Summary
På grund af jordens uigennemsigtighed kan interaktioner mellem dets bestanddele ikke let visualiseres med cellulær opløsning. Her præsenteres to mikrofluidiske værktøjer, som giver nye muligheder for at undersøge svampe-mikrobielle interaktioner. Enhederne er alsidige og enkle at bruge, hvilket muliggør høj spatiotemporal kontrol og billeddannelse i høj opløsning på mobilniveau.
Abstract
Filamentøse svampe er vellykkede indbyggere i jorden og spiller en vigtig rolle i jordens økosystemer, såsom i nedbrydning af organisk og uorganisk materiale samt regulering af næringsstofniveauer. Der finder de også mange muligheder for at interagere med en række andre mikrober såsom bakterier eller andre svampe. At studere svampeinteraktioner på celleniveau kan dog være udfordrende på grund af jordens sorte bokslignende natur. Nye mikrofluidiske værktøjer udvikles til undersøgelse af svampeinteraktioner; to platforme designet til at studere interaktioner mellem bakterie-svampe og svampe-svampe fremhæves. Inden for disse mikrokanaler kan svampe-mikrobielle interaktioner overvåges i kontrollerede fysisk-kemiske miljøer ved højere tidsmæssig og rumlig opløsning end tidligere muligt. Anvendelsen af disse værktøjer har givet adskillige nye biologiske indsigter, såsom observation af bakteriel polær tilknytning til hyfer eller afsløring af ukarakteriserede svampe-svampemodsætninger. Et centralt træk ved disse metoder vedrører brugervenligheden af dette værktøj af ikke-eksperter, hvilket giver meget omsættelige teknologier til brug i mikrobiologiske laboratorier.
Introduction
Jordbunden er et usædvanligt forskelligartet miljø, der indeholder en overflod af mikroorganismer, der er medvirkende til kulstof- og fosforcyklusser 1,2. Filamentøse svampe er en vigtig bestanddel af talrige økosystemer som nedbrydere af organisk og uorganisk materiale og kan forbedre plantens ernæring gennem dannelse af symbiotiske forhold 3,4. Inden for jord interagerer svampe dynamisk med en lang række mikrober såsom andre svampe5, bakterier6, vira7 og nematoder8. Disse interaktioner har betydelige konsekvenser for jord- og plantesundheden. Men på grund af mangel på passende eksperimentelle systemer, der er i stand til at billeddanne interagerende mikroorganismer med høj opløsning, forbliver mange udefinerede.
Undersøgelser vedrørende bakterie-svampeinteraktioner (BFI'er) og svampe-svampeinteraktioner (FFI'er) har værdifulde anvendelser på en række områder, herunder antimikrobielle stoffer i medicin og biologiske bekæmpelsesmidler i landbruget. For eksempel producerer svampen Coprinopsis cinerea peptidet copsin, som har vist sig at udvise antibakteriel aktivitet mod det humane patogen Listeria monocytogenes9. Tilsvarende anvendes den svampeafledte forbindelse, griseofulvin, i vid udstrækning som behandling for humane svampeinfektioner og er desuden i stand til at hæmme væksten af den plantepatogene svamp Alternaria solani10,11. Flere stammer af den jordboende bakterie Bacillus subtilis har også vist sig at være effektive biokontrolmidler af svampeplantepatogenet Rhizoctonia solani12,13. På grund af begrænsninger forbundet med traditionelle metoder forstås BFI'er og FFI'er ikke desto mindre dårligt på niveau med enkeltceller.
Konventionelle undersøgelser undersøger typisk BFI'er og FFI'er på makroskalaen ved hjælp af agarplader med to eller flere arter i konfrontation. Deres interaktion vurderes ved at måle vækstrater og metabolitproduktion af de konfronterende arter 14,15,16; denne metode er dog kun løst til koloniniveau. For at studere interaktioner på celleniveau kan bakterie- og svampeinokulanter dyrkes på glasmikroskopglas belagt med agar, der derefter afbildes under et mikroskop17. Ikke desto mindre kan det være svært at følge en enkelt hypha ved hjælp af mikroskop dias på grund af manglende indeslutning, hvilket betyder, at time-lapse-billeder er sværere at få. Endvidere er muligheden for rumligt at begrænse andre mikroorganismer inden for definerede områder af svampemyceliet eller skabe definerede kemiske miljøer, der for eksempel kan forstyrres, ikke mulig i sådanne opsætninger. Jordens "sorte boks" natur øger også kompleksiteten ved at studere svampe-mikrobielle interaktioner på niveau med enkeltceller18. Ved at observere interagerende arter væk fra den utrolige mangfoldighed af jordmikrobiomet kan den nøjagtige måde, hvorpå individuelle medlemmer interagerer, vurderes. Der er således et fortsat behov for alsidige platforme, der muliggør høj opløsning, enkeltcellebilleddannelse af BFI'er og FFI'er.
Mikrofluidiske teknologier, såkaldte lab-on-a-chip-systemer, giver en ideel platform til undersøgelse af BFI'er og FFI'er på niveau med enkeltceller. Mikrofluidikområdet, der stammer fra teknologier udviklet til kemisk analyse og mikroelektronik, er blevet vedtaget af de biologiske videnskaber19. Mikrofluidiske teknologier regulerer små mængder væsker inden for et skræddersyet netværk af miniaturiserede kanaler, der har mindst en dimension på mikrometerskalaen, og deres anvendelse i biologisk forskning udvides20. Især er mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at undersøge væksten af filamentøse svampe 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fordel ved at bruge denne teknologi er, at indeslutning af hyfer og fordelingen af næringsstoffer inden for mikrokanaler mere ligner jordmiljøets struktur end konventionelle agarmetoder31. For nylig er mikrofluidiske platforme blevet brugt til at undersøge interaktioner mellem humane neutrofiler og svampepatogener32, bakterier og planterødder33 samt svampe og nematoder34,35.
