Summary
Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.
Abstract
Filamentöse Pilze sind erfolgreiche Bewohner des Bodens und spielen eine wichtige Rolle in Bodenökosystemen, etwa beim Abbau organischer und anorganischer Stoffe, sowie bei der Regulierung des Nährstoffgehalts. Dort finden sie auch zahlreiche Möglichkeiten, mit einer Vielzahl anderer Mikroben wie Bakterien oder anderen Pilzen zu interagieren. Die Untersuchung von Pilzinteraktionen auf zellulärer Ebene kann jedoch aufgrund der Black-Box-ähnlichen Natur des Bodens eine Herausforderung darstellen. Neue mikrofluidische Werkzeuge werden für die Untersuchung von Pilzinteraktionen entwickelt; Zwei Plattformen zur Untersuchung von bakteriell-pilzlichen und Pilz-Pilz-Interaktionen werden hervorgehoben. Innerhalb dieser Mikrokanäle können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen in kontrollierten physikalisch-chemischen Umgebungen mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung als bisher beobachtet werden. Die Anwendung dieser Werkzeuge hat zahlreiche neue biologische Erkenntnisse hervorgebracht, wie z.B. die Beobachtung der bakteriellen polaren Bindung an Hyphen oder die Aufdeckung uncharakterisierter Pilz-Pilz-Antagonismen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methoden ist die einfache Verwendung dieses Tools durch Nicht-Experten, was zu hochgradig übersetzbaren Technologien für den Einsatz in mikrobiologischen Labors führt.
Introduction
Der Boden ist eine außergewöhnlich vielfältige Umgebung, die eine Fülle von Mikroorganismen enthält, die für Kohlenstoff- und Phosphorzyklen von entscheidender Bedeutung sind 1,2. Filamentöse Pilze sind ein wichtiger Bestandteil zahlreicher Ökosysteme als Zersetzer von organischer und anorganischer Substanz und können die Ernährung von Pflanzen durch die Bildung symbiotischer Beziehungenverbessern 3,4. Im Boden interagieren Pilze dynamisch mit einer Vielzahl von Mikroben wie anderen Pilzen5, Bakterien 6, Viren7 und Nematoden8. Diese Wechselwirkungen haben erhebliche Folgen für die Boden- und Pflanzengesundheit. Aufgrund des Mangels an geeigneten experimentellen Systemen, die in der Lage sind, interagierende Mikroorganismen mit hoher Auflösung abzubilden, bleiben viele jedoch undefiniert.
Untersuchungen zu bakteriell-pilzlichen Interaktionen (BFIs) und Pilz-Pilz-Interaktionen (FFIs) haben wertvolle Anwendungen in einer Reihe von Bereichen, darunter antimikrobielle Mittel in der Medizin und biologische Bekämpfungsmittel in der Landwirtschaft. Zum Beispiel produziert der Pilz Coprinopsis cinerea das Peptid Copsin, das nachweislich eine antibakterielle Aktivität gegen den menschlichen Erreger Listeria monocytogenes9 aufweist. Ebenso wird die pilzliche Verbindung Griseofulvin häufig zur Behandlung von menschlichen Pilzinfektionen eingesetzt und ist zusätzlich in der Lage, das Wachstum des pflanzenpathogenen Pilzes Alternaria solani10,11 zu hemmen. Mehrere Stämme des bodenbewohnenden Bakteriums Bacillus subtilis haben sich ebenfalls als wirksame Biokontrollmittel des pilzlichen Pflanzenpathogens Rhizoctonia solani12,13 erwiesen. Aufgrund von Einschränkungen, die mit traditionellen Methoden verbunden sind, werden BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen jedoch nur unzureichend verstanden.
Konventionelle Studien untersuchen typischerweise BFIs und FFIs auf der Makroskala unter Verwendung von Agarplatten mit zwei oder mehr Arten in Konfrontation. Ihre Wechselwirkung wird durch Messung der Wachstumsraten und der Metabolitenproduktion der konfrontierenden Spezies14,15,16 bewertet; Diese Methodik wird jedoch nur auf Kolonieebene gelöst. Um Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen, können bakterielle und pilzliche Impfmittel auf mit Agar beschichteten Glasmikroskopobjektträgern kultiviert werden, die dann unter einem Mikroskopabgebildet werden 17. Dennoch kann es schwierig sein, einem einzelnen Hypha mit Objektträgern zu folgen, da es an Enge mangelt, was bedeutet, dass Zeitrafferbilder schwieriger zu erhalten sind. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, andere Mikroorganismen räumlich in definierten Regionen des Pilzmyzels einzuschließen oder definierte chemische Umgebungen zu schaffen, die beispielsweise gestört werden können, in solchen Aufbauten nicht möglich. Die "Black Box" -Natur des Bodens trägt auch zur Komplexität der Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Interaktionen auf der Ebene einzelner Zellenbei 18. Durch die Beobachtung interagierender Arten abseits der unglaublichen Vielfalt des Bodenmikrobioms kann die genaue Art und Weise, wie einzelne Mitglieder interagieren, beurteilt werden. Daher besteht weiterhin Bedarf an vielseitigen Plattformen, die eine hochauflösende Einzelzellbildgebung von BFIs und FFIs ermöglichen.
Mikrofluidische Technologien, sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, bieten eine ideale Plattform für die Untersuchung von BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen. Der Bereich der Mikrofluidik, der aus Technologien stammt, die für die chemische Analyse und Mikroelektronik entwickelt wurden, wurde von den Biowissenschaftenübernommen 19. Mikrofluidische Technologien regulieren kleine Mengen von Flüssigkeiten innerhalb eines maßgeschneiderten Netzwerks miniaturisierter Kanäle, die mindestens eine Dimension auf der Mikrometerskala haben, und ihre Verwendung in der biologischen Forschung nimmt zu20. Insbesondere wurden mikrofluidische Geräte entwickelt, um das Wachstum von fadenförmigen Pilzen 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 zu untersuchen. Ein Vorteil der Verwendung dieser Technologie besteht darin, dass der Einschluss von Hyphen und die Verteilung von Nährstoffen innerhalb von Mikrokanälen der Struktur der Bodenumgebung ähnlicher ist als herkömmliche Agarmethoden31. In jüngster Zeit wurden mikrofluidische Plattformen verwendet, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neutrophilen und pilzlichen Krankheitserregern 32, Bakterien und Pflanzenwurzeln33 sowie Pilzen und Nematoden34,35 zu untersuchen.
