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Bioengineering

Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein nicht-emulsionsbasiertes Verfahren zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen. Die Größe dieser Mikrogele kann präzise kontrolliert werden, und sie können pH-abhängige Schwellungen aufweisen, in vivo abgebaut werden und mit therapeutischen Molekülen beladen sein, die im Laufe der Zeit nachhaltig freigesetzt werden, was sie für Tissue-Engineering-Anwendungen sehr relevant macht.

Abstract

Chitosan-Mikrogele sind aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums, ihrer niedrigen Kosten und ihrer Immunogenität von großem Interesse im Tissue Engineering. Chitosan-Mikrogele werden jedoch üblicherweise mit Emulsionsmethoden hergestellt, die organische Lösungsmittelspülungen erfordern, die giftig und umweltschädlich sind. Das vorliegende Protokoll stellt eine schnelle, nicht zytotoxische, nicht auf Emulsion basierende Methode zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen ohne die Notwendigkeit organischer Lösungsmittelspülungen vor. Die hierin beschriebenen Mikrogele können mit präziser Größenkontrolle hergestellt werden. Sie weisen eine anhaltende Freisetzung von Biomolekülen auf und sind damit für Tissue Engineering, Biomaterialien und regenerative Medizin von hoher Relevanz. Chitosan wird mit Genipin zu einem Hydrogelnetzwerk vernetzt und dann durch einen Spritzenfilter geleitet, um die Mikrogele herzustellen. Die Mikrogele können gefiltert werden, um eine Reihe von Größen zu erzeugen, und sie zeigen pH-abhängige Schwellungen und bauen sich im Laufe der Zeit enzymatisch ab. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell eingesetzt und es wurde gezeigt, dass sie eine erhöhte Knorpelgewebereparatur fördern und nach 28 Tagen in vivo einen vollständigen Abbau zeigen. Aufgrund ihrer niedrigen Kosten, ihres hohen Komforts und ihrer einfachen Herstellung mit zytokompatiblen Materialien stellen diese Chitosan-Mikrogele eine aufregende und einzigartige Technologie im Tissue Engineering dar.

Introduction

Die Wachstumsplatte, auch bekannt als Physis, ist die Knorpelstruktur am Ende langer Knochen, die das Wachstum bei Kindern vermittelt. Wenn die Wachstumsplatte verletzt wird, kann sich Reparaturgewebe bilden, das als "knöcherner Balken" bekannt ist, was das normale Wachstum unterbricht und Wachstumsdefekte oder Winkeldeformitäten verursachen kann. Epidemiologische Daten haben gezeigt, dass 15%-30% aller Skelettverletzungen im Kindesalter mit der Wachstumsplatte zusammenhängen. Die Bildung von Knochenstäben tritt bei bis zu 30% dieser Verletzungen auf, was Wachstumsplattenverletzungen und die damit verbundene Behandlung zu einem signifikanten klinischen Manifestationsproblemmacht 1,2,3,4. Wenn eine knöcherne Stabbildung auftritt, besteht der häufigste Behandlungsweg darin, den knöchernen Stab zu resektieren und ein Interpositionsmaterial wie Silizium oder Fettgewebeeinzuführen 5. Patienten, die sich einer knöchernen Bar-Resektionsoperation unterziehen, haben jedoch oft eine schlechte Prognose für eine vollständige Genesung, da es derzeit keine Behandlung gibt, die eine verletzte Wachstumsplatte vollständig reparieren kann 6,7,8. Angesichts dieser Mängel besteht ein kritischer Bedarf an wirksamen Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen, sowohl bei der Verhinderung der Bildung eines knöchernen Balkens als auch bei der Regeneration von gesundem physärem Knorpelgewebe.

