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Bioengineering

सेलुलर स्तर पर फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन की जांच के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63917
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Imperial College London

Summary

मिट्टी की अपारदर्शिता के कारण, इसके घटक रोगाणुओं के बीच बातचीत को सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ आसानी से कल्पना नहीं की जा सकती है। यहां, दो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण प्रस्तुत किए जाते हैं, जो फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन की जांच के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं। उपकरण बहुमुखी और उपयोग करने में सरल हैं, जो सेलुलर स्तर पर उच्च स्थानिक नियंत्रण और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करते हैं।

Abstract

फिलामेंटस कवक मिट्टी के सफल निवासी हैं और मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जैसे कि कार्बनिक और अकार्बनिक पदार्थों के अपघटन के साथ-साथ पोषक तत्वों के स्तर का विनियमन। वहां उन्हें बैक्टीरिया या अन्य कवक जैसे विभिन्न अन्य रोगाणुओं के साथ बातचीत करने के कई अवसर भी मिलते हैं। सेलुलर स्तर पर फंगल इंटरैक्शन का अध्ययन करना, हालांकि, मिट्टी की ब्लैक बॉक्स जैसी प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। फंगल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए नए माइक्रोफ्लुइडिक टूल विकसित किए जा रहे हैं; बैक्टीरियल-फंगल और फंगल-फंगल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किए गए दो प्लेटफार्मों पर प्रकाश डाला गया है। इन माइक्रोचैनलों के भीतर, फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन को पहले से संभव की तुलना में उच्च अस्थायी और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर नियंत्रित भौतिक-रासायनिक वातावरण में निगरानी की जा सकती है। इन उपकरणों के अनुप्रयोग ने कई उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त की हैं, जैसे कि हाइप के लिए बैक्टीरिया ध्रुवीय लगाव का अवलोकन या अनिर्दिष्ट कवक-कवक विरोध का खुलासा करना। इन पद्धतियों की एक प्रमुख विशेषता गैर-विशेषज्ञों द्वारा इस उपकरण के उपयोग में आसानी का संबंध है, जो सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए अत्यधिक अनुवाद योग्य प्रौद्योगिकियों का उत्पादन करती है।

Introduction

मिट्टी एक असाधारण विविध वातावरण है जिसमें सूक्ष्मजीवों की बहुतायत होती है जो कार्बन और फॉस्फोरस चक्र 1,2 के लिए सहायक होती है। फिलामेंटस कवक कार्बनिक और अकार्बनिक पदार्थों के डीकंपोजर के रूप में कई पारिस्थितिक तंत्रों का एक प्रमुख घटक है और सहजीवी संबंधों 3,4 के गठन के माध्यम से पौधों के पोषण को बढ़ा सकता है। मिट्टी के भीतर, कवक रोगाणुओं की एक भीड़ के साथ गतिशील रूप से बातचीत करता है जैसे कि अन्य कवक5, बैक्टीरिया6, वायरस7 और नेमाटोड8। इन इंटरैक्शन के मिट्टी और पौधों के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हैं। फिर भी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन के साथ सूक्ष्मजीवों को बातचीत करने में सक्षम उपयुक्त प्रयोगात्मक प्रणालियों की कमी के कारण, कई अपरिभाषित रहते हैं।

बैक्टीरियल-फंगल इंटरैक्शन (बीएफआई) और फंगल-फंगल इंटरैक्शन (एफएफआई) से संबंधित जांच में कई क्षेत्रों में मूल्यवान अनुप्रयोग हैं, जिनमें चिकित्सा में रोगाणुरोधी और कृषि में जैविक नियंत्रण एजेंट शामिल हैं। उदाहरण के लिए, कवक कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया पेप्टाइड कॉप्सिन का उत्पादन करता है, जिसे मानव रोगज़नक़ लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेनेस9 के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। इसी तरह, फंगल-व्युत्पन्न यौगिक, ग्रिसोफुल्विन, व्यापक रूप से मानव फंगल संक्रमण के उपचार के रूप में उपयोग किया जाता है और इसके अतिरिक्त पौधे रोगजनक कवक अल्टरनेरिया सोलानी10,11 के विकास को बाधित करने में सक्षम है। मिट्टी में रहने वाले जीवाणु बैसिलस सबटिलिस के कई उपभेदों को फंगल प्लांट रोगज़नक़ राइजोक्टोनिया सोलानी12,13 के प्रभावी जैव नियंत्रण एजेंटों के रूप में भी प्रदर्शित किया गया है। बहरहाल, पारंपरिक पद्धतियों से जुड़ी सीमाओं के कारण, बीएफआई और एफएफआई को एकल कोशिकाओं के स्तर पर खराब समझा जाता है।

पारंपरिक अध्ययन आमतौर पर टकराव में दो या दो से अधिक प्रजातियों के साथ अगर प्लेटों का उपयोग करके मैक्रोस्केल पर बीएफआई और एफएफआई का पता लगाते हैं। उनकी बातचीत का मूल्यांकन14,15,16 प्रजातियों की वृद्धि दर और मेटाबोलाइट उत्पादन को मापकर किया जाता है; हालाँकि, इस पद्धति को केवल कॉलोनी स्तर तक हल किया जाता है। सेलुलर स्तर पर बातचीत का अध्ययन करने के लिए, बैक्टीरिया और फंगल इनोकुलेंट्स को अगर के साथ लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर खेती की जा सकती है जो तब माइक्रोस्कोप17 के तहत इमेज किए जाते हैं। फिर भी, कारावास की कमी के कारण माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके एक एकल हाइफा का पालन करना मुश्किल हो सकता है, जिसका अर्थ है कि समय-चूक छवियों को प्राप्त करना कठिन है। इसके अलावा, फंगल मायसेलियम के परिभाषित क्षेत्रों के भीतर अन्य सूक्ष्मजीवों को स्थानिक रूप से सीमित करने या परिभाषित रासायनिक वातावरण बनाने का अवसर जो परेशान हो सकता है, उदाहरण के लिए, ऐसे सेट-अप में संभव नहीं है। मिट्टी की "ब्लैक बॉक्स" प्रकृति एकल कोशिकाओं18 के स्तर पर फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने की जटिलता को भी जोड़ती है। मिट्टी माइक्रोबायोम की अविश्वसनीय विविधता से दूर बातचीत करने वाली प्रजातियों को देखकर, व्यक्तिगत सदस्यों के बातचीत करने के सटीक तरीके का आकलन किया जा सकता है। इस प्रकार, बहुमुखी प्लेटफार्मों की निरंतर आवश्यकता है जो बीएफआई और एफएफआई के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, सिंगल-सेल इमेजिंग को सक्षम करते हैं।

माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियां, तथाकथित लैब-ऑन-ए-चिप सिस्टम, एकल कोशिकाओं के स्तर पर बीएफआई और एफएफआई के अध्ययन के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करती हैं। रासायनिक विश्लेषण और माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक के लिए विकसित प्रौद्योगिकियों से उत्पन्न माइक्रोफ्लुइडिक्स के क्षेत्र कोजैविक विज्ञान द्वारा अपनाया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियां लघु चैनलों के बेस्पोक नेटवर्क के भीतर तरल पदार्थों की छोटी मात्रा को विनियमित करती हैं, जिसमें माइक्रोमीटर पैमाने पर कम से कम एक आयाम होता है, और जैविक अनुसंधान में उनका उपयोग20 का विस्तार हो रहा है। विशेष रूप से, फिलामेंटस कवक 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 की वृद्धि की जांच करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण विकसित किए गए हैं। इस तकनीक का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि हाइप का कारावास और माइक्रोचैनलों के भीतर पोषक तत्वों का वितरण पारंपरिक अगर विधियों की तुलना में मिट्टी के वातावरण की संरचना से अधिक निकटता से मिलता जुलताहै 31. हाल ही में, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का उपयोग मानव न्यूट्रोफिल और फंगल रोगजनकों32, बैक्टीरिया और पौधों की जड़ों33, साथ ही कवक और नेमाटोड34,35 के बीच बातचीत की जांच करने के लिए किया गया है।

