Summary
Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.
Abstract
Chitosan microgels zijn van groot belang in tissue engineering vanwege hun brede scala aan toepassingen, lage kosten en immunogeniciteit. Chitosan-microgels worden echter vaak vervaardigd met behulp van emulsiemethoden die organische oplosmiddelspoelingen vereisen, die giftig en schadelijk zijn voor het milieu. Het huidige protocol presenteert een snelle, niet-cytotoxische, niet-emulsie-gebaseerde methode voor het vervaardigen van chitosan-genipin microgels zonder de noodzaak van organische oplosmiddelspoelingen. De hierin beschreven microgels kunnen worden vervaardigd met nauwkeurige maatcontrole. Ze vertonen aanhoudende afgifte van biomoleculen, waardoor ze zeer relevant zijn voor weefseltechnologie, biomaterialen en regeneratieve geneeskunde. Chitosan is gekruist met genipin om een hydrogelnetwerk te vormen en vervolgens door een spuitfilter te gaan om de microgels te produceren. De microgels kunnen worden gefilterd om een reeks maten te creëren en ze vertonen pH-afhankelijke zwelling en degraderen in de loop van de tijd enzymatisch. Deze microgels zijn gebruikt in een rattengroeiplaatletselmodel en er werd aangetoond dat ze een verhoogd kraakbeenweefselherstel bevorderen en volledige afbraak vertonen na 28 dagen in vivo. Vanwege hun lage kosten, hoge gemak en gemak van fabricage met cytocompatibele materialen, presenteren deze chitosan microgels een opwindende en unieke technologie in tissue engineering.
Introduction
De groeischijf, ook bekend als de physis, is de kraakbeenstructuur aan het einde van lange botten die de groei bij kinderen bemiddelt. Als de groeischijf gewond raakt, kan zich herstelweefsel vormen dat bekend staat als een "benige staaf", die de normale groei onderbreekt en groeiafwijkingen of hoekige misvormingen kan veroorzaken. Epidemiologische gegevens hebben aangetoond dat 15% -30% van alle skeletletsels bij kinderen gerelateerd zijn aan de groeischijf. Benige staafvorming komt voor bij maximaal 30% van deze verwondingen, waardoor groeischijfletsels en de bijbehorende behandeling een significant klinisch manifestatieprobleemzijn 1,2,3,4. Wanneer benige staafvorming optreedt, is de meest voorkomende behandelingsweg het resectie van de benige staaf en het inbrengen van een interpositief materiaal, zoals silicium of vetweefsel5. Patiënten die een benige staafresectieoperatie ondergaan, hebben echter vaak een slechte prognose voor volledig herstel, omdat er momenteel geen behandeling is die een gewonde groeischijf volledig kan herstellen 6,7,8. In het licht van deze tekortkomingen is er een kritieke behoefte aan effectieve strategieën voor de behandeling van groeischijfletsels, zowel bij het voorkomen van de vorming van een benige staaf als bij het regenereren van gezond feyseaal kraakbeenweefsel.