Hydrogel-Mikropartikel oder Mikrogele haben in letzter Zeit Interesse als injizierbare Gerüste gewonnen, die eine anhaltende Freisetzung von Therapeutika ermöglichenkönnen 9. Aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit und Biokompatibilität eignen sich Mikrogele auch gut für die Bioaktivfaktor- oder Zellverkapselung. Mikrogele können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, die von synthetischen Polymeren wie Polyethylenglykol (PEG) bis hin zu natürlichen Polymeren wie Alginat oder Chitosan10,11,12 reichen. Es hat sich gezeigt, dass Chitosan mehrere positive Auswirkungen auf das Tissue Engineering hat, wie z.B. seine Fähigkeit, die äußere Membran von gramnegativen Bakterien zu destabilisieren und dadurch inhärente antimikrobielle Aktivitätzu bieten 1 3,14. Darüber hinaus ist Chitosan kostengünstig, zellinteraktiv und leicht zu modifizieren mit seiner aminhaltigen Struktur. Chitosan-basierte Mikrogele versprechen eine Biomaterialstrategie für die Arzneimittelabgabe und Materialsignalisierung, die die Geweberegeneration fördern und gleichzeitig bakterielle Infektionen verhindern kann. Chitosan-Mikrogele werden jedoch oft mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, die spezielle Ausrüstung, Emulsionstechniken oder zytotoxische Lösungsmittelspülungen erfordern. Zum Beispiel haben einige Studien Chitosan-Mikrogele mit emulsionsbasierten Methoden hergestellt, aber diese Protokolle erfordern Lösungsmittelspülungen und zytotoxische Vernetzer, was möglicherweise ihre Translation in klinische Umgebungen negiert15,16. Andere Studien haben Mikrofluidik- oder Elektrospray-Ansätze verwendet, um Chitosan-Mikrogele herzustellen, die spezielle Ausrüstung, Vorbereitung und Schulung erfordern17,18. Chitosan-Mikrogele werden auch üblicherweise mit einem tropfenweisen Prozess des Vernetzers in Chitosanlösung hergestellt; Diese Methode ist jedoch stark von der Lösungsviskosität, der Polymerkonzentration und der Durchflussrate abhängig, was es schwierig macht, die Größe und Dispersität der Mikrogele19,20 zu kontrollieren. Umgekehrt erfordert das hierin beschriebene Verfahren zur Mikrogelherstellung keine spezielle Ausrüstung oder Lösungsmittelspülungen, wodurch diese Mikrogele für die Herstellung in fast jedem Labor oder jeder Umgebung geeignet sind. Daher stellen diese Mikrogele hochrelevante Biomaterialien für ein schnelles, kostengünstiges und einfach herzustellendes Arzneimittelabgabevehikel für viele Anwendungen dar.

Durch die Modulation der Zusammensetzung und der Materialeigenschaften eines Mikrogels können Forscher eine präzise Kontrolle über die zelluläre Mikroumgebung erlangen und so das Zellverhalten materialabhängig steuern. Mikrogele können allein oder in Kombination mit Bulk-Biomaterialsystemen eingesetzt werden, um spezifische Funktionalitäten zu vermitteln, wie z.B. die verlängerte Freisetzung bioaktiver Faktoren oder eine präzise spezielle Signalgebung für native oder exogene Zellen. Biomaterialien und Mikrogele haben sich als attraktive Behandlungsmöglichkeiten für Wachstumsplattenverletzungen herauskristallisiert. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Alginat- und Chitosan-basierte Biomaterialien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen zu entwickeln 21,22,23,24,25. Aufgrund der dynamischen zeitlichen Natur der Wachstumsplattenverknöcherung und Knochendehnung ist der Mechanismus der knöchernen Balkenbildung nicht vollständig verstanden. Daher wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um die Mechanismen der endochondralen Ossifikation und der knöchernen Balkenbildung, wie bei Ratten, Kaninchen und Schafen, besser aufzuklären26,27,28. Ein solches Modell ist ein Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell, das einen Bohrlochdefekt in der Rattentibia verwendet, um einen knöchernen Balken in einer vorhersehbaren und reproduzierbaren Weise herzustellen und menschliche Verletzungen in allen drei Zonen der Wachstumsplatte 29,30 nachzuahmen. Mehrere biomaterialbasierte Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen wurden mit diesem Modell getestet. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen entwickelt, die als injizierbares Biomaterialsystem verwendet werden können, das Therapeutika nachhaltig freisetzt 10,31. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenphyseal-Verletzungsmodell eingesetzt und zeigten eine verbesserte Knorpelregeneration31 bei der Freisetzung von SDF-1a und TGF-b3. Die in diesem Protokoll bereitgestellten Techniken beschreiben Methoden, die zur Herstellung dieser Chitosan-Mikrogele entwickelt wurden, die dann in einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt werden können. Zum Beispiel haben neuere Studien thermo- oder magento-responsive Chitosan-Mikrogele für kontrollierte onkologische Arzneimittelverabreichungsanwendungenverwendet 32,33.

