Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שאינה מבוססת על תחליב לייצור מיקרוגלים של צ'יטוזן-גניפין. ניתן לשלוט במדויק בגודלם של המיקרוג'לים האלה, והם יכולים להציג נפיחות תלוית pH, לפרק in vivo ולהיות עמוסים במולקולות טיפוליות שמשחררות לאורך זמן באופן מתמשך, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד ליישומים של הנדסת רקמות.

Abstract

מיקרוגלים של Chitosan הם בעלי עניין משמעותי בהנדסת רקמות בשל מגוון רחב של יישומים, עלות נמוכה ואימונוגניות. עם זאת, מיקרוג'לים צ'יטוזן מיוצרים בדרך כלל בשיטות תחליב הדורשות שטיפות ממס אורגניות, שהן רעילות ומזיקות לסביבה. הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, לא ציטוטוקסית, לא מבוססת תחליב, לייצור מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפין ללא צורך בשטיפות ממס אורגניות. ניתן לייצר את המיקרוג'לים המתוארים כאן עם בקרת גודל מדויקת. הם מציגים שחרור מתמשך של ביומולקולות, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד להנדסת רקמות, ביו-חומרים ורפואה רגנרטיבית. Chitosan הוא crosslinked עם genipin כדי ליצור רשת הידרוג'ל, ולאחר מכן מועבר דרך מסנן מזרק כדי לייצר את microgels. ניתן לסנן את המיקרוג'לים כדי ליצור מגוון גדלים, והם מראים נפיחות תלוית pH ומתפרקים עם הזמן באופן אנזימטי. מיקרוג'לים אלה שימשו במודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה והודגמו כמעודדים תיקון מוגבר של רקמות הסחוס ומראים פירוק מלא לאחר 28 ימים in vivo. בשל העלות הנמוכה שלהם, הנוחות הגבוהה וקלות הייצור שלהם עם חומרים cytocompatible, מיקרוג'לים chitosan אלה מציגים טכנולוגיה מרגשת וייחודית בהנדסת רקמות.

Introduction

לוח הגדילה, הידוע גם בשם הפיזה, הוא מבנה הסחוס הממוקם בקצה העצמות הארוכות המתווך צמיחה אצל ילדים. אם צלחת הגדילה נפגעת, יכולה להיווצר רקמת תיקון המכונה "מוט גרמי", אשר קוטעת את הצמיחה הרגילה ועלולה לגרום לפגמים בגדילה או לעיוותים זוויתיים. נתונים אפידמיולוגיים הראו כי 15%-30% מכלל פציעות השלד בילדות קשורות ללוחית הגדילה. היווצרות מוטות גרמיים מתרחשת בעד 30% מהפציעות הללו, מה שהופך את הפציעות של לוחות הגדילה והטיפול הקשור אליהן לבעיה משמעותית של ביטוי קליני 1,2,3,4. כאשר מתרחשת היווצרות מוטות גרמיים, שדרת הטיפול הנפוצה ביותר כוללת כריתה של המוט הגרמי והחדרת חומר אינטרפוזיציוני, כגון סיליקון או רקמת שומן5. עם זאת, לחולים שעוברים ניתוח כריתת בר גרמי יש לעתים קרובות פרוגנוזה גרועה להחלמה מלאה, שכן אין כיום טיפול שיכול לתקן באופן מלא לוחית גדילה פצועה 6,7,8. לאור חסרונות אלה, קיים צורך קריטי באסטרטגיות יעילות לטיפול בפציעות של לוחות גדילה, הן במניעת היווצרות מוט גרמי והן בחידוש רקמת סחוס גופנית בריאה.

מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל, או מיקרו-ג'לים, צברו לאחרונה עניין כפיגומים הניתנים להזרקה שיכולים לספק שחרור מתמשך של טיפולים9. בשל יכולת הכוונון הגבוהה וההתאמה הביולוגית שלהם, מיקרו-ג'לים מתאימים גם לגורם ביו-אקטיבי או לעטיפת תאים. מיקרוג'לים יכולים להיות עשויים מחומרים שונים, החל מפולימרים סינתטיים, כגון פוליאתילן גליקול (PEG), ועד פולימרים טבעיים כמו אלגינט או צ'יטוזן 10,11,12. הודגם כי לצ'יטוזן יש מספר השפעות מועילות על הנדסת רקמות, כגון יכולתו לערער את הממברנה החיצונית של חיידקים גראם שליליים, ובכך להציע פעילות אנטי-מיקרוביאלית מובנית1 3,14. בנוסף, chitosan הוא חסכוני, אינטראקטיבי לתאים, ומשתנה בקלות באמצעות המבנה המכיל אמין שלו. מיקרוג'לים מבוססי צ'יטוזן מבטיחים אסטרטגיה חומרית ביולוגית להעברת תרופות ואיתות חומרים שיכולים לקדם התחדשות רקמות תוך מניעת זיהום חיידקי. עם זאת, מיקרוג'לים צ'יטוזן מיוצרים לעתים קרובות עם מגוון רחב של טכניקות הדורשות ציוד מיוחד, טכניקות תחליב או שטיפות ממסים ציטוטוקסיים. לדוגמה, מחקרים מסוימים יצרו מיקרו-ג'לים צ'יטוזן בשיטות מבוססות תחליב, אך פרוטוקולים אלה דורשים שטיפות ממסים והצלבות ציטוטוקסיות, מה שעלול לשלול את תרגומם להגדרות קליניות15,16. מחקרים אחרים השתמשו בגישות מיקרופלואידיות או אלקטרוספריי כדי לייצר מיקרוג'לים של צ'יטוזן, הדורשים ציוד מיוחד, הכנה והכשרה17,18. מיקרוגלים של צ'יטוזן מיוצרים בדרך כלל גם בתהליך טיפתי של קרוסלינקר לתמיסת צ'יטוזן; עם זאת, שיטה זו תלויה מאוד בצמיגות התמיסה, בריכוז הפולימרים ובקצב הזרימה, מה שמקשה על שליטה בגודל ובפיזור של המיקרוג'לים19,20. לעומת זאת, השיטה לייצור מיקרוג'ל המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מומחה או שטיפות ממסים, מה שהופך את המיקרוג'לים הללו לכדאיים לייצור כמעט בכל מעבדה או סביבה. לכן, מיקרוג'לים אלה מייצגים ביו-חומרים רלוונטיים ביותר עבור כלי מהיר, חסכוני וקל לייצור של תרופות עבור יישומים רבים.

על ידי ויסות הרכב המיקרוג'ל ומאפייני החומר, חוקרים יכולים להשיג שליטה מדויקת על המיקרו-סביבה התאית, ובכך לכוון את התנהגות התאים באופן התלוי בחומר. ניתן להשתמש במיקרוג'לים בכוחות עצמם או בשילוב עם מערכות חומר ביולוגי בתפזורת כדי להקנות פונקציות ספציפיות, כגון שחרור ממושך של גורמים ביו-אקטיביים או איתות מיוחד מדויק לתאים מקומיים או אקסוגניים. ביו-חומרים ומיקרו-ג'לים התגלו כאפיקי טיפול אטרקטיביים לפציעות בלוחות גדילה. מאמץ משמעותי הוקדש לפיתוח ביו-חומרים מבוססי אלגינט וצ'יטוזן לטיפול בפציעות של לוחות גדילה 21,22,23,24,25. בשל האופי הזמני הדינמי של אוסיפיקציה של צלחת גדילה והתארכות עצם, המנגנון של היווצרות מוטות גרמי אינו מובן במלואו. לכן, פותחו מספר מודלים של בעלי חיים כדי להבהיר טוב יותר את המנגנונים של אוסיפיקציה אנדוכונדרלית והיווצרות מוטות גרמיים, כגון בחולדות, ארנבות וכבשים 26,27,28. מודל אחד כזה הוא מודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה, המשתמש בפגם חור מקדחה בשוקת החולדה כדי לייצר מוט גרמי באופן צפוי וניתן לשחזור ומחקה פציעות אנושיות בכל שלושת האזורים של לוחית הגדילה29,30. מספר אסטרטגיות מבוססות חומר ביולוגי לטיפול בפציעות של לוחות גדילה נבדקו באמצעות מודל זה. בנוסף, פותחו שתי שיטות שונות לייצור מיקרוגלים צ'יטוזן, שיכולות לשמש כמערכת חומרית ביולוגית הניתנת להזרקה המשחררת טיפולים באופן מתמשך10,31. מיקרו-ג'לים אלה הוכנסו למודל של פגיעה גופנית בחולדה, והם הראו שיפור בהתחדשותהסחוס 31 בעת שחרור SDF-1a ו-TGF-b3. הטכניקות המסופקות בפרוטוקול זה מתארות שיטות שפותחו לייצור מיקרו-ג'לים צ'יטוזן אלה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם במגוון רחב של יישומים להנדסת רקמות. לדוגמה, מחקרים אחרונים השתמשו במיקרוגלים של צ'יטוזן המגיבים לתרמו או מג'נטו עבור יישומי אספקת תרופות אונקולוגיות מבוקרות32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו דנבר. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דאולי זכרות בנות 6 שבועות. מודל הפגיעה בלוחית הגדילה של החולדה נוצר בעקבות דו"ח30 שפורסם בעבר.