माइक्रोबियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करने के कई फायदों में से एक में माइक्रोचैनल पर्यावरण का विशिष्ट नियंत्रण शामिल है। उदाहरण के लिए, लामिना प्रवाह शासनों को परिभाषित एकाग्रता ढाल उत्पन्न करने के लिए शोषण किया जा सकता है, जो बैक्टीरिया केमोटैक्सिस36 की जांच करते समय विशेष रूप से उपयोगी होता है। एक अन्य लाभ यह है कि पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) (पीडीएमएस) की पारदर्शी प्रकृति, एक सस्ती, जैव संगत इलास्टोमेरिक बहुलक आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण में उपयोग किया जाता है, ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी37 का उपयोग करके एकल कोशिकाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है। इसी तरह, माइक्रोचैनलों के भीतर रोगाणुओं के कारावास का मतलब है कि एकल कोशिकाओं पर नज़र रखने वाले समय-चूक प्रयोग किए जा सकते हैं, जिससे व्यक्तिगत सेलुलर प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड किया जा सकता है और37 की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अंत में, जैसा कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को उपयोगकर्ता के अनुकूल होने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, उन्हें गैर-विशेषज्ञों द्वारा आसानी से नियोजित किया जा सकताहै।

जैव विविधता को बनाए रखने और स्थलीय वातावरण पर जलवायु परिवर्तन के प्रभाव को कम करने के लिए टिकाऊ पारिस्थितिकी तंत्र प्रबंधन प्रथाओं में सुधार के लिए मिट्टी में रहने वाले सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के ज्ञान कोआगे बढ़ाना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, उपन्यास माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का विकास कवक की समझ और सेलुलर स्तर पर उनकी बातचीत का विस्तार करने के लिए मौलिक है। यहां प्रोटोकॉल बीएफआई40 और एफएफआई41 के अध्ययन के लिए उत्पादित दो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों पर ध्यान केंद्रित करेगा जैसा कि चित्र 1 में दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल-फंगल इंटरैक्शन (बीएफआई) और फंगल-फंगल इंटरैक्शन (एफएफआई) उपकरणों का दृश्य और योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डिवाइस में हाइफल वृद्धि की अनुमति देने के लिए माइक्रोचैनल के एक छोर के प्रवेश द्वार पर एक माइसेलियल प्लग रखा गया है। जीवाणु इनलेट विपरीत छोर पर है। स्केल बार = 5 मिमी (बी) बीएफआई डिवाइस का योजनाबद्ध अवलोकन, बैक्टीरिया इनलेट्स की स्थिति और इंटरैक्शन माइक्रोचैनल के माध्यम से हाइफल विकास की दिशा को दर्शाता है। चैनल गहराई में 10 μm, 100 μm चौड़ा और 7 मिमी लंबा है, जिसमें कुल 28 अवलोकन चैनल हैं। (सी) कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया और बेसिलस सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के बीच अगर प्लेट पर टकराव परख, स्केल बार = 20 मिमी (बाएं)। माइक्रोचैनल (मध्य और दाएं) के भीतर सी सिनेरिया और बी सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के बीच बातचीत दिखाने वाली माइक्रोस्कोपी छवियां, यानी, फंगल हाइपहे के लिए बैक्टीरिया का ध्रुवीय लगाव। स्केल बार = 25 μm (मध्य) और 10 μm (दाएं)। (डी) एफएफआई डिवाइस की छवि एक ग्लास-तल वाले पेट्री डिश से बंधी हुई है, जो मायसेलियल प्लग के साथ दोहरी टीका है। स्केल बार = 1 सेमी (ई) एफएफआई डिवाइस का योजनाबद्ध अवलोकन। डिवाइस के दोनों छोर पर इनलेट में दो फंगल इनोकुलेंट प्लग पेश किए जाते हैं, जिससे माइक्रोचैनलों के हाइफल अन्वेषण की अनुमति मिलती है। नियंत्रण चैनल केवल एक फंगल इनलेट से जुड़े होते हैं और परीक्षण कवक के बीच बातचीत को रोकने, एक मृत अंत चैनल होता है। इंटरैक्शन चैनल दोनों फंगल इनलेट्स को जोड़ते हैं और माइक्रोचैनल के भीतर परीक्षण विषयों के बीच हाइफल इंटरैक्शन की अनुमति देते हैं। प्रत्येक इंटरैक्शन चैनल में 18 हीरे के आकार के खंड होते हैं, जो 8.8 मिमी (490 x 430 μm प्रति हीरा), 10 μm गहरे, और 20 μm के प्रत्येक हीरे के बीच एक कनेक्टिंग क्षेत्र की कुल लंबाई को मापते हैं। चैनल प्रकार डुप्लिकेट किए जाते हैं, स्केल बार = 1 मिमी (एफ) दो आने वाले हाइफल मोर्चों के बीच इंटरैक्शन ज़ोन, इंटरकनेक्टेड इंटरैक्शन चैनल के विपरीत सिरों से बढ़ता है। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि, स्केल बार = 250 μm। इस आंकड़े में पैनलों को स्टेनली एट अल, 2014 (ए-सी) 40 और गिमेनो एट अल, 2021 (डी-एफ) 41 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रक्रियाओं का सारांश नेत्रहीन चित्रा 2 में दर्शाया गया है।

Figure 2
चित्रा 2: इस प्रोटोकॉल में विस्तृत पांच प्रमुख वर्गों से मिलकर प्रस्तुत पद्धति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डिवाइस डिज़ाइन कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर और फोटोलिथोग्राफी (1) का उपयोग करके निर्मित एक मास्टर मोल्ड का उपयोग करके बनाए जाते हैं। इसका उपयोग पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) (पीडीएमएस) डालने के लिए किया जाता है, जिसे तब स्लैब में विभाजित किया जाता है और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने के लिए कांच के तल वाले पेट्री व्यंजनों से बंधा होता है (2). अध्ययन में शामिल किए जाने वाले रोगाणुओं को सुसंस्कृत किया जाता है (3) और उपकरणों को टीका लगाने के लिए उपयोग किया जाता है (4). माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इंटरैक्शन का अध्ययन किया जाता है और छवि विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की जाती है (5). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. मास्टर मोल्ड निर्माण