Hydrogel microdeeltjes, of microgels, hebben onlangs belangstelling gekregen als injecteerbare steigers die langdurige afgifte van therapeutica kunnen bieden9. Vanwege hun hoge tonijnbaarheid en biocompatibiliteit zijn microgels ook zeer geschikt voor bioactieve factor of celinkapseling. Microgels kunnen worden gemaakt van verschillende materialen, variërend van synthetische polymeren, zoals polyethyleenglycol (PEG), tot natuurlijke polymeren zoals alginaat of chitosan 10,11,12. Van Chitosan is aangetoond dat het verschillende gunstige effecten heeft voor tissue engineering, zoals het vermogen om het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën te destabiliseren, waardoor inherente antimicrobiële activiteitwordt geboden 1 3,14. Bovendien is chitosan kosteneffectief, cel-interactief en gemakkelijk te wijzigen met behulp van de amine-bevattende structuur. Op Chitosan gebaseerde microgels beloven een biomateriaalstrategie voor medicijnafgifte en materiaalsignalering die weefselregeneratie kan bevorderen en tegelijkertijd bacteriële infecties kan voorkomen. Chitosan-microgels worden echter vaak vervaardigd met een breed scala aan technieken die speciale apparatuur, emulsietechnieken of cytotoxische oplosmiddelspoelingen vereisen. Sommige studies hebben bijvoorbeeld chitosan-microgels gefabriceerd met op emulsie gebaseerde methoden, maar deze protocollen vereisen oplosmiddelspoelingen en cytotoxische crosslinkers, waardoor hun vertaling naar klinische instellingen mogelijk teniet wordtgedaan 15,16. Andere studies hebben microfluïdica of elektrospraybenaderingen gebruikt om chitosan-microgels te fabriceren, waarvoor speciale apparatuur, voorbereiding en training vereistis 17,18. Chitosan microgels worden ook vaak gemaakt met een druppelsgewijs proces van crosslinker in chitosan-oplossing; deze methode is echter sterk afhankelijk van de viscositeit van de oplossing, de polymeerconcentratie en de stroomsnelheid, waardoor het moeilijk is om de grootte en dispersie van de microgelste regelen 19,20. Omgekeerd vereist de hierin beschreven methode voor de fabricage van microgels geen gespecialiseerde apparatuur of oplosmiddelspoelingen, waardoor deze microgels levensvatbaar zijn voor fabricage in bijna elk laboratorium of elke omgeving. Daarom vertegenwoordigen deze microgels zeer relevante biomaterialen voor een snel, kosteneffectief en gemakkelijk te produceren medicijnafgiftevoertuig voor vele toepassingen.
Door de samenstelling en materiaaleigenschappen van een microgel te moduleren, kunnen onderzoekers nauwkeurige controle krijgen over de cellulaire micro-omgeving, waardoor het celgedrag op een materiaalafhankelijke manier wordt gestuurd. Microgels kunnen op zichzelf worden gebruikt of worden gecombineerd met bulkbiomateriaalsystemen om specifieke functionaliteiten te geven, zoals de verlengde afgifte van bioactieve factoren of nauwkeurige speciale signalering voor inheemse of exogene cellen. Biomaterialen en microgels zijn naar voren gekomen als aantrekkelijke behandelingsmogelijkheden voor groeischijfletsels. Aanzienlijke inspanningen zijn gewijd aan de ontwikkeling van op alginaat en chitosan gebaseerde biomaterialen om groeischijfletsels te behandelen 21,22,23,24,25. Vanwege de dynamische temporele aard van groeischijfverbeening en botverlenging, is het mechanisme van benige staafvorming niet volledig begrepen. Daarom zijn verschillende diermodellen ontwikkeld om de mechanismen van endochondrale ossificatie en benige staafvorming, zoals bij ratten, konijnen en schapen, beter te verduidelijken 26,27,28. Een dergelijk model is een rattengroeischijfletselmodel, dat een boorgatdefect in het tibia van de rat gebruikt om op een voorspelbare en reproduceerbare manier een benige staaf te produceren en menselijke verwondingen nabootst in alle drie de zones van de groeischijf29,30. Verschillende op biomaterialen gebaseerde strategieën voor de behandeling van groeischijfletsels zijn getest met behulp van dit model. Daarnaast zijn er twee verschillende methoden ontwikkeld voor het fabriceren van chitosan microgels, die kunnen worden gebruikt als een injecteerbaar biomateriaalsysteem dat therapeutica op een duurzame manier vrijgeeft10,31. Deze microgels zijn gebruikt in een feyseaal letselmodel van ratten en ze vertoonden verbeterde kraakbeenregeneratie31 bij het vrijgeven van SDF-1a en TGF-b3. De technieken in dit protocol beschrijven methoden die zijn ontwikkeld om deze chitosan-microgels te fabriceren, die vervolgens kunnen worden gebruikt in een breed scala aan tissue engineering-toepassingen. Recente studies hebben bijvoorbeeld thermo- of magento-responsieve chitosan-microgels gebruikt voor gecontroleerde oncologische medicijnafgiftetoepassingen32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee. 6 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt voor de huidige studie. Het model voor kankerletsel op de groeischijf van ratten is gemaakt naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport30.