1. הכנת פולימר הצ'יטוזן

  1. קבל צ'יטוזן מטוהר וליופיליזציה של משקל מולקולרי נמוך (LMW) ממקורות זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים).
  2. הוסיפו 495 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ddH2O) ומוט ערבוב לכוס 1 ליטר. מוסיפים 5 גרם של צ'יטוזן (שלב 1.1)ומערבבים היטב.
    הערה: צ'יטוזן מסיס במשורה רק בתמיסה מימית ב-pH פיזיולוגי, כך שהצ'יטוזן לא יתמוסס בקלות בשלב זה.
  3. הוסיפו 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית לתמיסת הצ'יטוזן המוכנה לעיל.
  4. יש לערבב ב-300 סל"ד במשך 18 שעות כשהכוס מונחת באמבט מים שנערך בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
  5. באמצעות בקבוקון ומשפך של Büchner, סנן את תמיסת הצ'יטוזן באמצעות הקטנת הגדלים של נייר המסנן: 22 מיקרומטר, 8 מיקרומטר, 8 מיקרומטר ו-2.7 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
  6. הוסיפו את תמיסת הצ'יטוזן המסוננת לצינורות דיאליזה של תאית (ראו טבלת חומרים) ואפשרו דיאליזה ב-ddH2O בטמפרטורת החדר למשך 4 ימים, תוך שינוי ה-ddH2O מדי יום.
    הערה: השתמש במים ultrapure ddH2O לשינוי האחרון.
  7. העבר את תמיסת הצ'יטוזן עם דיאליז לכוס והתאם את ה- pH ל- 8.0 באמצעות NaOH 1 M.
  8. Aliquot את chitosan לתוך צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 4000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. נקו את הסופרנאטנט לזרם פסולת והחזירו את הצ'יטוזן ב-ddH2O, תוך חזרה על 2x.
  10. להקפיא ולאחר מכן ליופיליזציה של גלולת הצ'יטוזן.
    1. בכל יום, להסיר את המוצר lyophilized ולרשום את המסה.
      הערה: כאשר המסה של המוצר lyophilized כבר לא משתנה, המוצר מיובש לחלוטין וניתן לאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.

