Summary
På grunn av jordens opasitet kan interaksjoner mellom dens bestanddeler ikke lett visualiseres med cellulær oppløsning. Her presenteres to mikrofluidiske verktøy, som gir nye muligheter for å undersøke sopp-mikrobielle interaksjoner. Enhetene er allsidige og enkle å bruke, noe som muliggjør høy romlig kontroll og høyoppløselig bildebehandling på mobilnivå.
Abstract
Filamentøse sopp er vellykkede innbyggere i jord og spiller en viktig rolle i jordøkosystemer, som i nedbrytning av organisk og uorganisk materiale, samt regulering av næringsnivåer. Der finner de også mange muligheter til å samhandle med en rekke andre mikrober som bakterier eller andre sopp. Å studere soppinteraksjoner på cellenivå kan imidlertid være utfordrende på grunn av jordens svarte bokslignende natur. Nye mikrofluidiske verktøy utvikles for studiet av soppinteraksjoner; to plattformer designet for å studere bakteriell-sopp og sopp-sopp interaksjoner er fremhevet. Innenfor disse mikrokanalene kan sopp-mikrobielle interaksjoner overvåkes i kontrollerte fysisk-kjemiske miljøer med høyere temporal og romlig oppløsning enn tidligere mulig. Anvendelsen av disse verktøyene har gitt en rekke nye biologiske innsikter, for eksempel observasjon av bakteriell polar tilknytning til hyphae eller avsløre ukarakteriserte sopp-sopp antagonismer. Et sentralt trekk ved disse metodene anser brukervennligheten av dette verktøyet av ikke-eksperter, noe som gir svært overførbare teknologier for bruk i mikrobiologilaboratorier.
Introduction
Jord er et eksepsjonelt mangfoldig miljø som inneholder en overflod av mikroorganismer som er medvirkende til karbon- og fosforsykluser 1,2. Filamentøse sopp er en viktig komponent i mange økosystemer som nedbrytere av organisk og uorganisk materiale og kan forbedre ernæringen av planter gjennom dannelsen av symbiotiske forhold 3,4. Innenfor jord samhandler sopp dynamisk med en rekke mikrober som andre sopp5, bakterier6, virus7 og nematoder8. Disse interaksjonene har betydelige konsekvenser for jord- og plantehelsen. Likevel, på grunn av mangel på passende eksperimentelle systemer som er i stand til å avbilde interagerende mikroorganismer med høy oppløsning, forblir mange udefinerte.
Undersøkelser om bakteriell-sopp interaksjoner (BFF) og sopp-sopp interaksjoner (FFIer) har verdifulle anvendelser på en rekke felt, inkludert antimikrobielle midler i medisin og biologiske kontrollmidler i landbruket. For eksempel produserer sopp coprinopsis cinerea peptid copsin, som har vist seg å vise antibakteriell aktivitet mot det menneskelige patogenet Listeria monocytogenes9. På samme måte er den soppavledede forbindelsen, griseofulvin, mye brukt som behandling for menneskelige soppinfeksjoner og er i tillegg i stand til å hemme veksten av planten patogen sopp Alternaria solani10,11. Flere stammer av jordboende bakterie Bacillus subtilis har også vist seg å være effektive biokontrollmidler av soppplantepatogenet Rhizoctonia solani12,13. Likevel, på grunn av begrensninger knyttet til tradisjonelle metoder, er BBFIer og FFIer dårlig forstått på nivået av enkeltceller.
Konvensjonelle studier utforsker vanligvis BBFIer og FFIer på makroskalaen ved hjelp av agarplater med to eller flere arter i konfrontasjon. Deres interaksjon vurderes ved å måle vekstrater og metabolittproduksjon av de konfronterende artene 14,15,16; Denne metodikken løses imidlertid bare til koloninivå. For å studere interaksjoner på cellenivå, kan bakterielle og soppinokulanter dyrkes på glassmikroskopsklier belagt med agar som deretter avbildes under et mikroskop17. Likevel kan det være vanskelig å følge en enkelt hypha ved hjelp av mikroskoplysbilder på grunn av mangel på innesperring, noe som betyr at tidsforløpbilder er vanskeligere å få tak i. Videre er muligheten til å romlig begrense andre mikroorganismer innenfor definerte regioner i soppmiceliet eller skape definerte kjemiske miljøer som for eksempel kan bli forstyrret, ikke mulig i slike oppsett. Jordens "black box" natur legger også til kompleksiteten ved å studere sopp-mikrobielle interaksjoner på nivået av enkeltceller18. Ved å observere interagerende arter vekk fra det utrolige mangfoldet i jordmikrobiomet, kan den nøyaktige måten individuelle medlemmer samhandler på vurderes. Dermed er det et fortsatt behov for allsidige plattformer som muliggjør høyoppløselig, encellet bildebehandling av BFFIer og FFIer.
Mikrofluidisk teknologi, såkalte lab-on-a-chip-systemer, gir en ideell plattform for studiet av BFF-er og FFIer på nivået av enkeltceller. Feltet mikrofluidikk, med opprinnelse fra teknologier utviklet for kjemisk analyse og mikroelektronikk, er vedtatt av biovitenskapene19. Mikrofluidiske teknologier regulerer små mengder væsker i et skreddersydd nettverk av miniatyriserte kanaler, har minst en dimensjon på mikrometreskalaen, og bruken i biologisk forskning utvides20. Spesielt er mikrofluidiske enheter utviklet for å undersøke veksten av filamentøse sopp 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fordel med å bruke denne teknologien er at innesperring av hyphae og fordelingen av næringsstoffer i mikrokanal ligner mer på jordens struktur enn konvensjonelle agarmetoder31. Nylig har mikrofluidiske plattformer blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom menneskelige nøytrofiler og sopppatogener32, bakterier og planterøtter33, samt sopp og nematoder34,35.