En af de mange fordele ved at bruge mikrofluidik til undersøgelse af mikrobielle interaktioner inkluderer den specifikke kontrol af mikrokanalmiljøet. For eksempel kan laminære flowregimer udnyttes til at generere definerede koncentrationsgradienter, hvilket er særligt nyttigt ved undersøgelse af bakteriel kemotaxis36. En anden fordel er, at den gennemsigtige karakter af poly (dimethylsiloxan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomer polymer, der almindeligvis anvendes til fremstilling af mikrofluidiske enheder, letter billeddannelse i høj opløsning af enkeltceller ved hjælp af brightfield og fluorescensmikroskopi37. Ligeledes betyder indeslutning af mikrober inden for mikrokanaler, at time-lapse-eksperimenter, der sporer enkeltceller, kan udføres, hvilket gør det muligt at registrere og kvantificere individuelle cellulære reaktioner37. Da mikrofluidiske anordninger kan designes til at være brugervenlige, kan de endelig let anvendes af ikke-eksperter38.
Det er vigtigt at fremme viden om samspillet mellem jordboende mikroorganismer for at forbedre bæredygtig økosystemforvaltningspraksis, der opretholder biodiversiteten og afbøder klimaændringernes indvirkning på terrestriske miljøer39. Udviklingen af nye mikrofluidiske værktøjer er således grundlæggende for at udvide forståelsen af svampe og deres interaktioner på celleniveau. Protokollen her vil fokusere på to mikrofluidiske enheder produceret til undersøgelse af BVI40 og FFI'er41 som repræsenteret i figur 1.
Figur 1: Visuel og skematisk repræsentation af bakterie-svampeinteraktion (BFI) og svampe-svampeinteraktion (FFI) enheder. (A) Billede af BFI-enheden. Et mycelstik placeres ved indgangen til den ene ende af mikrokanalerne for at tillade hyphal vækst i enheden. Bakterieindløbet er i den modsatte ende. Skalabjælke = 5 mm. (B) Skematisk oversigt over BFI-enheden, der viser placeringen af bakterieindløbene og retningen af bindestregsvækst gennem interaktionsmikrokanalerne. Kanalerne er 10 μm i dybden, 100 μm brede og 7 mm lange med i alt 28 observationskanaler. (C) Konfrontationsassay på agarplade mellem Coprinopsis cinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610, skalastang = 20 mm (venstre). Mikroskopibilleder, der viser interaktionen mellem C. cinerea og B. subtilis NCIB 3610 inden for mikrokanalen (midten og højre), dvs. polær vedhæftning af bakterier til svampehyfer. Skalabjælke = 25 μm (midten) og 10 μm (højre). (D) Billede af FFI-enheden bundet til en petriskål med glasbund, dobbelt podet med mycelpropper. Skalabjælke = 1 cm. (E) Skematisk oversigt over FFI-enheden. To svampeinokulantpropper indføres i indløbene i hver ende af enheden, hvilket tillader hyphal udforskning af mikrokanalerne. Kontrolkanaler er kun forbundet med et svampeindløb og har en blindgydekanal, hvilket forhindrer interaktioner mellem testsvampene. Interaktionskanaler forbinder begge svampeindløb og tillader bindestregsinteraktioner mellem forsøgspersonerne inden for mikrokanalen. Hver interaktionskanal består af 18 diamantformede sektioner, der måler en samlet længde på 8,8 mm (490 x 430 μm pr. Diamant), 10 μm dyb og har et forbindelsesområde mellem hver diamant på 20 μm. Kanaltyper duplikeres, skalabjælker = 1 mm. (F) Interaktionszone mellem to nærliggende bindestregfronter, der vokser fra modsatte ender af den sammenkoblede interaktionskanal. Fasekontrastmikroskopibillede, skalabjælke = 250 μm. Panelerne i denne figur er blevet ændret fra Stanley et al., 2014 (A-C)40 og Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Et resumé af de procedurer, der er skitseret i denne protokol, er visuelt afbildet i figur 2.
Figur 2: Skematisk repræsentation af den præsenterede metode bestående af fem hovedafsnit, der er beskrevet i denne protokol. Enhedsdesign oprettes ved hjælp af CAD-software (Computer Aided Design) og en masterform fremstillet ved hjælp af fotolitografi (1). Dette bruges til at støbe poly (dimethylsiloxan) (PDMS), som derefter terninger i plader og limes til glasbundede petriskåle for at danne de mikrofluidiske anordninger (2). Mikrober, der skal indgå i undersøgelsen, dyrkes (3) og bruges til at pode enhederne (4). Interaktioner studeres ved hjælp af mikroskopi og kvantificeres ved hjælp af billedanalyseteknikker (5). Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Master form fabrikation
- Fotomaske produktion
- Generer mikrofluidiske enhedsdesign ved hjælp af CAD-software (Computer Aided Design). Dimensionerne på de præsenterede enheder er angivet i figur 1, og flere detaljer om de specifikke designfunktioner er udførligt anført i de respektive publikationer40,41.
- Eksporter CAD-designfilen ved hjælp af et passende format (f.eks. .dwg, .dxf). Udskriv en filmfotolitografimaske ved at sende den eksporterede CAD-designfil til en kommerciel udbyder til udskrivning.
- Fotolitografi
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i et støvfrit og lysstyret miljø, såsom en laminær flowhætte eller renrumsfacilitet. De eksperimentelle betingelser, der er angivet her, er vejledende og bør optimeres internt. Forfatterne anbefaler at søge specifik træning og konsultere etablerede protokoller42.- Forbered en 100 mm siliciumskive ved bagning i en ovn ved 200 ° C i 2 timer. Spin-coat siliciumskiven med SU-8 2010 fotoresist, der sigter mod en måltykkelse på 10 μm, ved hjælp af følgende betingelser: 500 rpm for 10 s (acceleration 100 rpm/s) og 3.000 rpm for 45 s (acceleration 300 rpm/s).