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Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. 6 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden für die vorliegende Studie verwendet. Das Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell wurde nach einem zuvor veröffentlichten Berichterstellt 30.

1. Herstellung des Chitosanpolymers

  1. Erhalten Sie gereinigtes und lyophilisiertes niedermolekulares (LMW) Chitosan aus kommerziell verfügbaren Quellen (siehe Materialtabelle).
  2. 495 ml doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) und eine Rührstange zu einem 1 L Becherglas geben. 5 g Chitosan (Schritt 1.1.) zugeben und gut mischen.
    HINWEIS: Chitosan ist in einer wässrigen Lösung bei physiologischem pH-Wert nur spärlich löslich, so dass sich das Chitosan bei diesem Schritt nicht leicht auflöst.
  3. Fügen Sie 5 ml Eisessigsäure zu der oben hergestellten Chitosanlösung hinzu.
  4. Bei 300 U/min 18 h mit dem Becherglas in einem Wasserbad bei 50 °C umrühren.
  5. Filtern Sie die Chitosanlösung mit einem Büchnerkolben und Trichter durch abnehmende Filterpapiergrößen: 22 μm, 8 μm und 2,7 μm (siehe Materialtabelle).
  6. Die gefilterte Chitosanlösung in den Cellulose-Dialyseschlauch geben (siehe Materialtabelle) und in ddH 2 O bei Raumtemperatur 4Tage lang dialysieren lassen, wobei das ddH2O täglich gewechselt wird.
    HINWEIS: Verwenden Sie für die letzte Änderung ultrareines ddH2O-Wasser.
  7. Die dialysierte Chitosanlösung in ein Becherglas geben und den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8,0 einstellen.
  8. Aliquot das Chitosan in Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 4000 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  9. Dekantieren Sie den Überstand zu einem Abfallstrom und suspendieren Sie das Chitosan in ddH 2 O, wobei Sie2x wiederholen.
  10. Einfrieren und dann das Chitosan-Pellet lyophilisieren.
    1. Entfernen Sie jeden Tag das lyophilisierte Produkt und zeichnen Sie die Masse auf.
      HINWEIS: Wenn sich die Masse des lyophilisierten Produkts nicht mehr ändert, ist das Produkt vollständig getrocknet und kann bei -20 ° C gelagert werden, bis es gebrauchsfertig ist.

