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Bioengineering

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63917
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Imperial College London

Summary

A causa dell'opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.

Abstract

I funghi filamentosi sono abitanti di successo del suolo e svolgono un ruolo importante negli ecosistemi del suolo, come nella decomposizione della materia organica e inorganica, nonché nella regolazione dei livelli di nutrienti. Lì trovano anche numerose opportunità di interagire con una varietà di altri microbi come batteri o altri funghi. Studiare le interazioni fungine a livello cellulare, tuttavia, può essere difficile a causa della natura del suolo simile a una scatola nera. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti microfluidici per lo studio delle interazioni fungine; sono evidenziate due piattaforme progettate per studiare le interazioni batterico-fungine e fungino-fungine. All'interno di questi microcanali, le interazioni fungo-microbiche possono essere monitorate in ambienti fisico-chimici controllati a una risoluzione temporale e spaziale più elevata di quanto fosse possibile in precedenza. L'applicazione di questi strumenti ha prodotto numerose nuove intuizioni biologiche, come l'osservazione dell'attaccamento polare batterico alle ife o la rivelazione di antagonismi fungino-fungini non caratterizzati. Una caratteristica fondamentale di queste metodologie riguarda la facilità d'uso di questo strumento da parte di non esperti, producendo tecnologie altamente traducibili per l'uso nei laboratori di microbiologia.

Introduction

Il suolo è un ambiente eccezionalmente diversificato contenente un'abbondanza di microrganismi che sono strumentali ai cicli del carbonio e del fosforo 1,2. I funghi filamentosi sono una componente importante di numerosi ecosistemi come decompositori di materia organica e inorganica e possono migliorare la nutrizione delle piante attraverso la formazione di relazioni simbiotiche 3,4. All'interno del suolo, i funghi interagiscono dinamicamente con una moltitudine di microbi come altri funghi5, batteri6, virus7 e nematodi8. Queste interazioni hanno conseguenze significative per la salute del suolo e delle piante. Tuttavia, a causa della mancanza di sistemi sperimentali appropriati in grado di eseguire l'imaging di microrganismi interagenti ad alta risoluzione, molti rimangono indefiniti.

Le indagini riguardanti le interazioni batterico-fungine (BFI) e le interazioni fungo-fungine (FFI) hanno preziose applicazioni in una vasta gamma di campi, tra cui gli antimicrobici in medicina e gli agenti di controllo biologico in agricoltura. Ad esempio, il fungo Coprinopsis cinerea produce il peptide copsina, che ha dimostrato di esibire attività antibatterica contro il patogeno umano Listeria monocytogenes9. Allo stesso modo, il composto di derivazione fungina, griseofulvina, è ampiamente usato come trattamento per le infezioni fungine umane ed è inoltre in grado di inibire la crescita del fungo patogeno della pianta Alternaria solani10,11. Diversi ceppi del batterio Bacillus subtilis che abita nel suolo hanno anche dimostrato di essere efficaci agenti di biocontrollo del patogeno vegetale fungino Rhizoctonia solani12,13. Tuttavia, a causa delle limitazioni associate alle metodologie tradizionali, i BFI e gli FFA sono poco compresi a livello di singole cellule.

Gli studi convenzionali in genere esplorano BFI e FFI su macroscala usando placche di agar con due o più specie in confronto. La loro interazione è valutata misurando i tassi di crescita e la produzione di metaboliti delle specie in confronto 14,15,16; tuttavia, questa metodologia è risolta solo a livello di colonia. Per studiare le interazioni a livello cellulare, gli inoculanti batterici e fungini possono essere coltivati su vetrini per microscopio rivestiti di agar che vengono poi ripresi al microscopio17. Tuttavia, può essere difficile seguire una singola ifa usando vetrini per microscopio a causa della mancanza di confinamento, il che significa che le immagini time-lapse sono più difficili da ottenere. Inoltre, l'opportunità di confinare spazialmente altri microrganismi all'interno di regioni definite del micelio fungino o di creare ambienti chimici definiti che possono essere perturbati, ad esempio, non è possibile in tali configurazioni. La natura "scatola nera" del suolo aggiunge anche alla complessità dello studio delle interazioni fungo-microbiche a livello di singole cellule18. Osservando le specie interagenti lontano dall'incredibile diversità del microbioma del suolo, è possibile valutare il modo esatto in cui i singoli membri interagiscono. Pertanto, vi è una continua necessità di piattaforme versatili che consentano l'imaging ad alta risoluzione a cella singola di BFI e FFA.

Le tecnologie microfluidiche, i cosiddetti sistemi lab-on-a-chip, forniscono una piattaforma ideale per lo studio di BFI e FONI a livello di singole celle. Il campo della microfluidica, originato da tecnologie sviluppate per l'analisi chimica e la microelettronica, è stato adottato dalle scienze biologiche19. Le tecnologie microfluidiche regolano piccoli volumi di fluidi all'interno di una rete su misura di canali miniaturizzati, aventi almeno una dimensione su scala micrometrica, e il loro uso nella ricerca biologica si sta espandendodi 20. In particolare, sono stati sviluppati dispositivi microfluidici per esaminare la crescita di funghi filamentosi 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Uno dei vantaggi dell'utilizzo di questa tecnologia è che il confinamento delle ife e la distribuzione dei nutrienti all'interno di microcanali assomiglia più da vicino alla struttura dell'ambiente del suolo rispetto ai metodi convenzionali di agar31. Recentemente, le piattaforme microfluidiche sono state utilizzate per studiare le interazioni tra neutrofili umani e patogeni fungini32, batteri e radici vegetali33, nonché funghi e nematodi34,35.

Uno dei molti vantaggi dell'utilizzo della microfluidica per lo studio delle interazioni microbiche include il controllo specifico dell'ambiente dei microcanali. Ad esempio, i regimi di flusso laminare possono essere sfruttati per generare gradienti di concentrazione definiti, il che è particolarmente utile quando si esamina la chemiotassi batterica36. Un altro vantaggio è che la natura trasparente del poli(dimetilsilossano) (PDMS), un polimero elastomerico economico e biocompatibile comunemente usato nella produzione di dispositivi microfluidici, facilita l'imaging ad alta risoluzione di singole cellule utilizzando la microscopia a campo luminoso e fluorescenza37. Allo stesso modo, il confinamento dei microbi all'interno di microcanali significa che possono essere eseguiti esperimenti time-lapse che tracciano singole cellule, consentendo di registrare e quantificare le singole risposte cellulari37. Infine, poiché i dispositivi microfluidici possono essere progettati per essere facili da usare, possono essere facilmente utilizzati da non esperti38.