FORSIGTIG: SU-8 fotoresist er farlig, pas på ved håndtering og forhindre indånding og kontakt med huden. Det er brandfarligt, potentielt kræftfremkaldende og giftigt for miljøet. - Bag den overtrukne siliciumskive ved 95 °C i 2,5 min (blød bagning). Udsæt fotoresisten for ultraviolet (UV) lys ved hjælp af filmfotolitografimasken og en energidosis på 140 mJ /cm2 ved 365 nm bølgelængde ved hjælp af en maskejustering.
- Bag den overtrukne siliciumskive ved 95 °C i 3,5 min. (bages efter eksponering). Nedsænk og omrør siliciumskiven i udvikleropløsningen i 3 minutter for at afsløre de mikrofabrikerede strukturer ved at fjerne den ueksponerede fotoresist.
FORSIGTIG: Udviklerløsningen kan være brandfarlig, tage passende forholdsregler ved håndtering og opbevaring. - Skyl med frisk udvikleropløsning i 10 s. Skyl med isopropylalkohol i 10 s og lufttør. Brug filtreret trykluft for at sikre, at strukturerne er grundigt tørre. Mål højden af SU-8 strukturerne, for eksempel ved hjælp af et profilometer.
- Silanisere hver masterform med 50 μL chlorotrimethylsilan ved at påføre et vakuumtryk på 50 mbar i 2 timer. Forfatterne bemærker, at re-silanisering af masterformen ikke blev fundet nødvendig.
FORSIGTIG: Chlorotrimethylsilan er et farligt stof. Brug passende personlige værnemidler (PPE) og håndter med omhu. Undgå kontakt med hud og øjne og forhindre indånding. Holdes væk fra antændelseskilder og brug i et godt ventileret område.
- Forbered en 100 mm siliciumskive ved bagning i en ovn ved 200 ° C i 2 timer. Spin-coat siliciumskiven med SU-8 2010 fotoresist, der sigter mod en måltykkelse på 10 μm, ved hjælp af følgende betingelser: 500 rpm for 10 s (acceleration 100 rpm/s) og 3.000 rpm for 45 s (acceleration 300 rpm/s).
2. Fabrikation af enheder
BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i et støvfrit miljø, såsom en laminær flowhætte.
- Fremstilling af poly(dimethylsiloxan) (PDMS) plader
- Forbered ca. 40 g PDMS ved grundigt at blande basen og hærdningsmidlet i forholdet 10: 1 ved hjælp af en spatel i en ren plastikkop. Afgas blandingen for at fjerne alle luftbobler ved at placere plastikkoppen indeholdende PDMS i et vakuumkammer (vakuumtryk = 50 mbar) i 1 time.
- Fastgør masterformen til et plastbeslag ved hjælp af klar tape. Rengør med komprimeret filtreret luft for at fjerne støvpartikler.
BEMÆRK: Alternativt kan aluminiumsfolie formes omkring en glasstelet og derefter bruges til at huse masterformen og indeholde PDMS43. - Hæld PDMS-blandingen på midten af masterformen, så den er på en plan overflade, og lad den sætte sig.
BEMÆRK: PDMS-blandingen skal hældes så tæt som muligt på overfladen af masterformen, og en kontinuerlig strøm opretholdes for at minimere indførelsen af luftbobler. Luftbobler kan fjernes ved at lede trykluft over boblen eller ved at øse dem ud med en fin nål. - Dæk masterformen løst med et plastiklåg for at forhindre støvpartikler i at sætte sig på overfladen af PDMS. Overfør masterformen til en ovn og hærd natten over ved 70 °C.
- Fjern hovedformen fra ovnen og lad den køle af. Skræl den hærdede PDMS væk fra masterformen og plastrammen, og pas på at undgå at beskadige masterformen / PDMS.
- Placer klar tape over mikrokanalerne præget i PDMS for at opretholde en støvfri overflade. Sørg for, at båndet fjernes inden limning.
- Skær PDMS i plader (dvs. hvis flere enheder er inkluderet i designet på masterformen, kan mange fremstilles fra en enkelt støbning) som angivet af designet ved hjælp af en monteret guillotine eller barberblad. Når du skærer den laterale åbning af BFI PDMS-pladen, skal du sikre dig, at mikrokanalerne er helt åbne (figur 1A). For FFI PDMS-pladen skal du sørge for, at hvert hjørne er trimmet, så det passer ind i den glasbundede petriskål, der er vist i figur 1D.
- Stans ønskede indløbs-/udløbshuller i henhold til enhedens design. Brug en præcisionsskærer til at stanse indløbshuller på henholdsvis 3,18 mm og 4,75 mm til de eksemplariske BFI- og FFI-enheder.
- Limning af PDMS-plader for at oprette enheder
BEMÆRK: Følgende vasketrin (2.2.1-2.2.2) brug en ultralydsrenser fyldt med renset vand (ddH2O) ved 37 kHz. Vask af PDMS-pladerne hjælper med at forbedre vellykket binding44 og reducere risikoen for forurening. For at manipulere PDMS-pladerne skal du bruge rene tang og løfte ved hjælp af indløbshullerne for at undgå beskadigelse af mikrokanalerne eller enhedens overflade.- Nedsænk PDMS-pladerne i 0,5 M NaOH og sonikere i 5 minutter. Skyl med steril ddH2O. Overfør PDMS-plader til 70% ethanolopløsning og sonikat i 5 min. Skyl med steril ddH20.