2. Herstellung von Chitosan-Hydrogel

  1. Fügen Sie 2 ml 6% Essigsäure und 120 mg gereinigtes Chitosan (Schritt 1) zu einer 10 ml Luer-Lock-Spritze hinzu, um eine 6% w/v Chitosanlösung zu bilden.
  2. Verbinden Sie die Luer-Lock-Spritze mit einer anderen identischen Spritze über einen Luer-Lock-Buchsenstecker und mischen Sie die Lösung 30 s hin und her oder bis sich das Chitosan vollständig in der Essigsäure aufgelöst hat.
  3. Vor der Vernetzung fügen Sie der Chitosanlösung (falls erforderlich) ein therapeutisches oder bioaktives Mittel hinzu. Für die vorliegende Studie wurden den Mikrogelen 200 ng SDF-1a und TGF-b3 (siehe Tabelle der Materialien) zugesetzt.
    HINWEIS: SDF-1a und TGF-b3 sind bioaktive Wirkstoffe, die für die Regeneration von Wachstumsplattengewebe relevant sind. SDF-1a fördert die Migration von mesenchymalen Stammzellen zur Defektstelle, und TGF-b3 dient als chondrogener Faktor, um die Differenzierung dieser Stammzellen entlang der chondrogenen Linie31 zu induzieren.
    HINWEIS: Mischen Sie das Chitosan erneut zwischen den Spritzen, um das therapeutische Mittel vollständig zu integrieren.
  4. Bereiten Sie 100 mM Stammvernetzerlösung von Genipin (siehe Materialtabelle) in 100% Ethanol vor.
  5. 100 μL der hergestellten Genipinlösung (Schritt 2.4.) in die Chitosan-haltige Spritze geben und erneut 30 s zwischen den Spritzen hin und her mischen.
  6. Die Mischung aus der Spritze auf eine 35 mm Petrischale extrudieren, mit Paraffinfolie abdecken und über Nacht bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre inkubieren.
    HINWEIS: Die Lösung färbt sich dunkelblau, was darauf hinweist, dass die Vernetzungsreaktion zwischen Chitosan und Genipin stattgefunden hat, was zur Bildung von Chitosan-Mikrogel geführt hat.
  7. Filtern Sie das hergestellte Chitosan-Mikrogel mit den folgenden Schritten.
    1. Brechen Sie das Hydrogel vorsichtig mit einem Spatel in kleinere Stücke.
      HINWEIS: Die Stücke sollten klein genug sein, um auf die Rückseite einer 10-ml-Spritze mit einem Durchmesser von ~ 1-2 cm übertragen zu werden.
    2. Legen Sie einen Filter der gewünschten Maschenweite in die Rückseite einer sauberen 10-ml-Spritze.
      HINWEIS: Der typische Größenbereich für Mikrogele liegt zwischen 50-200 μm.
    3. Die zerbrochenen Gelstücke in die mit dem Filter versehene Spritze geben und 6 ml ddH2O hinzufügen.
      HINWEIS: Das Chitosan-Gel schwillt im wässrigen Medium deutlich an, so dass eine große Veränderung des Gelvolumens erwartet wird.
    4. Verbinden Sie die Spritze über einen Luer-Lock-Stecker mit einer anderen sauberen 10-ml-Spritze.
    5. Zwingen Sie das Gel + Wasser-Gemisch durch die Spritze mit dem Filter, um Mikrogele mit einem bestimmten maximalen Durchmesser zu erzeugen.
      1. Öffnen Sie nach der ersten Filtration die Rückseite der Spritze, die den Filter enthält, und extrudieren Sie die Mischung wieder in diese Spritze.
      2. Ersetzen Sie die Rückseite der Spritze und drücken Sie die Mischung erneut durch den Filter.
      3. Wiederholen Sie die Filtration 5-6x oder bis es wenig Widerstand durch den Filter gibt.
  8. Spülen und reinigen Sie die gefilterten Mikrogele.
    1. Übertragen Sie die filtrierte Gelmischung auf ein konisches 50-ml-Rohr, bringen Sie das Gesamtvolumen mit ddH2O auf 20 ml und wirbeln Sie dann die Mischung um, um eine homogene Dispersion zu gewährleisten.
    2. Die Mikrogele bei 100 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und die obere wässrige Phase dekantieren.
    3. Suspendieren Sie die Mikrogele in 10 ml 70% Ethanol, Wirbel und legen Sie sie für 1 Stunde unter UV-Licht, um zu sterilisieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Mikrogele bei 1.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie das Ethanol und spülen Sie es 3x mit ddH2O ab.