Einer der vielen Vorteile der Verwendung von Mikrofluidik zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist die spezifische Steuerung der Mikrokanalumgebung. Zum Beispiel können laminare Strömungsregime genutzt werden, um definierte Konzentrationsgradienten zu erzeugen, was besonders bei der Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis36 nützlich ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass die transparente Natur von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS), einem kostengünstigen, biokompatiblen Elastomerpolymer, das üblicherweise bei der Herstellung von mikrofluidischen Bauelementen verwendet wird, die hochauflösende Bildgebung einzelner Zellen mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopieermöglicht 37. Ebenso bedeutet der Einschluss von Mikroben in Mikrokanälen, dass Zeitrafferexperimente, die einzelne Zellen verfolgen, durchgeführt werden können, so dass einzelne zelluläre Reaktionen aufgezeichnet und quantifiziert werdenkönnen 37. Da mikrofluidische Geräte benutzerfreundlich gestaltet werden können, können sie von Nicht-Experten leicht eingesetzt werden38.
Die Förderung des Wissens über die Wechselwirkungen zwischen bodenbewohnenden Mikroorganismen ist wichtig, um nachhaltige Ökosystembewirtschaftungspraktiken zu verbessern, die die biologische Vielfalt erhalten und die Auswirkungen des Klimawandels auf die terrestrische Umwelt mildern39. Daher ist die Entwicklung neuartiger mikrofluidischer Werkzeuge von grundlegender Bedeutung, um das Verständnis von Pilzen und ihren Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu erweitern. Das Protokoll konzentriert sich hier auf zwei mikrofluidische Geräte, die für die Untersuchung der BFIs40 und FFIs41 hergestellt wurden, wie in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Visuelle und schematische Darstellung der Geräte für die bakterielle-pilzische Interaktion (BFI) und die Pilz-Pilz-Interaktion (FFI). (A) Bild des BFI-Geräts. Ein Myzelstopfen wird am Eingang zu einem Ende der Mikrokanäle platziert, um das Wachstum der Hyphen in das Gerät zu ermöglichen. Der bakterielle Einlass befindet sich am gegenüberliegenden Ende. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) Schematische Übersicht des BFI-Geräts, das die Positionierung der bakteriellen Einlässe und die Richtung des Hyphenwachstums durch die Interaktionsmikrokanäle darstellt. Die Kanäle sind 10 μm tief, 100 μm breit und 7 mm lang, mit insgesamt 28 Beobachtungskanälen. (C) Konfrontationstest auf Agarplatte zwischen Coprinopsis cinerea und Bacillus subtilis NCIB 3610, Skalenstab = 20 mm (links). Mikroskopische Aufnahmen, die die Wechselwirkung zwischen C. cinerea und B. subtilis NCIB 3610 innerhalb des Mikrokanals (Mitte und rechts) zeigen, d.h. die polare Anheftung von Bakterien an Pilzhyphen. Skalenbalken = 25 μm (Mitte) und 10 μm (rechts). (D) Abbildung des FFI-Geräts, das an eine Petrischale mit Glasboden gebunden ist, die mit Myzelstopfen doppelt beimpft ist. Maßstabsleiste = 1 cm. (E) Schematische Übersicht des FFI-Geräts. Zwei Pilzimpfstopfen werden an beiden Enden des Geräts in die Einlässe eingeführt, was eine hyphalische Exploration der Mikrokanäle ermöglicht. Die Steuerkanäle sind nur mit einem Pilzeinlass verbunden und haben einen Sackgassenkanal, der Wechselwirkungen zwischen den Testpilzen verhindert. Interaktionskanäle verbinden beide Pilzeinlässe und ermöglichen hyphalische Interaktionen zwischen den Probanden innerhalb des Mikrokanals. Jeder Interaktionskanal besteht aus 18 rautenförmigen Abschnitten, die eine Gesamtlänge von 8,8 mm (490 x 430 μm pro Diamant), 10 μm tief und einen Verbindungsbereich zwischen jedem Diamanten von 20 μm messen. Kanaltypen werden dupliziert, Maßstabsbalken = 1 mm. (F) Interaktionszone zwischen zwei sich nähernden Hyphenfronten, die von gegenüberliegenden Enden des miteinander verbundenen Interaktionskanals wächst. Phasenkontrastmikroskopie-Bild, Maßstabsbalken = 250 μm. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Stanley et al., 2014 (A-C)40 und Gimeno et al., 2021 (D-F)41 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Protocol
HINWEIS: Eine Zusammenfassung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 2 visuell dargestellt.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der vorgestellten Methodik, bestehend aus fünf Hauptabschnitten, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind. Gerätedesigns werden mit CAD-Software (Computer Aided Design) und einer mit Photolithographie hergestellten Masterform erstellt (1). Dies wird verwendet, um Poly (Dimethylsiloxan) (PDMS) zu gießen, das dann in Platten gewürfelt und mit Glasboden-Petrischalen verbunden wird, um die mikrofluidischen Geräte zu bilden (2). Mikroben, die in die Studie einbezogen werden sollen, werden kultiviert (3) und zur Impfung der Geräte verwendet (4). Wechselwirkungen werden mittels Mikroskopie untersucht und mittels Bildanalysetechniken quantifiziert (5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Meisterformenbau
- Fotomasken-Produktion
- Generieren Sie mikrofluidische Gerätedesigns mit CAD-Software (Computer Aided Design). Die Abmessungen der vorgestellten Geräte sind in Abbildung 1 dargestellt und weitere Details zu den spezifischen Konstruktionsmerkmalen sind in den jeweiligen Publikationen40,41 umfassend aufgeführt.
- Exportieren Sie die CAD-Konstruktionsdatei in einem geeigneten Format (z. B. .dwg, .dxf). Drucken Sie eine Filmfotolithographiemaske, indem Sie die exportierte CAD-Konstruktionsdatei zum Drucken an einen kommerziellen Anbieter senden.
- Fotolithografie
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer staubfreien und lichtkontrollierten Umgebung durchgeführt werden, z. B. in einer Laminar-Flow-Haube oder einer Reinraumanlage. Die hier bereitgestellten Versuchsbedingungen dienen als Richtschnur und sollten im eigenen Haus optimiert werden. Die Autoren empfehlen, eine spezifische Schulung zu suchen und die etablierten Protokolle42 zu konsultieren.- Bereiten Sie einen 100 mm Siliziumwafer vor, indem Sie ihn 2 h lang in einem Ofen bei 200 °C backen. Beschichten Sie den Siliziumwafer mit dem Fotolack SU-8 2010 mit einer Zieldicke von 10 μm unter folgenden Bedingungen: 500 U/min für 10 s (Beschleunigung 100 U/min/s) und 3.000 U/min für 45 s (Beschleunigung 300 U/min/s).
ACHTUNG: SU-8 Fotolack ist gefährlich, seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und verhindern Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut. Es ist brennbar, potenziell krebserregend und giftig für die Umwelt. - Den beschichteten Siliziumwafer bei 95 °C für 2,5 min backen (weich backen). Setzen Sie den Fotolack ultraviolettem (UV) Licht aus, indem Sie die Filmfotolithographiemaske und eine Energiedosis von 140 mJ/cm2 bei einer Wellenlänge von 365 nm mit einem Masken-Aligner verwenden.
- Backen Sie den beschichteten Siliziumwafer bei 95 °C für 3,5 min (Backen nach der Belichtung). Tauchen und rühren Sie den Siliziumwafer 3 Minuten lang in die Entwicklerlösung, um die mikrofabrizierten Strukturen zu enthüllen, indem Sie den unbelichteten Fotolack entfernen.
ACHTUNG: Die Entwicklerlösung kann brennbar sein, treffen Sie entsprechende Vorkehrungen bei der Handhabung und Lagerung. - Spülen Sie mit einer frischen Entwicklerlösung für 10 s. Mit Isopropylalkohol 10 s abspülen und an der Luft trocknen. Verwenden Sie gefilterte Druckluft, um sicherzustellen, dass die Strukturen gründlich trocken sind. Messen Sie beispielsweise die Höhe der SU-8-Strukturen mit einem Profilometer.
- Silanisieren Sie jede Masterform mit 50 μL Chlortrimethylsilan, indem Sie einen Vakuumdruck von 50 mbar für 2 h anlegen. Die Autoren stellen fest, dass eine Resilanisierung der Masterform nicht für notwendig befunden wurde.
ACHTUNG: Chlortrimethylsilan ist ein gefährlicher Stoff. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und behandeln Sie sie mit Vorsicht. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und verhindern Sie das Einatmen. Von Zündquellen fernhalten und in einem gut belüfteten Bereich verwenden.
- Bereiten Sie einen 100 mm Siliziumwafer vor, indem Sie ihn 2 h lang in einem Ofen bei 200 °C backen. Beschichten Sie den Siliziumwafer mit dem Fotolack SU-8 2010 mit einer Zieldicke von 10 μm unter folgenden Bedingungen: 500 U/min für 10 s (Beschleunigung 100 U/min/s) und 3.000 U/min für 45 s (Beschleunigung 300 U/min/s).
2. Geräteherstellung
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer staubfreien Umgebung, z. B. einer Laminar-Flow-Haube, durchgeführt werden.
- Herstellung von Poly(dimethylsiloxan)- (PDMS)-Brammen
- Bereiten Sie ca. 40 g PDMS vor, indem Sie die Basis und das Härter im Verhältnis 10:1 mit einem Spatel in einem sauberen Plastikbecher gründlich mischen. Entgasen Sie das Gemisch, um alle Luftblasen zu entfernen, indem Sie den Plastikbecher mit dem PDMS für 1 h in eine Vakuumkammer (Vakuumdruck = 50 mbar) geben.
- Befestigen Sie die Master-Form mit durchsichtigem Klebeband in einer Kunststoffhalterung. Reinigen Sie mit komprimierter gefilterter Luft, um Staubpartikel zu entfernen.
HINWEIS: Alternativ kann Aluminiumfolie um eine Glas-Petrischale herum geformt und dann verwendet werden, um die Master-Form unterzubringen und das PDMS43 zu enthalten. - Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die Mitte der Masterform, stellen Sie sicher, dass sie sich auf einer ebenen Oberfläche befindet, und lassen Sie sie absetzen.
HINWEIS: Die PDMS-Mischung sollte so nah wie möglich an die Oberfläche der Masterform gegossen und ein kontinuierlicher Durchfluss aufrechterhalten werden, um die Einführung von Luftblasen zu minimieren. Luftblasen können entfernt werden, indem Druckluft über die Blase geleitet oder mit einer feinen Nadel herausgeschöpft wird. - Decken Sie die Masterform locker mit einem Kunststoffdeckel ab, um zu verhindern, dass sich Staubpartikel auf der Oberfläche des PDMS absetzen. Die Masterform in einen Ofen geben und über Nacht bei 70 °C aushärten.
- Entfernen Sie die Master-Form aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Ziehen Sie das ausgehärtete PDMS von der Masterform und dem Kunststoffrahmen weg und achten Sie darauf, dass die Masterform / das PDMS nicht beschädigt werden.
- Legen Sie durchsichtiges Klebeband über die in das PDMS geprägten Mikrokanäle, um eine staubfreie Oberfläche zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Band vor dem Kleben entfernt wird.
- Schneiden Sie das PDMS in Brammen (d. h. wenn mehrere Geräte im Design der Master-Form enthalten sind, können viele aus einem einzigen Gussteil hergestellt werden), wie vom Design mit einer montierten Guillotine oder Rasierklinge vorgesehen. Achten Sie beim Schneiden der seitlichen Öffnung der BFI-PDMS-Platte darauf, dass die Mikrokanäle vollständig geöffnet sind (Abbildung 1A). Stellen Sie bei der FFI PDMS-Platte sicher, dass jede Ecke so beschnitten ist, dass sie in die Petrischale mit Glasboden in Abbildung 1D passt.
- Stanzen Sie gewünschte Einlass- / Auslasslöcher entsprechend dem Gerätedesign. Verwenden Sie einen Präzisionsschneider, um Einlasslöcher von 3,18 mm bzw. 4,75 mm für die beispielhaften BFI- bzw. FFI-Geräte zu stanzen.
- Verklebung von PDMS-Brammen zur Herstellung von Bauelementen
HINWEIS: Bei den folgenden Waschschritten (2.2.1-2.2.2) wird ein Ultraschallreiniger verwendet, der mit gereinigtem Wasser (ddH2O) bei 37 kHz gefüllt ist. Das Waschen der PDMS-Platten trägt dazu bei, die erfolgreiche Verklebung44 zu verbessern und das Risiko einer Kontamination zu verringern. Um die PDMS-Platten zu manipulieren, verwenden Sie saubere Pinzetten und heben Sie sie mit den Einlasslöchern an, um Schäden an den Mikrokanälen oder der Geräteoberfläche zu vermeiden.- Tauchen Sie die PDMS-Platten in 0,5 M NaOH ein und beschallen Sie für 5 min. Mit sterilem ddH2O abspülen. PDMS-Platten in 70%ige Ethanollösung geben und 5 min beschallen. Mit sterilem ddH20 abspülen.
- PDMS-Platten in sterile ddH2O tauchen und 5 min beschallen. Entfernen Sie die PDMS-Platten aus der sterilen ddH2O, trocknen Sie sie mit gefilterter Druckluft und legen Sie sie in eine sterile quadratische Petrischale.
- Stellen Sie die quadratische Petrischale mit den PDMS-Platten für 1 Stunde zum Trocknen in einen Ofen bei 70 °C. Aus dem Ofen nehmen und in staubfreier Umgebung abkühlen lassen. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche der PDMS-Brammen mit Klebeband und/oder gefilterter Druckluft.
- Aktivieren Sie die Oberflächen der zu verklebenden PDMS-Platten und Petrischalen mit Glasboden mit einem Plasmareiniger mit folgenden Einstellungen: Vakuumdruck 0,75 mbar, Leistung 50%, Beschichtungszeit 1 min. Legen Sie die zu aktivierenden (und anschließend zu verklebenden) Oberflächen nach oben in den Plasmareiniger.
- Entfernen Sie die PDMS-Platten und die Petrischalen mit Glasboden aus dem Plasmareiniger und verbinden Sie sie, indem Sie die aktivierten Oberflächen vorsichtig in konformen Kontakt miteinander bringen. Verkleben Sie die BFI- und FFI-PDMS-Platten mit den Glasboden-Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm bzw. 50 mm (Glasstärke 0,17 mm).
HINWEIS: Achten Sie darauf, beim Kleben nicht zu viel Druck auszuüben, da dies zum Kollaps der Mikrokanäle führen kann. - Überprüfen Sie die erfolgreiche Verklebung, indem Sie einfach versuchen, die PDMS-Platte mit einer Pinzette von der Petrischale mit Glasboden zu ziehen. Visualisieren Sie die Geräte mit dem Auge oder mit generischer Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Impfeinlässe oder Mikrokanäle nicht kollabieren.
HINWEIS: Für gesättigte Bedingungen (d. h. wassergesättigte und/oder nährstoffreiche Bedingungen) schließen Sie Schritt 2.2.7 des Protokolls ein. Wenn wasserungesättigte Bedingungen erforderlich sind, fahren Sie mit Schritt 2.2.8 fort. Geräte können mit Wasser oder Medien befüllt werden. - Füllen Sie die Geräte unmittelbar nach dem Verkleben, indem Sie 100 μL der gewünschten Lösung für das BFI-Gerät (bakterieller Einlass und seitliche Öffnung) oder 30 μL Medien in jeden Einlass (60 μL insgesamt) für das FFI-Gerät pipettieren. Wenn Luftblasen vorhanden sind, lösen sich diese etwa 10 Minuten nach dem Befüllen auf, da PDMS porös ist.
- Fügen Sie steriles ddH2O (~ 100-200 μL) in die Petrischale hinzu, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
3. Mikrobielle Kultur
HINWEIS: Die folgenden Schritte bieten ein allgemeines mikrobiologisches Verfahren für die Pilz- und Bakterienkultur und sollten unter sterilen Bedingungen (d. H. Unter Verwendung einer Flamme oder einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank) durchgeführt werden, die für den für die gewünschten Mikroben erforderlichen Sicherheitsgrad geeignet sind. Spezifische Beispiele werden am Ende jedes Abschnitts für eine Art von Interesse gegeben.
- Pilzkultur
- Bereiten Sie das gewünschte Kulturmedium mit Agar ergänzt vor. Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min. Lassen Sie das Medium auf 50 ° C abkühlen und gießen Sie es in Petrischalen mit einem Durchmesser von 9 cm, wobei die sterilen Bedingungen erhalten bleiben.
- Verwenden Sie einen Korkbohrer, um einen Agarstopfen mit 4 mm Durchmesser, der Myzel enthält, aus einer Kühlcontainerkolonie des gewünschten Pilzstamms zu entfernen, um das Isolat zu aktivieren. Dies wird durchgeführt, um ein standardisiertes und kräftiges Wachstum des Pilzes vor der Impfung des Geräts zu gewährleisten.
HINWEIS: Die Mikroben können auch aus einem Glycerinbestand aktiviert werden, d. H. Pilzisolate, die auf Agarstopfen in 50% iger Glycerinlösung bei -70 ° C41 gespeichert sind. - Platzieren Sie die Seite des Steckers mit Myzel in Kontakt mit der Agaroberfläche in der Mitte der ungeimpften Petrischale. Ersetzen Sie den Deckel auf der Oberseite der Petrischale und verschließen Sie, bevor Sie bei der für die gewünschte Belastung geeigneten Temperatur für die erforderliche Zeit, typischerweise etwa 3 bis 4 Tage, inkubieren.
HINWEIS: Beispiel für Kulturbedingungen für Trichoderma rossicum: Malzextraktagar, 48 h bei 25 °C im Dunkeln inkubiert.
- Bakterienkultur
- Streichen Sie das gewünschte Bakterienisolat aus dem Quellmaterial (z. B. Glycerinbestand oder einzelne Kolonie aus der Agarplatte) auf eine Agarplatte, um einzelne Bakterienkolonien zu erhalten und sicherzustellen, dass keine Kontaminationauftritt 45. Verschließen Sie die Platte mit Folie.
- Inkubieren Sie mit einer Temperatur und Dauer, die für das interessierende Isolat spezifisch sind, bis einzelne Kolonien beobachtet werden.
- Bereiten Sie die gewünschte Kulturbrühe vor. Zum Beispiel fügen Sie 10 g Trypton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro 1 L ddH2O hinzu, um LB-Medium für die Kultur von B. subtilis vorzubereiten. Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min.
- Lassen Sie das Medium auf Raumtemperatur abkühlen. Geben Sie das Medium in einen sterilen Kulturkolben in einer sterilen Umgebung.
- Berühren Sie eine einzelne Bakterienkolonie von der Agarplatte mit einer sterilen Impfschleife. Übertragen Sie die geimpfte Schleife in das sterile Kulturmedium, indem Sie die Flüssigkeit kurz mit der Schlaufe berühren.
- Verschließen Sie den Kolben mit einem sterilen Deckel oder einer sterilen Folie und legen Sie ihn über Nacht in einen Schüttelinkubator mit den für die ausgewählte Art geeigneten Einstellungen.
HINWEIS: Beispielkulturbedingungen für B. subtilis: i) Flüssigkultur - aerobes Wachstum bei 37 °C bei 200 U/min in LB-Medium und ii) Plattenkultur - Raumtemperatur auf LB-Agarplatte. Weitere Einzelheiten zur Kultivierung verschiedener Pilzstämme finden Sie in den FFI/BFI-Papieren40,41.
4. Geräteimpfung
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer Laminar-Flow-Haube mit sterilen Geräten durchgeführt werden.
- Pilzimpfung
- Verwenden Sie einen sterilisierten Korkbohrer (ø = 4 mm), um einen Agarstopfen aus der Kolonie am Rande einer 3 Tage alten Kultur zu entfernen (Schritt 3.1). Stellen Sie sicher, dass die wachsende Hyphenfront intakt bleibt.
- Führen Sie den Stecker in den Pilzeinlass ein, Myzel mit der Seite nach unten, wobei die Wachstumsrichtung der Hyphenfront auf die Mikrokanalöffnungen ausgerichtet ist, um die Hypheninfiltration der Kanäle zu fördern.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2 für die zweite Pilzart (wenn Sie das FFI-Gerät verwenden), und führen Sie den Stecker in den gegenüberliegenden Einlass ein. Wenn Sie das BFI-Gerät verwenden, lassen Sie diesen Schritt aus und fahren Sie mit Schritt 4.1.4 fort.
- Die Petrischale mit transparenter Folie versiegeln und bei 25-28 °C im Dunkeln inkubieren, bis die Bildgebung beginnt. Bestimmen Sie die Inkubationszeit vor der Bildgebung in Abhängigkeit von dem beabsichtigten biologischen Ereignis, das beobachtet werden soll, z. B. Pilz-Pilz-Konfrontationen, und der Wachstumsrate der im Gerät enthaltenen Arten.
- Bakterielle Impfung
- Die Bakterien aus einer Übernachtkultur (Schritt 3.2) werden im Verhältnis 1:25 mit demselben Kulturmedium wie in Schritt 3.2.3 beschrieben verdünnt. Kultur für 3 h bei 37 °C.
- Waschen Sie die Bakterien durch Pelletieren der Kultur mit einer Zentrifuge bei 2000 x g für 10 min. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen im gewünschten Volumen von 0,9% w / v Natriumchloridlösung.
- Zentrifen Sie erneut, um ein Pellet zu erhalten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in flüssigem Medium (z. B . C. cinerea minimales Medium bis zu einem OD600 von 1). Optimieren Sie den OD600-Wert für den betreffenden Bakterienstamm.
- Entfernen Sie das BFI-Gerät aus dem Inkubator und öffnen Sie es in einer sterilen Umgebung. Pipette 10 μL Suspension in den bakteriellen Einlass.
HINWEIS: Optimieren Sie die genauen Impfzeiten für die betreffenden bakteriell-pilzlichen Interaktionen. Führen Sie beispielsweise Bakterien 18 h nach der Pilzimpfung in das BFI-Gerät ein, wenn Sie C. cinerea verwenden. - Die Petrischale mit einer transparenten Folie versiegeln und bei 25 °C im Dunkeln inkubieren, bis die Bildgebung beginnt. Bewahren Sie das Gerät aufrecht auf.
5. Mikroskopie und Bildanalyse
- Mikroskopie
HINWEIS: Der Forscher sollte die geeignete Bildgebungsmethode auswählen, die mit der Art des durchzuführenden Experiments übereinstimmt, z. B. eine invertierte Weitfeldepifluoreszenz oder konfokale Mikroskopie. Hier wurde ein allgemeiner Überblick gegeben, da spezifische Details von den Attributen des gewählten Mikroskopie-Setups abhängen.- Schalten Sie den Mikroskopcomputer, den Hauptkörper des Mikroskops (falls zutreffend), die Kamera, den temperaturgesteuerten Inkubator und die Lichtquelle(n) ein. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop richtig eingestellt wurde, z. B. wurde die Köhler-Beleuchtung für eine gleichmäßige Beleuchtung der Probe korrekt angewendet. Initiieren Sie das Imaging-Softwarepaket.
HINWEIS: Bei der Verwendung eines temperaturgesteuerten Inkubators ist es wichtig, die Mikroskoptemperatur mehrere Stunden lang ausgleichen zu lassen, bevor ein Experiment gestartet wird. - Montieren Sie das mikrofluidische Gerät in den Bühneneinsatz. Stellen Sie sicher, dass das Gerät gut gesichert ist, d. h. mit Band, um ein Verschieben des Geräts während der aktiven Bühnenbewegung zu verhindern.
- Erfassen Sie Bilder der geimpften Geräte, z. B. entweder Einzelpunkt- oder Zeitrafferexperimente. Umfassende Bildgebungsspezifikationen, die für die mit den BFI- und FFI-Geräten durchgeführten Experimente relevant sind, finden Sie in den jeweils vorgenannten Publikationen40,41.
HINWEIS: Hellfeldbilder wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen, um die Hyphenproliferation durch die Wachstumskanäle mit Autofokus-Software und entweder 10-facher Vergrößerung, 0,30 NA (numerische Blende) oder 20-facher Vergrößerung, 0,45 NA-Objektivlinsen zu visualisieren. Die Anregung fluoreszierender Reporterproteine wurde mit einer Hochleistungs-Leuchtdioden-Lichtmaschine mit Wellenlängen erreicht, die für den Fluorophor spezifisch sind. - Exportieren Sie Bilder in ein geeignetes Format für die anschließende Bildverarbeitung. Beispiel: .tiff.
- Schalten Sie den Mikroskopcomputer, den Hauptkörper des Mikroskops (falls zutreffend), die Kamera, den temperaturgesteuerten Inkubator und die Lichtquelle(n) ein. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop richtig eingestellt wurde, z. B. wurde die Köhler-Beleuchtung für eine gleichmäßige Beleuchtung der Probe korrekt angewendet. Initiieren Sie das Imaging-Softwarepaket.
- Bildanalyse
HINWEIS: Die Autoren empfehlen Fidschi46 als Werkzeug zur Bildanalyse, aber auch andere Softwarepakete sind verfügbar. Im Folgenden finden Sie Beispiele für Bildanalysen, die mit Fidschi aus den vorgestellten BFI- und FFI-Gerätepublikationen durchgeführt wurden. Diese Schritte sind spezifisch für einen Mac und können sich bei Verwendung eines PCs geringfügig unterscheiden.- Messungen der Hyphenwachstumsrate
HINWEIS: Diese Methode wurde im BFI-Manuskript40 verwendet, um die Wachstumsraten einzelner Hyphen zu messen.- Laden Sie Fidschi herunter, installieren Sie es und starten Sie es. Importieren Sie die Bildsequenz aus einem Zeitrafferexperiment, indem Sie Datei > > Bildsequenz importieren auswählen. Suchen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert sind, und wählen Sie Öffnen aus. Wählen Sie im Fenster "Sequenzoptionen" die Option "Einstellungen" und dann "OK".
- Wählen Sie in der Hauptsymbolleiste das Symbol "Gerade Linie" aus. Positionieren Sie den Anfang der geraden Linie an der Spitze der wachsenden Hyphenspitze, indem Sie klicken und dann gleichzeitig den Cursor an einen anderen Punkt innerhalb des Fensters ziehen. Es erscheint eine gelbe Linie mit drei Feldern, die den Anfang, die Mitte und das Ende der Linie anzeigen.
- Wechseln zum nächsten Frame in der Bildsequenz, indem Sie Strg und > gedrückt halten. Positionieren Sie das Ende der geraden Linie an der Spitze des wachsenden Hyphas, indem Sie die quadratische Box auswählen und an die richtige Position ziehen.
- Halten Sie Strg und M gedrückt, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen. Es erscheint ein Ergebnisfenster mit den Messdaten. Definieren Sie die im Ergebnisfenster angezeigten Daten wie folgt: Klicken Sie auf das Fenster Ergebnisse, und wählen Sie dann Ergebnisse > Messungen festlegen aus.
- Wechseln Sie zum nächsten Frame in der Bildsequenz, indem Sie die Strg-Taste gedrückt halten und dann >. Positionieren Sie den Anfang der geraden Linie an der Spitze des wachsenden Hyphas, indem Sie die quadratische Box auswählen und an die richtige Position ziehen.
- Halten Sie Strg und dann M gedrückt, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen. Es erscheint ein Ergebnisfenster mit den Messdaten.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1.5-5.2.1.6, bis Sie das Wachstum des Bindestrichs in Pixeln gemessen haben.
- Wählen Sie alle Daten im Ergebnisfenster aus. Kopieren und Einfügen in ein anderes Softwareprogramm, z. B. eine Tabellenkalkulation, um die Daten zu verarbeiten. Zeichnen Sie das Hyphenwachstum (in Pixeln oder Mikrometern) als Funktion der Zeit auf und berechnen Sie die durchschnittlichen Wachstumsraten. Führen Sie mindestens drei biologische Replikationen pro Experiment durch.
- Fluoreszenzintensitätsmessungen
ANMERKUNG: Diese Methode wurde in der FFI-Publikation41 verwendet, um die Änderung der Fluoreszenzintensität in Hyphen von Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP bei Kontakt mit Clonostachys rosea 016 als Funktion der Zeit zu bewerten.- Laden Sie Fidschi herunter, installieren Sie es und starten Sie es. Importieren Sie die Bildsequenz aus einem Zeitrafferexperiment, indem Sie Datei > > Bildsequenz importieren auswählen. Suchen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert sind, und wählen Sie Öffnen aus. Wählen Sie im Fenster "Sequenzoptionen" die Option "Voreinstellungen" und dann "OK".
- Geben Sie einen Bereich von Interesse (ROI) an, um die absolute Fluoreszenzintensität einer Hypha mit dem rechteckigen Werkzeug in der Hauptsymbolleiste zu messen. Die Größe des Quadrats kann genau wie folgt definiert werden: Bearbeiten > Auswahl > angeben; Der ROI kann auch zur späteren Bezugnahme im ROI-Manager gespeichert werden, indem Sie > Auswahl bearbeiten > Zu Manager hinzufügen auswählen.
- Messen Sie die absolute Fluoreszenzintensität (mittlerer Grauwert) innerhalb des definierten ROI für jedes Bild in der gesamten Bildsequenz oder im Stack wie folgt: Image > Stacks > Measure Stack. Das Ergebnisfenster wird automatisch geöffnet, sobald alle Bilder im Stapel verarbeitet wurden.
HINWEIS: Die im Ergebnisfenster angezeigten Daten können wie folgt definiert werden: Klicken Sie auf das Ergebnisfenster und wählen Sie dann Ergebnisse > Messungen festlegen. Stellen Sie sicher, dass der mittlere Grauwert ausgewählt wurde. - Wählen Sie alle Daten im Ergebnisfenster aus. Kopieren Sie es und fügen Sie es in ein anderes Softwareprogramm ein, z. B. eine Tabellenkalkulation, um die absoluten Fluoreszenzintensitäten des angegebenen ROI als Funktion der Zeit darzustellen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2.2-5.2.2.4, um absolute Fluoreszenzintensitätsmessungen für jeden ROI zu erfassen, d. h. für den interessierenden Hyph, neben dem interessierenden Hypha oder innerhalb des entsprechenden Kontrollkanals.
- Berechnen Sie die geeigneten relativen Fluoreszenzintensitäten in beliebigen Einheiten (AU), z. B. indem Sie die absolute Fluoreszenzintensität des ROI [Hypha of Interest] durch die absolute Fluoreszenzintensität des ROI [Kontrollkanal] dividieren. Weitere Einzelheiten finden Sie in derFFI-Veröffentlichung 41.
- Führen Sie mindestens drei biologische Replikate pro Experiment durch und zeichnen Sie die relativen Fluoreszenzintensitäten als Funktion der Zeit auf.
- Messungen der Hyphenwachstumsrate
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse werden anhand der Exemplare BFI40 und FFI41 vorgestellt. Hyphenwachstumsratenmessungen können mit diesen Geräten in Kombination mit grundlegenden Mikroskopietechniken leicht durchgeführt werden. Abbildung 3A-B veranschaulicht bakteriell-pilzliche Interaktionen zwischen C. cinerea hyphae und B. subtilis NCIB 3610. Das Vorhandensein von B. subtilis stoppt das Wachstum von C. cinerea nach ca. 5 h nach der Co-Impfung (Abbildung 3B). Pfeile zeigen die gleichzeitige morphologische Beobachtung dünnerer und transparenterer Hyphen an (Abbildung 3A). Es wurde auch festgestellt, dass sich nicht betroffene Hyphenzellen weiter vermehrten. Abbildung 3C-D zeigt die starke hemmende Wirkung von F. graminearum PH1-dsRed auf T. rossicum NEU135 nach Hyphenwechselwirkung, was zu einem vollständigen Stillstand des Hyphenwachstums von T. rossicum führt.
Abbildung 3: Beispiele für die Quantifizierung und Beobachtung der Wachstumsrate mit den BFI- und FFI-Geräten. (A) Hellfeldmikroskopische Aufnahmen von Wechselwirkungen zwischen Coprinopsis cinerea und Bacillus subtilis NCIB 3610 in den Mikrokanälen des BFI-Geräts zu den Zeitpunkten nach der Koinokulation. Pfeile markieren eine dünne Hyphenmorphologie, die nach der Interaktion mit B. subtilis NCIB 3610 auftrat. Skalenbalken = 25 μm. (B) Hyphenwachstumsrate führender Hyphenspitzen, gemessen über 10 h nach der Koinokulation. Balken stellen Standardabweichungen von drei biologischen Replikaten dar. (C) Boxplot (n = 6) mit der relativen Wachstumsrate von Fusarium graminearum PH1-dsRed gegenüber Trichoderma rossicum. Die Signifikanz wird mit ** bezeichnet und stellt p < 0,01 dar, berechnet mit dem Mann-Witney U-Test. Balken stellen die größte oder kleinste Beobachtung dar, die dem oberen bzw. unteren Perzentil entspricht (± 1,5 x Interquartilsbereich). (D) F. graminearum PH1-dsRed (wächst von links nach rechts) vs T. rossicum NEU135 (wächst von rechts nach links) bei 24 h, 48 h und 72 h nach der Co-Impfung. Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle überlagert. Maßstabsleiste = 200 μm. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Stanley et al., 2014 (A-B)40 und Gimeno et al., 2021 (C-D)41 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die morphologischen Veränderungen, die durch Interaktionsereignisse induziert werden, können auf zellulärer Ebene mit den in dieser Arbeit beschriebenen Methoden beobachtet werden. Abbildung 4 zeigt Beispiele für morphologische Beobachtungen für die vorgestellten BFI- und FFI-Geräte. Abbildung 4A zeigt den Verlust der Polarität des Verticillium longisporum hyphalischen Wachstums bei der Begegnung mit den Bakterien Pseudomonas synxantha (P_phen) oder P. fluorescens (P_rhizo) im Vergleich zu den Kontrollpilzen allein (V1)47. Pilz-bakterielle Wechselwirkungen führten zum lockigen Aussehen der Hyphen. Dies wurde auf signifikante bakteriell induzierte transkriptomische Veränderungen in den Pilzen und das mutmaßliche Vermeidungsverhalten zurückgeführt. Diese Ergebnisse sind signifikant, da V. longisporum ein Pflanzenpathogen ist, was den Pseudomonas sp. hat das Potenzial, in diesem Fall als Biokontrolle eingesetzt zuwerden 47.
Abbildung 4B zeigt ein Zeitrafferexperiment, bei dem der dynamische Verlust von hyphalischen Zellinhalten beobachtet werden kann, wobei Blebs gebildet werden, die das rot fluoreszierende Protein dTomato behalten. Diese blebbende Morphologie trat nach der Co-Inokulation mit B. subtilis auf, wurde aber nur in einigen apikalen Zellen beobachtet. Der Kollaps der Hyphen und die anschließenden Blubging-Phänomene korrelierten jedoch nicht mit der bakteriellen Anhaftung. Dies deutete darauf hin, dass eine potenzielle fungizide bakterielle Aktivität auftrat, die nicht bindungsabhängig war, was vermutlich auf die Sekretion von Lipopeptiden zurückzuführen war. Hochauflösende dynamische Bildgebungsverfahren haben auch einen mutmaßlichen Abwehrmechanismus von F. graminearum aufgedeckt, der eine erhöhte Septabildung aufweist, wenn er von C. rosea antagonisiert wird, wie die Pfeile in Abbildung 4C zeigen.
Abbildung 4: Beispiele für Veränderungen in der Morphologie, die während Interaktionsereignissen in den BFI- und FFI-Geräten beobachtet wurden. (A) Die morphologischen Veränderungen in den pflanzenpathogenen Pilzen Verticillium longisporum (V1), die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert sind48. Diese Morphologie trat als Reaktion auf eine fluoreszierende Pseudomonas spp. mit Genen, die für die Phenazinsynthese (P_phen; P. synxantha) und ein Bakterium, das aus der Rhizosphäre von Raps (P_rhizo; P. fluorescens). Maßstabsstäbe = 20 μm. (B) dTomato-exprimierende Coprinopsis cinerea40 co-inokuliert mit Bacillus subtilis abgebildet 5 h nach der Co-Impfung. Die Zellen waren um 5 h intakt (links), aber ein Hypha kollabierte 30 Minuten später (Verlust der Fluoreszenz) und es wurden Blasen beobachtet, die (fluoreszierendes) Zellmaterial enthielten. Maßstabsleiste = 25 μm. (C) Pfeile heben die Bildung von Septen in Fusarium graminearum hyphen hervor, die nach der Interaktion mit Clonostachys rosea hyphae beobachtet wurden. Skalenbalken = 10 μm, Zeitstempel = h nach der Co-Impfung. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 und Gimeno et al., 2021 (C)41 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die vorgestellten Geräte eignen sich auch zur Beobachtung dynamischer physiologischer Veränderungen. Mit dem BFI-Gerät wurde gezeigt, dass sich die Konzentration von Hyphen-assoziierten Bakterien im Laufe der Zeit änderte und nach einer lokalen Ansammlung von Zellen abnahm (Abbildung 5A). Eine bakterielle Mobilisierung entlang von Mikrokanälen wurde auch in clusterartigen Assemblagen beobachtet. Im FFI-Gerät ermöglichte die Fluoreszenzmarkierung die Quantifizierung der Proliferation von C. rosea hyphale , wenn sie mit F. graminearum konfrontiert wurde, um die Dynamik der antagonistischen Interaktion zu charakterisieren (Abbildung 5B). Diese Messungen wurden über einen Zeitraum von 20 h durchgeführt und zeigen das Potenzial dieser Geräte für die Durchführung langfristiger Zeitrafferexperimente.
Abbildung 5: Beispielhafte dynamische physiologische Charakterisierungsmessungen sowohl für das BFI als auch für das FFI-Gerät. (A) Zeitrafferexperiment im BFI-Gerät, das die Befestigung von Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 an den Hyphen von Coprinopsis cinerea pMA41240 über 3 h darstellt. Maßstabsleiste = 50 μm. (B) Hellfeld- und Fluoreszenzkanalbilder zeigen die Quantifizierung von grün fluoreszierendem Protein (GFP), das mit dem FFI-Gerät während der Interaktion zwischen fluoreszierend markierten Clonostachys rosea und Fusarium graminearum49 nachgewiesen wurde. Maßstabsleiste = 50 μm. Diagramm (rechts) zeigt relative Fluoreszenz in beliebigen Einheiten (AE) über 20 h, n = 6 und Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Orangefarbene und graue Diagramme veranschaulichen die Fluoreszenzintensitäten von (i) GFP, das im Hyphennetzwerk von C. rosea nachgewiesen wurde, und (ii) des Interaktionskanals im Vergleich zum C. rosea-haltigen Kontrollkanal. Das schwarze Kontrolldiagramm zeigt die Fluoreszenzintensität von Hyphen im Kontrollkanal C. rosea im Vergleich zum Kontrollkanal. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Stanley et al., 2014 (A)40 und Gimeno et al., 2021 (B)41 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen unter Verwendung der Kanalmikrofluidik vor. Ziel der Autoren ist es, die Vielseitigkeit dieser Geräte zu demonstrieren und die Anpassung an die Interessen des Forschers zu fördern. Mit Hilfe der beispielhaften BFI- und FFI-Geräte können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen detaillierter untersucht werden, als bisher zugänglich. Durch die Beseitigung der Hintergrundkomplexität und Heterogenität des Bodens, die Moderation des Wachstums von Hyphen so, dass sie auf eine einzige Monoschicht beschränkt sind, und durch die strenge Regulierung der Umweltparameter ist es möglich, hochauflösende Bilder dieser biologischen Ereignisse im Laufe der Zeit aufzunehmen. Mit diesen Geräten wurden die Wechselwirkungen zwischen mikrobiellen Partnern unter Verwendung von Wachstumsrate, Fluoreszenzquantifizierung und beobachtender Bioimaging morphologischer Merkmale charakterisiert.