Approfondire la conoscenza delle interazioni tra microrganismi che vivono nel suolo è importante per migliorare le pratiche di gestione sostenibile degli ecosistemi che mantengono la biodiversità e per mitigare l'impatto dei cambiamenti climatici sugli ambienti terrestri39. Pertanto, lo sviluppo di nuovi strumenti microfluidici è fondamentale per espandere la comprensione dei funghi e delle loro interazioni a livello cellulare. Il protocollo qui si concentrerà su due dispositivi microfluidici prodotti per lo studio di BFI40 e FFI41 come rappresentato nella Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione visiva e schematica dei dispositivi di interazione batterico-fungina (BFI) e di interazione fungo-fungino (FFI). (A) Immagine del dispositivo BFI. Una spina miceliale è posizionata all'ingresso di un'estremità dei microcanali per consentire la crescita ifale nel dispositivo. L'ingresso batterico si trova all'estremità opposta. Barra della scala = 5 mm. (B) Panoramica schematica del dispositivo BFI, raffigurante il posizionamento delle prese batteriche e la direzione della crescita ifale attraverso i microcanali di interazione. I canali sono profondi 10 μm, larghi 100 μm e lunghi 7 mm, con 28 canali di osservazione in totale. (C) Saggio di confronto su piastra di agar tra Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610, barra di scala = 20 mm (sinistra). Immagini al microscopio che mostrano l'interazione tra C. cinerea e B. subtilis NCIB 3610 all'interno del microcanale (centrale e destro), cioè l'attaccamento polare dei batteri alle ife fungine. Barra della scala = 25 μm (al centro) e 10 μm (a destra). (D) Immagine del dispositivo FFI legato a una capsula di Petri con fondo di vetro, doppia inoculata con tappi miceliali. Barra della scala = 1 cm. (E) Panoramica schematica del dispositivo FFI. Due spine inoculanti fungine vengono introdotte nelle prese d'ingresso alle due estremità del dispositivo, consentendo l'esplorazione ifale dei microcanali. I canali di controllo sono collegati a un solo ingresso fungino e hanno un canale senza uscita, impedendo le interazioni tra i funghi di prova. I canali di interazione collegano entrambe le insenature fungine e consentono interazioni ifali tra i soggetti del test all'interno del microcanale. Ogni canale di interazione è costituito da 18 sezioni a forma di diamante, che misurano una lunghezza totale di 8,8 mm (490 x 430 μm per diamante), 10 μm di profondità e hanno una regione di collegamento tra ciascun diamante di 20 μm. I tipi di canale sono duplicati, barre di scala = 1 mm. (F) Zona di interazione tra due fronti ifali in avvicinamento, che crescono da estremità opposte del canale di interazione interconnesso. Immagine al microscopio a contrasto di fase, barra di scala = 250 μm. I pannelli in questa figura sono stati modificati da Stanley et al., 2014 (A-C)40 e Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

Nota : un riepilogo delle procedure descritte in questo protocollo sono rappresentate visivamente nella Figura 2.

Figure 2
Figura 2: Rappresentazione schematica della metodologia presentata composta da cinque sezioni principali dettagliate in questo protocollo. I progetti dei dispositivi vengono creati utilizzando un software CAD (Computer Aided Design) e uno stampo master prodotto con fotolitografia (1). Questo viene utilizzato per fondere il poli(dimetilsilossano) (PDMS), che viene poi tagliato a dadini in lastre e legato a piastre di Petri con fondo di vetro per formare i dispositivi microfluidici (2). I microbi da includere nello studio vengono coltivati (3) e utilizzati per inoculare i dispositivi (4). Le interazioni sono studiate al microscopio e quantificate utilizzando tecniche di analisi delle immagini (5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Fabbricazione dello stampo principale

  1. Produzione di maschere fotografiche
    1. Genera progetti di dispositivi microfluidici utilizzando il software CAD (Computer Aided Design). Le dimensioni dei dispositivi presentati sono riportate nella Figura 1 e maggiori dettagli sulle caratteristiche specifiche del design sono elencati in modo completo nelle rispettive pubblicazioni40,41.
    2. Esportare il file di progettazione CAD utilizzando un formato appropriato (ad esempio, .dwg, .dxf). Stampare una maschera fotolitografica su pellicola inviando il file di progettazione CAD esportato a un fornitore commerciale per la stampa.
  2. Fotolitografia
    NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti all'interno di un ambiente privo di polvere e controllato dalla luce, come una cappa a flusso laminare o una camera bianca. Le condizioni sperimentali qui fornite sono fornite come guida e dovrebbero essere ottimizzate internamente. Gli autori raccomandano di cercare una formazione specifica e di consultare i protocollistabiliti 42.
    1. Preparare un wafer di silicio da 100 mm cuocendo in forno a 200 °C per 2 ore. Spin-coat il wafer di silicio con fotoresist SU-8 2010, puntando ad uno spessore target di 10 μm, utilizzando le seguenti condizioni: 500 rpm per 10 s (accelerazione 100 rpm/s) e 3.000 rpm per 45 s (accelerazione 300 rpm/s).
      ATTENZIONE: il fotoresist SU-8 è pericoloso, fare attenzione durante la manipolazione e prevenire l'inalazione e il contatto con la pelle. È infiammabile, potenzialmente cancerogeno e tossico per l'ambiente.
    2. Cuocere il wafer di silicio rivestito a 95 °C per 2,5 minuti (cottura morbida). Esporre il fotoresiste alla luce ultravioletta (UV), utilizzando la maschera fotolitografica a pellicola e una dose di energia di 140 mJ/cm2 a una lunghezza d'onda di 365 nm utilizzando un allineatore a maschera.
    3. Cuocere il wafer di silicio rivestito a 95 °C per 3,5 minuti (cottura post esposizione). Immergere e agitare il wafer di silicio in una soluzione di sviluppo per 3 minuti per rivelare le strutture microfabbricate rimuovendo il fotoresist non esposto.
      ATTENZIONE: la soluzione per sviluppatori può essere infiammabile, prendere le precauzioni appropriate durante la manipolazione e l'archiviazione.
    4. Risciacquare con una nuova soluzione per sviluppatori per 10 s. Risciacquare con alcool isopropilico per 10 s e asciugare all'aria. Utilizzare aria compressa filtrata per garantire che le strutture siano completamente asciutte. Misurare l'altezza delle strutture SU-8, ad esempio utilizzando un profilometro.
    5. Silanizzare ogni stampo master con 50 μL di clorotrimetilsilano applicando una pressione di vuoto di 50 mbar per 2 ore. Gli autori osservano che la ri-silanizzazione dello stampo principale non è risultata necessaria.
      ATTENZIONE: Il clorotrimetilsilano è una sostanza pericolosa. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e maneggiare con cura. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi e prevenire l'inalazione. Tenere lontano da fonti di accensione e utilizzare in un'area ben ventilata.