3. Herstellung von Mikrogelen für In-vitro- oder In-vivo-Anwendungen

HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde die Knorpelregeneration bei Wachstumsplattenverletzungen in einem Rattenmodell untersucht. Weitere Informationen finden Sie unter Referenz31.

  1. Resuspendiert die Mikrogelpellets 1:1 in ddH 2 O. Mikrogele können bis zu 1 Monat suspendiert in ddH2O bei 4 °C gelagert werden. Wenn ein bioaktives Mittel verwendet wird, müssen die Mikrogele sofort verwendet werden.
  2. Erstellen Sie die Verletzungsstelle im Tier nach einem zuvor veröffentlichten Bericht30.
  3. Spülen Sie die Verletzungsstelle mit Kochsalzlösung und halten Sie das Tier entweder unbehandelt (zur Kontrollstudie) oder injizieren Sie nur die Chitosan-Mikrogele oder die mit den bioaktiven Wirkstoffen beladenen Mikrogele (Schritt 3.2.).
  4. Schließen Sie die Wunde im Tier und verabreichen Sie postoperative Analgetika30.
  5. An den Tagen 7 oder 28 nach der Operation, euthanasieren Sie die Ratte durch CO 2 Überdosis, entfernen Sie die Gliedmaßen und führen Sie eine Histologie durch, um die Gewebereparatur an der Verletzungsstellezu beurteilen 31.

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Representative Results

Die erfolgreiche Herstellung von Chitosan-Mikrogelen beruht auf der Vernetzungsreaktion zwischen Genipin und Chitosan, an der insbesondere die Amine an den Chitosan-Polymerketten beteiligt sind. Im Gegensatz zu anderen Mikrogel-Herstellungstechniken erfordert diese Methode keine Emulsionen oder Lösungsmittelspülungen und kann schnell und einfach mit kostengünstigen Geräten durchgeführt werden. Ein charakteristischer Indikator für eine erfolgreiche Mikrogelherstellung ist der deutliche Farbwechsel von cremefarben zu dunkelblau, nachdem Chitosan und Genipin gemischt wurden. Die Vernetzungsreaktion zwischen Genipin und aminhaltigen Verbindungen, wie Chitosan oder anderen Proteinen, wurde in der Literatur gut charakterisiert34. Kurz gesagt, der Vernetzungsmechanismus wird als nukleophiler Angriff der Aminogruppen von Chitosan angesehen, bei dem Genipin als Dialdehyd mit stabilen Kondensationsproduktenwirkt 35. Die kurzen Ketten aus stabilem, kondensiertem Genipin fungieren als verbindende Brücken zwischen den Chitosanpolymeren. Die Vernetzungsreaktion bewirkt, dass die Lösung dunkelblau wird, wahrscheinlich aufgrund der durch Sauerstoffradikale induzierten Polymerisation und Dehydrierung von Zwischenverbindungen, die der ringöffnenden Reaktion des nukleophilen Angriffs36 folgt.

Nachdem die Mikrogele in einer 1:1-Wasserverdünnung gefiltert und resuspendiert wurden, können sie problemlos in verschiedenen Biomaterialanwendungen eingesetzt werden. Vor kurzem wurden Arbeiten veröffentlicht, die diese emulsionsfreien Chitosan-Mikrogele verwenden, um die Knorpelregeneration bei Wachstumsplattenverletzungen zu fördern. Die Mikrogele wurden wie hierin beschrieben hergestellt und entweder leer gehalten oder mit SDF-1a und TGF-b3 beladen, die bioaktive Wirkstoffe sind, die für die Regeneration von Wachstumsplattengewebe relevant sind, wobei SDF-1a die Migration von mesenchymalen Stammzellen zur Defektstelle fördert und TGF-b3 als chondrogener Faktor dient, um die Differenzierung dieser Stammzellen entlang der chondrogenen Linie zu induzieren37, 38. Die Freisetzungsrate der Proteine wurde in vitro über ELISA quantifiziert, und die Freisetzung dieser Moleküle wurde im Laufe der Zeitaufrechterhalten 31. Dann wurden die Mikrogele in einem In-vivo-Rattenmodell in eine Wachstumsplattenverletzung injiziert, und die injizierten Mikrogele verhinderten eine frühe knöcherne Balkenbildung in vivo31. Diese injizierbaren, kostengünstigen und einfach herzustellenden Chitosan-Mikrogele könnten problemlos in vielen Biomaterialanwendungen eingesetzt werden.