2. ייצור הידרוג'ל צ'יטוזן

  1. הוסיפו 2 מ"ל של 6% חומצה אצטית ו-120 מ"ג של צ'יטוזן מטוהר (שלב 1) למזרק Luer-lock של 10 מ"ל כדי ליצור תמיסת צ'יטוזן של 6% w/v.
  2. חברו את מזרק ה-Luer-lock למזרק זהה אחר באמצעות מחבר Luer-lock נקבי-נקבי וערבבו את התמיסה קדימה ואחורה במשך 30 שניות, או עד שהצ'יטוזן מתמוסס במלואו בחומצה האצטית.
  3. לפני קישור צולב, הוסיפו כל חומר טיפולי או ביו-אקטיבי לתמיסת הצ'יטוזן (במידת הצורך). לצורך המחקר הנוכחי, 200 ננוגרם של SDF-1a ו-TGF-b3 (ראו טבלת חומרים) נוספו למיקרוגלים.
    הערה: SDF-1a ו- TGF-b3 הם חומרים ביו-אקטיביים הרלוונטיים להתחדשות רקמת צלחת הגדילה. SDF-1a מקדם נדידה של תאי גזע מזנכימליים לאתר הפגם, ו-TGF-b3 משמש כגורם כונדרוגני כדי לגרום להתמיינות של תאי גזע אלה במורד השושלת הכונדרוגנית31.
    הערה: ערבבו שוב את הצ'יטוזן בין המזרקים כדי לשלב באופן מלא את הטיפול.
  4. הכן 100 mM של תמיסת קרוסלינקר מלאי של גניפין (ראה טבלת חומרים) ב-100% אתנול.
  5. הוסיפו 100 μL של תמיסת הגניפין המוכנה (שלב 2.4.) למזרק המכיל צ'יטוזן, וערבבו שוב הלוך ושוב בין מזרקים במשך 30 שניות.
  6. מוציאים את התערובת מהמזרק לצלחת פטרי 35 מ"מ, מכסים אותה בסרט פרפין ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באווירה לחה.
    הערה: התמיסה תהפוך לכחולה כהה, מה שמעיד על כך שתגובת הקישור ההצלבה בין צ'יטוזן לגניפין התרחשה, מה שיוביל להיווצרות של מיקרוג'ל צ'יטוזן.
  7. סנן את המיקרוג'ל הצ'יטוזן המוכן בהתאם לשלבים הבאים.
    1. יש לשבור בעדינות את ההידרוג'ל לחתיכות קטנות יותר באמצעות מרית.
      הערה: החלקים צריכים להיות קטנים מספיק כדי להיות מועברים לחלק האחורי של מזרק 10 מ"ל, ~ 1-2 ס"מ קוטר.
    2. הניחו מסנן בגודל הרשת הרצוי בגבו של מזרק נקי של 10 מ"ל.
      הערה: טווח הגודל האופייני למיקרו-ג'לים הוא בין 50-200 מיקרומטר.
    3. מעבירים את חתיכות הג'ל השבורות למזרק המצויד במסנן ומוסיפים 6 מ"ל של ddH2O.
      הערה: ג'ל הצ'יטוזן יתנפח באופן משמעותי במדיום המיימי, ולכן צפוי שינוי גדול בנפח הג'ל.
    4. חברו את המזרק באמצעות מחבר Luer-lock למזרק נקי נוסף של 10 מ"ל.
    5. כפה את תערובת הג'ל + המים דרך המזרק עם המסנן כדי ליצור מיקרוג'לים בקוטר מקסימלי מוגדר.
      1. לאחר הסינון הראשון, פתחו את גב המזרק המכיל את המסנן והחזירו את התערובת למזרק זה.
      2. החלף את החלק האחורי של המזרק ואלץ את התערובת לעבור שוב את המסנן.
      3. חזור על הסינון 5-6x או עד שתהיה התנגדות מועטה דרך המסנן.
  8. יש לשטוף ולטהר את המיקרוג'לים המסוננים.
    1. מעבירים את תערובת הג'ל המסוננת לצינור חרוטי של 50 מ"ל, מביאים את הנפח הכולל עד 20 מ"ל עם ddH2O, ואז מערבלים את התערובת כדי להבטיח פיזור הומוגני.
    2. צנטריפוגה המיקרוגלים ב 100 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ודקדק את הפאזה מימית העליונה.
    3. בצעו שימוש חוזר במיקרוגלים ב-10 מ"ל של 70% אתנול, מערבולת, והניחו תחת אור UV למשך שעה אחת כדי לעקר אותם.
    4. צנטריפוגות המיקרוג'לים ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, משליכים את האתנול ושוטפים 3x עם ddH2O.