2. Fabbricazione del dispositivo

NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti all'interno di un ambiente privo di polvere, ad esempio una cappa a flusso laminare.

  1. Preparazione di lastre di poli(dimetilsilossano) (PDMS)
    1. Preparare circa 40 g di PDMS mescolando accuratamente la base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10:1 usando una spatola in un bicchiere di plastica pulito. Degassare la miscela per rimuovere tutte le bolle d'aria posizionando il bicchiere di plastica contenente il PDMS in una camera a vuoto (pressione del vuoto = 50 mbar) per 1 ora.
    2. Fissare lo stampo principale in un supporto di plastica utilizzando nastro trasparente. Pulire utilizzando aria filtrata compressa per rimuovere eventuali particelle di polvere.
      NOTA: In alternativa, il foglio di alluminio può essere modellato attorno a una capsula di Petri di vetro e quindi utilizzato per ospitare lo stampo principale e contenere il PDMS43.
    3. Versare la miscela PDMS sul centro dello stampo master, assicurandosi che sia su una superficie piana e lasciare depositare.
      NOTA: La miscela PDMS deve essere versata il più vicino possibile alla superficie dello stampo master e un flusso continuo mantenuto per ridurre al minimo l'introduzione di bolle d'aria. Le bolle d'aria possono essere rimosse dirigendo l'aria compressa sulla bolla o estraendole usando un ago sottile.
    4. Coprire liberamente lo stampo principale con un coperchio di plastica per evitare che le particelle di polvere si depositino sulla superficie del PDMS. Trasferire lo stampo master in forno e polimerizzare durante la notte a 70 °C.
    5. Togliere lo stampo master dal forno e lasciare raffreddare. Staccare il PDMS polimerizzato dallo stampo master e dal telaio in plastica, avendo cura di evitare di danneggiare lo stampo master / PDMS.
    6. Posizionare del nastro trasparente sui microcanali in rilievo nel PDMS per mantenere una superficie priva di polvere. Assicurarsi che il nastro venga rimosso prima dell'incollaggio.
    7. Tagliare il PDMS in lastre (cioè, se più dispositivi sono inclusi nel progetto sullo stampo principale, molti possono essere fabbricati da una singola fusione) come indicato dal progetto utilizzando una ghigliottina montata o una lama di rasoio. Quando si taglia l'apertura laterale della lastra BFI PDMS, assicurarsi che i microcanali siano completamente aperti (Figura 1A). Per la lastra FFI PDMS, assicurarsi che ogni angolo sia tagliato per consentirgli di adattarsi alla capsula di Petri con fondo di vetro mostrata nella Figura 1D.
    8. Punzonare i fori di ingresso / uscita desiderati in base al design del dispositivo. Utilizzare una fresa di precisione per perforare fori di ingresso di 3,18 mm e 4,75 mm per i dispositivi BFI e FFI esemplari, rispettivamente.
  2. Incollaggio di lastre PDMS per creare dispositivi
    NOTA: Le seguenti fasi di lavaggio (2.2.1-2.2.2) utilizzano un pulitore ad ultrasuoni riempito con acqua purificata (ddH2O) a 37 kHz. Il lavaggio delle lastre PDMS aiuta a migliorare il successo dell'incollaggio44 e a ridurre il rischio di contaminazione. Per manipolare le lastre PDMS, utilizzare pinze pulite e sollevare utilizzando i fori di ingresso per evitare danni ai microcanali o alla superficie del dispositivo.
    1. Immergere le lastre PDMS in 0,5 M NaOH e sonicare per 5 min. Risciacquare con ddH2O. Trasferire lastre PDMS in soluzione di etanolo al 70% e sonicare per 5 minuti. Risciacquare con ddHsterile 20.
    2. Immergere le lastre PDMS in ddH2O sterile e sonicare per 5 minuti. Rimuovere le lastre PDMS dal ddH2O sterile, asciugare con aria compressa filtrata e metterle in una capsula di Petri quadrata sterile.
    3. Mettere la capsula di Petri quadrata contenente le lastre PDMS in un forno a 70 °C per 1 ora ad asciugare. Togliere dal forno e lasciare raffreddare in un ambiente privo di polvere. Eliminare la polvere dalla superficie delle lastre PDMS utilizzando nastro adesivo e/o aria compressa filtrata.
    4. Attivare le superfici delle lastre PDMS e delle piastre di Petri con fondo in vetro da incollare utilizzando un pulitore al plasma con le seguenti impostazioni: pressione del vuoto 0,75 mbar, potenza 50%, tempo di rivestimento 1 min. Posizionare le superfici da attivare (e successivamente incollare) rivolte verso l'alto nel detergente al plasma.
    5. Rimuovere le lastre PDMS e le piastre di Petri con fondo di vetro dal detergente al plasma e legare delicatamente le superfici attivate in contatto conforme l'una con l'altra. Legare le lastre BFI e FFI PDMS alle piastre di Petri con fondo di vetro da 35 mm e 50 mm di diametro (spessore del vetro 0,17 mm), rispettivamente.
      NOTA: Fare attenzione a non applicare troppa pressione durante l'incollaggio, in quanto ciò può causare il collasso dei microcanali.
    6. Verificare il successo dell'incollaggio semplicemente cercando di estrarre la lastra PDMS dalla piastra di Petri con fondo di vetro con una pinzetta. Visualizza i dispositivi a occhio o utilizzando la microscopia generica per garantire che non ci siano collassi degli ingressi o dei microcanali di inoculazione.
      NOTA: per le condizioni sature (ad esempio, condizioni sature di acqua e/o ricche di sostanze nutritive), includere il punto 2.2.7 del protocollo. Se sono richieste condizioni di insaturo d'acqua, procedere al passaggio 2.2.8. I dispositivi possono essere riempiti con acqua o supporti.
    7. Riempire i dispositivi immediatamente dopo l'incollaggio pipettando 100 μL della soluzione desiderata per il dispositivo BFI (ingresso batterico e apertura laterale) o 30 μL di fluido in ciascun ingresso (60 μL totali) per il dispositivo FFI. Se sono presenti bolle d'aria, queste si dissipano circa 10 minuti dopo il riempimento poiché pdms è poroso.
    8. Aggiungere ddH2O sterile (~100-200 μL) nella capsula di Petri per mantenere l'umidità.