En av de mange fordelene ved å bruke mikrofluidikk for å studere mikrobielle interaksjoner inkluderer den spesifikke kontrollen av mikrokanalmiljøet. For eksempel kan laminære strømningsregimer utnyttes for å generere definerte konsentrasjonsgradienter, noe som er spesielt nyttig når du undersøker bakteriell chemotaxis36. En annen fordel er at den gjennomsiktige naturen til poly (dimetylsiloksan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomerisk polymer som vanligvis brukes til fremstilling av mikrofluidiske enheter, letter høyoppløselig avbildning av enkeltceller ved hjelp av brightfield og fluorescensmikroskopi37. På samme måte betyr innesperring av mikrober i mikrokanal at tidsforløpeksperimenter som sporer enkeltceller, kan utføres, slik at individuelle cellulære responser kan registreres og kvantifiseres37. Til slutt, da mikrofluidiske enheter kan utformes for å være brukervennlige, kan de enkelt brukes av ikke-eksperter38.
Videre kunnskap om samspillet mellom jordboende mikroorganismer er viktig for å forbedre bærekraftige økosystemforvaltningspraksiser som opprettholder biologisk mangfold og for å redusere virkningen av klimaendringer på terrestriske miljøer39. Dermed er utviklingen av nye mikrofluidiske verktøy grunnleggende for å utvide forståelsen av sopp og deres interaksjoner på cellenivå. Protokollen her vil fokusere på to mikrofluidiske enheter produsert for studiet av BFIer40 og FFIer41 som representert i figur 1.
Figur 1: Visuell og skjematisk fremstilling av bakteriell soppinteraksjon (BFI) og sopp-soppinteraksjonsenheter (FFI). (A) Bilde av BFI-enheten. En mycelial plugg er plassert ved inngangen til den ene enden av mikrokanalene for å tillate hyphalvekst i enheten. Bakterieinntaket er i motsatt ende. Skalastang = 5 mm. (B) Skjematisk oversikt over BFI-enheten, som viser plasseringen av bakterieinntakene og retningen av hyphalvekst gjennom interaksjonsmikrokanalene. Kanalene er 10 μm i dybden, 100 μm brede og 7 mm lange, med totalt 28 observasjonskanaler. (C) Konfrontasjonsanalyse på agarplate mellom Coprinopsis sinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610, skala bar = 20 mm (venstre). Mikroskopibilder som viser samspillet mellom C. cinerea og B. subtilis NCIB 3610 innenfor mikrokanal (midten og høyre), det vil si polar festing av bakterier til sopphyphae. Skalastang = 25 μm (midten) og 10 μm (høyre). (D) Bilde av FFI-enheten festet til en glassbunnet Petri-tallerken, dobbelt inokulert med mycelialplugger. Skalastang = 1 cm. (E) Skjematisk oversikt over FFI-enheten. To soppinokulantplugger blir introdusert i innløpene i hver ende av enheten, slik at hyphalutforskning av mikrokanalene tillater hyphalutforskning av mikrokanalene. Kontrollkanaler er kun koblet til ett soppinntak og har en blind kanal, noe som forhindrer interaksjoner mellom testsvampene. Interaksjonskanaler forbinder både soppinntak og tillater hyphalinteraksjoner mellom testpersonene i mikrokanal. Hver interaksjonskanal består av 18 diamantformede seksjoner, som måler en total lengde på 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm dyp og har en forbindelsesregion mellom hver diamant på 20 μm. Kanaltyper dupliseres, skalastenger = 1 mm. (F) Interaksjonssone mellom to nærliggende hyphalfronter, som vokser fra motsatte ender av den sammenkoblede samhandlingskanalen. Fasekontrastmikroskopibilde, skalalinje = 250 μm. Panelene i denne figuren er modifisert fra Stanley et al., 2014 (A-C)40 og Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Et sammendrag av prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen, er visuelt avbildet i figur 2.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av den presenterte metodikken bestående av fem hoveddeler som er beskrevet i denne protokollen. Enhetsdesign er laget ved hjelp av CAD-programvare (Computer Aided Design) og en master mold produsert ved hjelp av fotolitografi (1). Dette brukes til å kaste poly (dimetylsiloksan) (PDMS), som deretter terninges i plater og bindes til glassbunnede Petri-retter for å danne mikrofluidiske enheter (2). Mikrober som skal inkluderes i studien dyrkes (3) og brukes til å inokulere enhetene (4). Interaksjoner studeres ved hjelp av mikroskopi og kvantifiseres ved hjelp av bildeanalyseteknikker (5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Mestre muggfabrikasjon
- Produksjon av fotomasker
- Generer mikrofluidisk enhetsdesign ved hjelp av CAD-programvare (Computer Aided Design). Dimensjonene til de presenterte enhetene er gitt i figur 1, og flere detaljer om de spesifikke designfunksjonene er grundig oppført i de respektive publikasjonene40,41.
- Eksporter CAD-utformingsfilen med riktig format (f.eks. .dwg, .dxf). Skriv ut en filmfotolittografimaske ved å sende den eksporterte CAD-utformingsfilen til et trykkeri for utskrift.
- Fotolitografi
MERK: Følgende trinn bør utføres i et støvfritt og lyskontrollert miljø, for eksempel en laminær strømningshette eller et rent romanlegg. De eksperimentelle forholdene som er gitt her er gitt som en guide og bør optimaliseres internt. Forfatterne anbefaler å søke spesifikk opplæring og konsultere etablerte protokoller42.- Forbered en 100 mm silisiumskive ved å bake i en ovn ved 200 °C i 2 timer. Spin-coat silisiumskiven med SU-8 2010 fotoresist, med sikte på en måltykkelse på 10 μm, ved hjelp av følgende forhold: 500 rpm for 10 s (akselerasjon 100 rpm / s) og 3000 rpm for 45 s (akselerasjon 300 rpm / s).