  1. फोटोमास्क उत्पादन
    1. कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिज़ाइन उत्पन्न करें। प्रस्तुत उपकरणों के आयाम चित्रा 1 में दिए गए हैं और विशिष्ट डिजाइन सुविधाओं के बारे में अधिक विवरण संबंधित प्रकाशनों40,41 में व्यापक रूप से सूचीबद्ध हैं।
    2. एक उपयुक्त प्रारूप (जैसे, .dwg, .dxf) का उपयोग करके सीएडी डिज़ाइन फ़ाइल निर्यात करें। मुद्रण के लिए एक वाणिज्यिक प्रदाता को निर्यात किए गए सीएडी डिजाइन फ़ाइल भेजकर एक फिल्म फोटोलिथोग्राफी मास्क प्रिंट करें।
  2. फोटोलिथोग्राफी
    नोट: निम्नलिखित चरणों को धूल मुक्त और प्रकाश-नियंत्रित वातावरण के भीतर आयोजित किया जाना चाहिए, जैसे कि लामिना प्रवाह हुड या स्वच्छ कमरे की सुविधा। यहां प्रदान की गई प्रयोगात्मक स्थितियों को एक गाइड के रूप में दिया गया है और इन-हाउस अनुकूलित किया जाना चाहिए। लेखक विशिष्ट प्रशिक्षण और परामर्श स्थापित प्रोटोकॉल42 की मांग करने की सलाह देते हैं।
    1. 2 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेकिंग करके 100 मिमी सिलिकॉन वेफर तैयार करें। एसयू -8 2010 फोटोरेसिस्ट के साथ सिलिकॉन वेफर को स्पिन-कोट करें, निम्नलिखित स्थितियों का उपयोग करके 10 μm की लक्ष्य मोटाई के लिए लक्ष्य: 10 एस (त्वरण 100 आरपीएम /
      सावधानी: एसयू -8 फोटोरेसिस्ट खतरनाक है, हैंडलिंग करते समय देखभाल करें और त्वचा के साथ साँस लेना और संपर्क को रोकें। यह ज्वलनशील, संभावित रूप से कार्सिनोजेनिक और पर्यावरण के लिए विषाक्त है।
    2. 2.5 मिनट (नरम सेंकना) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर लेपित सिलिकॉन वेफर सेंकना। फिल्म फोटोलिथोग्राफी मास्क और मास्क संरेखक का उपयोग करके 365 एनएम तरंग दैर्ध्य पर 140 एमजे / सेमी2 की ऊर्जा खुराक का उपयोग करके पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के लिए फोटोरेसिस्ट का पर्दाफाश करें।
    3. 3.5 मिनट (पोस्ट एक्सपोजर सेंकना) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर लेपित सिलिकॉन वेफर सेंकना। विसर्जित और 3 मिनट के लिए डेवलपर समाधान में सिलिकॉन वेफर आंदोलन के लिए अप्रकाशित फोटोरेसिस्ट को हटाकर माइक्रोफैब्रिकेटेड संरचनाओं को प्रकट करने के लिए।
      सावधानी: डेवलपर समाधान ज्वलनशील हो सकता है, हैंडलिंग और भंडारण करते समय उचित सावधानी बरतें।
    4. 10 एस के लिए ताजा डेवलपर समाधान के साथ कुल्ला। 10 एस के लिए आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ कुल्ला और हवा सूखी। यह सुनिश्चित करने के लिए फ़िल्टर्ड, संपीड़ित हवा का उपयोग करें कि संरचनाएं अच्छी तरह से सूखी हैं। एसयू -8 संरचनाओं की ऊंचाई को मापें, उदाहरण के लिए, एक प्रोफिलोमीटर का उपयोग करके।
    5. 2 घंटे के लिए 50 एमबार के वैक्यूम दबाव को लागू करके क्लोरोट्रिमिथाइलसिलेन के 50 μL के साथ प्रत्येक मास्टर मोल्ड को सिलानाइज़ करें। लेखकों ने ध्यान दिया कि मास्टर मोल्ड का पुन: सिलानाइजेशन आवश्यक नहीं पाया गया था।
      सावधानी: क्लोरोट्रिमिथाइलसिलेन एक खतरनाक पदार्थ है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें और देखभाल के साथ संभालें। त्वचा और आंखों के संपर्क से बचें और साँस लेना रोकें। प्रज्वलन के स्रोतों से दूर रहें और एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में उपयोग करें।

2. डिवाइस निर्माण

नोट: निम्नलिखित चरणों को धूल मुक्त वातावरण के भीतर आयोजित किया जाना चाहिए, जैसे कि लामिना प्रवाह हुड।

  1. पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) (पीडीएमएस) स्लैब तैयार करना
    1. एक साफ प्लास्टिक कप में स्पैटुला का उपयोग करके 10: 1 अनुपात में आधार और इलाज एजेंट को अच्छी तरह से मिलाकर लगभग 40 ग्राम पीडीएमएस तैयार करें। पीडीएमएस युक्त प्लास्टिक कप को 1 घंटे के लिए वैक्यूम चैंबर (वैक्यूम दबाव = 50 एमबार) में रखकर सभी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए मिश्रण को डिगास करें।
    2. स्पष्ट टेप का उपयोग करके मास्टर मोल्ड को प्लास्टिक माउंट में सुरक्षित करें। किसी भी धूल के कणों को हटाने के लिए संपीड़ित फ़िल्टर्ड हवा का उपयोग करके साफ करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एल्यूमीनियम पन्नी को एक ग्लास पेट्री डिश के चारों ओर आकार दिया जा सकता है, और फिर मास्टर मोल्ड को घर देने के लिए उपयोग किया जाता है और पीडीएमएस43 होता है।
    3. मास्टर मोल्ड के केंद्र पर पीडीएमएस मिश्रण डालो, यह सुनिश्चित करें कि यह एक स्तर की सतह पर है, और बसने की अनुमति दें।
      नोट: पीडीएमएस मिश्रण को मास्टर मोल्ड की सतह पर जितना संभव हो उतना बारीकी से डाला जाना चाहिए और हवा के बुलबुले की शुरूआत को कम करने के लिए एक निरंतर प्रवाह बनाए रखा जाना चाहिए। हवा के बुलबुले को बुलबुले पर संपीड़ित हवा को निर्देशित करके या एक ठीक सुई का उपयोग करके उन्हें बाहर निकालकर हटाया जा सकता है।
    4. पीडीएमएस की सतह पर धूल के कणों को बसने से रोकने के लिए मास्टर मोल्ड को प्लास्टिक के ढक्कन के साथ शिथिल रूप से कवर करें। एक ओवन के लिए मास्टर मोल्ड स्थानांतरण और 70 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इलाज।
    5. ओवन से मास्टर मोल्ड निकालें और ठंडा होने दें। मास्टर मोल्ड और प्लास्टिक फ्रेम से दूर ठीक पीडीएमएस को छीलें, मास्टर मोल्ड / पीडीएमएस को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए ध्यान रखें।
    6. धूल मुक्त सतह को बनाए रखने के लिए पीडीएमएस में उभरा माइक्रोचैनलों पर स्पष्ट टेप रखें। सुनिश्चित करें कि बॉन्डिंग से पहले टेप को हटा दिया गया है।
    7. पीडीएमएस को स्लैब में काटें (यानी, यदि मास्टर मोल्ड पर डिजाइन में कई उपकरण शामिल हैं, तो कई को एक ही कास्टिंग से गढ़ा जा सकता है) जैसा कि एक घुड़सवार गिलोटिन या रेजर ब्लेड का उपयोग करके डिजाइन द्वारा निर्दिष्ट किया गया है। बीएफआई पीडीएमएस स्लैब के पार्श्व उद्घाटन को काटते समय, सुनिश्चित करें कि माइक्रोचैनल पूरी तरह से खुले हैं (चित्रा 1 ए)। एफएफआई पीडीएमएस स्लैब के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कोने को चित्रा 1 डी में दिखाए गए ग्लास-बॉटम वाले पेट्री डिश में फिट करने में सक्षम बनाने के लिए छंटनी की गई है।
    8. डिवाइस डिजाइन के अनुसार वांछित इनलेट / आउटलेट छेद पंच करें। क्रमशः अनुकरणीय बीएफआई और एफएफआई उपकरणों के लिए 3.18 मिमी और 4.75 मिमी के इनलेट छेद पंच करने के लिए एक सटीक कटर का उपयोग करें।
  2. उपकरण बनाने के लिए पीडीएमएस स्लैब की बॉन्डिंग
    नोट: निम्नलिखित धोने के कदम (2.2.1-2.2.2) 37 किलोहर्ट्ज पर शुद्ध पानी (डीडीएच2ओ) से भरे अल्ट्रासोनिक क्लीनर का उपयोग करते हैं। पीडीएमएस स्लैब को धोने से सफल संबंध44 को बढ़ाने और संदूषण के जोखिम को कम करने में मदद मिलती है। पीडीएमएस स्लैब में हेरफेर करने के लिए, माइक्रोचैनल या डिवाइस की सतह को नुकसान से बचने के लिए इनलेट छेद का उपयोग करके स्वच्छ संदंश और लिफ्ट का उपयोग करें।
    1. पीडीएमएस स्लैब को 0.5 एम एनएओएच में डुबोएं और 5 मिनट के लिए सोनीकेट करें। बाँझ डीडीएच2ओ के साथ कुल्ला पीडीएमएस स्लैब 70% इथेनॉल समाधान में स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए सोनीकेट। बाँझ डीडीएच20 के साथ कुल्ला।
    2. बाँझ डीडीएच2ओ में पीडीएमएस स्लैब विसर्जित करें और 5 मिनट के लिए सोनीकेट करें। बाँझ डीडीएच2ओ से पीडीएमएस स्लैब निकालें, फ़िल्टर्ड संपीड़ित हवा का उपयोग करके सूखा, और एक बाँझ वर्ग पेट्री डिश में रखें।
    3. पीडीएमएस स्लैब युक्त वर्ग पेट्री डिश को सूखने के लिए 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें। ओवन से निकालें और धूल मुक्त वातावरण में ठंडा होने दें। टेप और / या फ़िल्टर की गई संपीड़ित हवा का उपयोग करके पीडीएमएस स्लैब की सतह से किसी भी धूल को साफ करें।
    4. पीडीएमएस स्लैब और ग्लास-तल वाले पेट्री व्यंजनों की सतहों को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करके बंधुआ बनाने के लिए सक्रिय करें: वैक्यूम दबाव 0.75 एमबार, पावर 50%, कोटिंग समय 1 मिनट। प्लाज्मा क्लीनर में ऊपर की ओर सतहों को सक्रिय (और बाद में बंधुआ) रखें।
    5. प्लाज्मा क्लीनर से पीडीएमएस स्लैब और ग्लास-तल पेट्री व्यंजनों को हटा दें और सक्रिय सतहों को धीरे-धीरे एक दूसरे के अनुरूप संपर्क में रखकर बंधन करें। बीएफआई और एफएफआई पीडीएमएस स्लैब को क्रमशः 35 मिमी और 50 मिमी व्यास ग्लास-बॉटम पेट्री डिश (ग्लास मोटाई 0.17 मिमी) में बॉन्ड करें।
      नोट: ध्यान रखें कि बॉन्डिंग करते समय बहुत अधिक दबाव लागू न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप माइक्रोचैनल का पतन हो सकता है।
    6. चिमटी के साथ ग्लास-तल वाले पेट्री डिश से पीडीएमएस स्लैब को खींचने की कोशिश करके सफल बंधन की जांच करें। आंखों द्वारा या जेनेरिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उपकरणों की कल्पना करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि टीकाकरण इनलेट्स या माइक्रोचैनल का कोई पतन न हो।
      नोट: संतृप्त स्थितियों (यानी, पानी संतृप्त और / या पोषक तत्वों से भरपूर स्थितियों) के लिए, प्रोटोकॉल के चरण 2.2.7 शामिल हैं। यदि पानी-असंतृप्त स्थितियों की आवश्यकता होती है, तो चरण 2.2.8 पर आगे बढ़ें। उपकरणों को पानी या मीडिया से भरा जा सकता है।
    7. एफएफआई डिवाइस के लिए प्रत्येक इनलेट (60 μL कुल) में BFI डिवाइस (बैक्टीरियल इनलेट और पार्श्व उद्घाटन) या मीडिया के 30 μL के लिए वांछित समाधान के 100 μL पाइपिंग द्वारा संबंध के तुरंत बाद उपकरणों को भरें। यदि हवा के बुलबुले मौजूद हैं, तो ये भरने के लगभग 10 मिनट बाद नष्ट हो जाएंगे क्योंकि पीडीएमएस छिद्रपूर्ण है।
    8. आर्द्रता बनाए रखने के लिए पेट्री डिश में बाँझ डीडीएच2ओ (~ 100-200 μL) जोड़ें।