3. Coltura microbica

NOTA: Le seguenti fasi forniscono una procedura microbiologica generale per la coltura fungina e batterica e devono essere eseguite in condizioni sterili (ad esempio, utilizzando una fiamma o un armadietto di sicurezza microbiologica) appropriato per il livello di contenimento richiesto per i microbi desiderati. Esempi specifici sono forniti alla fine di ogni sezione per una specie di interesse.

  1. Coltura fungina
    1. Preparare il terreno di coltura desiderato integrato con agar. Autoclave del mezzo a 121 °C per 15 min. Lasciare raffreddare il mezzo a 50 °C e versare in piastre di Petri da 9 cm di diametro, mantenendo condizioni sterili.
    2. Utilizzare una piralide di sughero per rimuovere un tappo di agar di 4 mm di diametro contenente micelio da una colonia di frigoriferi del ceppo fungino desiderato per attivare l'isolato. Questo è condotto per garantire una crescita standardizzata e vigorosa del fungo prima dell'inoculazione del dispositivo.
      NOTA: I microbi possono anche essere attivati da uno stock di glicerolo, cioè isolati fungini conservati su tappi di agar in soluzione di glicerolo al 50% a -70 °C41.
    3. Posizionare il lato del tappo con micelio a contatto con la superficie dell'agar al centro della capsula di Petri non inoculata. Sostituire il coperchio sulla parte superiore della capsula di Petri e sigillare prima di incubare alla temperatura appropriata per la deformazione desiderata per il periodo di tempo richiesto, in genere, circa 3 o 4 giorni.
      NOTA: Esempio di condizioni di coltura per Trichoderma rossicum: Estratto di malto agar, incubato a 25 °C al buio per 48 ore.
  2. Coltura batterica
    1. Strisciare l'isolato batterico desiderato dal brodo di origine (ad esempio, brodo di glicerolo o singola colonia dalla piastra di agar) su una piastra di agar per ottenere singole colonie batteriche e garantire l'assenza di contaminazione45. Sigillare la piastra con pellicola.
    2. Incubare ad una temperatura e durata specifiche per l'isolato di interesse fino a quando non si osservano singole colonie.
    3. Preparare il brodo di coltura desiderato. Ad esempio, aggiungere 10 g di triptone, 10 g di NaCl e 5 g di estratto di lievito per 1 L di ddH2O per preparare il terreno LB per la coltura di B. subtilis. Autoclave del mezzo a 121 °C per 15 min.
    4. Lasciare raffreddare il mezzo a temperatura ambiente. Aggiungere il mezzo a un pallone di coltura sterile all'interno di un ambiente sterile.
    5. Toccare una singola colonia batterica dalla piastra di agar usando un anello di inoculazione sterile. Trasferire l'anello inoculato nel terreno di coltura sterile toccando brevemente il liquido con il ciclo.
    6. Sigillare il matraccio con un coperchio sterile o un foglio e metterlo all'interno di un'incubatrice vibrante durante la notte utilizzando le impostazioni appropriate per le specie selezionate.
      NOTA: Esempio di condizioni di coltura per B. subtilis: i) coltura liquida - crescita aerobica a 37 °C a 200 giri/min in terreno LB e ii) coltura su piastra - temperatura ambiente su piastra lb agar. Fare riferimento ai documenti FFI / BFI 40,41 per ulteriori dettagli sulla coltivazione di diversi ceppi fungini.

4. Inoculazione del dispositivo

NOTA: I seguenti passaggi devono avvenire all'interno di una cappa a flusso laminare utilizzando apparecchiature sterili.