1. Bereiding van het chitosanpolymeer
- Verkrijg gezuiverde en gelyofiliseerde laagmoleculaire gewicht (LMW) chitosan uit commercieel beschikbare bronnen (zie Tabel met materialen).
- Voeg 495 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en een roerstaaf toe aan een bekerglas van 1 liter. Voeg 5 g chitosan toe (stap 1.1.) en meng goed.
OPMERKING: Chitosan is slechts matig oplosbaar in een waterige oplossing bij fysiologische pH, dus de chitosan zal bij deze stap niet gemakkelijk oplossen. - Voeg 5 ml ijsazijn toe aan de hierboven bereide chitosanoplossing.
- Roer afgedekt bij 300 tpm gedurende 18 uur met het bekerglas in een waterbad op 50 °C.
- Filtreer de chitosanoplossing met behulp van een Büchner-kolf en trechter door steeds kleinere formaten filterpapier: 22 μm, 8 μm en 2,7 μm (zie Materiaaltabel).
- Voeg de gefilterde chitosanoplossing toe aan de cellulosedysebuizen (zie materiaaltabel) en laat gedurende 4 dagen dialyseren in ddH2O bij kamertemperatuur, waarbij de ddH2O elke dag wordt vervangen.
OPMERKING: Gebruik ultrapuur ddH2O water voor de laatste verandering. - Breng de gedialyseerde chitosanoplossing over in een bekerglas en stel de pH in op 8,0 met 1 M NaOH.
- Gebruik de chitosan in centrifugebuizen en centrifugeer bij 4000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteer het supernatant naar een afvalstroom en resuspend de chitosan in ddH2O, 2x herhalend.
- Vries in en lyofiliseer vervolgens de chitosan pellet.
- Verwijder elke dag het gelyofiliseerde product en noteer de massa.
OPMERKING: Wanneer de massa van het gelyofiliseerde product niet langer verandert, is het product volledig gedroogd en kan het bij -20 °C worden bewaard totdat het klaar is voor gebruik.
- Verwijder elke dag het gelyofiliseerde product en noteer de massa.
2. Vervaardiging van chitosan hydrogel
- Voeg 2 ml 6% azijnzuur en 120 mg gezuiverd chitosan (stap 1) toe aan een Luer-lock spuit van 10 ml om een 6% w/v chitosan-oplossing te vormen.
- Sluit de Luer-lock spuit aan op een andere identieke spuit met behulp van een vrouw-vrouw Luer-lock connector en meng de oplossing heen en weer gedurende 30 s, of totdat de chitosan volledig is opgelost in het azijnzuur.
- Voeg voor het crosslinken een therapeutisch of bioactief middel toe aan de chitosan-oplossing (indien nodig). Voor de huidige studie werden 200 ng SDF-1a en TGF-b3 (zie Tabel met materialen) toegevoegd aan de microgels.
OPMERKING: SDF-1a en TGF-b3 zijn bioactieve stoffen die relevant zijn voor de regeneratie van groeiplaatweefsel. SDF-1a bevordert de migratie van mesenchymale stamcellen naar de defecte plaats, en TGF-b3 dient als een chondrogene factor om differentiatie van deze stamcellen langs de chondrogene afstamming31 te induceren.
OPMERKING: Meng de chitosan opnieuw tussen de spuiten om de therapeutische volledig op te nemen. - Bereid 100 mM stock crosslinker-oplossing van genipin (zie tabel met materialen) in 100% ethanol.
- Voeg 100 μL van de bereide genipinoplossing (stap 2.4.) toe aan de chitosanbevattende spuit en meng opnieuw heen en weer tussen de spuiten gedurende 30 s.
- Extrudeer het mengsel uit de spuit op een petrischaaltje van 35 mm, bedek het met paraffinefilm en incubeer het 's nachts bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer.