3. माइक्रोबियल संस्कृति

नोट: निम्नलिखित चरण कवक और जीवाणु संस्कृति के लिए एक सामान्य सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रक्रिया प्रदान करते हैं और वांछित रोगाणुओं के लिए आवश्यक रोकथाम के स्तर के लिए उपयुक्त बाँझ परिस्थितियों (यानी, लौ या सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करके) के तहत किया जाना चाहिए। ब्याज की एक प्रजाति के लिए प्रत्येक खंड के अंत में विशिष्ट उदाहरण दिए गए हैं।

  1. कवक संस्कृति
    1. अगर के साथ पूरक वांछित संस्कृति माध्यम तैयार करें। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम आटोक्लेव। मध्यम को 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें और बाँझ परिस्थितियों को बनाए रखते हुए 9 सेमी व्यास पेट्री व्यंजनों में डालें।
    2. पृथक को सक्रिय करने के लिए वांछित कवक तनाव के फ्रिज स्टॉक कॉलोनी से माइसेलियम युक्त अगर के 4 मिमी व्यास प्लग को हटाने के लिए कॉर्क बोरर का उपयोग करें। यह डिवाइस टीकाकरण से पहले कवक के मानकीकृत और जोरदार विकास को सुनिश्चित करने के लिए आयोजित किया जाता है।
      नोट: रोगाणुओं को ग्लिसरॉल स्टॉक से भी सक्रिय किया जा सकता है, अर्थात, -70 डिग्री सेल्सियस41 पर 50% ग्लिसरॉल समाधान में अगर प्लग पर संग्रहीत फंगल आइसोलेट्स।
    3. यूनिनोकुलेटेड पेट्री डिश के केंद्र में अगर सतह के संपर्क में मायसेलियम के साथ प्लग के किनारे रखें। पेट्री डिश के शीर्ष पर ढक्कन को बदलें और आवश्यक समय के लिए वांछित तनाव के लिए उचित तापमान पर इनक्यूबेट करने से पहले सील करें, आमतौर पर, लगभग 3 से 4 दिन।
      नोट: ट्राइकोडर्मा रॉसिकम के लिए उदाहरण संस्कृति की स्थिति: माल्ट निकालने अगर, 48 घंटे के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया।
  2. जीवाणु संस्कृति
    1. स्रोत स्टॉक (जैसे, ग्लिसरॉल स्टॉक या अगर प्लेट से एकल कॉलोनी) से वांछित जीवाणु पृथक को एक अगर प्लेट पर लकीर करें ताकि एकल जीवाणु कॉलोनियों को प्राप्त किया जा सके और कोई संदूषण सुनिश्चित न हो सके45. फिल्म के साथ प्लेट सील करें।
    2. व्यक्तिगत उपनिवेशों को देखे जाने तक ब्याज के अलगाव के लिए विशिष्ट तापमान और अवधि पर सेते हैं।
    3. वांछित संस्कृति शोरबा तैयार करें। उदाहरण के लिए, बी सबटिलिस की संस्कृति के लिए एलबी माध्यम तैयार करने के लिए डीडीएच2ओ के प्रति 1 एल ट्रिप्टोन के 10 ग्राम, एनएसीएल के 10 ग्राम और खमीर निकालने के 5 ग्राम जोड़ें। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम आटोक्लेव।
    4. माध्यम को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। एक बाँझ वातावरण के अंदर एक बाँझ संस्कृति फ्लास्क के लिए माध्यम जोड़ें।
    5. एक बाँझ टीकाकरण पाश का उपयोग कर अगर प्लेट से एक एकल जीवाणु कॉलोनी स्पर्श करें। लूप के साथ तरल को संक्षेप में छूकर बाँझ संस्कृति माध्यम में टीका लूप को स्थानांतरित करें।
    6. एक बाँझ ढक्कन या पन्नी का उपयोग कर फ्लास्क सील करें, और चयनित प्रजातियों के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का उपयोग करके रात भर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर के अंदर रखें।
      सबटिलिस के लिए उदाहरण संस्कृति की स्थिति: i) तरल संस्कृति - एलबी माध्यम में 200 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एरोबिक वृद्धि और ii) प्लेट संस्कृति - एलबी अगर प्लेट पर कमरे का तापमान। विभिन्न कवक उपभेदों की खेती के अधिक विवरण के लिए एफएफआई / बीएफआई पेपर 40,41 देखें।

4. डिवाइस टीकाकरण

नोट: निम्नलिखित कदम बाँझ उपकरण का उपयोग कर एक लामिना प्रवाह हुड के अंदर जगह लेनी चाहिए।