3. הכנת מיקרוג'לים ליישומי in vitro או in vivo

הערה: עבור המחקר הנוכחי, התחדשות הסחוס בפציעות לוחות גדילה נחקרה במודל של חולדה. לפרטים ראו הפניה31.

  1. Resuspend כדורי microgel 1:1 ב ddH2O. Microgels ניתן לאחסן עד 1 חודש מושהה ב ddH2O ב 4 °C (76 °F). אם נעשה שימוש בחומר ביו-אקטיבי, יש להשתמש במיקרוגלים באופן מיידי.
  2. צור את אתר הפציעה בבעל החיים בעקבות דו"ח30 שפורסם בעבר.
  3. שטפו את אתר הפציעה במי מלח ושמרו על בעל החיים ללא טיפול (לצורך מחקר בקרה) או הזריקו את המיקרוגלים של הצ'יטוזן בלבד או את המיקרוג'לים הטעונים בחומרים הביו-אקטיביים (שלב 3.2.).
  4. סגור את הפצע בבעל החיים ותן משככי כאבים לאחר הניתוח30.
  5. בימים 7 או 28 לאחר הניתוח, להרדים את החולדה על ידי מנת יתר של CO2 , לבלות את הגפיים ולבצע היסטולוגיה כדי להעריך את תיקון הרקמה באתר הפציעה31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ייצור מוצלח של מיקרוגלים צ'יטוזן מסתמך על תגובת ההצלבה בין גניפין לצ'יטוזן, במיוחד המערבת את האמינים בשרשראות הפולימרים של הצ'יטוזן. בניגוד לטכניקות אחרות לייצור מיקרוג'ל, שיטה זו אינה דורשת תחליבים או שטיפות ממסים וניתן לבצע אותה במהירות ובקלות עם ציוד זול. סימן היכר לייצור מוצלח של מיקרוג'ל הוא שינוי הצבע המובהק מאוף-ווייט לכחול כהה לאחר שהכיטוזן והגניפין התערבבו. התגובה ההצלבה בין גניפין לתרכובות המכילות אמין, כגון צ'יטוזן או חלבונים אחרים, אופיינה היטב בספרות34. בקיצור, מנגנון ההצלבה נחשב להתקפה נוקלאופילית על ידי קבוצות האמינו של צ'יטוזן, שבה גניפין פועל כדיאלדהיד עם תוצרי עיבוי יציבים35. השרשראות הקצרות של גניפין יציב ומעובה משמשות כגשרים חוצי גבולות בין הפולימרים הצ'יטוזן. תגובת הקישור ההצלבה גורמת לתמיסה להפוך לכחולה כהה, ככל הנראה עקב פילמור המושרה על ידי רדיקל חמצן ודהידרוגנציה של תרכובות ביניים, אשר עוקבת אחר תגובת פתיחת הטבעת מהתקפה נוקלאופילית36.

לאחר שהמיקרו-ג'לים סוננו ועברו החייאה בדילול מים ביחס של 1:1, ניתן להשתמש בהם בקלות ביישומים ביו-חומריים שונים. לאחרונה פורסמה עבודה תוך שימוש במיקרוגלים אלה של צ'יטוזן ללא תחליב כדי לקדם התחדשות סחוס בפציעות של לוחות גדילה. המיקרוג'לים יוצרו כמתואר כאן והוחזקו ריקים או טעונים ב-SDF-1a ו-TGF-b3, שהם חומרים ביו-אקטיביים הרלוונטיים להתחדשות רקמות צלחת הגדילה, כאשר SDF-1a מקדם נדידה של תאי גזע מזנכימליים לאתר הפגם ו-TGF-b3 משמש כגורם כונדרוגני לגרימת התמיינות של תאי גזע אלה במורד השושלת הכונדרוגנית37, 38. קצב השחרור של החלבונים כומת במבחנה באמצעות ELISA, ושחרור המולקולות הללו נשמר לאורך זמן31. לאחר מכן, המיקרוג'לים הוזרקו לתוך פגיעה בלוחית גדילה במודל של חולדה in vivo , והמיקרוג'לים שהוזרקו מנעו היווצרות מוטות גרמיים מוקדמים ב-vivo31. מיקרו-ג'לים צ'יטוזיים אלה הניתנים להזרקה, חסכוניים ופשוטים לייצור, יכולים בקלות לשמש ביישומים ביו-חומריים רבים.