Geräte können so konzipiert werden, dass sie die Charakterisierung von pilzlich-mikrobiellen Interaktionen auf zellulärer Ebene ermöglichen. Die Vielseitigkeit und Einfachheit des Designs für Nicht-Spezialisten machen dieses Protokoll geeignet für die Anpassung an eine breite Palette von Forschungsfragen. Die BFI- und FFI-Geräte eignen sich aufgrund ihrer transparenten Natur und glasgebundenen Oberfläche für den Einsatz mit einer Vielzahl von Mikroskopen, um dem experimentellen Ziel gerecht zu werden. Die Geräte können sowohl hinsichtlich ihrer Konfiguration als auch hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Parameter angepasst werden; Beispielsweise können Feuchtigkeit, Temperatur oder Kanalsättigung das Umgebungserlebnis für den Probanden verändern. Dann kann das Gerät so konstruiert werden, dass es das Wachstum physisch steuern oder ein bestimmtes Verhalten hervorrufen kann, wie z. B. Interaktionsereignisse oder Navigationsstrategien, gesteuert durch Kanalstruktur und -größe oder die Einbeziehung von Hindernissen. Dies ist mit aktuellen Methoden wie Agarplattenassays31 nicht möglich.
Bisher wurden mikrofluidische Geräte auch eingesetzt, um die Wechselwirkungen zwischen Pilz-Phagen50 und Pilz-Nematode35 zu erforschen. Der Einsatz der Kanalmikrofluidik ermöglicht auch die Steuerung und den Austausch von Flüssigkeiten innerhalb des Gerätes. Dieses wichtige und vorteilhafte Merkmal war maßgeblich an der Untersuchung der mycelialen Phagenretention50 beteiligt. Darüber hinaus ergab der Einsatz mikrofluidischer Technologien für Transkriptomik-Studien eine größere Auflösung von differentiell exprimierten Genen im Vergleich zu einem ähnlichen Agar-basierten Assay. Die Methoden waren in 24 der 28 differentiell exprimierten Gene, die durch dasselbe Agarplattenexperiment identifiziert wurden, gleichzeitig, wobei die mikrofluidischen Geräte viele weitere Gene identifizierten und eine höhere relative Expression im Vergleich35 meldeten.
Die kritischen Schritte des Protokolls beginnen mit dem ursprünglichen Gerätedesign. Um ein geeignetes Design zu erreichen, muss auf den Lebensstil und die Wachstums- / Mobilitätsstrategie der interessierenden Mikroben geachtet werden. Zum Beispiel einschließlich ausreichender Kanaltiefe oder -länge, um den physiologischen Anforderungen und der Wachstumsgeschwindigkeit des interessierenden Mikroorganismus gerecht zu werden. Die strukturellen Eigenschaften und Komponenten der Mikrokanäle können so konzipiert werden, dass sie bestimmte Verhaltensweisen induzieren oder manipulieren, z. B. Öffnungen für Interaktionszonen oder Hindernisse zur Beobachtung von Navigationsstrategien. Darüber hinaus muss die experimentelle Forschungsfrage mit dem Gerätedesign adressierbar sein. Betrachten wir zum Beispiel: (i) wie laminare Strömungsprofile genutzt werden können, (ii) Anpassung und Variation der Mikrokanalhöhen für den zu untersuchenden Organismus und (iii) Verengung von Mikrokanaleingängen, um eine Überwucherung von Hyphen innerhalb des Geräts zu verhindern. Die Autoren schlagen diese weiteren Ressourcen für das mikrofluidische Gerätedesignvor 51,52,53. Es ist auch wichtig, die Geräte während der Herstellung staubfrei zu halten. Daher sollte darauf geachtet werden, dass in allen Phasen des Herstellungsprozesses sowie durch die Verwendung von Klebeband und gefilterter Druckluft eine staubfreie Umgebung aufrechterhalten wird und die PDMS-Oberflächen bei Nichtgebrauch bedeckt bleiben. Weitere wichtige Schritte des Protokolls sind die Minimierung des Kontaminationsrisikos durch Waschen der Geräte in 70% iger Ethanollösung und die Gewährleistung einer angemessenen Verbindung zwischen der Glasoberfläche und der PDMS-Platte, indem die aktivierten Oberflächen vorsichtig miteinander in Kontakt gebracht werden und nicht zu viel Druck auf die Mikrokanäle ausgeübt wird. Überprüfen Sie auf zufriedenstellende Haftung, indem Sie versuchen, die PDMS-Platte vor der Impfung aus dem Glas zu entfernen. Eine Einschränkung dieser Geräte besteht darin, dass sie zwischen den Experimenten nicht wiederverwendet werden können.
Die Einbeziehung von Bodenmikroben in maßgeschneiderte mikrofluidische Geräte läutet eine aufregende neue Ära für die Erforschung mikrobieller Wechselwirkungen ein. Mögliche zukünftige Anwendungen der vorgestellten Methodik sind breit gefächert, wie die Entdeckung neuartiger Biokontrollspezies oder antimikrobieller Verbindungen oder die Charakterisierung der sogenannten Pilzautobahn für die bakterielle Mobilisierung. Die BFI- und FFI-Geräte bieten eine Plattform zur Visualisierung dynamischer morphologischer und physiologischer Veränderungen, die vor und nach der Interaktion auf zellulärer Ebene auftreten. Neue Geräte sind einfach zu entwerfen und zu erstellen, was einfach Einfallsreichtum erfordert, um der experimentellen Forschungsfrage gerecht zu werden. Ihre Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit bedeutet, dass diese Methode von Nicht-Experten verwendet werden kann, um die Erforschung des Bodenmikrobioms auf zellulärer Ebene voranzutreiben.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken der finanziellen Unterstützung des Department of Bioengineering am Imperial College London und des Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
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