  1. फंगल टीकाकरण
    1. 3-दिवसीय संस्कृति (चरण 3.1) की परिधि पर कॉलोनी से एक अगर प्लग को हटाने के लिए एक निष्फल कॉर्क बोरर (ø = 4 मिमी) का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि बढ़ता हाइफल फ्रंट बरकरार रहे।
    2. चैनलों के हाइफल घुसपैठ को प्रोत्साहित करने के लिए माइक्रोचैनल उद्घाटन की ओर उन्मुख हाइफल फ्रंट की वृद्धि दिशा के साथ फंगल इनलेट, मायसेलियम साइड डाउन में प्लग का परिचय दें।
    3. दूसरी कवक प्रजातियों (यदि एफएफआई डिवाइस का उपयोग कर रहे हैं) के लिए चरण 4.1.1-4.1.2 दोहराएं, प्लग को विपरीत इनलेट में पेश करें। यदि BFI डिवाइस का उपयोग कर रहे हैं, तो इस चरण को छोड़ दें और चरण 4.1.4 के लिए जारी रखें।
    4. पारदर्शी फिल्म के साथ पेट्री डिश सील करें और इमेजिंग शुरू होने तक अंधेरे में 25-28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्री-इमेजिंग इनक्यूबेशन समय का निर्धारण किया जाना है, जो कि देखे जाने वाले इच्छित जैविक घटना पर निर्भर करता है, उदाहरण के लिए, फंगल-फंगल टकराव, और डिवाइस के भीतर शामिल प्रजातियों की वृद्धि दर।
  2. जीवाणु टीकाकरण
    1. चरण 3.2.3 में विस्तृत के रूप में एक ही संस्कृति माध्यम का उपयोग कर एक 1:25 अनुपात में एक रात ोंरात संस्कृति (चरण 3.2) से बैक्टीरिया पतला। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए संस्कृति।
    2. 10 मिनट के लिए 2000 एक्स जी पर एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करके संस्कृति को गोली मारकर बैक्टीरिया को धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.9% डब्ल्यू / वी सोडियम क्लोराइड समाधान की वांछित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. एक गोली प्राप्त करने के लिए फिर से अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तरल माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (उदाहरण के लिए, सी सिनेरिया न्यूनतम माध्यम 1 के ओडी600 के लिए)। प्रश्न में जीवाणु तनाव के लिएआयुध डिपो 600 मूल्य का अनुकूलन करें।
    4. इनक्यूबेटर से बीएफआई डिवाइस निकालें और इसे बाँझ वातावरण में खोलें। विंदुक बैक्टीरिया इनलेट में निलंबन के 10 μL.
      नोट: प्रश्न में बैक्टीरिया-फंगल इंटरैक्शन के लिए सटीक टीकाकरण समय का अनुकूलन करें। उदाहरण के लिए, बीएफआई डिवाइस में बैक्टीरिया को 18 घंटे पोस्ट-फंगल टीकाकरण में पेश करें यदि सी।
    5. एक पारदर्शी फिल्म के साथ पेट्री डिश सील करें और इमेजिंग शुरू होने तक अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। डिवाइस को सीधा स्टोर करें।

5. माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण

  1. माइक्रोस्कोपी
    नोट: शोधकर्ता को आयोजित किए जाने वाले प्रयोग की प्रकृति के साथ इमेजिंग की उपयुक्त विधि का चयन करना चाहिए, उदाहरण के लिए, एक उल्टा वाइड-फील्ड एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी। यहां एक सामान्य अवलोकन प्रदान किया गया है, क्योंकि विशिष्ट विवरण चुने हुए माइक्रोस्कोपी सेट की विशेषताओं पर निर्भर करेगा।
    1. माइक्रोस्कोप कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप मुख्य शरीर (यदि लागू हो), कैमरा, तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर और प्रकाश स्रोत (ओं) को चालू करें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप सही ढंग से स्थापित किया गया है, उदाहरण के लिए, कोहलर रोशनी को नमूने की रोशनी के लिए भी सही ढंग से लागू किया गया है। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर पैकेज प्रारंभ करें।
      नोट: तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर का उपयोग करते समय, प्रयोग शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप तापमान को कई घंटों तक संतुलित करने की अनुमति देना महत्वपूर्ण है।
    2. चरण डालने में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस माउंट करें। सुनिश्चित करें कि डिवाइस अच्छी तरह से सुरक्षित है, यानी, टेप के साथ, सक्रिय चरण आंदोलन के दौरान डिवाइस को हटाने से रोकने के लिए।
    3. टीका लगाए गए उपकरणों की छवियों को प्राप्त करें, उदाहरण के लिए, या तो एकल-बिंदु या समय-चूक प्रयोग। बीएफआई और एफएफआई उपकरणों के साथ किए गए प्रयोगों के लिए प्रासंगिक व्यापक इमेजिंग विनिर्देश संबंधित उपरोक्त प्रकाशनों40,41 में प्रदान किए जाते हैं।
      नोट: ब्राइटफील्ड छवियों को ऑटोफोकस सॉफ़्टवेयर और या तो 10x आवर्धन, 0.30 एनए (संख्यात्मक एपर्चर) या 20x आवर्धन, 0.45 एनए उद्देश्य लेंस का उपयोग करके विकास चैनलों के माध्यम से हाइफल प्रसार की कल्पना करने के लिए चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन की उत्तेजना फ्लोरोफोर के लिए विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ एक उच्च शक्ति प्रकाश उत्सर्जक डायोड प्रकाश इंजन का उपयोग करके प्राप्त की गई थी।
    4. बाद की छवि प्रसंस्करण के लिए एक उपयुक्त प्रारूप में छवियों को निर्यात करें। उदाहरण के लिए, .tiff।
  2. छवि विश्लेषण
    नोट: लेखक फिजी की सलाह देते हैं46 छवि विश्लेषण के लिए एक उपकरण के रूप में, लेकिन अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेज उपलब्ध हैं। प्रस्तुत बीएफआई और एफएफआई डिवाइस प्रकाशनों से फिजी का उपयोग करके किए गए छवि विश्लेषण के उदाहरण निम्नलिखित हैं। ये चरण मैक के लिए विशिष्ट हैं और पीसी का उपयोग करते समय थोड़ा भिन्न हो सकते हैं।
    1. हाइफ़ल विकास दर माप
      नोट: इस विधि का उपयोग व्यक्तिगत हाइप की वृद्धि दर को मापने के लिए बीएफआई पांडुलिपि40 में किया गया था।
      1. डाउनलोड करें, स्थापित करें, और फ़िजी लॉन्च करें। फ़ाइल > आयात > छवि अनुक्रम का चयन करके एक समय चूक प्रयोग से छवि अनुक्रम आयात करें। उस फ़ोल्डर की स्थिति जानें जहाँ डेटा संग्रहीत है और खोलें का चयन करें। अनुक्रम विकल्प विंडो में, प्राथमिकताएँका चयन करें, और उसके बाद ठीक है।
      2. मुख्य उपकरण पट्टी से सीधी रेखा आइकन का चयन करें। क्लिक करके और फिर खिड़की के भीतर किसी अन्य बिंदु पर कर्सर को खींचकर बढ़ती हाइफल टिप की नोक पर सीधी रेखा की शुरुआत रखें। लाइन की शुरुआत, मध्य बिंदु और अंत को इंगित करने वाले तीन बक्से के साथ एक पीली रेखा दिखाई देगी।
      3. सीटीआरएल और > दबाकर और दबाकर छवि अनुक्रम में अगले फ्रेम पर जाएं। वर्ग बॉक्स को सही स्थिति में चुनकर और खींचकर बढ़ती हाइफा की नोक पर सीधी रेखा के अंत को रखें।
      4. पिक्सेल में लाइन की लंबाई मापने के लिए सीटीआरएल और एम दबाए रखें। मापा डेटा के साथ एक परिणाम विंडो दिखाई देगी। परिणाम विंडो में प्रदर्शित डेटा निम्नानुसार परिभाषित करें: परिणाम विंडो पर क्लिक करें, और तब माप सेट करें > परिणाम का चयन करें।
      5. सीटीआरएल को दबाकर और दबाकर छवि अनुक्रम में अगले फ्रेम पर जाएं और फिर >। वर्ग बॉक्स को सही स्थिति में चुनकर और खींचकर बढ़ती हाइफा की नोक पर सीधी रेखा की शुरुआत रखें।
      6. पिक्सेल में लाइन की लंबाई को मापने के लिए सीटीआरएल और फिर एम दबाए रखें। मापा डेटा के साथ एक परिणाम विंडो दिखाई देगी।
      7. पिक्सेल में हाइफा की वृद्धि को मापने के समाप्त होने तक चरण 5.2.1.5-5.2.1.6 दोहराएं।
      8. परिणाम विंडो में सभी डेटा का चयन करें। डेटा को संसाधित करने के लिए किसी अन्य सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में कॉपी और पेस्ट करें, उदाहरण के लिए, एक स्प्रेडशीट। समय के एक समारोह के रूप में हाइफल वृद्धि (पिक्सेल या माइक्रोमीटर में) प्लॉट करें और औसत वृद्धि दर की गणना करें। प्रति प्रयोग कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियां करें।
    2. प्रतिदीप्ति तीव्रता माप
      नोट: इस विधि का उपयोग एफएफआई प्रकाशन41 में समय के एक समारोह के रूप में क्लोनोस्टैचिस रोसिया 016 के संपर्क में आने पर फ्यूजेरियम ग्रामिनियरम 8/1-डब्ल्यूटी-जीएफपी के हाइपहे में प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए किया गया था।
      1. डाउनलोड करें, स्थापित करें, और फ़िजी लॉन्च करें। फ़ाइल > आयात > छवि अनुक्रम का चयन करके एक समय चूक प्रयोग से छवि अनुक्रम आयात करें। उस फ़ोल्डर की स्थिति जानें जहाँ डेटा संग्रहीत है और खोलें का चयन करें। अनुक्रम विकल्प विंडो में प्राथमिकताएँ और फिर ठीक का चयन करें।
      2. मुख्य टूल बार में स्थित आयताकार उपकरण का उपयोग करके हाइफा की पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए ब्याज का एक क्षेत्र (आरओआई) निर्दिष्ट करें। वर्ग का आकार ठीक निम्नानुसार परिभाषित किया जा सकता है: चयन > संपादित करें > निर्दिष्ट करें; आरओआई को संपादित करें > चयन > प्रबंधक में जोड़ें का चयन करके आरओआई प्रबंधक में भविष्य के संदर्भ के लिए भी सहेजा जा सकता है।
      3. पूरे छवि अनुक्रम या स्टैक में प्रत्येक छवि के लिए परिभाषित आरओआई के भीतर निरपेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता (मतलब ग्रे मान) को निम्नानुसार मापें: छवि > स्टैक > माप स्टैक। स्टैक में सभी छवियों को संसाधित करने के बाद परिणाम विंडो स्वचालित रूप से खुल जाएगी।
        नोट:: परिणाम विंडो में प्रदर्शित डेटा निम्नानुसार परिभाषित किया जा सकता है: परिणाम विंडो पर क्लिक करें और फिर माप सेट > परिणाम का चयन करें। सुनिश्चित करें कि मीन ग्रे मान चयनित किया गया है।
      4. परिणाम विंडो में सभी डेटा का चयन करें। कॉपी और एक अन्य सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में पेस्ट करें, उदाहरण के लिए, एक स्प्रेडशीट, समय के एक समारोह के रूप में निर्दिष्ट आरओआई की पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्लॉट करने के लिए।
      5. प्रत्येक आरओआई के लिए पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता माप एकत्र करने के लिए चरण 5.2.2.2-5.2.2.4 दोहराएं, अर्थात्, ब्याज के हाइफा पर, ब्याज के हाइफा के बगल में या संबंधित नियंत्रण चैनल के भीतर।
      6. मनमानी इकाइयों (एयू) में उपयुक्त सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें, उदाहरण के लिए, आरओआई [नियंत्रण चैनल] की पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता से आरओआई [ब्याज का हाइफा] की पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता को विभाजित करके। अधिक विशिष्ट विवरण के लिए एफएफआई प्रकाशन41 से परामर्श करें।
      7. प्रति प्रयोग कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियां करें और समय के एक समारोह के रूप में सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश करें।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम अनुकरणीय बीएफआई40 और एफएफआई41 उपकरणों से प्रस्तुत किए जाते हैं। बुनियादी माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ संयोजन में इन उपकरणों का उपयोग करके हाइफल विकास दर माप आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। चित्रा 3 ए-बी सी सिनेरिया हाइपहे और बी सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के बीच बैक्टीरिया-फंगल इंटरैक्शन को दर्शाता है। बी सबटिलिस की उपस्थिति सीए के बाद सी सिनेरिया के विकास को रोकती है 5 घंटे पोस्ट सह-टीकाकरण (चित्रा 3 बी)। तीर पतले और अधिक पारदर्शी हाइपहे (चित्रा 3 ए) के समवर्ती रूपात्मक अवलोकन को इंगित करते हैं। यह भी ध्यान दिया गया कि अप्रभावित हाइफल कोशिकाओं का प्रसार जारी रहा। चित्रा 3 सी-डी हाइफल इंटरैक्शन के बाद टी रॉसिकम एनईयू 135 पर एफ ग्रामिनियरम पीएच 1-डीएसआरईडी के मजबूत निरोधात्मक प्रभाव को दर्शाता है, जिसके परिणामस्वरूप टी रॉसिकम हाइफल वृद्धि की पूरी गिरफ्तारी होती है।