  1. Inoculazione fungina
    1. Utilizzare una piralide di sughero sterilizzata (ø = 4 mm) per rimuovere un tappo di agar dalla colonia alla periferia di una coltura di 3 giorni (passaggio 3.1). Assicurarsi che il fronte ifale in crescita rimanga intatto.
    2. Introdurre il tappo nell'ingresso fungino, micelio lato verso il basso, con la direzione di crescita del fronte ifale orientato verso le aperture dei microcanali per favorire l'infiltrazione ifale dei canali.
    3. Ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.2 per la seconda specie fungina (se si utilizza il dispositivo FFI), introducendo la spina nell'ingresso opposto. Se si utilizza il dispositivo BFI, omettere questo passaggio e continuare con il passaggio 4.1.4.
    4. Sigillare la capsula di Petri con pellicola trasparente e incubare a 25-28 °C al buio fino all'inizio dell'imaging. Determinare il tempo di incubazione pre-imaging in base all'evento biologico previsto da osservare, ad esempio i confronti fungo-fungino e il tasso di crescita delle specie incluse all'interno del dispositivo.
  2. Inoculazione batterica
    1. Diluire i batteri da una coltura notturna (fase 3.2) in un rapporto 1:25 utilizzando lo stesso terreno di coltura come descritto nel punto 3.2.3. Coltura per 3 ore a 37 °C.
    2. Lavare i batteri pellettizzando la coltura utilizzando una centrifuga a 2000 x g per 10 minuti. Scartare il surnatante e risospese le cellule nel volume desiderato di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% p/v.
    3. Centrifugare di nuovo per ottenere un pellet. Scartare il surnatante e risospese le cellule in mezzo liquido (ad esempio, C. cinerea mezzo minimo a un OD600 di 1). Ottimizzare il valore OD600 per il ceppo batterico in questione.
    4. Rimuovere il dispositivo BFI dall'incubatore e aprirlo in un ambiente sterile. Pipetta 10 μL di sospensione nell'ingresso batterico.
      NOTA: Ottimizzare i tempi esatti di inoculazione per le interazioni batterico-fungine in questione. Ad esempio, introdurre batteri nel dispositivo BFI 18 ore di inoculazione post-fungina se si utilizza C. cinerea.
    5. Sigillare la capsula di Petri con una pellicola trasparente e incubare a 25 °C al buio fino all'inizio dell'imaging. Conservare il dispositivo in posizione verticale.

5. Microscopia e analisi delle immagini

  1. Microscopia
    NOTA: Il ricercatore dovrebbe selezionare il metodo appropriato di imaging in accordo con la natura dell'esperimento da condurre, ad esempio un'epifluorescenza a campo largo invertita o una microscopia confocale. Qui è stata fornita una panoramica generale, poiché i dettagli specifici dipenderanno dagli attributi della configurazione della microscopia scelta.
    1. Accendere il computer del microscopio, il corpo principale del microscopio (se applicabile), la fotocamera, l'incubatore a temperatura controllata e le sorgenti luminose. Assicurarsi che il microscopio sia stato impostato correttamente, ad esempio, l'illuminazione Köhler è stata applicata correttamente per un'illuminazione uniforme del campione. Avviare il pacchetto software di imaging.
      NOTA: quando si utilizza un incubatore a temperatura controllata, è importante consentire alla temperatura del microscopio di equilibrarsi per diverse ore prima di iniziare un esperimento.
    2. Montare il dispositivo microfluidico nell'inserto del palco. Assicurarsi che il dispositivo sia ben fissato, cioè con nastro adesivo, per evitare di spostare il dispositivo durante il movimento attivo della fase.
    3. Acquisire immagini dei dispositivi inoculati, ad esempio esperimenti a punto singolo o time-lapse. Le specifiche di imaging complete relative agli esperimenti condotti con i dispositivi BFI e FFI sono fornite nelle rispettive pubblicazioni di cui sopra40,41.
      NOTA: le immagini Brightfield sono state acquisite utilizzando la microscopia a contrasto di fase per visualizzare la proliferazione ifale attraverso i canali di crescita utilizzando il software di messa a fuoco automatica e ingrandimento 10x, 0,30 NA (apertura numerica) o ingrandimento 20x, obiettivi da 0,45 NA. L'eccitazione delle proteine reporter fluorescenti è stata ottenuta utilizzando un motore di luce a diodi emettitori di luce ad alta potenza con lunghezze d'onda specifiche per il fluoroforo.
    4. Esportare le immagini in un formato adatto per la successiva elaborazione delle immagini. Ad esempio, .tiff.
  2. Analisi delle immagini
    NOTA: Gli autori raccomandano Fiji46 come strumento per l'analisi delle immagini, ma sono disponibili altri pacchetti software. Di seguito sono riportati esempi di analisi delle immagini condotte utilizzando Fiji dalle pubblicazioni sui dispositivi BFI e FFI presentate. Questi passaggi sono specifici per un Mac e possono differire leggermente se si utilizza un PC.
    1. Misurazioni del tasso di crescita ifale
      NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nel manoscritto BFI40 per misurare i tassi di crescita delle singole ife.
      1. Scarica, installa e avvia Fiji. Importate la sequenza di immagini da un esperimento time-lapse selezionando File > Importa sequenza > immagine. Individuare la cartella in cui sono archiviati i dati e selezionare Apri. Nella finestra Opzioni sequenza selezionare Preferenze, quindi OK.
      2. Selezionate l'icona Linea retta dalla barra degli strumenti principale. Posizionare l'inizio della linea retta sulla punta della punta ifale crescente facendo clic e quindi trascinando contemporaneamente il cursore in un altro punto all'interno della finestra. Apparirà una linea gialla con tre caselle che indicano l'inizio, il punto medio e la fine della linea.
      3. Passare al fotogramma successivo della sequenza di immagini tenendo premuti CTRL e >. Posiziona l'estremità della linea retta sulla punta dell'ifa crescente selezionando e trascinando la casella quadrata nella posizione corretta.
      4. Tieni premuti Ctrl e M per misurare la lunghezza della linea in pixel. Apparirà una finestra Risultati con i dati misurati. Definire i dati visualizzati nella finestra Risultati come segue: fare clic sulla finestra Risultati , quindi selezionare Risultati > Imposta misurazioni.
      5. Passare al fotogramma successivo della sequenza di immagini tenendo premuto CTRL e quindi >. Posiziona l'inizio della linea retta sulla punta dell'ifa crescente selezionando e trascinando la casella quadrata nella posizione corretta.
      6. Tenere premuto CTRL e quindi M per misurare la lunghezza della linea in pixel. Apparirà una finestra Risultati con i dati misurati.
      7. Ripetere i passaggi 5.2.1.5-5.2.1.6 fino al termine della misurazione della crescita dell'ifa in pixel.
      8. Selezionare tutti i dati nella finestra Risultati . Copia e incolla in un altro programma software, ad esempio un foglio di calcolo, per elaborare i dati. Traccia la crescita ifale (in pixel o micrometri) in funzione del tempo e calcola i tassi di crescita medi. Eseguire almeno tre repliche biologiche per esperimento.
    2. Misure di intensità di fluorescenza
      NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nella pubblicazione FFI41 per valutare la variazione dell'intensità di fluorescenza nelle ife di Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP a contatto con Clonostachys rosea 016 in funzione del tempo.
      1. Scarica, installa e avvia Fiji. Importate la sequenza di immagini da un esperimento time-lapse selezionando File > Importa sequenza > immagine. Individuare la cartella in cui sono archiviati i dati e selezionare Apri. Nella finestra Opzioni sequenza selezionare Preferenze , quindi OK.
      2. Specificare una regione di interesse (ROI) per misurare l'intensità assoluta di fluorescenza di un'ifa utilizzando lo strumento rettangolare, situato nella barra degli strumenti principale. La dimensione del quadrato può essere definita esattamente come segue: Modifica > Selezione > Specifica; il ROI può anche essere salvato per riferimento futuro in ROI Manager selezionando Modifica > selezione > Aggiungi al manager.
      3. Misurare l'intensità assoluta di fluorescenza (valore di grigio medio) all'interno del ROI definito per ogni immagine nell'intera sequenza o pila di immagini come segue: Image > Stacks > Measure Stack. La finestra Risultati si aprirà automaticamente una volta che tutte le immagini nello stack sono state elaborate.
        NOTA: i dati visualizzati nella finestra Risultati possono essere definiti come segue: fare clic sulla finestra Risultati e quindi selezionare Risultati > Imposta misurazioni. Assicurarsi che l'opzione Valore grigio medio sia stata selezionata.
      4. Selezionare tutti i dati nella finestra Risultati . Copia e incolla in un altro programma software, ad esempio un foglio di calcolo, per tracciare le intensità assolute di fluorescenza del ROI specificato in funzione del tempo.
      5. Ripetere i passaggi 5.2.2.2-5.2.2.4 per raccogliere le misurazioni assolute dell'intensità di fluorescenza per ciascun ROI, cioè sull'ifa di interesse, accanto all'ifa di interesse o all'interno del canale di controllo corrispondente.
      6. Calcolare le opportune intensità di fluorescenza relativa in unità arbitrarie (AU), ad esempio dividendo l'intensità di fluorescenza assoluta del ROI [ifa di interesse] per l'intensità assoluta di fluorescenza del ROI [canale di controllo]. Consultare la pubblicazione FFI41 per dettagli più specifici.
      7. Eseguire almeno tre repliche biologiche per esperimento e tracciare le intensità di fluorescenza relative in funzione del tempo.