- Nedsænk PDMS-plader i sterile ddH2O og sonikere i 5 minutter. Fjern PDMS-pladerne fra den sterile ddH2O, tør med filtreret trykluft, og læg dem i en steril firkantet petriskål.
- Det firkantede petriskål med PDMS-pladerne anbringes i en ovn ved 70 °C i 1 time for at tørre. Fjern fra ovnen og lad afkøle i et støvfrit miljø. Fjern eventuelt støv fra overfladen af PDMS-pladerne ved hjælp af tape og/eller filtreret trykluft.
- Aktiver overfladerne på PDMS-pladerne og petriskålene med glasbund, der skal limes ved hjælp af en plasmarenser med følgende indstillinger: vakuumtryk 0,75 mbar, effekt 50%, belægningstid 1 min. Placer overfladerne, der skal aktiveres (og derefter bindes) opad i plasmarenseren.
- Fjern PDMS-pladerne og petriskålene med glasbund fra plasmarenseren, og bind dem ved forsigtigt at placere de aktiverede overflader i konform kontakt med hinanden. Lim BFI- og FFI PDMS-pladerne til henholdsvis 35 mm og 50 mm diameter glasbundede petriskåle (glastykkelse 0,17 mm).
BEMÆRK: Pas på ikke at lægge for meget pres ved limning, da dette kan resultere i sammenbrud af mikrokanalerne. - Kontroller for vellykket binding ved blot at prøve at trække PDMS-pladen af den glasbundede petriskål med pincet. Visualiser enhederne med øjet eller ved hjælp af generisk mikroskopi for at sikre, at podningsindtagene eller mikrokanalerne ikke kollapser.
BEMÆRK: For mættede forhold (dvs. vandmættede og/eller næringsrige forhold) indbefattes trin 2.2.7 i protokollen. Hvis der kræves vandumættede forhold, fortsættes til trin 2.2.8. Enheder kan fyldes med vand eller medier. - Fyld enhederne umiddelbart efter binding ved at pipettere 100 μL af den ønskede opløsning til BFI-enheden (bakteriel indgang og lateral åbning) eller 30 μL medier i hvert indløb (60 μL i alt) for FFI-enheden. Hvis der er luftbobler til stede, vil disse forsvinde omkring 10 minutter efter påfyldning, da PDMS er porøs.
- Tilsæt steril ddH2O (~ 100-200 μL) i petriskålen for at opretholde fugtigheden.
3. Mikrobiel kultur
BEMÆRK: Følgende trin giver en generel mikrobiologisk procedure for svampe- og bakteriekultur og skal udføres under sterile forhold (dvs. ved hjælp af en flamme eller et mikrobiologisk sikkerhedsskab), der passer til det indeslutningsniveau, der kræves for de ønskede mikrober. Specifikke eksempler er angivet i slutningen af hvert afsnit for en art af interesse.
- Svampekultur
- Forbered ønsket kulturmedium suppleret med agar. Autoklave mediet ved 121 °C i 15 min. Mediet afkøles til 50 °C, og hældes i petriskåle med en diameter på 9 cm, idet der opretholdes sterile forhold.
- Brug en korkborer til at fjerne en 4 mm diameter prop af agar indeholdende mycelium fra en køleskabskoloni af den ønskede svampestamme for at aktivere isolatet. Dette udføres for at sikre standardiseret og kraftig vækst af svampen inden enhedens podning.
BEMÆRK: Mikroberne kan også aktiveres fra en glycerolbestand, dvs. svampeisolater opbevaret på agarpropper i 50% glycerolopløsning ved -70 ° C41. - Placer siden af stikket med mycelium i kontakt med agaroverfladen i midten af den ikke-inokulerede petriskål. Udskift låget oven på petriskålen og forsegl, inden du inkuberer ved den passende temperatur for den ønskede belastning i den krævede tid, typisk omkring 3 til 4 dage.
BEMÆRK: Eksempel på dyrkningsbetingelser for Trichoderma rossicum: Maltekstraktagar, inkuberet ved 25 °C i mørke i 48 timer.
- Bakteriekultur
- Stræk det ønskede bakterieisolat ud af kildestammen (f.eks. glycerolbestand eller enkeltkoloni fra agarpladen) på en agarplade for at opnå enkelte bakteriekolonier og sikre ingen forurening45. Forsegl pladen med film.
- Inkuberes ved en temperatur og varighed, der er specifik for isolatet af interesse, indtil de enkelte kolonier observeres.
- Forbered den ønskede kultur bouillon. For eksempel tilsættes 10 g trypton, 10 g NaCl og 5 g gærekstrakt pr. 1 liter ddH2O for at forberede LB-medium til dyrkning af B. subtilis. Autoklave mediet ved 121 °C i 15 min.
- Lad mediet afkøle til stuetemperatur. Tilsæt mediet til en steril kulturkolbe inde i et sterilt miljø.
- Rør ved en enkelt bakteriekoloni fra agarpladen ved hjælp af en steril podningssløjfe. Overfør den podede sløjfe til det sterile kulturmedium ved kort at røre væsken med løkken.
- Kolben forsegles med et sterilt låg eller folie, og anbringes i en rysteinkubator natten over ved hjælp af de indstillinger, der passer til den valgte art.
BEMÆRK: Eksempelkulturbetingelser for B. subtilis: i) væskekultur - aerob vækst ved 37 °C ved 200 o / min i LB-medium og ii) pladekultur - stuetemperatur på LB-agarplade. Se FFI/BFI-papirerne 40,41 for yderligere detaljer om dyrkning af forskellige svampestammer.
4. Podning af enheden
BEMÆRK: Følgende trin skal finde sted inde i en laminær flowhætte ved hjælp af sterilt udstyr.
- Svampe podning
- Brug en steriliseret korkborer (ø = 4 mm) til at fjerne et agarstik fra kolonien i periferien af en 3 dage gammel kultur (trin 3.1). Sørg for, at den voksende bindestregsfront forbliver intakt.