Figure 3
चित्रा 3: बीएफआई और एफएफआई उपकरणों से विकास दर परिमाणीकरण और अवलोकन के उदाहरण( ए) सह-टीकाकरण के बाद समय बिंदुओं पर बीएफआई डिवाइस के माइक्रोचैनलों में कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया और बेसिलस सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के बीच बातचीत की ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी छवियां। तीर एक पतली हाइफल आकृति विज्ञान को उजागर करते हैं, जो बी सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के साथ बातचीत के बाद हुआ था। स्केल बार = 25 μm. (B) अग्रणी हाइफ़ल युक्तियों की हाइफ़ल वृद्धि दर 10 घंटे बाद सह-टीकाकरण से अधिक मापा जाता है। बार्स तीन जैविक प्रतिकृतियों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) बॉक्सप्लॉट (एन = 6) फुसेरियम ग्रामिनियरम पीएच 1-डीएसरेड बनाम ट्राइकोडर्मा रॉसिकम की सापेक्ष वृद्धि दर प्रदर्शित करता है। महत्व को ** द्वारा दर्शाया गया है और पी < 0.01 का प्रतिनिधित्व करता है, जिसकी गणना मान-विटनी यू परीक्षण का उपयोग करके की जाती है। बार्स क्रमशः ऊपरी और निचले प्रतिशत के बराबर सबसे बड़े या सबसे छोटे अवलोकन का प्रतिनिधित्व करते हैं (± 1.5 एक्स इंटरक्वार्टाइल रेंज)। (डी) एफ ग्रैमिनियरम पीएच 1-डीएसआरईडी (बाएं से दाएं बढ़ रहा है) बनाम टी रॉसिकम एनईयू 135 (दाएं से बाएं बढ़ रहा है) 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे के बाद सह-टीकाकरण पर। ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति चैनल मढ़ा हुआ। स्केल बार = 200 μm। इस आंकड़े में पैनलों को स्टेनली एट अल, 2014 (ए-बी) 40 और गिमेनो एट अल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इंटरैक्शन घटनाओं से प्रेरित रूपात्मक परिवर्तन इस पत्र में उल्लिखित पद्धतियों का उपयोग करके सेलुलर स्तर पर देखे जा सकते हैं। चित्रा 4 प्रस्तुत बीएफआई और एफएफआई उपकरणों के लिए रूपात्मक टिप्पणियों के उदाहरण देता है। चित्रा 4 ए अकेले नियंत्रण कवक (वी 1) 47 की तुलना में बैक्टीरिया स्यूडोमोनास सिंक्सैंथा (P_phen) या पी फ्लोरेसेंस (P_rhizo) का सामना करते समय वर्टिसिलियम लॉन्गिस्पोरम हाइफल वृद्धि की ध्रुवीयता के नुकसान को दर्शाता है। फंगल-बैक्टीरियल इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप हाइपहे की घुंघराले उपस्थिति हुई। यह कवक और पुटेटिव परिहार व्यवहार में महत्वपूर्ण बैक्टीरिया से प्रेरित ट्रांसक्रिप्टोमिक परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। ये परिणाम महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वी लॉन्गिस्पोरम एक पौधे रोगज़नक़ है, जिसका अर्थ है स्यूडोमोनास एसपी। इस उदाहरण में बायोकंट्रोल के रूप में उपयोग किए जाने की क्षमताहै 47.