Obwohl dieser Prozess zur Mikrogelherstellung für einfache Setups und Anwendungen optimiert wurde, könnten immer noch einige Probleme auftreten, auf die Forscher achten sollten. Eine unzureichende Durchmischung des Polymers und der Vernetzungskomponenten ist die wahrscheinlichste Ursache für unterschiedliche Ergebnisse während der Herstellung. Das feste Chitosan muss kräftig zwischen den Spritzen gemischt werden, und die resultierende Chitosanlösung muss vollständig homogen sein, bevor der Genipin-Vernetzer hinzugefügt wird. Wenn die Lösung nicht homogen ist, bilden die in der Lösung verbleibenden festen Chitosanbrocken Klumpen, und es kommt zu einer ungleichmäßigen Vernetzung, die eine effektive Filterung verhindert und zu polydispergierten Mikrogelen mit deutlich variierenden Durchmessern führt. Ein weiterer wichtiger Faktor, der bei der Herstellung zu berücksichtigen ist, ist die Vermeidung von Verdunstung während der Vernetzungsphase, die mit Paraffinfilm oder anderen Verdampfungseinfangtechniken verhindert werden muss. Wenn das Chitosan-Hydrogel austrocknet, quillt es während des Wasserspülens nicht auf und filtert nicht durch die Spritze. Schließlich müssen die Mikrogele während des Filtrationsprozesses in überschüssigem Wasser suspendiert und bei Nichtgebrauch in Wasser bei 4 °C gelagert werden. Die Mikrogele sind nicht extrudierbar oder injizierbar, es sei denn, sie sind in mindestens einer 1:1-Verdünnung von Wasser suspendiert.

Abbildung 1 zeigt einen breiten Überblick über den Mikrogel-Herstellungsprozess. Derselbe Prozess wird in Abbildung 2 erneut dargestellt, die Fotos des Prozesses zeigt und die Protokollphasen hervorhebt, die allein aus dem Text schwer zu verstehen sind. Abbildung 2D zeigt beispielsweise, wie ein Drahtgitterfilter in die 10-ml-Spritze eingeführt wird. Sobald er vollständig an der Oberseite der Spritze sitzt, ermöglicht dieser Drahtgeflechtfilter eine schnelle und bequeme Filtration der Chitosan-Mikrogele ohne Spezialausrüstung oder Lösungsmittel. In ähnlicher Weise zeigt Abbildung 2E den Fluss von hydratisiertem Chitosangel durch den Netzfilter, der die Grundlage für die Mikrogelherstellung bildet. Abbildung 3 wurde aus unserer vorherigen Publikation zu diesen Mikrogelen angepasst und zeigt ihr pH-abhängiges Quellverhalten und die Unterschiede in der Größe der Mikrogele in Abhängigkeit von der Porengröße des Netzfilters. Verschiedene Maschenweiten können beim Hersteller bestellt werden, was eine bequeme Kontrolle über die Größe der Mikrogele ermöglicht. Diese präzise Kontrolle der Mikrogelgröße ist bei der Entwicklung von Arzneimittelabgabesystemen mit klar definierten therapeutischen Belastungsfreisetzungsraten von großer Bedeutung. Frühere Arbeiten an Mikrogelen zeigten auch, dass sie in Gegenwart von Lysozym nach 2-4 Wochen31 signifikant abgebaut werden. Schließlich zeigt Abbildung 4 histologische Bilder31 in einem Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell, das mit den Chitosan-Mikrogelen behandelt wurde, die mit SDF-1a und TGF-b3 beladen sind.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Herstellung von Chitosan-Mikrogelen. Die Figur wurde mit biorender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Fotos des Mikrogelherstellungsprozesses . (A) Chitosanlösung in Spritzen, die mit Luer-Schloss verbunden sind. (B) Extrusion von Chitosangel in eine 35 mm Petrischale. (C) Abruf von Chitosan-Gel nach der Vernetzung des Farbwechsels von cremefarben zu dunkelblau. (D) Draufsicht im Inneren der Spritze, die das an der Düse der Spritze angebrachte Drahtgeflechtsieb zeigt. (E) Chitosan-Gel wurde durch einen Netzfilter gepresst, um Mikrogele herzustellen. (F) Mikrogele wurden in einer 1:1-Verdünnung von ddH 2 O in einem konischen Röhrchen gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: pH-abhängiges Quellverhalten der Mikrogele. (A) Normalverteilungsdiagramm des Feret-Durchmessers, das das Quellverhalten der Mikrogele als Reaktion auf pH-Änderungen zeigt. (B) Fluoreszierende Bilder von Mikrogelen, die unter Verwendung von Mesh Nr. 200 (oberes Bild: <75 μm große Mikrogele) und Nr. 100 Mesh (unteres Bild: 75-150 μm große Mikrogele) hergestellt werden. Die Abbildung wird mit Genehmigung von Referenz31 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Histologische Bilder in einem Ratten-Wachstumsplattenverletzungsmodell, das mit den mit SDF-1a und TGF-b3 beladenen Chitosan-Mikrogelen behandelt wurde. 10x histologische Bilder zeigen Wachstumsplattenreparaturgewebe von intaktem (A) und (E), unbehandeltem (B) und (F), Mikrogel behandelt (C) und (G), Mikrogel + SDF-1a behandelt (D) und (H) und Mikrogel + TGF-b3 behandelt (I ) Gliedmaßen. An keinem Tag wurden 7 Tiere mit Mikrogel + TGFb3 behandelt. Alcianisches blaues Hämatoxylin (ABH) färbt den Knochen orange bis rot, das faserige Gewebe rosa und den Knorpel blau. Das Mikrogel erscheint als dunkelrotes faserartiges Gewebe. Maßstabsstäbe = 500 μm. Die Abbildung wird mit Genehmigung von Referenz31 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Mikrogele wurden in den letzten Jahren aufgrund ihrer hohen Anwendbarkeit für verschiedene Zwecke, wie z.B. Arzneimittelabgabe oder Zellverkapselung, umfassend erforscht9. Die einfache Herstellung von Biomaterialkonstrukten im Mikromaßstab ist im Tissue Engineering von erheblicher Bedeutung, da sie es Forschern ermöglicht, Hydrogel-basierte Strategien in einer bestimmten Größe und Zeitskala zu entwickeln. Die meisten Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen erfordern jedoch teure Geräte und Reagenzien, Emulsionen oder zytotoxische Lösungsmittelspülungen, was ihre Übersetzung in den klinischen Gebrauch verhindert 15,16,17,18,19,20. Diese Mikrogele zeichnen sich durch ihre erhebliche Bequemlichkeit der Herstellung aus und erfordern keine Emulsionstechniken oder Lösungsmittelspülungen. Darüber hinaus behalten diese Mikrogele die idealen Eigenschaften für ein gewebetechnisch hergestelltes Konstrukt, wie pH-abhängige Schwellung und Medikamentenbelastung, abgestimmtes Abbauverhalten und anhaltende Freisetzung von Therapeutika.