- Indfør stikket i svampeindløbet, myceliumsiden nedad, med vækstretningen af bindestregsfronten orienteret mod mikrokanalåbningerne for at tilskynde til hyphal infiltration af kanalerne.
- Trin 4.1.1-4.1.2 gentages for den anden svampeart (hvis du bruger FFI-enheden), og stikket sættes i det modsatte indløb. Hvis du bruger BFI-enheden, skal du udelade dette trin og fortsætte til trin 4.1.4.
- Forsegl petriskålen med gennemsigtig film og inkuberes ved 25-28 °C i mørke, indtil billeddannelsen påbegyndes. Bestem inkubationstiden før billeddannelse afhængigt af den tilsigtede biologiske hændelse, der skal observeres, f.eks. svampe-svampekonfrontationer, og vækstraten for inkluderede arter i enheden.
- Bakteriel podning
- Bakterierne fortyndes fra en kultur natten over (trin 3.2) i forholdet 1:25 med samme dyrkningsmedium som beskrevet i trin 3.2.3. Kultur i 3 timer ved 37 °C.
- Vask bakterierne ved pelleteringskultur med en centrifuge ved 2000 x g i 10 min. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i det ønskede volumen på 0,9 % w/v natriumchloridopløsning.
- Centrifuger igen for at opnå en pellet. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i flydende medium (f.eks . C. cinerea minimalt medium til en OD600 på 1). Optimer OD600-værdien for den pågældende bakteriestamme.
- Fjern BFI-enheden fra inkubatoren og åbn den i et sterilt miljø. Pipetter 10 μL suspension i bakterieindløbet.
BEMÆRK: Optimer de nøjagtige podningstimeringer for de pågældende bakterie-svampeinteraktioner. For eksempel introducere bakterier i BFI-enheden 18 timer efter svampevaccination, hvis du bruger C. cinerea. - Forsegl petriskålen med en gennemsigtig film, og der inkuberes ved 25 °C i mørke, indtil billeddannelsen begynder. Opbevar enheden lodret.
5. Mikroskopi og billedanalyse
- Mikroskopi
BEMÆRK: Forskeren skal vælge den passende billeddannelsesmetode, der er i overensstemmelse med arten af det eksperiment, der skal udføres, for eksempel en omvendt bredfelt epifluorescens eller konfokal mikroskopi. En generel oversigt er givet her, da specifikke detaljer vil afhænge af attributterne for den valgte mikroskopiopsætning.- Tænd for mikroskopcomputeren, mikroskopets hovedlegeme (hvis relevant), kameraet, den temperaturstyrede inkubator og lyskilden/lyskilderne. Sørg for, at mikroskopet er sat korrekt op, f.eks. at Köhler-belysningen er korrekt anvendt til jævn belysning af prøven. Start billedbehandlingssoftwarepakken.
BEMÆRK: Når du bruger en temperaturstyret inkubator, er det vigtigt at lade mikroskoptemperaturen ekvilibrere i flere timer, før du starter et eksperiment. - Monter den mikrofluidiske enhed i trinindsatsen. Sørg for, at enheden er godt sikret, dvs. med tape, for at forhindre, at enheden løsnes under aktiv bevægelse.
- Få billeder af de podede enheder, f.eks. enten single-point eller time-lapse eksperimenter. Omfattende billedspecifikationer, der er relevante for de eksperimenter, der udføres med BFI- og FFI-enhederne, findes i de respektive ovennævnte publikationer40,41.
BEMÆRK: Brightfield-billeder blev erhvervet ved hjælp af fasekontrastmikroskopi til at visualisere orddelingsproliferation gennem vækstkanalerne ved hjælp af autofokussoftware og enten 10x forstørrelse, 0,30 NA (numerisk blænde) eller 20x forstørrelse, 0,45 NA objektive linser. Excitation af fluorescerende reporterproteiner blev opnået ved hjælp af en højeffekt lysemitterende diodelysmotor med bølgelængder, der er specifikke for fluoroforen. - Eksporter billeder til et passende format til efterfølgende billedbehandling. For eksempel .tiff.
- Tænd for mikroskopcomputeren, mikroskopets hovedlegeme (hvis relevant), kameraet, den temperaturstyrede inkubator og lyskilden/lyskilderne. Sørg for, at mikroskopet er sat korrekt op, f.eks. at Köhler-belysningen er korrekt anvendt til jævn belysning af prøven. Start billedbehandlingssoftwarepakken.
- Billedanalyse
BEMÆRK: Forfatterne anbefaler Fiji46 som et værktøj til billedanalyse, men andre softwarepakker er tilgængelige. Følgende er eksempler på billedanalyser udført ved hjælp af Fiji fra de præsenterede BFI- og FFI-enhedspublikationer. Disse trin er specifikke for en Mac og kan afvige lidt, hvis du bruger en pc.- Målinger af hyphal væksthastighed
BEMÆRK: Denne metode blev anvendt i BFI-manuskriptet40 til at måle vækstraterne for individuelle hyfer.- Download, installer og start Fiji. Importer billedsekvensen fra et timelapseeksperiment ved at vælge Filer > Importer > billedsekvens. Find den mappe, hvor dataene er gemt, og vælg Åbn. I vinduet Sekvensindstillinger skal du vælge Indstillinger og derefter OK.
- Vælg ikonet Lige linje fra hovedværktøjslinjen. Placer begyndelsen af den lige linje ved spidsen af den voksende bindestreg ved at klikke og derefter samtidig trække markøren til et andet punkt i vinduet. Der vises en gul linje med tre felter, der angiver linjens begyndelse, midtpunkt og slutning.