चित्रा 4 बी एक समय चूक प्रयोग जिसमें हाइफल सेलुलर सामग्री के गतिशील नुकसान को देखा जा सकता है, जिससे ब्लेब्स बनते हैं जो लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन डीटीमैटो को बनाए रखते हैं। यह ब्लेबिंग आकृति विज्ञान बी सबटिलिस के साथ सह-टीकाकरण के बाद हुआ, लेकिन केवल कुछ एपिकल कोशिकाओं में देखा गया था। हालांकि, हाइप का पतन और बाद में ब्लेबिंग घटना बैक्टीरिया लगाव के साथ सहसंबद्ध नहीं थी। इसने सुझाव दिया कि संभावित कवकनाशी जीवाणु गतिविधि हो रही थी जो लगाव-निर्भर नहीं थी, लिपोपेप्टाइड्स के स्राव के कारण होने की परिकल्पना की गई थी। उच्च-रिज़ॉल्यूशन गतिशील इमेजिंग तकनीकों ने एफ ग्रामिनियरम के एक पुटेटिव रक्षा तंत्र का भी खुलासा किया है, जो सी रोसिया द्वारा विरोधी होने पर सेप्टा गठन में वृद्धि का प्रदर्शन करता है, जैसा कि चित्रा 4 सी में तीरों द्वारा इंगित किया गया है।

Figure 4
चित्रा 4: बीएफआई और एफएफआई उपकरणों में बातचीत की घटनाओं के दौरान देखे गए आकृति विज्ञान में परिवर्तन के उदाहरण( ए) पौधे रोगजनक कवक वर्टिसिलियम लॉन्गिस्पोरम (वी 1) में कर्लिंग रूपात्मक परिवर्तन हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) 48 के साथ टैग किए गए। यह आकृति विज्ञान फ्लोरोसेंट स्यूडोमोनास एसपीपी के जवाब में हुआ। फेनाज़िन संश्लेषण के लिए जीन एन्कोडिंग के साथ (P_phen; पी. सिंक्सैंथा) और रेपसीड के राइजोस्फीयर से पृथक एक बैक्टीरिया (P_rhizo; पी फ्लोरेसेंस)। स्केल बार = 20 μm. (बी) डीटोमैटो-एक्सप्रेसिंग कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया40 बैसिलस सबटिलिस के साथ सह-टीका लगाया गया 5 घंटे बाद सह-टीकाकरण। कोशिकाएं 5 घंटे में बरकरार (बाएं) थीं, लेकिन 30 मिनट बाद एक हाइफा ढह गया (प्रतिदीप्ति का नुकसान) और (फ्लोरोसेंट) सेलुलर सामग्री युक्त ब्लेब्स देखे गए। स्केल बार = 25 μm. (सी) तीर फ्यूजेरियम ग्रामिनियरम हाइपहे में सेप्टा गठन को उजागर करते हैं जो क्लोनोस्टैचिस रोजिया हाइपहे के साथ बातचीत के बाद मनाया जाता है। स्केल बार = 10 μm, समय टिकट = एच पोस्ट सह-टीकाकरण। इस आंकड़े में पैनलों को हार्टिंग एट अल, 2021 (ए) 47, स्टेनली एट अल, 2014 (बी) 40 और गिमेनो एट अल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रस्तुत उपकरण गतिशील शारीरिक परिवर्तनों को देखने के लिए भी उपयुक्त हैं। बीएफआई डिवाइस का उपयोग करते हुए, यह दिखाया गया था कि हाइप-जुड़े बैक्टीरिया की एकाग्रता समय के साथ बदल गई और कोशिकाओं के स्थानीय संचय (चित्रा 5 ए) के बाद कम हो गई। माइक्रोचैनलों के साथ बैक्टीरियल मोबिलाइजेशन भी क्लस्टर जैसे संयोजनों में देखा गया था। एफएफआई डिवाइस में, प्रतिदीप्ति लेबलिंग ने विरोधी बातचीत (चित्रा 5 बी) की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए एफ ग्रामिनियरम के साथ सामना करते समय सी रोजिया हाइफल प्रसार की मात्रा का ठहराव की अनुमति दी। इन मापों को 20 घंटे की अवधि में लिया गया था और दीर्घकालिक समय-चूक प्रयोगों के संचालन के लिए इन उपकरणों की क्षमता का प्रदर्शन किया गया था।

Figure 5
चित्रा 5: बीएफआई और एफएफआई उपकरणों दोनों के लिए अनुकरणीय गतिशील शारीरिक लक्षण वर्णन माप( ए) बीएफआई डिवाइस में समय चूक प्रयोग बेसिलस सबटिलिस एनसीआईबी 3610 पीएमएफ 37 40 द्वारा लगाव को दर्शाता है कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया पीएमए 412 40 3 घंटे से अधिक। (बी) ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति चैनल छवियां फ्लोरोसेंटली टैग किए गए क्लोनोस्टैचिस रोजिया और फ्यूजेरियम ग्रामिनियरम49 के बीच बातचीत के दौरान एफएफआई डिवाइस का उपयोग करके पता लगाए गए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की मात्रा का ठहराव दिखाती हैं। स्केल बार = 50 μm। ग्राफ (दाएं) भूखंडों 20 घंटे से अधिक मनमानी इकाइयों (एयू) में सापेक्ष प्रतिदीप्ति, एन = 6 और त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का संकेत मिलता है। ऑरेंज और ग्रे प्लॉट क्रमशः सी रोजिया युक्त नियंत्रण चैनल की तुलना में (i) जीएफपी और (ii) सी रोजिया युक्त नियंत्रण चैनल की तुलना में इंटरैक्शन चैनल की प्रतिदीप्ति तीव्रता का वर्णन करते हैं। ब्लैक कंट्रोल प्लॉट नियंत्रण चैनल की तुलना में सी रोजिया नियंत्रण चैनल में हाइप की प्रतिदीप्ति तीव्रता को दर्शाता है। इस आंकड़े में पैनलों को स्टेनली एट अल, 2014 (ए) 40 और गिमेनो एट अल, 2021 (बी) 41 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह लेख चैनल माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। लेखकों का उद्देश्य इन उपकरणों की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करना और शोधकर्ता के हितों के अनुरूप अनुकूलन को प्रोत्साहित करना है। अनुकरणीय बीएफआई और एफएफआई उपकरणों का उपयोग करके, फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन का पहले से सुलभ की तुलना में अधिक विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है। मिट्टी की पृष्ठभूमि जटिलता और विषमता को हटाकर, हाइपहे के विकास को कम करके जैसे कि वे एक एकल मोनोलेयर तक ही सीमित हैं, और पर्यावरणीय मापदंडों को कसकर विनियमित करते हैं, समय के साथ इन जैविक घटनाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करना संभव है। इन उपकरणों का उपयोग करते हुए, माइक्रोबियल भागीदारों के बीच बातचीत को विकास दर, प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव और रूपात्मक लक्षणों के अवलोकन बायोइमेजिंग का उपयोग करके विशेषता दी गई है।

उपकरणों को सेलुलर स्तर पर फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन के लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। गैर-विशेषज्ञों के लिए बहुमुखी प्रतिभा और डिजाइन में आसानी इस प्रोटोकॉल को अनुसंधान प्रश्नों की एक विस्तृत चौड़ाई के अनुकूलन के लिए उपयुक्त बनाती है। बीएफआई और एफएफआई उपकरण अपनी पारदर्शी प्रकृति और कांच से बंधी सतह के कारण प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुरूप विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त हैं। उपकरणों को उनके कॉन्फ़िगरेशन और भौतिक-रासायनिक मापदंडों दोनों के संबंध में सिलवाया जा सकता है; उदाहरण के लिए, आर्द्रता, तापमान, या चैनल संतृप्ति परीक्षण विषय के लिए पर्यावरणीय अनुभव को बदल सकती है। फिर, डिवाइस को इस तरह से डिज़ाइन किया जा सकता है कि यह शारीरिक रूप से विकास को निर्देशित कर सकता है या किसी विशेष व्यवहार को प्राप्त कर सकता है, जैसे कि इंटरैक्शन इवेंट या नेविगेशन रणनीतियों, चैनल संरचना और आकार या बाधाओं को शामिल करके नियंत्रित किया जाता है। यह वर्तमान पद्धतियों के साथ संभव नहीं है, जैसे कि अगर-प्लेट परख31।