למרות שתהליך זה לייצור מיקרו-ג'ל הותאם להגדרה ויישומים פשוטים, עדיין עלולות להתעורר מספר בעיות שהחוקרים צריכים להיות מודעים אליהן. ערבוב לא מספיק של רכיבי הפולימר וההצלבה הוא הגורם הסביר ביותר לתוצאות שונות במהלך הייצור. יש לערבב את הצ'יטוזן המוצק במרץ בין המזרקים, ותמיסת הצ'יטוזן המתקבלת חייבת להיות הומוגנית לחלוטין לפני שמוסיפים את קרוסלינקר הגניפין. אם התמיסה אינה הומוגנית, גושי הצ'יטוזן המוצקים שנותרו בתמיסה ייצרו גושים, ויתרחשו הצלבות לא אחידות, מה שימנע סינון יעיל וכתוצאה מכך מיקרוג'לים מפוזרים באופן רב-צדדי בקטרים משתנים באופן משמעותי. גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון במהלך הייצור הוא הימנעות מהתאדות במהלך תקופת ההצלבה, אשר יש למנוע באמצעות סרט פרפין או טכניקות אחרות של לכידת אידוי. אם ההידרוג'ל הצ'יטוזן מתייבש, הוא לא יתנפח במהלך שטיפת המים, והוא לא יסתנן דרך המזרק. לבסוף, יש להשעות את המיקרוג'לים בעודפי מים במהלך תהליך הסינון ולאחסן אותם במים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר אינם בשימוש. המיקרוגלים אינם ניתנים להסרה או להזרקה אלא אם כן הם תלויים בדילול מים של 1:1 לפחות.

איור 1 מציג סקירה רחבה של תהליך ייצור המיקרוג'ל. אותו תהליך מתואר שוב באיור 2, המציג צילומים של התהליך, תוך הדגשת שלבי הפרוטוקול שקשה להבין אותם מהטקסט בלבד. לדוגמה, איור 2D מראה כיצד מסנן רשת תיל מוכנס למזרק של 10 מ"ל. לאחר הישיבה המלאה על החלק העליון של המזרק, מסנן רשת חוט זה מאפשר סינון מהיר ונוח של המיקרוגלים chitosan ללא ציוד מומחה או ממסים. באופן דומה, איור 2E מראה את הזרימה של ג'ל צ'יטוזן מיובש דרך מסנן הרשת, שהוא הבסיס לייצור מיקרוג'ל. איור 3 הותאם מהפרסום הקודם שלנו על המיקרוג'לים האלה ומראה את התנהגות הנפיחות תלוית ה-pH שלהם ואת ההבדלים בגודל המיקרוגלים התלויים בגודל הנקבוביות של מסנן הרשת. ניתן להזמין גדלי רשת שונים מהיצרן, מה שמאפשר שליטה נוחה על גודל המיקרוג'לים. שליטה מדויקת זו על גודל המיקרוג'ל חשובה ביותר בעת תכנון מערכות אספקת תרופות עם שיעורי שחרור עומס טיפוליים מוגדרים היטב. עבודות קודמות על microgels גם הראו כי הם מתדרדרים באופן משמעותי בנוכחות lysozyme ב 2-4 שבועות31. לבסוף, איור 4 מציג תמונות היסטולוגיותמס' 31 במודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה שטופל במיקרוגלים של צ'יטוזן הטעונים ב-SDF-1a וב-TGF-b3.