- Gå til den næste ramme i billedsekvensen ved at trykke på ctrl og holde > nede. Placer enden af den lige linje ved spidsen af den voksende hypha ved at vælge og trække den firkantede boks til den rigtige position.
- Tryk og hold Ctrl og M nede for at måle længden af linjen i pixels. Der vises et resultatvindue med de målte data. Definer de data, der vises i vinduet Resultater som følger: Klik på vinduet Resultater , og vælg derefter Resultater > Indstil målinger.
- Gå til den næste ramme i billedsekvensen ved at trykke på og holde Ctrl nede og derefter >. Placer begyndelsen af den lige linje ved spidsen af den voksende hypha ved at vælge og trække den firkantede boks til den rigtige position.
- Tryk og hold Ctrl og derefter M nede for at måle længden af linjen i pixels. Der vises et resultatvindue med de målte data.
- Trin 5.2.1.5-5.2.1.6 gentages, indtil hyferne er færdige med at måle væksten i pixel.
- Vælg alle dataene i vinduet Resultater . Kopier og indsæt i et andet softwareprogram, f.eks. et regneark, for at behandle dataene. Orddelingsvæksten (i pixels eller mikrometer) afbildes som funktion af tiden, og de gennemsnitlige vækstrater beregnes. Udfør mindst tre biologiske replikater pr. Eksperiment.
- Målinger af fluorescensintensitet
BEMÆRK: Denne metode blev anvendt i FFI-publikationen41 til at vurdere ændringen i fluorescensintensitet i hyfer af Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP ved kontakt med Clonostachys rosea 016 som en funktion af tiden.- Download, installer og start Fiji. Importer billedsekvens fra et timelapseeksperiment ved at vælge Filer > Importer > billedsekvens. Find den mappe, hvor dataene er gemt, og vælg Åbn. I vinduet Sekvensindstillinger skal du vælge Indstillinger og derefter OK.
- Angiv et interesseområde (ROI) for at måle den absolutte fluorescensintensitet for en hypha ved hjælp af det rektangulære værktøj, der er placeret i hovedværktøjslinjen. Kvadratets størrelse kan defineres nøjagtigt som følger: Rediger > markering > Angiv; ROI kan også gemmes til fremtidig reference i ROI Manager ved at vælge Rediger > Selection > Føj til Manager.
- Mål den absolutte fluorescensintensitet (middelgrå værdi) inden for den definerede ROI for hvert billede i hele billedsekvensen eller stakken som følger: Billede > Stakke > Målingsstak. Vinduet Resultater åbnes automatisk, når alle billederne i stakken er blevet behandlet.
BEMÆRK: De data, der vises i vinduet Resultater , kan defineres som følger: Klik på Vinduet Resultater , og vælg derefter Resultater > Indstil målinger. Sørg for, at Middelgrå værdi er valgt. - Vælg alle dataene i vinduet Resultater . Kopier og indsæt i et andet softwareprogram, f.eks. et regneark, for at plotte de absolutte fluorescensintensiteter af det specificerede investeringsafkast som en funktion af tiden.
- Trin 5.2.2.2-5.2.2.4 gentages for at indsamle absolutte fluorescensintensitetsmålinger for hver ROI, dvs. på den pågældende hyfer ved siden af interessehyferne eller inden for den tilsvarende kontrolkanal.
- Beregn de passende relative fluorescensintensiteter i vilkårlige enheder (AU), fx ved at dividere den absolutte fluorescensintensitet af ROI [hypha of interest] med den absolutte fluorescensintensitet af ROI [kontrolkanalen]. Se FFI-publikationen41 for mere specifikke detaljer.
- Udfør mindst tre biologiske replikater pr. eksperiment, og plot de relative fluorescensintensiteter som en funktion af tiden.
- Målinger af hyphal væksthastighed
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater præsenteres fra de eksemplariske BFI40- og FFI41-enheder. Hyphal væksthastighedsmålinger kan let opnås ved hjælp af disse enheder i kombination med grundlæggende mikroskopiteknikker. Figur 3A-B illustrerer bakterielle-svampeinteraktioner mellem C. cinerea hyphae og B. subtilis NCIB 3610. Tilstedeværelsen af B. subtilis standser væksten af C. cinerea efter ca. 5 timer efter co-inokulation (figur 3B). Pile angiver den samtidige morfologiske observation af tyndere og mere gennemsigtige hyfer (figur 3A). Det blev også bemærket, at upåvirkede bindestregceller fortsatte med at sprede sig. Figur 3C-D viser den stærke hæmmende virkning af F. graminearum PH1-dsRed på T. rossicum NEU135 efter bindestregsinteraktion, hvilket resulterer i en fuldstændig anholdelse af T. rossicum hyphal vækst.
Figur 3: Eksempler på kvantificering og observation af vækstrater fra BFI- og FFI-enhederne. (A) Brightfield-mikroskopibilleder af interaktioner mellem Coprinopsis cinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610 i BFI-enhedens mikrokanaler på tidspunkter efter co-podning. Pile fremhæver en tynd bindestregmorfologi, der opstod efter interaktion med B. subtilis NCIB 3610. Skalabjælke = 25 μm. (B) Bindestregsvæksthastighed for førende bindestregspidser målt over 10 timer efter co-podning. Søjler repræsenterer standardafvigelser fra tre biologiske replikater. (C) Boxplot (n = 6), der viser den relative vækstrate for Fusarium graminearum PH1-dsRed versus Trichoderma rossicum. Signifikans betegnes med ** og repræsenterer p < 0,01, beregnet ved hjælp af Mann-Witney U-test. Søjler repræsenterer henholdsvis største eller mindste observation svarende til henholdsvis øvre og nedre percentil (± 1,5 x interkvartilområde). (D) F. graminearum PH1-dsRed (vokser fra venstre mod højre) vs T. rossicum NEU135 (vokser fra højre mod venstre) ved 24 timer, 48 timer og 72 timer efter co-podning. Brightfield og fluorescenskanaler overlejret. Skala bar = 200 μm. Panelerne i denne figur er blevet ændret fra Stanley et al., 2014 (A-B)40 og Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Klik her for at se en større version af denne figur.