अब तक, फंगल-फेज 50 और फंगल-नेमाटोड35 इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिकउपकरणों को भी नियोजित किया गया है। चैनल माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग डिवाइस के भीतर तरल पदार्थों के नियंत्रण और आदान-प्रदान की भी अनुमति देता है। यह महत्वपूर्ण और लाभप्रद विशेषता मायसेलियल फेज-प्रतिधारण50 के अध्ययन में सहायक थी। इसके अतिरिक्त, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स अध्ययनों के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों के उपयोग से एक समान अगर-आधारित परख की तुलना में अलग-अलग व्यक्त जीन का अधिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त हुआ। विधियां एक ही अगर प्लेट प्रयोग द्वारा पहचाने गए 28 अलग-अलग व्यक्त जीनों में से 24 में समवर्ती थीं, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों ने कई और जीनों की पहचान की और35 की तुलना में एक उच्च सापेक्ष अभिव्यक्ति की रिपोर्ट की।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण मूल डिवाइस डिज़ाइन से शुरू होते हैं। एक उपयुक्त डिजाइन प्राप्त करने के लिए, ब्याज के रोगाणुओं की जीवन शैली और विकास / गतिशीलता रणनीति पर ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, शारीरिक आवश्यकताओं और ब्याज के सूक्ष्मजीव की वृद्धि की गति को समायोजित करने के लिए पर्याप्त चैनल गहराई या लंबाई सहित। माइक्रोचैनलों की संरचनात्मक विशेषताओं और घटकों को विशिष्ट व्यवहारों को प्रेरित करने या हेरफेर करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, जैसे कि नेविगेशनल रणनीतियों का पालन करने के लिए इंटरैक्शन ज़ोन या बाधाओं के लिए उद्घाटन। इसके अलावा, प्रायोगिक अनुसंधान प्रश्न को डिवाइस डिज़ाइन के साथ संबोधित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, विचार करें: (i) लामिना के प्रवाह प्रोफाइल का शोषण कैसे किया जा सकता है, (ii) जीव की जांच के लिए माइक्रोचैनल ऊंचाइयों को अनुकूलित करना और बदलना, और (iii) डिवाइस के भीतर हाइप के अति-प्रसार को रोकने के लिए माइक्रोचैनल प्रवेश द्वारों को संकुचित करना। लेखकमाइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिजाइन51,52,53 के लिए इन आगे के संसाधनों का सुझाव देते हैं। निर्माण के दौरान उपकरणों को धूल से मुक्त रखना भी आवश्यक है। इसलिए, निर्माण प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान धूल मुक्त वातावरण बनाए रखने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, साथ ही टेप और फ़िल्टर की गई संपीड़ित हवा का उपयोग करके, और उपयोग में नहीं होने पर पीडीएमएस सतहों को कवर रखना चाहिए। प्रोटोकॉल के अन्य महत्वपूर्ण चरणों में 70% इथेनॉल समाधान में उपकरणों को धोकर संदूषण के जोखिम को कम करना, और कांच की सतह और पीडीएमएस स्लैब के बीच पर्याप्त संबंध सुनिश्चित करना, धीरे-धीरे सक्रिय सतहों को एक दूसरे के संपर्क में रखकर और माइक्रोचैनलों पर बहुत अधिक दबाव लागू नहीं करना शामिल है। टीकाकरण से पहले कांच से पीडीएमएस स्लैब को विस्थापित करने का प्रयास करके संतोषजनक आसंजन की जांच करें। इन उपकरणों की एक सीमा यह है कि प्रयोगों के बीच उनका पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता है।

बेस्पोक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मिट्टी के रोगाणुओं को शामिल करने से माइक्रोबियल इंटरैक्शन में अनुसंधान के लिए एक रोमांचक नया युग शुरू होता है। प्रस्तुत पद्धति के संभावित भविष्य के अनुप्रयोग व्यापक हैं, जैसे कि उपन्यास बायोकंट्रोल प्रजातियों या एंटी-माइक्रोबियल यौगिकों की खोज, या जीवाणु जुटाने के लिए तथाकथित कवक राजमार्ग का लक्षण वर्णन। बीएफआई और एफएफआई डिवाइस सेलुलर स्तर पर पूर्व और बाद में होने वाले गतिशील रूपात्मक और शारीरिक परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। नए उपकरण डिजाइन और बनाने के लिए सरल हैं, बस प्रयोगात्मक अनुसंधान प्रश्न के अनुरूप सरलता की आवश्यकता होती है। उनकी बहुमुखी प्रतिभा और उपयोग में आसानी का मतलब है कि इस पद्धति का उपयोग गैर-विशेषज्ञों द्वारा सेलुलर स्तर पर मिट्टी माइक्रोबायोम अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम इंपीरियल कॉलेज लंदन और लीवरहुल्मे ट्रस्ट (रिसर्च ग्रांट रेफरेंस: आरपीजी -2020-352) में बायोइंजीनियरिंग विभाग से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Difco Laboratories 214010 Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil Fisher Scientific Ltd 11759408
AutoCAD 2021 Autodesk, USA
Autoclave (VX-75) Systec
Centrifuge (5810R) Eppendorf
Chlorotrimethysilane Merck Life Sciences 386529 CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer SLS COR1000
Developer solution (mr-Dev 600) Microresist Technologies CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks VWR 214-1108 e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)  Fisher Scientific Ltd E/0650DF/15 Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji ImageJ Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers SLS INS5026
Forceps Fisher Scientific Ltd 10008051 Bent, sharp
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD35-100 35 mm
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD5040-100 50 mm
Glass crystallisation dishes VWR 216-1865 Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes VWR 216-1866 Used in the development of master moulds
Glass media bottles Fisher Scientific Ltd 15456113 e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton) Fisher Scientific Ltd 10625251 Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM) SAWATEC
Inoculation loop VWR COPA175CS01
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
Laminar flow hood Air Science (PCR) Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium Fisher Scientific Ltd BP9723-500 Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB) Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner Suss Microtec
Malt extract VWR 84618 Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer Applied Materials 4700DP Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount 3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2) Contained Air Solutions Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water Available as standard in biology labs. 
NaOH Fisher Scientific Ltd BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software Nikon Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer Nikon Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115) Fisher Scientific Ltd 15602126 Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S) KOYO Used for preparing silicon wafers
Parafilm Bemis HS234526B transparent film
Petri dishes, square sterile Fisher Scientific Ltd 11708573 120.5 mm
Petri dishes, sterile Fisher Scientific Ltd 15370366 90 mm 
Photolithography mask Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto) Diener Electronic 100012601
Plastic cup Semadeni 8323
Plastic spatula Semadeni 3340
Portable precision balance (OHAUS Scout) Fisher Scientific Ltd 15519631 Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter Syneo HS1251135P1183 Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter  Syneo HS1871730P1183S Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer  Bruker Dektak XT-stylus
Razor blades Häberle Labortechnik 9156110
Refridgerator Haden 4-6 °C
Retiga R1 CCD camera Qimaging Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape Office Depot 3969954 19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) Fisher Scientific Ltd 10257954
Silicon wafer Inseto 100 mm
Soda lime glass plate Inseto 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Spincoater  SAWATEC SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist MicroChem CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. 
Sylgard 184 elastomer kit VWR 634165S Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator Okolab Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope Nikon MEA54000 Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line Fisher Scientific Ltd FB15050
Vacuum desiccator Fisher Scientific Ltd 10528861 Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH20105 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH48230 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions

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बायोइंजीनियरिंग अंक 184
सेलुलर स्तर पर फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन की जांच के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण
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Masters-Clark, E., Clark, A. J.,… More

Masters-Clark, E., Clark, A. J., Stanley, C. E. Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level. J. Vis. Exp. (184), e63917, doi:10.3791/63917 (2022).

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