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Representative Results

I risultati rappresentativi sono presentati dai dispositivi esemplari BFI40 e FFI41. Le misurazioni del tasso di crescita ifale possono essere facilmente ottenute utilizzando questi dispositivi in combinazione con tecniche di microscopia di base. La Figura 3A-B illustra le interazioni batterico-fungine tra C. cinerea hyphae e B. subtilis NCIB 3610. La presenza di B. subtilis arresta la crescita di C. cinerea dopo circa 5 ore dopo la co-inoculazione (Figura 3B). Le frecce indicano l'osservazione morfologica simultanea di ife più sottili e trasparenti (Figura 3A). È stato anche notato che le cellule ifali non colpite hanno continuato a proliferare. La Figura 3C-D mostra il forte effetto inibitorio di F. graminearum PH1-dsRed su T. rossicum NEU135 a seguito di interazione ifale, con conseguente arresto completo della crescita ifale di T. rossicum.

Figure 3
Figura 3: Esempi di quantificazione e osservazione del tasso di crescita dai dispositivi BFI e FFI. (A) Immagini al microscopio a campo luminoso delle interazioni tra Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610 nei microcanali del dispositivo BFI nei punti temporali post co-inoculazione. Le frecce evidenziano una sottile morfologia ifale, che si è verificata dopo l'interazione con B. subtilis NCIB 3610. Barra della scala = 25 μm. (B) Tasso di crescita ifale delle principali punte ifali misurato su 10 ore dopo la co-inoculazione. Le barre rappresentano deviazioni standard da tre repliche biologiche. (C) Boxplot (n = 6) che mostra il tasso di crescita relativo di Fusarium graminearum PH1-dsRed rispetto a Trichoderma rossicum. La significatività è indicata da ** e rappresenta p < 0,01, calcolata utilizzando il test U di Mann-Witney. Le barre rappresentano l'osservazione più grande o più piccola pari rispettivamente al percentile superiore e inferiore (± intervallo interquartile 1,5 x). (D) F. graminearum PH1-dsRed (che cresce da sinistra a destra) vs T. rossicum NEU135 (cresce da destra a sinistra) a 24 h, 48 h e 72 h dopo la co-inoculazione. Canali brightfield e fluorescenza sovrapposti. Barra della scala = 200 μm. I pannelli in questa figura sono stati modificati da Stanley et al., 2014 (A-B)40 e Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I cambiamenti morfologici indotti da eventi di interazione possono essere osservati a livello cellulare utilizzando le metodologie delineate in questo articolo. La Figura 4 fornisce esempi di osservazioni morfologiche per i dispositivi BFI e FFI presentati. La Figura 4A mostra la perdita della polarità della crescita ifale di Verticillium longisporum quando si incontrano i batteri Pseudomonas synxantha (P_phen) o P. fluorescens (P_rhizo), rispetto ai soli funghi di controllo (V1)47. Le interazioni fungo-batterio hanno provocato l'aspetto riccio delle ife. Ciò è stato attribuito a significativi cambiamenti trascrittomici indotti da batteri nei funghi e al comportamento di evitamento putativo. Questi risultati sono significativi in quanto V. longisporum è un patogeno vegetale, cioè lo Pseudomonas sp. ha il potenziale per essere utilizzato come biocontrollo in questo caso47.

La Figura 4B mostra un esperimento time-lapse in cui si può osservare la perdita dinamica del contenuto cellulare ifale, formando blebs che trattengono la proteina fluorescente rossa dTomato. Questa morfologia di blebbing si è verificata dopo la co-inoculazione con B. subtilis, ma è stata osservata solo in alcune cellule apicali. Tuttavia, il collasso delle ife e i successivi fenomeni di blebbing non erano correlati con l'attaccamento batterico. Ciò ha suggerito che si verificava una potenziale attività batterica fungicida che non era dipendente dall'attaccamento, ipotizzata come dovuta alla secrezione di lipopeptidi. Le tecniche di imaging dinamico ad alta risoluzione hanno anche rivelato un presunto meccanismo di difesa di F. graminearum, che mostra una maggiore formazione di setti quando antagonizzato da C. rosea, come indicato dalle frecce nella Figura 4C.