De morfologiske ændringer induceret af interaktionshændelser kan observeres på celleniveau ved hjælp af de metoder, der er skitseret i dette papir. Figur 4 giver eksempler på morfologiske observationer for de præsenterede BFI- og FFI-enheder. Figur 4A viser tabet af polariteten af Verticillium longisporum hyphal vækst ved stød på bakterierne Pseudomonas synxantha (P_phen) eller P. fluorescens (P_rhizo), sammenlignet med kontrolsvampene alene (V1)47. Svampe-bakterielle interaktioner resulterede i hyphae krøllede udseende. Dette blev tilskrevet signifikante bakterielt inducerede transkriptomiske ændringer i svampene og formodet undgåelsesadfærd. Disse resultater er signifikante, da V. longisporum er et plantepatogen, hvilket betyder Pseudomonas sp. har potentiale til at blive anvendt som biokontrol i dette tilfælde47.
Figur 4B viser et timelapse-eksperiment, hvor det dynamiske tab af bindestregscellulært indhold kan observeres og danner blebs, der bevarer det røde fluorescerende protein dTomato. Denne blebbing morfologi opstod efter co-inokulation med B. subtilis, men blev kun observeret i nogle apikale celler. Hyphaens sammenbrud og efterfølgende blebbingfænomener var imidlertid ikke korreleret med bakteriel vedhæftning. Dette antydede, at der forekom potentiel fungicid bakteriel aktivitet, der ikke var vedhæftningsafhængig, antaget at skyldes udskillelsen af lipopeptider. Dynamiske billeddannelsesteknikker med høj opløsning har også afsløret en formodet forsvarsmekanisme for F. graminearum, der udviser øget septadannelse, når den modarbejdes af C. rosea, som angivet med pilene i figur 4C.
Figur 4: Eksempler på ændringer i morfologi observeret under interaktionshændelser i BFI- og FFI-enhederne. (A) De krøllemorfologiske ændringer i de plantepatogene svampe Verticillium longisporum (V1) mærket med grønt fluorescerende protein (GFP)48. Denne morfologi opstod som reaktion på en fluorescerende Pseudomonas spp. med gener, der koder for phenazinsyntese (P_phen; P. synxantha) og en bakterie isoleret fra rapsens rhizosfære (P_rhizo; P. fluorescerende). Skalastænger = 20 μm. (B) dTomato-udtrykkende Coprinopsis cinerea40 co-inokuleret med Bacillus subtilis afbildet 5 timer efter co-inokulation. Celler var intakte (venstre) ved 5 timer, men en hypha kollapsede 30 minutter senere (tab af fluorescens), og blebs indeholdende (fluorescerende) cellulært materiale blev observeret. Skala bar = 25 μm. (C) Pile fremhæver septadannelse i Fusarium graminearum hyphae observeret efter interaktion med Clonostachys rosea hyphae. Skalabjælke = 10 μm, tidsstempel = h post co-inokulation. Panelerne i denne figur er blevet ændret fra Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 og Gimeno et al., 2021 (C)41. Klik her for at se en større version af denne figur.
De præsenterede enheder er også velegnede til at observere dynamiske fysiologiske ændringer. Ved hjælp af BFI-enheden blev det vist, at koncentrationen af hyphae-associerede bakterier ændrede sig over tid og faldt efter en lokal akkumulering af celler (figur 5A). Bakteriel mobilisering langs mikrokanaler blev også observeret at forekomme i klyngelignende samlinger. I FFI-enheden tillod fluorescensmærkning kvantificering af C. rosea hyphal proliferation, når den konfronteres med F. graminearum for at karakterisere dynamikken i den antagonistiske interaktion (figur 5B). Disse målinger blev foretaget over en periode på 20 timer og demonstrerer potentialet i disse enheder til at udføre langsigtede time-lapse-eksperimenter.
Figur 5: Eksemplariske dynamiske fysiologiske karakteriseringsmålinger for både BFI- og FFI-enhederne. (A) Time lapse-eksperiment i BFI-enheden, der viser vedhæftningen af Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 til hyphae af Coprinopsis cinerea pMA41240 over 3 timer. Skalabjælke = 50 μm. (B) Brightfield- og fluorescenskanalbilleder viser kvantificering af grønt fluorescerende protein (GFP) detekteret ved hjælp af FFI-enheden under interaktionen mellem fluorescerende mærket Clonostachys rosea og Fusarium graminearum49. Skala bar = 50 μm. Graf (højre) afbilder relativ fluorescens i vilkårlige enheder (AU) over 20 timer, n = 6, og fejlbjælker angiver standardfejlen. Orange og grå plot illustrerer fluorescensintensiteten af (i) GFP detekteret i henholdsvis C. rosea bindestregsnetværk og (ii) interaktionskanalen sammenlignet med den C. rosea-holdige kontrolkanal. Det sorte kontrolplot viser fluorescensintensiteten af hyfer i C. rosea-kontrolkanalen sammenlignet med kontrolkanalen. Panelerne i denne figur er blevet ændret fra Stanley et al., 2014 (A)40 og Gimeno et al., 2021 (B)41. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer en protokol til undersøgelse af svampe-mikrobielle interaktioner ved hjælp af kanalmikrofluidik. Forfatterne sigter mod at demonstrere alsidigheden af disse enheder og tilskynde til tilpasning, der passer til forskerens interesser. Ved hjælp af de eksemplariske BFI- og FFI-enheder kan svampe-mikrobielle interaktioner studeres mere detaljeret end tidligere tilgængelig. Ved at fjerne jordens baggrundskompleksitet og heterogenitet, moderere væksten af hyfer, så de er begrænset til et enkelt enkelt lag, og stramt regulere miljøparametre, er det muligt at fange billeder i høj opløsning af disse biologiske begivenheder over tid. Ved hjælp af disse enheder er interaktionerne mellem mikrobielle partnere blevet karakteriseret ved hjælp af vækstrate, fluorescenskvantificering og observationsbioimaging af morfologiske træk.
Enheder kan designes til at muliggøre karakterisering af svampe-mikrobielle interaktioner på celleniveau. Alsidigheden og letheden ved design for ikke-specialister gør denne protokol velegnet til tilpasning til en bred vifte af forskningsspørgsmål. BFI- og FFI-enhederne er velegnede til brug med en række mikroskoper, der passer til det eksperimentelle mål, på grund af deres gennemsigtige natur og glasbundne overflade. Enhederne kan skræddersys med hensyn til både deres konfiguration og fysisk-kemiske parametre; for eksempel kan fugtighed, temperatur eller kanalmætning ændre miljøoplevelsen for testpersonen. Derefter kan enheden designes således, at den fysisk kan styre væksten eller fremkalde en bestemt adfærd, såsom interaktionshændelser eller navigationsstrategier, styret af kanalstruktur og størrelse eller inkludering af forhindringer. Dette er ikke muligt med de nuværende metoder, såsom agar-pladeassays31.
Indtil videre er mikrofluidiske enheder også blevet anvendt til at udforske svampefag50 og svampe-nematode35 interaktioner. Brugen af kanalmikrofluidik tillader også kontrol og udveksling af væsker i enheden. Denne vigtige og fordelagtige funktion var medvirkende til undersøgelsen af mycelial fagretention50. Derudover gav brugen af mikrofluidiske teknologier til transkriptomiske undersøgelser en større opløsning af differentielt udtrykte gener sammenlignet med et lignende agarbaseret assay. Metoderne var samtidige i 24 ud af de 28 differentielt udtrykte gener identificeret ved det samme agarpladeeksperiment, hvor de mikrofluidiske enheder identificerede mange yderligere gener og rapporterede et højere relativt udtryk i sammenligning35.
De kritiske trin i protokollen begynder med det originale enhedsdesign. For at opnå et passende design skal der lægges vægt på livsstil og vækst / mobilitetsstrategi for mikroberne af interesse. For eksempel inklusive tilstrækkelig kanaldybde eller længde til at imødekomme de fysiologiske krav og væksthastigheden for mikroorganismen af interesse. Mikrokanalernes strukturelle egenskaber og komponenter kan designes til at inducere eller manipulere specifik adfærd, såsom åbninger til interaktionszoner eller forhindringer for at observere navigationsstrategier. Desuden skal det eksperimentelle forskningsspørgsmål kunne behandles med enhedens design. Overvej f.eks.: i) hvordan laminære flowprofiler kan udnyttes, ii) tilpasning og varierende mikrokanalhøjder for den organisme, der skal undersøges, og iii) indsnævring af mikrokanalindgange for at forhindre overproliferation af hyfer i anordningen. Forfatterne foreslår disse yderligere ressourcer til mikrofluidisk enhedsdesign 51,52,53. Det er også vigtigt at holde enhederne fri for støv under fremstillingen. Derfor skal man sørge for at opretholde et støvfrit miljø i alle faser af fremstillingsprocessen samt ved at bruge tape og filtreret trykluft og holde PDMS-overfladerne dækket, når de ikke er i brug. Andre kritiske trin i protokollen inkluderer minimering af risikoen for forurening ved at vaske enhederne i 70% ethanolopløsning og sikre tilstrækkelig binding mellem glasoverfladen og PDMS-pladen ved forsigtigt at placere de aktiverede overflader i kontakt med hinanden og ikke lægge for meget pres på mikrokanalerne. Kontroller for tilfredsstillende vedhæftning ved at forsøge at fortrænge PDMS-pladen fra glasset inden podning. En begrænsning af disse enheder er, at de ikke kan genbruges mellem eksperimenter.
Inkluderingen af jordmikrober i skræddersyede mikrofluidiske enheder begynder en spændende ny æra for forskning i mikrobielle interaktioner. Potentielle fremtidige anvendelser af den præsenterede metode er vidtrækkende, såsom opdagelsen af nye biokontrolarter eller antimikrobielle forbindelser eller karakteriseringen af den såkaldte svampemotorvej til bakteriel mobilisering. BFI- og FFI-enhederne giver en platform til at visualisere dynamiske morfologiske og fysiologiske ændringer, der forekommer før og efter interaktion på celleniveau. Nye enheder er ligetil at designe og skabe, hvilket simpelthen kræver opfindsomhed, der passer til det eksperimentelle forskningsspørgsmål. Deres alsidighed og brugervenlighed betyder, at denne metode kan bruges af ikke-eksperter til at fremme jordmikrobiomforskning på celleniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender økonomisk støtte fra Institut for Bioengineering ved Imperial College London og The Leverhulme Trust (Forskningsbevillingsreference: RPG-2020-352).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
References
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
- Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
- Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
- Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33 (2021).
- Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
- Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
- Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
- Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
- Tang, H. -Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
- Bai, Y. -B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
- Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
- Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
- Válková, H., Novotný, Č, Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
- Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), Basel, Switzerland. 572 (2020).
- Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
- Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
- Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
- Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
- Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
- Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
- Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
- Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
- Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163 (2019).
- Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
- Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535 (2020).
- Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
- Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
- Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154 (2017).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
- Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243 (2019).
- Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
- Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
- Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074 (2020).
- Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
- Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
- Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262 (2021).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010 (2018).
- Choi, C. -H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468 (2021).
- Boenisch, M. J. Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , Staats-und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky. (2013).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
- Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