FORSIKTIG: SU-8 fotoresist er farlig, vær forsiktig ved håndtering og forhindre innånding og kontakt med huden. Det er brannfarlig, potensielt kreftfremkallende og giftig for miljøet. - Stek den belagte silisiumskiven ved 95 °C i 2,5 min (myk bake). Utsett fotoresisten for ultrafiolett (UV) lys, ved hjelp av filmfotolitografimasken og en energidose på 140 mJ/cm2 ved 365 nm bølgelengde ved hjelp av en maskejustering.
- Stek den belagte silisiumskiven ved 95 °C i 3,5 min (etter eksponeringsbake). Fordyp og rør silisiumskiven i utviklerløsningen i 3 min for å avsløre de mikrofabrærerte strukturene ved å fjerne den ueksponerte fotoresisten.
FORSIKTIG: Utviklerløsningen kan være brannfarlig, ta nødvendige forholdsregler ved håndtering og lagring. - Skyll med fersk utviklerløsning i 10 s. Skyll med isopropylalkohol i 10 s og lufttørk. Bruk filtrert trykkluft for å sikre at konstruksjonene er grundig tørre. Mål høyden på SU-8-strukturene, for eksempel ved hjelp av et profilometer.
- Silaniser hver mesterform med 50 μL klorotrimetylsilane ved å påføre et vakuumtrykk på 50 mbar i 2 timer. Forfatterne bemerker at re-silanisering av mesterformen ikke ble funnet å være nødvendig.
FORSIKTIG: Klortrimetylsilane er et farlig stoff. Bruk egnet personlig verneutstyr (PVU) og håndter med forsiktighet. Unngå kontakt med hud og øyne og forhindre innånding. Holdes unna antennelseskilder og bruk i et godt ventilert område.
- Forbered en 100 mm silisiumskive ved å bake i en ovn ved 200 °C i 2 timer. Spin-coat silisiumskiven med SU-8 2010 fotoresist, med sikte på en måltykkelse på 10 μm, ved hjelp av følgende forhold: 500 rpm for 10 s (akselerasjon 100 rpm / s) og 3000 rpm for 45 s (akselerasjon 300 rpm / s).
2. Fabrikasjon av enheter
MERK: Følgende trinn bør utføres i et støvfritt miljø, for eksempel en laminær strømningshette.
- Fremstilling av poly(dimetylsiloksan) (PDMS) plater
- Forbered ca. 40 g PDMS ved å blande basen og herdemiddelet grundig i et 10:1-forhold ved hjelp av en slikkepott i en ren plastkopp. Degas blandingen for å fjerne alle luftbobler ved å plassere plastkoppen som inneholder PDMS i et vakuumkammer (vakuumtrykk = 50 mbar) i 1 time.
- Fest masterformen til en plastbrakett ved hjelp av klart tape. Rengjør med trykkfiltrert luft for å fjerne eventuelle støvpartikler.
MERK: Alternativt kan aluminiumsfolie formes rundt en Petri-tallerken i glass, og deretter brukes til å huse masterformen og inneholde PDMS43. - Hell PDMS-blandingen på midten av mesterformen, sørg for at den er på en jevn overflate, og la den slå seg ned.
MERK: PDMS-blandingen skal helles så nært som mulig på overflaten av masterformen og en kontinuerlig strømning opprettholdes for å minimere innføringen av luftbobler. Luftbobler kan fjernes ved å lede trykkluft over boblen eller ved å øse dem ut med en fin nål. - Dekk masterformen løst med et plastlokk for å forhindre at støvpartikler setter seg på overflaten av PDMS. Overfør master mold til en ovn og kurere over natten ved 70 °C.
- Fjern masterformen fra ovnen og la den avkjøles. Skrell den herdede PDMS bort fra hovedformen og plastrammen, og pass på at du unngår å skade masterformen /PDMS.
- Plasser klart tape over mikrokanalene som er preget inn i PDMS for å opprettholde en støvfri overflate. Pass på at tapen er fjernet før binding.
- Klipp PDMS i plater (dvs. hvis flere enheter er inkludert i designet på masterformen, kan mange fremstilles fra en enkelt støping) som angitt av designet ved hjelp av et montert giljotin- eller barberblad. Når du skjærer sideåpningen på BFI PDMS-platen, må du kontrollere at mikrokanalene er helt åpne (figur 1A). For FFI PDMS-platen må du sørge for at hvert hjørne er trimmet slik at det passer inn i den glassbunnede Petri-parabolen som er vist i figur 1D.
- Stans ønskede innløps-/utløpshull i henhold til enhetens design. Bruk en presisjonskutter til å stanse innløpshull på henholdsvis 3,18 mm og 4,75 mm for de eksemplariske BFI- og FFI-enhetene.
- Binding av PDMS-plater for å lage enheter
MERK: Følgende vasketrinn (2.2.1-2.2.2) bruker en ultralydrenser fylt med renset vann (ddH2O) ved 37 kHz. Vasking av PDMS-platene bidrar til å forbedre vellykket binding44 og redusere risikoen for forurensning. For å manipulere PDMS-platene, bruk rene tang og løft ved hjelp av innløpshullene for å unngå skade på mikrokanal eller enhetsoverflate.- Del ned PDMS-platene i 0,5 M NaOH og soniker i 5 minutter. Skyll med steril ddH2O. Overfør PDMS-plater til 70% etanoloppløsning og soniker i 5 min. Skyll med steril ddH20.