OPMERKING: De oplossing zal donkerblauw worden, wat aangeeft dat de crosslinking-reactie tussen chitosan en genipin is opgetreden, wat leidt tot de vorming van chitosan microgel. - Filter de bereide chitosan microgel volgens de onderstaande stappen.
- Breek de hydrogel voorzichtig in kleinere stukjes met behulp van een spatel.
OPMERKING: De stukjes moeten klein genoeg zijn om te worden overgebracht naar de achterkant van een spuit van 10 ml, ~ 1-2 cm in diameter. - Plaats een filter van de gewenste maaswijdte in de achterkant van een schone spuit van 10 ml.
OPMERKING: Het typische maatbereik voor microgels ligt tussen 50-200 μm. - Breng de gebroken gelstukjes over in de spuit die bij het filter is geleverd en voeg 6 ml ddH2O toe.
OPMERKING: De chitosan-gel zal aanzienlijk opzwellen in het waterige medium, dus een grote verandering in het gelvolume wordt verwacht. - Sluit de spuit via een Luer-lock connector aan op een andere schone spuit van 10 ml.
- Forceer het gel + watermengsel door de spuit met het filter om microgels met een opgegeven maximale diameter te maken.
- Open na de eerste filtratie de achterkant van de spuit met het filter en extrudeer het mengsel terug in deze spuit.
- Vervang de achterkant van de spuit en duw het mengsel opnieuw door het filter.
- Herhaal de filtratie 5-6x of totdat er weinig weerstand door het filter komt.
- Breek de hydrogel voorzichtig in kleinere stukjes met behulp van een spatel.
- Spoel en zuiver de gefilterde microgels.
- Breng het gefilterde gelmengsel over in een conische buis van 50 ml, breng het totale volume op 20 ml met ddH2O en draai vervolgens het mengsel om homogene dispersie te garanderen.
- Centrifugeer de microgels bij 100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en decanteer de bovenste waterige fase.
- Resuspend de microgels in 10 ml 70% ethanol, vortex en plaats onder UV-licht gedurende 1 uur om te steriliseren.
- Centrifugeer de microgels bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gooi de ethanol weg en spoel 3x af met ddH2O.
3. Bereiding van microgels voor in vitro of in vivo toepassingen
OPMERKING: Voor de huidige studie werd kraakbeenregeneratie bij groeischijfletsels bestudeerd in een rattenmodel. Zie referentie31 voor nadere bijzonderheden.
- Resuspend de microgelkorrels 1:1 in ddH2O. Microgels kunnen tot 1 maand worden bewaard, gesuspendeerd in ddH2O bij 4 °C. Als een bioactief middel wordt gebruikt, moeten de microgels onmiddellijk worden gebruikt.
- Maak de verwondingsplaats in het dier naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport30.
- Spoel de plaats van het letsel met zoutoplossing en houd het dier onbehandeld (voor controleonderzoek) of injecteer alleen de chitosan-microgels of de microgels geladen met de bioactieve stoffen (stap 3.2.).
- Sluit de wond in het dier en dien postoperatieve pijnstillers toe30.
- Op dag 7 of 28 na de operatie euthanaseer de rat door een overdosis CO2 , snijd de ledematen weg en voer histologie uit om het weefselherstel op de verwondingsplaatste beoordelen 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle fabricage van chitosan microgels is afhankelijk van de crosslinking reactie tussen genipin en chitosan, met name met betrekking tot de amines op de chitosan polymeerketens. In tegenstelling tot andere microgelfabricagetechnieken vereist deze methode geen emulsies of oplosmiddelspoelingen en kan deze snel en gemakkelijk worden uitgevoerd met goedkope apparatuur. Een kenmerkende indicator voor succesvolle microgelfabricage is de duidelijke kleurverandering van gebroken wit naar donkerblauw nadat de chitosan en genipin zijn gemengd. De crosslinking-reactie tussen genipin en aminebevattende verbindingen, zoals chitosan of andere eiwitten, is goed gekarakteriseerd in de literatuur34. Kortom, het crosslinking-mechanisme wordt beschouwd als een nucleofiele aanval door de aminogroepen van chitosan, waarbij genipin fungeert als een dialdehyde met stabiele condensatieproducten35. De korte ketens van stabiele, gecondenseerde genipin fungeren als crosslinking bruggen tussen de chitosan polymeren. De crosslinking-reactie zorgt ervoor dat de oplossing donkerblauw wordt, waarschijnlijk als gevolg van door zuurstofradicalen geïnduceerde polymerisatie en dehydrogenatie van intermediaire verbindingen, die de ringopeningsreactie van nucleofiele aanval volgt36.
Zodra de microgels zijn gefilterd en geresuspendeerd in een 1:1 waterverdunning, kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt in verschillende biomateriaaltoepassingen. Er is onlangs werk gepubliceerd met behulp van deze emulsievrije chitosan microgels om kraakbeenregeneratie bij groeischijfletsels te bevorderen. De microgels werden vervaardigd zoals hierin beschreven en ofwel leeg gehouden of geladen met SDF-1a en TGF-b3, die bioactieve stoffen zijn die relevant zijn voor de regeneratie van groeiplaatweefsel, waarbij SDF-1a de migratie van mesenchymale stamcellen naar de defecte plaats bevordert en TGF-b3 dient als een chondrogene factor om differentiatie van deze stamcellen langs de chondrogene afstamming te induceren37, 38. De afgiftesnelheid van de eiwitten werd in vitro gekwantificeerd via ELISA en de afgifte van deze moleculen werd in de loop van de tijd volgehouden31. Vervolgens werden de microgels geïnjecteerd in een groeischijfletsel in een in vivo rattenmodel en de geïnjecteerde microgels voorkwamen vroege benige staafvorming in vivo31. Deze injecteerbare, kosteneffectieve en eenvoudig te produceren chitosan-microgels kunnen gemakkelijk worden gebruikt in veel biomateriaaltoepassingen.
Hoewel dit proces voor microgelfabricage is geoptimaliseerd voor eenvoudige installatie en toepassingen, kunnen er nog steeds verschillende problemen optreden waar onderzoekers rekening mee moeten houden. Onvoldoende mengen van het polymeer en crosslinking componenten is de meest waarschijnlijke oorzaak voor verschillende resultaten tijdens de fabricage. De vaste chitosan moet krachtig tussen de spuiten worden gemengd en de resulterende chitosan-oplossing moet volledig homogeen zijn voordat de genipin-crosslinker wordt toegevoegd. Als de oplossing niet homogeen is, zullen de vaste chitosan-brokken die in de oplossing achterblijven klonten vormen en zal ongelijke verknoping optreden, waardoor effectieve filtering wordt voorkomen en resulteert in poly-gedispergeerde microgels met aanzienlijk variërende diameters. Een andere belangrijke factor om te overwegen tijdens de fabricage is het vermijden van verdamping tijdens de crosslinking-periode, die moet worden voorkomen met paraffinefilm of andere verdampingsvangtechnieken. Als de chitosan hydrogel uitdroogt, zal deze niet opzwellen tijdens het spoelen van het water en zal deze niet door de spuit filteren. Ten slotte moeten de microgels tijdens het filtratieproces in overtollig water worden gesuspendeerd en in water bij 4 °C worden opgeslagen wanneer ze niet in gebruik zijn. De microgels zijn niet extrudeerbaar of injecteerbaar, tenzij gesuspendeerd in ten minste een 1:1 verdunning van water.