Figure 4
Figura 4: Esempi di cambiamenti nella morfologia osservati durante gli eventi di interazione nei dispositivi BFI e FFI. (A) I cambiamenti morfologici del curling nei funghi patogeni delle piante Verticillium longisporum (V1) contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP)48. Questa morfologia si è verificata in risposta a uno Pseudomonas spp fluorescente. con geni che codificano per la sintesi della fenazina (P_phen; P. synxantha) e un batterio isolato dalla rizosfera della colza (P_rhizo; P. fluorescens). Barre di scala = 20 μm. (B) dTomato-esprimendo Coprinopsis cinerea40 co-inoculato con Bacillus subtilis ripreso 5 ore dopo la co-inoculazione. Le cellule erano intatte (a sinistra) a 5 ore, ma un'ifa collassò 30 minuti dopo (perdita di fluorescenza) e furono osservati bleb contenenti materiale cellulare (fluorescente). Barra della scala = 25 μm. (C) Le frecce evidenziano la formazione dei setti in Fusarium graminearum hyphae osservata dopo l'interazione con Clonostachys rosea hyphae. Barra della scala = 10 μm, timestamp = h post co-inoculazione. I pannelli in questa figura sono stati modificati da Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 e Gimeno et al., 2021 (C)41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I dispositivi presentati sono adatti anche per osservare cambiamenti fisiologici dinamici. Utilizzando il dispositivo BFI, è stato dimostrato che la concentrazione di batteri associati alle ife è cambiata nel tempo ed è diminuita a seguito di un accumulo locale di cellule (Figura 5A). La mobilizzazione batterica lungo i microcanali è stata osservata anche in assemblaggi simili a cluster. Nel dispositivo FFI, l'etichettatura a fluorescenza ha permesso la quantificazione della proliferazione ifale di C. rosea di fronte a F. graminearum per caratterizzare la dinamica dell'interazione antagonista (Figura 5B). Queste misurazioni sono state effettuate per un periodo di 20 ore e dimostrano il potenziale di questi dispositivi per condurre esperimenti time-lapse a lungo termine.

Figure 5
Figura 5: Misure di caratterizzazione fisiologica dinamica esemplari sia per i dispositivi BFI che FFI. (A) Esperimento time lapse nel dispositivo BFI raffigurante l'attaccamento di Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 alle ife di Coprinopsis cinerea pMA41240 su 3 h. Barra di scala = 50 μm. (B) Le immagini del campo luminoso e del canale di fluorescenza mostrano la quantificazione della proteina fluorescente verde (GFP) rilevata utilizzando il dispositivo FFI durante l'interazione tra Clonostachys rosea marcata fluorescentemente e Fusarium graminearum49. Barra della scala = 50 μm. Il grafico (a destra) traccia la fluorescenza relativa in unità arbitrarie (AU) oltre 20 h, n = 6 e le barre di errore indicano l'errore standard. I grafici arancioni e grigi illustrano le intensità di fluorescenza di (i) GFP rilevate nella rete ifale C. rosea e (ii) il canale di interazione rispetto al canale di controllo contenente C. rosea, rispettivamente. Il grafico di controllo nero mostra l'intensità di fluorescenza delle ife nel canale di controllo C. rosea rispetto al canale di controllo. I pannelli in questa figura sono stati modificati da Stanley et al., 2014 (A)40 e Gimeno et al., 2021 (B)41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo articolo presenta un protocollo per lo studio delle interazioni fungo-microbiche utilizzando la microfluidica del canale. Gli autori mirano a dimostrare la versatilità di questi dispositivi e incoraggiare l'adattamento per soddisfare gli interessi del ricercatore. Utilizzando i dispositivi esemplari BFI e FFI, le interazioni fungine-microbiche possono essere studiate in modo più dettagliato di quanto precedentemente accessibile. Rimuovendo la complessità di fondo e l'eterogeneità del suolo, moderando la crescita delle ife in modo tale che siano confinate in un unico monostrato e regolando strettamente i parametri ambientali, è possibile catturare immagini ad alta risoluzione di questi eventi biologici nel tempo. Utilizzando questi dispositivi, le interazioni tra partner microbici sono state caratterizzate utilizzando il tasso di crescita, la quantificazione della fluorescenza e la bioimaging osservazionale dei tratti morfologici.

I dispositivi possono essere progettati per consentire la caratterizzazione delle interazioni fungo-microbiche a livello cellulare. La versatilità e la facilità di progettazione per i non specialisti rendono questo protocollo adatto per l'adattamento a una vasta gamma di domande di ricerca. I dispositivi BFI e FFI sono adatti per l'uso con una varietà di microscopi per soddisfare l'obiettivo sperimentale, grazie alla loro natura trasparente e alla superficie legata al vetro. I dispositivi possono essere personalizzati sia per quanto riguarda la loro configurazione che i parametri fisico-chimici; ad esempio, l'umidità, la temperatura o la saturazione del canale possono alterare l'esperienza ambientale del soggetto del test. Quindi, il dispositivo può essere progettato in modo tale da poter dirigere fisicamente la crescita o suscitare un comportamento particolare, come eventi di interazione o strategie di navigazione, controllati dalla struttura e dalle dimensioni del canale o dall'inclusione di ostacoli. Questo non è possibile con le metodologie attuali, come i saggi a piastra di agar31.

Finora, sono stati impiegati anche dispositivi microfluidici per esplorare le interazioni fungo-fago50 e fungo-nematode35 . L'uso della microfluidica del canale consente anche il controllo e lo scambio di fluidi all'interno del dispositivo. Questa importante e vantaggiosa caratteristica è stata determinante nello studio della ritenzione dei fagi miceliali50. Inoltre, l'uso di tecnologie microfluidiche per studi di trascrittomica ha prodotto una maggiore risoluzione di geni differenzialmente espressi rispetto a un simile test basato sull'agar. I metodi erano concomitanti in 24 dei 28 geni differenzialmente espressi identificati dallo stesso esperimento di piastre di agar, con i dispositivi microfluidici che identificavano molti altri geni e riportavano un'espressione relativa più elevata nel confronto35.