- Senk PDMS-plater ned i steril ddH2O og soniker i 5 minutter. Fjern PDMS-platene fra den sterile ddH2O, tørk med filtrert trykkluft, og legg dem i en steril firkantet Petri-tallerken.
- Plasser den firkantede Petri-retten som inneholder PDMS-platene, i en ovn ved 70 °C i 1 time for å tørke. Fjern fra ovnen og la den avkjøles i støvfritt miljø. Fjern eventuelt støv fra overflaten av PDMS-platene ved hjelp av tape og/eller filtrert trykkluft.
- Aktiver overflatene på PDMS-platene og glassbunnede Petri-retter som skal bindes sammen ved hjelp av en plasmarenser med følgende innstillinger: vakuumtrykk 0,75 mbar, effekt 50%, beleggtid 1 min. Plasser overflatene som skal aktiveres (og deretter festes) vendt oppover i plasmarenseren.
- Fjern PDMS-platene og glassbunnede Petri-retter fra plasmarenseren og lim ved å forsiktig plassere de aktiverte overflatene i konform kontakt med hverandre. Lim BFI- og FFI PDMS-platene til henholdsvis 35 mm og 50 mm diameter glassbunnede Petri-retter (glasstykkelse 0,17 mm).
MERK: Pass på at du ikke legger for mye trykk når du binder, da dette kan føre til sammenbrudd av mikrokanalene. - Se etter vellykket binding ved ganske enkelt å prøve å trekke PDMS-platen av den glassbunnede Petri-parabolen med pinsett. Visualiser enhetene ved øye eller bruk generisk mikroskopi for å sikre at inokulasjonsinntakene eller mikrokanalene ikke kollapser.
MERK: For mettede tilstander (dvs. vannmettede og/eller næringsrike forhold) inkluderer du trinn 2.2.7 i protokollen. Hvis det kreves vann umettede forhold, går du videre til trinn 2.2.8. Enheter kan fylles med vann eller media. - Fyll enhetene umiddelbart etter tilkobling ved pipettering 100 μL av ønsket løsning for BFI-enheten (bakteriell innløps- og sideåpning) eller 30 μL medier i hvert innløp (totalt 60 μL) for FFI-enheten. Hvis luftbobler er til stede, vil disse spre seg rundt 10 minutter etter fylling, da PDMS er porøst.
- Tilsett steril ddH2O (~100-200 μL) i Petri-retten for å opprettholde fuktighet.
3. Mikrobiell kultur
MERK: Følgende trinn gir en generell mikrobiologisk prosedyre for sopp- og bakteriekultur og bør utføres under sterile forhold (dvs. ved hjelp av et flamme- eller mikrobiologisk sikkerhetsskap) som passer for det nivået av inneslutning som kreves for de ønskede mikrober. Spesifikke eksempler er gitt på slutten av hver seksjon for en art av interesse.
- Soppkultur
- Forbered ønsket kulturmedium supplert med agar. Autoklaver mediet ved 121 °C i 15 minutter. La mediet avkjøles til 50 °C og hell i Petri-retter med 9 cm diameter, og oppretthold sterile forhold.
- Bruk en korkborer for å fjerne en plugg med diameter på 4 mm av agar som inneholder mycelium fra en kjøleskapslagerkoloni av ønsket soppstamme for å aktivere isolasjonen. Dette utføres for å sikre standardisert og kraftig vekst av soppen før enhetens inokulering.
MERK: Mikrober kan også aktiveres fra et glyserollager, det vil si soppisolasjoner lagret på agarplugger i 50% glyseroloppløsning ved -70 °C41. - Plasser siden av pluggen med mycelium i kontakt med agaroverflaten i midten av den uinokulerte Petri-parabolen. Sett lokket på toppen av Petri-fatet og tetningen før du inkuberer ved riktig temperatur for ønsket belastning i ønsket tid, vanligvis rundt 3 til 4 dager.
MERK: Eksempel kulturforhold for Trichoderma rossicum: Malt ekstrakt agar, inkubert ved 25 °C i mørket i 48 timer.
- Bakteriekultur
- Strekk ut ønsket bakterieisolering fra kildebestanden (f.eks. glyserolbestand eller enkeltkoloni fra agarplaten) på en agarplate for å oppnå enkeltbakterielle kolonier og sikre ingen forurensning45. Forsegle platen med film.
- Inkuber ved en temperatur og varighet som er spesifikk for isolering av interesse til individuelle kolonier blir observert.
- Forbered ønsket kulturbuljong. For eksempel, tilsett 10 g trypton, 10 g NaCl og 5 g gjærekstrakt per 1 L ddH2O for å forberede LB-medium for kulturen til B. subtilis. Autoklaver mediet ved 121 °C i 15 minutter.
- La mediet avkjøles til romtemperatur. Legg mediet til en steril kulturflaske inne i et sterilt miljø.
- Berør en enkelt bakteriell koloni fra agarplaten ved hjelp av en steril inokulasjonssløyfe. Overfør den inokulerte løkken inn i det sterile kulturmediet ved å berøre væsken kort med løkken.
- Forsegle kolben ved hjelp av et sterilt lokk eller folie, og plasser inne i en ristende inkubator over natten ved hjelp av innstillingene som passer for de valgte artene.
MERK: Eksempel kulturforhold for B. subtilis: i) flytende kultur - aerob vekst ved 37 °C ved 200 o/min i LB medium og ii) platekultur - romtemperatur på LB agarplate. Se FFI/BFI-papirene 40,41 for ytterligere detaljer om dyrking av ulike soppstammer.
4. Inokulering av enheter
MERK: Følgende trinn bør foregå inne i en laminær strømningshette ved hjelp av sterilt utstyr.
- Sopp inokulering
- Bruk en sterilisert korkborer (ø = 4 mm) for å fjerne en agarplugg fra kolonien i periferien av en 3-dagers kultur (trinn 3.1). Sørg for at den voksende hyphalfronten forblir intakt.
- Introduser pluggen i soppinntaket, myceliumsiden ned, med vekstretningen til hyphalfronten orientert mot mikrokanalåpningene for å oppmuntre til hyphalinfiltrasjon av kanalene.
- Gjenta trinn 4.1.1-4.1.2 for den andre sopparten (hvis du bruker FFI-enheten), og sett pluggen inn i motsatt innløp. Hvis du bruker BFI-enheten, utelater du dette trinnet og fortsetter til trinn 4.1.4.
- Forsegle Petri-retten med gjennomsiktig film og inkuber ved 25-28 °C i mørket til avbildningen begynner. Bestem pre-imaging inkubasjonstiden avhengig av den tiltenkte biologiske hendelsen som skal observeres, for eksempel sopp-soppkonfrontasjoner, og vekstraten for inkluderte arter i enheten.
- Bakteriell inokulasjon
- Fortynn bakteriene fra en nattkultur (trinn 3.2) i et 1:25-forhold ved hjelp av samme kulturmedium som beskrevet i trinn 3.2.3. Kultur i 3 timer ved 37 °C.
- Vask bakteriene ved pelleteringskultur ved hjelp av en sentrifuge ved 2000 x g i 10 min. Kast supernatanten og resuspend cellene i ønsket volum på 0,9% m / v natriumkloridoppløsning.
- Sentrifuge igjen for å få en pellets. Kast supernatanten og resuspend cellene i flytende medium (f.eks . C. cinerea minimal medium til en OD600 av 1). Optimaliser OD600-verdien for den aktuelle bakteriestammen.
- Fjern BFI-enheten fra inkubatoren og åpne den i et sterilt miljø. Pipette 10 μL suspensjon i bakteriell innløp.
MERK: Optimaliser de nøyaktige inokulasjonstidsberegningene for de aktuelle bakteriell-soppinteraksjonene. Introduser for eksempel bakterier i BFI-enheten 18 timer etter sopp inokulering hvis du bruker C. cinerea. - Forsegle Petri-retten med en gjennomsiktig film og inkuber ved 25 °C i mørket til avbildningen begynner. Oppbevar enheten oppreist.
5. Mikroskopi og bildeanalyse
- Mikroskopi
MERK: Forskeren bør velge riktig metode for avbildning konkordans med arten av eksperimentet som skal utføres, for eksempel en invertert bredfelt epifluorescence eller konfiskert mikroskopi. En generell oversikt er gitt her, da spesifikke detaljer vil avhenge av attributtene til det valgte mikroskopioppsettet.- Slå på mikroskopdatamaskinen, mikroskopets hoveddel (hvis aktuelt), kamera, temperaturkontrollert inkubator og lyskilde(er). Kontroller at mikroskopet er riktig konfigurert, for eksempel at Köhler-belysningen er riktig påført for jevn belysning av prøven. Start bildebehandlingsprogramvarepakken.
MERK: Når du bruker en temperaturkontrollert inkubator, er det viktig å la mikroskoptemperaturen likevekte i flere timer før du starter et eksperiment. - Monter den mikrofluidiske enheten i sceneinnsatsen. Sørg for at enheten er godt festet, det vil si med tape, for å forhindre at enheten løsner under aktiv scenebevegelse.
- Skaff deg bilder av de inokulerte enhetene, for eksempel enten enkeltpunkts- eller tidsforløpeksperimenter. Omfattende bildespesifikasjoner som er relevante for forsøkene som utføres med BFI- og FFI-enhetene, leveres i de respektive nevnte publikasjonene40,41.
MERK: Brightfield-bilder ble anskaffet ved hjelp av fasekontrastmikroskopi for å visualisere hyphalproliferasjon gjennom vekstkanalene ved hjelp av autofokusprogramvare og enten 10x forstørrelse, 0,30 NA (numerisk blenderåpning) eller 20x forstørrelse, 0,45 NA objektive linser. Eksitasjon av fluorescerende reporterproteiner ble oppnådd ved hjelp av et høyeffektslys som avgir diodelysmotor med bølgelengder som er spesifikke for fluoroforen. - Eksporter bilder til et passende format for etterfølgende bildebehandling. For eksempel .tiff.
- Slå på mikroskopdatamaskinen, mikroskopets hoveddel (hvis aktuelt), kamera, temperaturkontrollert inkubator og lyskilde(er). Kontroller at mikroskopet er riktig konfigurert, for eksempel at Köhler-belysningen er riktig påført for jevn belysning av prøven. Start bildebehandlingsprogramvarepakken.
- Bildeanalyse
MERK: Forfatterne anbefaler Fiji46 som et verktøy for bildeanalyse, men andre programvarepakker er tilgjengelige. Følgende er eksempler på bildeanalyser utført ved hjelp av Fiji fra de presenterte BFI- og FFI-enhetspublikasjonene. Disse trinnene er spesifikke for en Mac og kan variere litt hvis du bruker en PC.- Målinger av hyphal vekstrat
MERK: Denne metoden ble brukt i BFI-manuskriptet40 for å måle vekstraten for individuell hyphae.- Last ned, installer og start Fiji. Importer bildesekvensen fra et intervalleksperiment ved å velge Fil > Importer > bildesekvens. Finn mappen der dataene er lagret, og velg Åpne. Velg Innstillinger i vinduet Sekvensalternativer, og velg deretter OK.
- Velg Rett linje-ikonet på hovedverktøylinjen. Plasser begynnelsen på den rette linjen på spissen av den voksende hyphalspissen ved å klikke og deretter samtidig dra markøren til et annet punkt i vinduet. En gul linje vises med tre bokser som angir begynnelsen, midtpunktet og slutten av linjen.
- Gå til neste delbilde i bildesekvensen ved å trykke og holde nede Ctrl og >. Plasser enden av den rette linjen på spissen av den voksende hyphaen ved å merke og dra firkantboksen til riktig posisjon.
- Trykk og hold nede CTRL og M for å måle lengden på linjen i piksler. Et resultatvindu vises med de målte dataene. Definer dataene som vises i Resultat-vinduet på følgende måte: Klikk i Resultater-vinduet , og velg deretter Resultater > Angi mål.
- Gå til neste delbilde i bildesekvensen ved å trykke og holde nede CTRL og deretter >. Plasser begynnelsen på den rette linjen på spissen av den voksende hyphaen ved å merke og dra firkantboksen til riktig posisjon.
- Trykk og hold nede CTRL og deretter M for å måle lengden på linjen i piksler. Et resultatvindu vises med de målte dataene.
- Gjenta trinn 5.2.1.5-5.2.1.6 til du er ferdig med å måle veksten av hypha i piksler.
- Merk alle dataene i Resultat-vinduet . Kopier og lim inn i et annet program, for eksempel et regneark, for å behandle dataene. Plott hyphalveksten (i piksler eller mikrometer) som en funksjon av tid og beregn gjennomsnittlig vekstrate. Utfør minst tre biologiske repliker per eksperiment.
- Målinger av fluorescensintensitet
MERK: Denne metoden ble brukt i FFI-publikasjonen41 for å vurdere endringen i fluorescensintensiteten i hyphae av Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP ved kontakt med Clonostachys rosea 016 som en funksjon av tid.- Last ned, installer og start Fiji. Importer bildesekvens fra et intervalleksperiment ved å velge Fil > Importer > bildesekvens. Finn mappen der dataene er lagret, og velg Åpne. Velg Innstillinger i vinduet Sekvensalternativer, og velg deretter OK.
- Angi et interesseområde (ROI) for å måle den absolutte fluorescensintensiteten til en hypha ved hjelp av det rektangulære verktøyet, som ligger i hovedverktøylinjen. Størrelsen på firkanten kan defineres nøyaktig slik: Rediger > merket område > Angi. avkastningen kan også lagres for fremtidig referanse i ROI Manager ved å velge Rediger > valg > Legg til i manager.
- Mål den absolutte fluorescensintensiteten (gjennomsnittlig grå verdi) innenfor den definerte avkastningen for hvert bilde i hele bildesekvensen eller stakken på følgende måte: Bilde > stabler > målestakk. Resultatvinduet åpnes automatisk når alle bildene i stakken er behandlet.
MERK: Dataene som vises i resultatvinduet kan defineres på følgende måte: Klikk på Resultat-vinduet og velg deretter Resultater > Angi målinger. Kontroller at Middelverdi grå verdi er valgt. - Merk alle dataene i Resultat-vinduet . Kopier og lim inn i et annet program, for eksempel et regneark, for å plotte de absolutte fluorescensintensitetene til den angitte avkastningen som en funksjon av tid.
- Gjenta trinn 5.2.2.2-5.2.2.4 for å samle absolutte fluorescensintensitetsmålinger for hver avkastning, det vil si på hypha av interesse, ved siden av hypha av interesse eller innenfor den tilsvarende kontrollkanalen.
- Beregn passende relative fluorescensintensiteter i vilkårlige enheter (AU), for eksempel ved å dele den absolutte fluorescensintensiteten til avkastningen [hypha of interest] med den absolutte fluorescensintensiteten til avkastningen [kontrollkanal]. Se FFI-publikasjonen41 hvis du vil ha mer informasjon.
- Utfør minst tre biologiske repliker per eksperiment og plott de relative fluorescensintensitetene som en funksjon av tid.
- Målinger av hyphal vekstrat
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater presenteres fra de eksemplariske BFI40- og FFI41-enhetene. Hyphal vekstratemålinger kan enkelt oppnås ved hjelp av disse enhetene i kombinasjon med grunnleggende mikroskopiteknikker. Figur 3A-B illustrerer bakteriell-sopp interaksjoner mellom C. cinerea hyphae og B. subtilis NCIB 3610. Tilstedeværelsen av B. subtilis stopper veksten av C. cinerea etter ca. 5 h post co-inokulasjon (figur 3B). Piler angir samtidig morfologisk observasjon av tynnere og mer gjennomsiktig hyphae (figur 3A). Det ble også bemerket at upåvirkede hyphalceller fortsatte å spre seg. Figur 3C-D viser den sterke hemmende effekten av F. graminearum PH1-dsRed på T. rossicum NEU135 etter hyphal interaksjon, noe som resulterer i en fullstendig arrestasjon av T. rossicum hyphal vekst.
Figur 3: Eksempler på kvantifisering og observasjon av vekstrater fra BFI- og FFI-enhetene. (A) Brightfield-mikroskopibilder av interaksjoner mellom Coprinopsis cinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610 i mikrokanalene til BFI-enheten på tidspunktene etter ko-inokulering. Piler fremhever en tynn hyphalmorfologi, som skjedde etter interaksjon med B. subtilis NCIB 3610. Skalastang = 25 μm. (B) Hyphal vekstrate av ledende hyphalspisser målt over 10 timer etter koinokulering. Stolper representerer standardavvik fra tre biologiske repliker. (C) Boxplot (n = 6) som viser den relative vekstraten for Fusarium graminearum PH1-dsRed versus Trichoderma rossicum. Signifikans er betegnet med ** og representerer p < 0,01, beregnet ved hjelp av Mann-Witney U-test. Stolper representerer henholdsvis største eller minste observasjon lik øvre og nedre persentil (± 1,5 x interkvartilt område). (D) F. graminearum PH1-dsRed (vokser fra venstre til høyre) vs T. rossicum NEU135 (vokser fra høyre til venstre) ved 24 timer, 48 timer og 72 timers postkookulasjon. Brightfield og fluorescenskanaler overlaid. Skalastang = 200 μm. Panelene i denne figuren er modifisert fra Stanley et al., 2014 (A-B)40 og Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
De morfologiske endringene forårsaket av interaksjonshendelser kan observeres på cellenivå ved hjelp av metodene som er skissert i dette papiret. Figur 4 gir eksempler på morfologiske observasjoner for de presenterte BFI- og FFI-enhetene. Figur 4A viser tapet av polariteten til Verticillium longisporum hyphal vekst når man møter bakteriene Pseudomonas synxantha (P_phen) eller P. fluorescens (P_rhizo), sammenlignet med kontroll sopp alene (V1)47. Soppbakterielle interaksjoner resulterte i hyphaens krøllete utseende. Dette tilskrives betydelige bakterieinduserte transkripsjonsendringer i sopp- og putativ unngåelsesatferd. Disse resultatene er signifikante da V. longisporum er et plantepatogen, noe som betyr Pseudomonas sp. kan brukes som biokontroll i dette tilfellet47.
Figur 4B viser et tidsforløpeksperiment der det dynamiske tapet av hyphal cellulært innhold kan observeres, og danner bleb som beholder det røde fluorescerende proteinet dTomato. Denne blebbing morfologien skjedde etter ko-inokulering med B. subtilis, men ble bare observert i noen apikale celler. Imidlertid ble sammenbruddet av hyphae og påfølgende blebbing fenomener ikke korrelert med bakteriell vedlegg. Dette antydet at det var potensiell soppdrepende bakteriell aktivitet som ikke var vedleggsavhengig, hypoteset å skyldes sekresjon av lipopeptider. Høyoppløselige dynamiske avbildningsteknikker har også avslørt en putativ forsvarsmekanisme av F. graminearum, som viser økt septadannelse når den antagoniseres av C. rosea, som indikert av pilene i figur 4C.
Figur 4: Eksempler på endringer i morfologi observert under interaksjonshendelser i BFI- og FFI-enhetene. (A) Curlingmorfologiske endringer i plantens patogene sopp Verticillium longisporum (V1) merket med grønt fluorescerende protein (GFP)48. Denne morfologien skjedde som svar på en fluorescerende Pseudomonas-slurk. med genkoding for fenazinsyntese (P_phen; P. synxantha) og en bakterie isolert fra rhizosfæren av rapsfrø (P_rhizo; P. fluorescens). Skalastenger = 20 μm. (B) dTomato-uttrykkende Coprinopsis cinerea40 co-inokulert med Bacillus subtilis avbildet 5 h post co-inokulering. Celler var intakte (venstre) ved 5 timer, men en hypha kollapset 30 minutter senere (tap av fluorescens) og blemer som inneholder (fluorescerende) cellulært materiale ble observert. Skala bar = 25 μm. (C) Piler markere septa formasjon i Fusarium graminearum hyphae observert etter interaksjon med Clonostachys rosea hyphae. Skalalinje = 10 μm, tidsstempel = h post co-inokulering. Panelene i denne figuren er modifisert fra Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 og Gimeno et al., 2021 (C)41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
De presenterte enhetene er også egnet for å observere dynamiske fysiologiske endringer. Ved hjelp av BFI-enheten ble det vist at konsentrasjonen av hyphae-assosierte bakterier endret seg over tid og reduserte etter en lokal opphopning av celler (figur 5A). Bakteriell mobilisering langs mikrokanal ble også observert i klyngelignende sammenstillinger. I FFI-enheten tillot fluorescensmerking kvantifisering av C. rosea hyphalproliferasjon når den konfronteres med F. graminearum for å karakterisere dynamikken i den antagonistiske interaksjonen (figur 5B). Disse målingene ble tatt over en periode på 20 timer og viser potensialet til disse enhetene for å utføre langsiktige tidsforløpeksperimenter.
Figur 5: Eksemplarisk dynamisk fysiologisk karakteriseringsmålinger for både BFI- og FFI-enhetene. (A) Tidsforløpeksperiment i BFI-enheten som viser vedlegget av Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 til hyphae av Coprinopsis cinerea pMA41240 over 3 t. Skalastang = 50 μm. (B) Brightfield- og fluorescenskanalbilder viser kvantifisering av grønt fluorescerende protein (GFP) som oppdages ved hjelp av FFI-enheten under samspillet mellom fluorescerende merket Clonostachys rosea, og Fusarium graminearum49. Skalastang = 50 μm. Graf (høyre) plotter relativ fluorescens i vilkårlige enheter (AU) over 20 timer, n = 6 og feilfelt indikerer standardfeilen. Oransje og grå tomter illustrerer fluorescensintensitetene til (i) GFP som er påvist i C. rosea hyphal-nettverk og (ii) interaksjonskanalen sammenlignet med C . rosea-inneholdende kontrollkanal, henholdsvis. Den svarte kontrollplottet viser fluorescensintensiteten til hyphae i C. rosea-kontrollkanalen sammenlignet med kontrollkanalen. Panelene i denne figuren er modifisert fra Stanley et al., 2014 (A)40 og Gimeno et al., 2021 (B)41. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer en protokoll for studiet av sopp-mikrobielle interaksjoner ved hjelp av kanalmikrofluidikk. Forfatterne tar sikte på å demonstrere allsidigheten til disse enhetene og oppmuntre til tilpasning som passer forskerens interesser. Ved hjelp av de eksemplariske BFI- og FFI-enhetene kan soppmikrobielle interaksjoner studeres mer detaljert enn tidligere tilgjengelig. Ved å fjerne jordens bakgrunnskompleksitet og heterogenitet, moderere veksten av hyphae slik at de er begrenset til en enkelt monolayer, og tett regulere miljøparametere, er det mulig å fange høyoppløselige bilder av disse biologiske hendelsene over tid. Ved hjelp av disse enhetene har interaksjonene mellom mikrobielle partnere blitt karakterisert ved hjelp av vekstrate, fluorescens kvantifisering og observasjonell bioimaging av morfologiske egenskaper.
Enheter kan utformes for å muliggjøre karakterisering av sopp-mikrobielle interaksjoner på cellenivå. Allsidigheten og enkel design for ikke-spesialister gjør denne protokollen egnet for tilpasning til en bred bredde av forskningsspørsmål. BFI- og FFI-enhetene er egnet for bruk med en rekke mikroskoper som passer til det eksperimentelle målet, på grunn av deres gjennomsiktige natur og glassbundne overflate. Enhetene kan skreddersys med hensyn til både deres konfigurasjon og fysisk-kjemiske parametere; For eksempel kan fuktighet, temperatur eller kanalmetning endre miljøopplevelsen for testpersonen. Deretter kan enheten utformes slik at den fysisk kan lede vekst eller fremkalle en bestemt oppførsel, for eksempel interaksjonshendelser eller navigasjonsstrategier, kontrollert av kanalstruktur og størrelse eller inkludering av hindringer. Dette er ikke mulig med gjeldende metoder, for eksempel agarplateanalyser31.
Så langt har mikrofluidiske enheter også blitt brukt til å utforske sopp-phage50 og sopp-nematode35 interaksjoner. Bruken av kanalmikrofluidikk tillater også kontroll og utveksling av væsker i enheten. Denne viktige og fordelaktige funksjonen var medvirkende i studiet av mycelial phage-oppbevaring50. I tillegg ga bruk av mikrofluidiske teknologier for transkripsjonsstudier en større oppløsning av differensialt uttrykte gener sammenlignet med en lignende agarbasert analyse. Metodene var samtidige i 24 av de 28 differensialt uttrykte genene identifisert av det samme agarplateeksperimentet, der mikrofluidiske enheter identifiserte mange flere gener og rapporterte et høyere relativt uttrykk i sammenligning35.
De kritiske trinnene i protokollen begynner med den opprinnelige enhetsutformingen. For å oppnå et passende design må det tas hensyn til livsstils- og vekst/ mobilitetsstrategien til mikrober av interesse. For eksempel, inkludert tilstrekkelig kanaldybde eller lengde for å imøtekomme de fysiologiske kravene og veksthastigheten til mikroorganismen av interesse. De strukturelle egenskapene og komponentene i mikrokanalene kan utformes for å indusere eller manipulere spesifikk oppførsel, for eksempel åpninger for interaksjonssoner eller hindringer for å observere navigasjonsstrategier. Videre må det eksperimentelle forskningsspørsmålet være adresserbart med enhetsdesignet. Tenk for eksempel på: (i) hvordan laminære strømningsprofiler kan utnyttes, (ii) tilpasning og varierende mikrokanalhøyder for organismen som skal undersøkes, og (iii) innsnevring av mikrokanalinnganger for å forhindre overspredning av hyphae i enheten. Forfatterne foreslår disse ytterligere ressursene for mikrofluidisk enhetsdesign 51,52,53. Det er også viktig å holde enhetene fri for støv under produksjon. Det bør derfor utvises forsiktighet for å opprettholde et støvfritt miljø i alle stadier av fabrikasjonsprosessen, samt ved å bruke tape og filtrert trykkluft, og holde PDMS-overflatene dekket når de ikke er i bruk. Andre kritiske trinn i protokollen inkluderer å minimere risikoen for forurensning ved å vaske enhetene i 70% etanolløsning, og sikre tilstrekkelig binding mellom glassoverflaten og PDMS-platen, ved å forsiktig plassere de aktiverte overflatene i kontakt med hverandre og ikke legge for mye press på mikrokanalene. Kontroller om det er tilfredsstillende vedheft ved å forsøke å fortrenge PDMS-platen fra glasset før inokulering. En begrensning ved disse enhetene er at de ikke kan brukes på nytt mellom eksperimenter.
Inkluderingen av jordmikrober i skreddersydde mikrofluidiske enheter begynner en spennende ny epoke for forskning på mikrobielle interaksjoner. Potensielle fremtidige anvendelser av den presenterte metodikken er omfattende, for eksempel oppdagelsen av nye biokontrollerarter eller antimikrobielle forbindelser, eller karakteriseringen av den såkalte soppveien for bakteriell mobilisering. BFI- og FFI-enhetene gir en plattform for å visualisere dynamiske morfologiske og fysiologiske endringer som skjer før og etter interaksjon på cellenivå. Nye enheter er enkle å designe og skape, bare krever oppfinnsomhet, for å passe til det eksperimentelle forskningsspørsmålet. Deres allsidighet og brukervennlighet betyr at denne metoden kan brukes av ikke-eksperter til ytterligere jordmikrobiomeforskning på cellenivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkjenner økonomisk støtte fra Institutt for bioingeniør ved Imperial College London og The Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
References
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
- Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
- Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
- Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33 (2021).
- Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
- Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
- Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
- Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
- Tang, H. -Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
- Bai, Y. -B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
- Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
- Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
- Válková, H., Novotný, Č, Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
- Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), Basel, Switzerland. 572 (2020).
- Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
- Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
- Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
- Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
- Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
- Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
- Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
- Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
- Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163 (2019).
- Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
- Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535 (2020).
- Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
- Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
- Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154 (2017).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
- Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243 (2019).
- Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
- Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
- Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074 (2020).
- Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
- Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
- Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262 (2021).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010 (2018).
- Choi, C. -H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468 (2021).
- Boenisch, M. J. Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , Staats-und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky. (2013).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
- Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