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטית של ייצור מיקרו-ג'ל צ'יטוזן. הדמות נוצרה באמצעות biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: צילומים של תהליך ייצור המיקרוג'ל. (A) תמיסת צ'יטוזן במזרקים המחוברים באמצעות מנעול לואר. (B) שחול של ג'ל צ'יטוזן לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ. (C) שליפה של ג'ל צ'יטוזן לאחר הצלבת צבע משתנה מאוף-ווייט לכחול כהה. (D) מבט מלמעלה למטה בתוך המזרק המציג את מסננת רשת התיל המותקנת כנגד הזרבובית של המזרק. (E) ג'ל צ'יטוזן נלחץ דרך מסנן רשת כדי לייצר מיקרוג'לים. (F) מיקרוג'לים אוחסנו בדילול של 1:1 של ddH2O בצינור חרוטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: התנהגות נפיחות תלוית pH של המיקרוגלים. (A) גרף התפלגות תקין של קוטר ה-Feret המציג את התנהגות הנפיחות של המיקרוגלים בתגובה לשינויי pH. (B) תמונות פלואורסצנטיות של מיקרו-ג'לים שיוצרו באמצעות רשת מס' 200 (תמונה עליונה: <75 מיקרומטר מיקרו-ג'לים בגודל מיקרו-ג'ל) ורשת מס' 100 (תמונה תחתונה: מיקרו-ג'לים בגודל 75-150 מיקרומטר). האיור נדפס מחדש באישור הפניה31. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תמונות היסטולוגיות במודל פגיעה בלוחית גדילה של חולדה שטופלו במיקרוגלים הצ'יטוזן הטעונים ב-SDF-1a וב-TGF-b3. 10x תמונות היסטולוגיות מראות רקמת תיקון צלחת גדילה של שלמה (A) ו-(E), לא מטופלת (B) ו-(F), מיקרוג'ל מטופל (C) ו-(G), מיקרוג'ל + SDF-1a מטופלים (D) ו-(H), ומיקרוג'ל + TGF-b3 מטופלים (I ) גפיים. לא טופלו יום 7 בעלי חיים במיקרוגל + TGFb3. המטוקסילין כחול אלקיאני (ABH) מכתים את העצם בכתום עד אדום, את הרקמה הסיבית בוורוד ואת הסחוס בכחול. המיקרוג'ל מופיע כרקמה דמוית סיבי אדום כהה. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. האיור נדפס מחדש באישור הפניה31. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקרוג'לים נחקרו באופן נרחב בשנים האחרונות בשל רמת הישימות הגבוהה שלהם למטרות שונות, כגון אספקת תרופות או אנקפסולציה של תאים9. קלות הייצור של מבנים ביו-חומריים בקנה מידה זעיר היא בעלת רלוונטיות משמעותית בהנדסת רקמות, מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים לפתח אסטרטגיות מבוססות הידרוג'ל בגודל ובקנה מידה מסוים של זמן. עם זאת, רוב השיטות לייצור מיקרוג'לים צ'יטוזן דורשות ציוד וריאגנטים יקרים, תחליבים או שטיפות ממסים ציטוטוקסיים, מה שמונע את תרגומם לשימוש קליני 15,16,17,18,19,20. מיקרוג'לים אלה מצטיינים מבחינת הנוחות המשמעותית שלהם בייצור, ואינם דורשים טכניקות תחליב או שטיפות ממסים. בנוסף, מיקרוג'לים אלה שומרים על התכונות האידיאליות עבור מבנה מהונדס ברקמות, כגון נפיחות תלוית pH והעמסת תרופות, התנהגות השפלה מכוונת ושחרור מתמשך של טיפולים.

השלב הקריטי ביותר בייצור המיקרוגלים הצ'יטוזיים הללו הוא סינון בין מזרקים. מיקרוג'לים אלה מתחילים כהידרוג'ל בתפזורת ומסוננים לטווח גודל מסוים באמצעות מסנני רשת תיל. ללא סינון, הישימות של המיקרוג'לים, התכונות המכניות ומאפייני שחרור התרופות יהיו שונים באופן משמעותי. שלב הסינון מאפשר שליטה מדויקת על גודל ההידרוג'לים, והוא גם מאפשר ייצור בתפוקה גבוהה של מיקרוג'לים המציגים נפיחות תלוית pH ושחרור מתמשך של טיפולים.