Der kritischste Schritt bei der Herstellung dieser Chitosan-Mikrogele ist die Filtration zwischen den Spritzen. Diese Mikrogele beginnen als Bulk-Hydrogel und werden mit Drahtgitterfiltern auf einen bestimmten Größenbereich filtriert. Ohne Filterung würden sich die Anwendbarkeit, die mechanischen Eigenschaften und die Eigenschaften der Wirkstofffreisetzung der Mikrogele signifikant unterscheiden. Der Filterschritt ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Größe der Hydrogele und ermöglicht auch die Herstellung von Mikrogelen mit hohem Durchsatz, die eine pH-abhängige Schwellung und eine anhaltende Freisetzung von Therapeutika aufweisen.

Eine Einschränkung dieses Prozesses besteht darin, dass der Filterschritt nicht zu Hydrogelen mit einer perfekt kugelförmigen Form geführt hat, was für einige Anwendungen ein wichtiger Faktor sein kann. Aus diesem Grund wurde die charakteristische Größe der Mikrogele mit Hilfe des Feret-Durchmessers beschrieben (Abbildung 3), der zur Quantifizierung unregelmäßig geformter Partikelnützlich ist 39. Obwohl die Geometrie der Mikrogele keine perfekte Kugel war, war die durchschnittliche Größe der Partikel basierend auf der Maschenweite des Spritzenfilters leicht zu kontrollieren, und für viele Anwendungen ist es nicht notwendig, perfekt kugelförmige Partikel zu haben. Der Polydispersitätsindex (PDI) der Mikrogele wurde unter Verwendung des Quadratverhältnisses der Standardabweichung des Feret-Durchmessers zum durchschnittlichen Feret-Durchmesser quantifiziert, der aus einer großen Partikelpopulation (n = 74) erhalten wurde. Die PDI wurde mit der Gleichung 0,076 berechnet.

PDI = (s/D)2

wobei s die Standardabweichung des durchschnittlichen Feret-Durchmessers und D der durchschnittliche Feret-Durchmesser40 ist. Aufgrund der Filterung während dieses Prozesses und der Verwendung des Feret-Durchmessers für unregelmäßig geformte Partikel war der Polydispersitätsindex dieser Partikel ziemlich niedrig, so dass sie als monodispers angesehen werden konnten.

Für zukünftige Forschung könnten mehrere Änderungen an diesem Protokoll vorgenommen werden, um dem gegebenen Forschungsbedarf besser gerecht zu werden. Zum Beispiel wurden nur zwei Proteine, SDF1-a und TGF-b3, auf ihre kontrollierte Freisetzung mit diesen Mikrogelen untersucht. Frühere Arbeiten haben eine anhaltende Freisetzung dieser bioaktiven Faktoren bis zu ~ 30 Tage in vitro gezeigt. Andere relevante Therapeutika wie Nanopartikel, RNA-interferierende (RNAi) -Moleküle, andere Biologika oder niedermolekulare Medikamente könnten jedoch ebenfalls untersucht werden, um ihre Freisetzungsrate und Wirksamkeit zu quantifizieren, wenn sie mit dieser Chitosan-Mikrogel-Technologie angewendet werden. Eine weitere Variable, die in Zukunft untersucht werden könnte, ist die Änderung des Größenbereichs der Mikrogele, die einfach durch Änderung der Maschenweite des Spritzenfilters erfolgt. Dies könnte auch einen signifikanten Einfluss auf die Freisetzungsrate von Therapeutika aus den Mikrogelen haben, was eine bequeme Kontrolle der Freisetzungskinetik ermöglicht, ohne die Chemie der Vernetzung zu verändern. Darüber hinaus kann dieses Protokoll leicht mit größeren Spritzen und Filtern oder Vakuumfiltrationstechniken skaliert werden, um große Mengen an Chitosan-Mikrogelen herzustellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases des National Institute of Health unter den Preisnummern R03AR068087 und R21AR071585 und von der Boettcher Foundation (#11219) an MDK unterstützt. CBE wurde von NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

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References

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Bioengineering Ausgabe 182
Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen
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Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

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