I passaggi critici del protocollo iniziano con la progettazione originale del dispositivo. Per ottenere un design adeguato, è necessario prestare attenzione allo stile di vita e alla strategia di crescita / mobilità dei microbi di interesse. Ad esempio, includendo una profondità o una lunghezza del canale sufficiente per soddisfare i requisiti fisiologici e la velocità di crescita del microrganismo di interesse. Le caratteristiche strutturali e i componenti dei microcanali possono essere progettati per indurre o manipolare comportamenti specifici, come aperture per zone di interazione o ostacoli per osservare strategie di navigazione. Inoltre, la questione della ricerca sperimentale deve essere affrontata con il design del dispositivo. Si consideri, ad esempio: (i) come i profili di flusso laminare possono essere sfruttati, (ii) l'adattamento e la variazione delle altezze dei microcanali per l'organismo da studiare e (iii) il restringimento degli ingressi dei microcanali per prevenire l'eccessiva proliferazione delle ife all'interno del dispositivo. Gli autori suggeriscono queste ulteriori risorse per la progettazione di dispositivimicrofluidici 51,52,53. È inoltre essenziale mantenere i dispositivi liberi dalla polvere durante la produzione. Pertanto, è necessario prestare attenzione a mantenere un ambiente privo di polvere durante tutte le fasi del processo di fabbricazione, nonché utilizzando nastro adesivo e aria compressa filtrata e mantenendo le superfici PDMS coperte quando non in uso. Altri passaggi critici del protocollo includono la riduzione al minimo del rischio di contaminazione lavando i dispositivi in una soluzione di etanolo al 70% e garantendo un adeguato legame tra la superficie del vetro e la lastra PDMS, posizionando delicatamente le superfici attivate a contatto tra loro e non applicando troppa pressione sui microcanali. Verificare l'adesione soddisfacente tentando di spostare la lastra PDMS dal vetro prima dell'inoculazione. Una limitazione di questi dispositivi è che non possono essere riutilizzati tra gli esperimenti.

L'inclusione dei microbi del suolo in dispositivi microfluidici su misura inizia una nuova entusiasmante era per la ricerca sulle interazioni microbiche. Le potenziali applicazioni future della metodologia presentata sono di ampio respiro, come la scoperta di nuove specie di biocontrollo o composti antimicrobici, o la caratterizzazione della cosiddetta autostrada fungina per la mobilizzazione batterica. I dispositivi BFI e FFI forniscono una piattaforma per visualizzare i cambiamenti morfologici e fisiologici dinamici che si verificano prima e dopo l'interazione a livello cellulare. I nuovi dispositivi sono semplici da progettare e creare, richiedendo semplicemente ingegno, per soddisfare la domanda di ricerca sperimentale. La loro versatilità e facilità d'uso significa che questo metodo può essere utilizzato da non esperti per promuovere la ricerca sul microbioma del suolo a livello cellulare.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Riconosciamo il sostegno finanziario del Dipartimento di Bioingegneria dell'Imperial College di Londra e del Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Difco Laboratories 214010 Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil Fisher Scientific Ltd 11759408
AutoCAD 2021 Autodesk, USA
Autoclave (VX-75) Systec
Centrifuge (5810R) Eppendorf
Chlorotrimethysilane Merck Life Sciences 386529 CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer SLS COR1000
Developer solution (mr-Dev 600) Microresist Technologies CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks VWR 214-1108 e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)  Fisher Scientific Ltd E/0650DF/15 Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji ImageJ Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers SLS INS5026
Forceps Fisher Scientific Ltd 10008051 Bent, sharp
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD35-100 35 mm
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD5040-100 50 mm
Glass crystallisation dishes VWR 216-1865 Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes VWR 216-1866 Used in the development of master moulds
Glass media bottles Fisher Scientific Ltd 15456113 e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton) Fisher Scientific Ltd 10625251 Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM) SAWATEC
Inoculation loop VWR COPA175CS01
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
Laminar flow hood Air Science (PCR) Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium Fisher Scientific Ltd BP9723-500 Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB) Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner Suss Microtec
Malt extract VWR 84618 Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer Applied Materials 4700DP Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount 3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2) Contained Air Solutions Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water Available as standard in biology labs. 
NaOH Fisher Scientific Ltd BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software Nikon Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer Nikon Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115) Fisher Scientific Ltd 15602126 Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S) KOYO Used for preparing silicon wafers
Parafilm Bemis HS234526B transparent film
Petri dishes, square sterile Fisher Scientific Ltd 11708573 120.5 mm
Petri dishes, sterile Fisher Scientific Ltd 15370366 90 mm 
Photolithography mask Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto) Diener Electronic 100012601
Plastic cup Semadeni 8323
Plastic spatula Semadeni 3340
Portable precision balance (OHAUS Scout) Fisher Scientific Ltd 15519631 Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter Syneo HS1251135P1183 Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter  Syneo HS1871730P1183S Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer  Bruker Dektak XT-stylus
Razor blades Häberle Labortechnik 9156110
Refridgerator Haden 4-6 °C
Retiga R1 CCD camera Qimaging Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape Office Depot 3969954 19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) Fisher Scientific Ltd 10257954
Silicon wafer Inseto 100 mm
Soda lime glass plate Inseto 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Spincoater  SAWATEC SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist MicroChem CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. 
Sylgard 184 elastomer kit VWR 634165S Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator Okolab Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope Nikon MEA54000 Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line Fisher Scientific Ltd FB15050
Vacuum desiccator Fisher Scientific Ltd 10528861 Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH20105 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH48230 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions

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Bioingegneria Numero 184
Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare
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Masters-Clark, E., Clark, A. J.,… More

Masters-Clark, E., Clark, A. J., Stanley, C. E. Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level. J. Vis. Exp. (184), e63917, doi:10.3791/63917 (2022).

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