מגבלה של תהליך זה היא כי שלב הסינון לא הוביל הידרוג'לים עם צורה כדורית לחלוטין, אשר עשוי להיות גורם חשוב לשקול עבור יישומים מסוימים. מסיבה זו, הגודל האופייני של המיקרוג'לים תואר באמצעות קוטר פרה (איור 3), שהוא שימושי לכימות חלקיקים בעלי צורה לא סדירה39. למרות שהגאומטריה של המיקרוגלים לא הייתה כדור מושלם, הגודל הממוצע של החלקיקים היה קל לשליטה בהתבסס על גודל הרשת של מסנן המזרקים, ועבור יישומים רבים, אין צורך בחלקיקים כדוריים מושלמים. מדד הפולידיספרסיות של המיקרוגלים (PDI) כומת באמצעות היחס הריבועי של סטיית התקן של קוטר פרה לקוטר ה-Feret הממוצע המתקבל מאוכלוסייה גדולה של חלקיקים (n = 74). ה-PDI חושב כ-0.076 באמצעות המשוואה

PDI = (s/D)2

כאשר s היא סטיית התקן של קוטר ה-Feret הממוצע ו-D הוא קוטר ה-Feret הממוצע40. בשל הסינון שנעשה בתהליך זה והשימוש בקוטר Feret עבור חלקיקים בעלי צורה לא סדירה, מדד הפולידיספרסיות של חלקיקים אלה היה נמוך למדי, עד כדי כך שהם יכלו להיחשב מונודיספרס.

עבור מחקר עתידי, ניתן לבצע מספר שינויים בפרוטוקול זה כדי להתאים טוב יותר לצורך המחקרי הנתון. לדוגמה, רק שני חלבונים, SDF1-a ו-TGF-b3, נחקרו עבור שחרורם המבוקר עם מיקרו-ג'לים אלה. עבודות קודמות הראו שחרור מתמשך של גורמים ביו-אקטיביים אלה עד כ-30 יום במבחנה. עם זאת, ניתן לחקור גם טיפולים רלוונטיים אחרים, כגון ננו-חלקיקים, מולקולות מפריעות של RNA (RNAi), תרופות ביולוגיות אחרות או תרופות בעלות מולקולות קטנות כדי לכמת את קצב השחרור והיעילות שלהם כאשר הם מיושמים בטכנולוגיית מיקרו-ג'ל צ'יטוזן זו. משתנה נוסף שניתן יהיה לחקור בעתיד הוא שינוי טווח הגודל של המיקרוגלים, שנעשה פשוט על ידי שינוי גודל הרשת של מסנן המזרק. זה יכול להיות גם בעל השפעה משמעותית על קצב השחרור של טיפולים מהמיקרוגלים, מה שמאפשר שליטה נוחה על קינטיקה של שחרור מבלי לשנות את הכימיה של crosslinking. בנוסף, ניתן להרחיב פרוטוקול זה בקלות באמצעות מזרקים ומסננים גדולים יותר או טכניקות סינון ואקום כדי לייצר כמויות גדולות של מיקרו-ג'לים צ'יטוזן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שלד-שריר ועור של המכון הלאומי לבריאות תחת מספרי הפרס R03AR068087 ו- R21AR071585 ועל ידי קרן Boettcher (#11219) ל- MDK. CBE נתמך על ידי NIH / NCATS קולורדו CTSA מענק מספר TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
  2. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
  3. Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
  4. Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
  5. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
  6. Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
  7. Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
  8. Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
  9. Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
  10. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  11. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
  12. Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
  13. Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
  14. Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
  15. Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
  16. Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
  17. Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
  18. Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
  19. Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
  20. Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
  21. Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
  22. Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
  23. Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
  24. Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
  25. Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
  26. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
  27. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
  28. Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
  29. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
  30. Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
  31. Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
  32. Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
  33. Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
  34. Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
  35. Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
  36. Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
  37. Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
  38. Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
  39. Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
  40. Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 182
ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stager, M. A., Erickson, C. B.,… More

Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter