne İstatistikleri kutularının işaretli olduğundan ve Oluşturma Tercihleri için Oluşturmayı Dilimleyici görünümüyle başlat kutusunun işaretli olmadığından emin olun. Devam etmek için mavi oka tıklayın.
- Yüzey Oluşturma aracının Boyut altındaki kutulara boyutlar girerek veya sarı kutunun kenarlarını sürükleyerek hücrenin etrafında ilgi çekici bir bölge oluşturun (Şekil 2A). Devam etmek için mavi oka tıklayın.
- Analiz için açılır listeden doğru Kaynak Kanalı'nı seçin (örneğin, Kanal 1 veya floresan hücre dolgusunu içeren kanal). Yüzeyler Ayrıntısı kutusundaki değer, yazılım tarafından belirlenir ve görüntü alma parametrelerine dayanır. Bu değerin deneydeki tüm örnekler için sabit kaldığından emin olun. Devam etmek için mavi oka tıklayın.
- Sarı çubuğu sürükleyerek veya kutuya değerler girerek Eşiği (Mutlak Yoğunluk) ayarlayın, böylece gri yüzey hücrenin sınırının ötesine geçmeden hücrenin sinyalinin mümkün olduğunca çoğunu doldurur. Yüzeyin kenarlarında az miktarda floresan sinyali görülecektir (Şekil 2B). Devam etmek için mavi oka tıklayın.
- Yüzey Oluşturma aracının son paneli, yazılımın varsayılan Alt Eşik değeri olan minimum kalite değerini ayarlar. Açılır listede, Voksel Sayısı Img=1'in seçili olduğundan emin olun. Alt Eşik için yalnızca sol güç düğmesinin yeşil (etkin) olup olmadığını kontrol edin; sağ güç düğmesi kırmızı olmalıdır (etkin değil). Yazılım, Alt Eşik değerini varsayılan olarak 10 olarak ayarlar. Bunu değiştirmeden bırakın ve yüzeyi oluşturmayı bitirmek için yeşil oka tıklayın.
- Yeni oluşturulan yüzeyi dikkatlice inceleyin. Hücrenin parçası olmayan yüzey parçalarını seçerek, kalem Düzenleme aracına tıklayarak ve Sil seçeneğine tıklayarak silin .
- Tümünü seçmek için huni Filtresi simgesine tıklayarak, kalem Düzenle simgesine tıklayarak ve Birleştir seçeneğine tıklayarak kalan yüzey parçalarını birleştirin (Şekil 2C).
NOT: Büyük bir görüntü dosyasında, yazılım bu protokolün sonraki adımları sırasında zaman zaman çökebilir. Bu noktada dosyayı kaydetmek iyi bir fikirdir.
- 3B Görünüm düğmesi tekrar seçiliyken, mavi renkli Yeni Yüzeyler ekle simgesine tıklayarak yeni bir yüzey oluşturun.
- Yüzeye yakın noktalar oluşturun
- Turuncu renkli Yeni Noktalar Ekle simgesine tıklayın. Yeni Noktalar (örneğin, "Noktalar 1") seçiliyken, Oluştur sekmesinde, Algoritma Ayarları için yalnızca Nesne-Nesne İstatistikleri kutusunun işaretli olduğundan ve Oluşturma Tercihleri için Oluşturma işlemini Dilimleyici görünümüyle başlat kutusunun işaretli olmadığından emin olun. Devam etmek için mavi oka tıklayın.
- Açılır listeden doğru Kaynak Kanalı'nı seçin (örneğin, Kanal 1) ve ardından kutuya 0,400 μm Tahmini XY Çapı değerini girin. Yalnızca Arka Plan Çıkarma kutusunun seçili olduğundan emin olun. Devam etmek için mavi oka tıklayın.
NOT: 0,400 μm, 63x, 60x veya 40x objektif kullanan 1024 x 1024 veya 512 x 512 görüntüler için uygundur. Diğer görüntüleme koşulları için, çap görüntüleme koşullarına göre belirlenmeli ve tüm analizler boyunca sabit kalmalıdır. Uygun değer, tüm pozitif sinyalleri kapsayacak kadar nokta oluşturacak, ancak arka plan sinyaline nokta eklemeyecektir. - Spot Oluşturma aracının son paneli, yazılımın varsayılan Alt Eşik değeri olan minimum kalite değerini ayarlar; lekelerin yerleşiminde/dağılımında gözle görülür bir fark olmadıkça (örneğin, daha düşük kaliteli bir lekelenme nedeniyle) bu değerin değişmeden kalmasını sağlayın. Noktaları oluşturmayı tamamlamak için yeşil oka tıklayın.
- Noktaları daha iyi görüntülemek için, Yüzey'i seçip Çok Renkli Renk aracını tıklatarak yüzeyin saydamlığını değiştirin. Malzeme altında, yüzeyi hücre boyunca lekeleri görüntüleyecek kadar saydam yapan malzemeyi seçin (listedeki dördüncü ila son malzeme) (Şekil 2D, E).
- Noktalar'ı yeniden seçin, Filtre simgesini tıklayın ve açılır listeden Yüzeylere En Kısa Mesafe = Yüzeyler X'i seçin; burada 'X Yüzeyleri' analiz edilen yüzeydir (örneğin, Yüzeyler 1). Hem Alt Eşik hem de Üst Eşik güç düğmelerinin yeşil (etkin) olduğundan emin olun.
- Alt Eşik kutusuna minimum -1,0 μm (noktaların yüzeyin içinden uzaklığı) ve Üst Eşik kutusuna maksimum 0,1 μm (dışarıdan uzaklık) mesafe girin. Yüzeye yakın noktalar oluşturmayı bitirmek için Seçimi yeni Noktalara Çoğalt düğmesine tıklayın.
NOT: Minimum ve maksimum mesafe değerleri, objektif, yakınlaştırma ve çözünürlük gibi farklı görüntü alma parametrelerine göre değişebilir. Bu sayılar ampirik olarak belirlenmelidir. Şeffaf yüzey, değerlerin yüzeyin şeklini doğru bir şekilde temsil eden tüm noktaları yakalayıp yakalamadığına karar vermeye yardımcı olur.
- Alt Eşik kutusuna minimum -1,0 μm (noktaların yüzeyin içinden uzaklığı) ve Üst Eşik kutusuna maksimum 0,1 μm (dışarıdan uzaklık) mesafe girin. Yüzeye yakın noktalar oluşturmayı bitirmek için Seçimi yeni Noktalara Çoğalt düğmesine tıklayın.
- Dışbükey gövde oluşturun ve bölge ölçümünü toplayın
- Yazılım penceresinin sol üst panelinde yeni oluşturulan Noktaların seçili olduğundan emin olun (örneğin; "Noktalar 1 Seçimi ['En Kısa Mesafe...]"). Dişli Araçları simgesine ve ardından Convex Hull eklentisine tıklayın. Eklentiye yalnızca bir kez tıklayın ve MATLAB penceresinin görünmesini ve ardından kaybolmasını bekleyin (bu birkaç saniye sürebilir). 3B görünümde sağlam bir gövde görünecektir.
- Sol üst panelde, X Noktası Seçiminin Dışbükey Gövdesini ['En Kısa Mesafe...], burada 'Noktalar X Seçimi' yeni oluşturulan noktalardır (örneğin, Nokta 1 Seçimi) ve ardından seçmek için gövdeye tıklayın (Şekil 2F).
- Grafik İstatistikleri simgesine tıklayın, Seçim sekmesini seçin, üstteki açılır listeden Belirli Değerler'in seçildiğinden emin olun ve ardından alt açılır listeden Birim'i seçin. Gövdenin hacmini kaydedin. Dosyayı kaydedin ve sonraki görüntüye geçin.
- Farklı floresan etiketlere sahip komşu hücreler için bölge örtüşme hacminin ölçülmesi
NOT: Protokolün bu bölümü, örnekler farklı floresan etiketleri ifade eden komşu astrositler içeriyorsa kullanılabilir (örneğin; Astrosit 1 yalnızca GFP'yi ifade eder ve Astrosit 2 yalnızca RFP'yi ifade eder). Bu etiketleme, daha önce tarif edildiği gibi viral veya genetik stratejiler kullanılarak elde edildi 9,10 (Şekil 3A).- Adım 5.4-5.6'da ayrıntılı olarak açıklanan adımları kullanarak, her astrosit için yüzeyi, yüzeye yakın noktaları ve dışbükey gövdeyi oluşturun (Şekil 3B).
- Dışbükey Gövde Noktaları 1 Seçimi... seçiliyken, kalem Düzenle simgesine tıklayın ve Maske Seçimi'ne tıklayın. Maske Kanalı penceresinde, Kanal 1'in (veya astrosit 1'i temsil eden kanalın) seçili olduğundan ve maske uygulamadan önce yinelenen kanalın yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun. Masked CH1 kanalını oluşturmak için Tamam'a tıklayın.
- Dışbükey Gövde Noktaları ile 2 Seçimi... seçildiğinde, kalem Düzenle simgesine tıklayın ve Maske Seçimi'ne tıklayın. Maske Kanalı penceresinde, açılır menüden Kanal 2'yi (veya astrosit 2'yi temsil eden kanalı) seçin ve maske uygulamadan önce yinelenen kanalın yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun. Masked CH2 kanalını oluşturmak için Tamam'a tıklayın (Şekil 3C).
- Ekranın üst kısmındaki Coloc düğmesine tıklayın ve iki maskeli kanalın ortak yerelleştirme kanalını oluşturmak için Coloc aracını kullanın. Kanal A'yı Kanal 3 - Maskeli CH1 ve Kanal B'yi Kanal 4 - Maskeli CH2'ye ayarlayın (Şekil 3D).
- Her iki kanal için de sarı histogram çubuğunu sola sürükleyin. Gri renkte görünecek olan birlikte lokalizasyon sinyalini gözlemlemek için aşağıdaki dilim görünümünü kullanın. İki hücrenin floresan sinyalleri aslında birlikte lokalize olmadığından, eşiğin sola taşınması gerekeceğini unutmayın, böylece yanlış birlikte lokalizasyonlar hücre-hücre temas noktalarında görünmeye başlar.
- İşlemi tamamlamak için sağ taraftaki Build Coloc Channel'a tıklayın. Standart 3B görünüme dönmek için 3B görünüme tıklayın. Bir Birlikte Yerelleştirme Sonucu kanalı artık gri renkte görünür ve ekran ayarlama kutusunda görünür.
- 5.4-5.7'de açıklanan adımları kullanarak yüzeyi, yüzeye yakın noktaları ve Kolokalizasyon Sonuç kanalının dışbükey gövdesini oluşturun (Şekil 3E,F).
- Dışbükey gövdenin hacmini kaydedin. Bu, bölge çakışma hacmidir. Bölge çakışma yüzdesini hesaplamak için bu sayıyı astrositlerden birinin bölge hacmine bölün. Astrositlerden biri diğerine göre genetik olarak manipüle edilmişse, kontrolü veya vahşi tip astrositi seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bu protokol için ana adımların ve iş akışının şematik bir taslağını sunmaktadır. Şekil 2 , bir yüzey oluşturmak, yüzeye yakın noktalar oluşturmak ve dışbükey bir gövde oluşturmak için görüntü analiz yazılımını kullanan önemli adımların ekran görüntülerini göstermektedir. Şekil 3 , astrosit bölgesi örtüşmesini/döşemesini belirlemek için bu tekniğin uygulanmasını göstermektedir. Şekil 4'te, daha önce yayınlanmış bir makale9'dan elde edilen temsili sonuçlar bu protokolün uygulanmasını göstermektedir. Şekil 4A ve Şekil 4B'de, astrositle zenginleştirilmiş hücre adezyon molekülü hepaCAM'in yıkılması, astrosit bölgesi hacmini önemli ölçüde azaltır. Şekil 4C ve Şekil 4D'de, fare korteksine seyrek mozaik etiketleme ve eşzamanlı genetik modifikasyon tanıtmak için Çift İşaretleyicilerle Mozaik Analizi (MADM) kullanılmıştır. MADM ile, vahşi tip astrositlerin kırmızı floresan proteini (RFP) ve Hepacam nakavt astrositlerinin yeşil bir floresan proteini (GFP) ifade ettiği fareler üretildi. Yukarıda açıklanan protokol kullanılarak, komşu RFP ve GFP astrosit çiftleri (WT: KO) arasındaki bölge çakışmasının yüzdesi hesaplandı. Bir kontrol olarak, bu, Hepacam'ın (WT: WT) genetik modifikasyonu olmayan farelerde komşu RFP ve GFP astrosit çiftleriyle karşılaştırıldı. WT: KO astrosit çiftleri, WT: WT astrosit çiftlerine kıyasla bölge örtüşme hacminin önemli ölçüde arttığını gösterdi. Toplu olarak, bu sonuçlar hepaCAM'in normal astrosit bölgesi hacmi ve astrosit döşemesi için gerekli olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Astrosit bölgesi hacmini analiz etmek için iş akışına genel bakış . (A) Protokol, astrositlerin seyrek veya mozaik floresan etiketlemesine sahip bir fare gerektirir. (B) Fare perfüze edilir ve daha sonra beyin rezeke edilir, işlenir ve dondurulur. (C) Donmuş beyin bir kriyostat kullanılarak bölümlere ayrılır ve (D) serbest yüzen doku bölümleri toplanır. (E) Kesitlemeden sonra, yüzen doku kesitleri immünohistokimya ile boyanır ve daha sonra (F) slaytlara monte edilir. (G) Monte edilmiş doku kesitleri içindeki astrositler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir. (H) Son olarak, görüntülenen hücrelerin bölge hacimleri görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Astrosit bölgesi hacmi için görüntü analizi prosedüründeki temel adımlar . (A) Görüntüdeki diğer sinyalleri analiz prosedüründen hariç tutan ilgi alanı kutusu olan hücrenin görünümü. (B) Sinyal (kırmızı) kullanılarak yüzey oluşturulması (gri) için kabul edilebilir bir göreceli eşik. (C) Ana hücre seçiliyken tamamlanmış yüzey (sarı). Yüzeyin hücre olmayan diğer kısımları silinir (kırmızı). (D) Lekeler oluşturulmuş yarı saydam yüzey. (E) Yarı saydam yüzeyin, yüzeye göre noktaların kabul edilebilir bir dağılımını göstermek için oluşturulan lekelerle yakın çekimi. (F) Son dışbükey gövde. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Astrosit bölgesi örtüşme analizinde önemli adımlar. (A) Farklı floresan belirteçleri ifade eden iki astrositin temsili görüntüsü, GFP (yeşil) ve RFP (macenta). (B) Her astrosit için dışbükey bir gövdenin oluşturulması. (C) Maskelenmiş GFP ve RFP kanallarının orijinal kanalları kaldırılmış olarak görünümü. (D) Bir "Kolokalizasyon Sonucu" kanalı oluşturmak için "Coloc" aracını kullanarak eşik oluşturma örneği. "Kolokalize" sinyal gri renkte gösterilir. (E) İki maskeli kanalın görünümü. (F) Bölge çakışma hacmini temsil eden "Kolokalizasyon Sonucu" kanalının (gri) dışbükey gövdesinin döndürülmüş görünümü. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Astrosit bölgesi hacmini ölçmek için protokolün başarılı bir şekilde uygulanması ve astrosit bölgesi örtüşmesi . (A) Doğum sonrası 21. günde vahşi tip CD1 farelerinin görsel korteksindeki astrositler, mCherry-CAAX (camgöbeği) ve bir kontrol shRNA'sı (shScramble) veya hepaCAM'ı (shHepacam) hedefleyen bir shRNA'yı ifade eder. Astrosit bölgesi kırmızı renkle özetlenmiştir. (B) HepaCAM kaybı, astrosit bölgesi hacmini önemli ölçüde azaltır. Veri noktaları, tek tek fare ortalamalarını temsil eder. Hata çubukları s.e.m. İç içe geçmiş t-testi ±. (C) Doğum sonrası 21. günde fare korteksindeki komşu astrositler GFP (yeşil) veya RFP (macenta) eksprese eder. MADM9 WT: WT farelerinde, her iki astrosit de vahşi tiptedir. MADM9 WT: KO farelerinde, yeşil astrosit vahşi tiptedir ve eflatun astrosit Hepacam için boştur. Bölge çakışması hacmi mavi renkle gösterilir. (MADM9 WT:WT genotipi: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/+. MADM9 WT:KO genotipi: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; Hepacam+/-). (D) Bölge hacmi çakışma yüzdesinin ölçülmesi. Veri noktaları, tek tek fare ortalamalarını temsil eder. Hata çubukları s.e.m. İç içe geçmiş t-testi ±. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şekildeki paneller yayıncının izniyle Baldwin ve ark.9'dan yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, fare korteksindeki astrosit bölgesi hacmini ve astrosit döşemesini analiz etmek için kurulmuş bir yöntemi açıklar ve perfüzyonla başlayan ve görüntü analizi ile biten tüm önemli adımları detaylandırır. Bu protokol, seyrek veya mozaik bir astrosit popülasyonunda floresan proteinleri eksprese eden farelerden beyinler gerektirir. Bu gereksinimin dışında, bu protokol için her yaştan fare kullanılabilir, perfüzyon ayarlarında sadece küçük ayarlamalar yapılır ve gömme kalıbına eklenen dondurucu ortamın hacmi kullanılır. Beyin dokusu bölümleri 7,11'de astrosit dallanma karmaşıklığı ve hacminin analizi için başka yöntemler yayınlanmış olsa da, bu protokolün birkaç benzersiz avantajı vardır. İlk olarak, bu protokol astrosit bölgesi hacmini elde etmek için kullanılabilecek özel bir kodu açıklar. Astrosit bölgesi hacmi, astrosit hücre hacminden farklı bir ölçümdür, çünkü dallanma karmaşıklığına bakılmaksızın bir astrosit tarafından işgal edilen tüm alanı ölçer. Ayrıca, bu protokol, astrosit bölgesi örtüşme hacmini ve dolayısıyla astrosit döşeme davranışını ölçmek için astrosit bölgesi hacim ölçümünün nasıl uygulanacağını açıklamaktadır. Son olarak, bu protokol, montaj koşulları, numune depolama koşulları ve görüntüleme ve analiz için dahil etme ve hariç tutma kriterleri dahil olmak üzere astrosit bölgesi hacmini ve veri toplamayı etkileyebilecek potansiyel değişkenlerin ayrıntılı bir tartışmasını sağlar. Bu benzersiz özelliklere ek olarak, serbest yüzen bölümlerin perfüzyonu, kriyoseksiyonu ve immün boyama dahil olmak üzere bu protokolün birçok yönü, farklı kalınlıklarda ve farklı antikor kombinasyonlarıyla beyin dokusu bölümlerinin boyanmasına geniş çapta uygulanabilir. Aşağıda, kritik adımlar, önemli noktalar, sorun giderme ve sınırlamalar ayrıntılı olarak ele alınmıştır.
Örnek koleksiyonunda dikkat edilmesi gereken noktalarSample collection considerations
Astrosit morfolojisini araştırmak için tasarlanan deneyler için çok önemli bir husus, numune toplama için günün tutarlı bir saatini korumaktır. Artan kanıtlar, astrosit fonksiyonel durumlarının sirkadiyen ritim ve uyku davranışlarıyla bağlantılı olduğunu göstermektedir14. Günün farklı saatlerinde toplanan örneklerin ortaya çıkarabileceği herhangi bir değişkenliği ortadan kaldırmak için, perfüzyonlar, bir deney için tüm örneklerin kabaca günün aynı saatinde, 2-3 saatlik bir zaman aralığında toplanması için planlanmalıdır. Tutarlı perfüzyonlar için, peristaltik bir pompanın kullanılması şiddetle tavsiye edilir. TBS'ye heparin ilavesi, kan pıhtılarının oluşumunu azaltmak için yararlıdır. Bu protokol daha kısa post-fiksasyon süreleri ile test edilmemiş olsa da, bir gecede fiksasyon sonrası gerekli olmayabilir ve 4 saatlik daha kısa bir fiksasyon sonrası düşünülebilir.
Kriyokessiyon için sorun giderme ipuçları
2: 1 Sakkaroz: OCT donma ortamında beyinlerin donması, bölümlemeden sonra toplama kuyularındaki OCT miktarını azaltır. Dondurulduğunda, dondurucu ortam OCT'nin kendisine benzer şekilde davranır, ancak daha az kırılgandır. Doku bloğunu mandrene dondururken, aynaya OCT ekledikten hemen sonra ayna üzerine düz bir şekilde bastırdığınızdan emin olun. Doku bloğu bölümleme sırasında mandren koparsa, altta yeni bir düz yüzey kesmek ve mandrene yeniden dondurmak için bir tıraş bıçağı kullanın. OCT'yi eklemeden önce aynaya kriyostat odası sıcaklığına soğuması için yeterli zaman vermek ve aynanın temiz ve kuru olduğundan emin olmak yapışmayı artıracaktır. Doku bölümlerini boya fırçasıyla hareket ettirirken, boya fırçasını bölümün köşe kenarına dokunun, böylece dokunun kendisine değil, OCT'ye dokunur. Biraz nemle, bölüm fırçaya yapışacaktır. Bölümün karşı kenarını ortama dokundurarak ve ortama çekilmesine izin vererek dokuyu kesitleme ortamına yavaşça yerleştirin. Fırça dondurucu ortama dokunursa, kriyostat içindeki bir kağıt havlu üzerinde silin. Çok ıslak bir fırça, bölümleri tabağa aktarmayı zorlaştıracaktır. OCT, doku kesiti kesitleme ortamına yerleştirildikten sonra çözülmelidir. Aksi takdirde, kriyostat odası sıcaklığı çok düşük olabilir.
Doku kesitlerinin boyanması ve montajı için dikkat edilmesi gereken önemli noktalar
Boyama kalitesini artırmak için, her deneyden önce TBST'yi taze olarak hazırlayın. Yüksek kaliteli% 10 sulu Triton kaynağı kullanın (Malzeme Tablosu). İkincil antikorun yapıldığı türle eşleşen bir serum seçin (örneğin; ikincil bir keçi anti-tavşanı için keçi serumu kullanın). Antikor çözeltileri kullanımdan önce santrifüjlenir, herhangi bir çökeltilmiş antikoru pelet eder ve uzaklaştırır. Antikor solüsyonunu tüpten plakaya aktarırken peleti rahatsız etmemeye dikkat edin (bu, pipo ucu ile tüpün dibine dokunmamak için her biri 1 mL'den biraz daha az antikor çözeltisi pipetleme anlamına gelebilir). Bu adım, arka plan lekelenmesini azaltmaya yardımcı olur. Bölümler TBS:dH2O'ya yerleştirildiğinde, çoğu kendiliğinden açılacak / çözülecektir, ancak bazıları katlanmış veya bükülmüş kalabilir. Bölümleri bir fırça kullanarak slayda aktarırken, doku bölümünü uygun noktaya yönlendirmeye yardımcı olması için diğer yandan bir P200 ucu kullanın. Fırçayı kullanarak bölümleri düz olacak şekilde yavaşça açın veya bükün. Kesitler, sıvı uzaklaştırıldıkça aspire edici pipete doğru hareket etme eğilimindedir. Aspirasyon yaparken mobil bölümleri yerinde tutmak için P200 ucunu kullanın. Montaj ortamı, tüm fazla sıvı çıkarıldıktan hemen sonra ve bölümlerin kuruma zamanı gelmeden önce bölümlere eklenmelidir. Bölümlerin birkaç dakika bile kurumasına izin vermek, bölüm içindeki hücrelerin hacmini büyük ölçüde etkileyecektir. Montaj ortamını slayda ekledikten sonra, görünür kabarcıkları çıkarmak için bir pipet kullanın. Kapak kaymasını ekledikten sonra, fazla montaj ortamını yanlardan çıkardığınızdan emin olun, çünkü bu, ojenin kuruma kabiliyetine müdahale edecektir. Ojelerin oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Montaj ortamının kalın bölümlere tamamen nüfuz etmek için yeterli zamana sahip olduğundan emin olmak için bölümleri görüntülemek için en az 2 saat veya ertesi güne kadar bekleyin.
Tam astrositlerin görüntülenmesi
Bölge hacmi analizi için astrositleri görüntülerken, görüntünün astrositin tüm hacmini yakalaması çok önemlidir. Doku kesitindeki birçok etiketli astrosit, tamamlanmamış astrositler olacaktır. Tam astrositler doku bölümünde tamamen yer alacaktır. Tüm astrositleri tanımlamak için, astrositin ortasındaki bir odak noktasıyla başlayın. Astrositin tepesine gitmek için odak düğmesini kullanın. Astrosit artık odakta olmadığında, dokunun diğer özellikleri odakta kalmalıdır. Astrositin dibi için bu işlemi tekrarlayın. Tamamlanmamış astrositleri görüntülemeyin. Kesitlerin kalınlığı nedeniyle, antikor penetrasyonu bölümün ortasında sağlam değildir. Etiketleme, astrositin dış kenarları etrafında daha güçlü ve merkezde daha zayıf olabilir. Bu yaygın olarak gözlenir ve bölge analizini etkilemez.
Görüntü analizi için ipuçları
Protokolün görüntü analizi kısmı için en önemli husus, dışbükey gövdenin sadece bir astrositi temsil etmesini sağlamaktır. Her seferinde dahil etme ve hariç tutma kriterlerini uygulayın. Bazen iki astrositin hücre gövdeleri birbirine çok yakın olur. Bunun 3B görünümde tanımlanması zor olabilir, ancak dilim görünümü kullanılarak tanımlanabilir. İlgilenilen astrositle temas eden floresan etiketli başka astrositler varsa, bu yüzey oluşturma sürecini zorlaştırabilir. İki hücre arasında makul derecede net bir sınır görünüyorsa (örneğin, yalnızca küçük bir dal noktasında bağlanırlar), klips aracı yüzeyde bir kesim yapmak için kullanılabilir ve yüzeyin bu kısmı silinebilir. Yüzeyi oluşturduktan sonra, hücrenin arkasına gizlenmiş olabilecek, ancak hücrenin parçası olmayan küçük yüzey parçalarını denetlemek için hücreyi 3B görünümde döndürün. Devam etmeden önce bunları silin. Dışbükey gövde, astrosit bölgesinin dışındaki bir noktaya kadar büyük ölçüde çıkıntı yaparsa, muhtemelen çıkarılmamış bir hücre dışı yüzey parçası vardır. Yazılım yüzey oluşturma sırasında rutin olarak çökerse, yüzey ayrıntı sayısı azaltılabilir. Noktalar oluşturulurken çökerse, yalnızca yüzey nesnesinin yakınında noktalar oluşturmak için ilgi çekici bir bölge kullanın.
Protokolün sınırlamaları
Bu protokolün birçok kullanımı ve avantajı olsa da, çeşitli sınırlamalar da vardır. Bu protokol, seyrek bir astrosit popülasyonunda floresan proteinlerini zaten eksprese eden fareleri gerektirir, ancak astrositlerde floresan proteinlerin ekspresyonunu tanıtma yöntemlerini tanımlamaz. Görüntüleme ve analiz işlem hatları zaman alıcıdır ve yüksek verimli analiz için uygun değildir. Ayrıca, bireysel astrositlerin ayrıntılı morfolojik özelliklerini tanımlamak yerine, özellikle astrosit bölgesi hacmini ve döşemesini ölçmeye yöneliktirler. Diğerleri, bu protokolün yaklaşımlarını ve stratejilerini, astrosit morfolojik karmaşıklığını ölçmek için yöntemleri detaylandıran yakın zamanda yayınlanan protokollerle birleştirmeyi yararlı bulabilir 7,11. Son olarak, bu protokolde kullanılan ticari yazılım platformları (yani, Imaris ve MATLAB) pahalıdır ve kullanmak için bir lisans gerektirir. Büyük kurumlar genellikle bu yazılım platformları için lisans satın alırken, bu daha küçük kurumlar ve bireysel laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir. Mikroskopi, açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı ve makine öğrenimi algoritmalarındaki gelişmeler, bu protokolün tüm laboratuvarlar için yaygın olarak erişilebilir olmasına yardımcı olabilir ve ayrıca görüntü toplama ve analizinin verimliliğini artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Mikroskopi, kısmen NIH-NINDS Sinirbilim Merkezi Destek Hibe P30 NS045892 ve NIH-NICHD Zihinsel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Hibe U54 HD079124'ün finansmanıyla desteklenen UNC Sinirbilim Mikroskopi Çekirdeğinde (RRID: SCR_019060) gerçekleştirildi. Şekil 1, BioRender.com ile oluşturulmuştur. Şekil 4'teki görüntüler ve veriler, yayımcının izniyle önceki bir yayın9'dan yeniden yazdırılmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