Figuur 1 toont een breed overzicht van het fabricageproces van microgel. Hetzelfde proces wordt opnieuw weergegeven in figuur 2, die foto's van het proces toont, met de nadruk op de protocolfasen die moeilijk te begrijpen zijn uit tekst alleen. Figuur 2D laat bijvoorbeeld zien hoe een gaasfilter in de spuit van 10 ml wordt gestoken. Eenmaal volledig tegen de bovenkant van de spuit geplaatst, zorgt dit gaasfilter voor een snelle en handige filtratie van de chitosan-microgels zonder gespecialiseerde apparatuur of oplosmiddelen. Op dezelfde manier toont figuur 2E de stroom van gehydrateerde chitosangel door het mesh-filter, dat de basis vormt voor de fabricage van microgel. Figuur 3 is aangepast van onze eerdere publicatie over deze microgels en toont hun pH-afhankelijke zwellingsgedrag en de verschillen in de grootte van de microgels afhankelijk van de poriegrootte van het mesh-filter. Verschillende maaswijdten kunnen bij de fabrikant worden besteld, waardoor de grootte van de microgels gemakkelijk kan worden gecontroleerd. Deze nauwkeurige controle over de grootte van de microgel is zeer belangrijk bij het ontwerpen van medicijnafgiftesystemen met goed gedefinieerde therapeutische belastingafgiftesnelheden. Eerder werk aan microgels toonde ook aan dat ze aanzienlijk afbreken in de aanwezigheid van lysozym na 2-4 weken31. Ten slotte toont figuur 4 histologische beelden31 in een model voor groeiplaatletsel bij ratten dat werd behandeld met de chitosan-microgels geladen met SDF-1a en TGF-b3.
Figuur 1: Schematisch overzicht van chitosan microgel fabricage. De figuur is gemaakt met behulp van biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Foto's van het fabricageproces van microgel. (A) Chitosan-oplossing in spuiten die zijn aangesloten met luerslot. (B) Extrusie van chitosangel in een petrischaaltje van 35 mm. (C) Ophalen van chitosan gel na crosslinking kleurverandering van gebroken wit naar donkerblauw. (D) Bovenaan in de spuit met de gaaszeef die tegen het mondstuk van de spuit is aangebracht. (E) Chitosan-gel werd door een gaasfilter geperst om microgels te produceren. (F) Microgels werden bewaard in een 1:1 verdunning van ddH2O in een conische buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: pH-afhankelijk zwelgedrag van de microgels. (A) Normale verdelingsgrafiek van de Feretdiameter met zwellingsgedrag van de microgels als reactie op pH-veranderingen. (B) Fluorescerende afbeeldingen van microgels vervaardigd met behulp van nr. 200 mesh (bovenste afbeelding: microgels van <75 μm) en nr. 100 mesh (onderste afbeelding: microgels van 75-150 μm). De figuur is met toestemming overgenomen uit referentie31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische beelden in een model voor groeiplaatletsel bij ratten behandeld met de chitosan microgels geladen met SDF-1a en TGF-b3. 10x histologische beelden met groeischijfherstelweefsel van intact (A) en (E), onbehandeld (B) en (F), microgel behandeld (C) en (G), microgel + SDF-1a behandeld (D) en (H), en microgel + TGF-b3 behandeld (I ) ledematen. Geen dag 7 dieren werden behandeld met microgel + TGFb3. Alcian blauwe hematoxyline (ABH) kleurt het bot oranje tot rood, het vezelige weefsel roze en het kraakbeen blauw. De microgel verschijnt als een donkerrood vezelachtig weefsel. Schaalbalken = 500 μm. De figuur is met toestemming overgenomen uit referentie31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microgels zijn de afgelopen jaren op grote schaal onderzocht vanwege hun hoge mate van toepasbaarheid voor verschillende doeleinden, zoals medicijnafgifte of celinkapseling9. Het gemak van de productie van biomateriaalconstructies op microschaal is van groot belang in tissue engineering, omdat het onderzoekers in staat stelt om op hydrogel gebaseerde strategieën te ontwikkelen op een specifieke grootte en tijdschaal. De meeste methoden voor het vervaardigen van chitosan-microgels vereisen echter dure apparatuur en reagentia, emulsies of cytotoxische oplosmiddelspoelingen, waardoor hun vertaling naar klinisch gebruik wordt voorkomen 15,16,17,18,19,20. Deze microgels blinken uit in termen van hun aanzienlijke fabricagegemak, waarvoor geen emulsietechnieken of oplosmiddelspoelingen nodig zijn. Bovendien behouden deze microgels de ideale eigenschappen voor een weefselmanipulatieconstructie, zoals pH-afhankelijke zwelling en medicijnbelasting, afgestemd afbraakgedrag en aanhoudende afgifte van therapeutica.
De meest kritieke stap bij het vervaardigen van deze chitosan microgels is de filtratie tussen spuiten. Deze microgels beginnen als bulk hydrogel en worden gefilterd tot een specifiek maatbereik met behulp van gaasfilters. Zonder filtering zouden de toepasbaarheid, mechanische eigenschappen en eigenschappen van de afgifte van geneesmiddelen aanzienlijk verschillen. De filterstap zorgt voor nauwkeurige controle over de grootte van de hydrogels, en het maakt ook een hoge doorvoer van microgels mogelijk die pH-afhankelijke zwelling en aanhoudende afgifte van therapeutica vertonen.
Een beperking van dit proces is dat de filterstap niet heeft geleid tot hydrogels met een perfect bolvorm, wat voor sommige toepassingen een belangrijke factor kan zijn om te overwegen. Om deze reden werd de karakteristieke grootte van de microgels beschreven met behulp van Feret-diameter (figuur 3), wat nuttig is voor het kwantificeren van onregelmatig gevormde deeltjes39. Hoewel de geometrie van de microgels geen perfecte bol was, was de gemiddelde grootte van de deeltjes gemakkelijk te regelen op basis van de maaswijdte van het spuitfilter en voor veel toepassingen is het niet nodig om perfect bolvormige deeltjes te hebben. De polydispersiteitsindex (PDI) van de microgels werd gekwantificeerd met behulp van de kwadraatverhouding van de standaarddeviatie van de feretdiameter tot de gemiddelde feretdiameter verkregen uit een grote populatie deeltjes (n = 74). De PDI werd berekend als 0,076 met behulp van de vergelijking
PDI = (s/D)2
waarbij s de standaarddeviatie is van de gemiddelde Feretdiameter en D de gemiddelde Feretdiameter40. Vanwege de filtering die tijdens dit proces werd uitgevoerd en het gebruik van de Feret-diameter voor onregelmatig gevormde deeltjes, was de polydispersiteitsindex van deze deeltjes vrij laag, in die mate dat ze als monodisperse konden worden beschouwd.
Voor toekomstig onderzoek kunnen verschillende wijzigingen in dit protocol worden aangebracht om beter aan te sluiten bij de gegeven onderzoeksbehoefte. Er zijn bijvoorbeeld slechts twee eiwitten, SDF1-a en TGF-b3, bestudeerd voor hun gecontroleerde afgifte met deze microgels. Eerder werk heeft aangetoond aanhoudende afgifte van deze bioactieve factoren tot ~ 30 dagen in vitro. Andere relevante therapieën, zoals nanodeeltjes, RNA-interfererende (RNAi) moleculen, andere biologische geneesmiddelen of geneesmiddelen met kleine moleculen kunnen echter ook worden onderzocht om hun afgiftesnelheid en werkzaamheid te kwantificeren wanneer ze worden toegepast met deze chitosan-microgeltechnologie. Een andere variabele die in de toekomst kan worden onderzocht, is het veranderen van het groottebereik van de microgels, wat eenvoudig wordt gedaan door de maaswijdte van het spuitfilter te wijzigen. Dit kan ook een aanzienlijke invloed hebben op de afgiftesnelheid van therapeutica uit de microgels, waardoor een gemakkelijke controle over de afgiftekinetiek mogelijk is zonder de chemie van crosslinking te veranderen. Bovendien kan dit protocol eenvoudig worden opgeschaald met behulp van grotere spuiten en filters of vacuümfiltratietechnieken om grote hoeveelheden chitosan-microgels te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van het National Institute of Health onder de toekenningsnummers R03AR068087 en R21AR071585 en door de Boettcher Foundation (# 11219) aan MDK. CBE werd ondersteund door NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
| Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
| Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
| Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
| Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
| Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |
References
- Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
- Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
- Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
- Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
- Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
- Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
- Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
- Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
- Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
- Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
- Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
- Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
- Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
- Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
- Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
- Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
- Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
- Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
- Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
- Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
- Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
- Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
- Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
- Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
- Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
- Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
- Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
- Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
- Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
- Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
- Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
- Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
- Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).
